CN105063041A - 用于检测甘草属植物的ssr分子标记引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测甘草属植物的SSR分子标记引物，核苷酸序列如SEQ.ID？NO.1和SEQ.ID？NO.2所示。本发明的SSR分子标记引物在甘草和刺果甘草物种中扩增出明显不同的条带大小，可用于区别甘草和刺果甘草物种。使用本发明引物对甘草不同物种居群进行聚类，同样得到明显的区分。本发明的SSR分子标记可以直接应用于更多甘草属植物的种质资源遗传多样性、物种分子鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种研究。

Description

用于检测甘草属植物的 SSR 分子标记引物

技术领域

本发明属于分子生物学分子标记技术领域，涉及一种SSR分子标记引物，特别是涉及一种用于检测甘草属植物的SSR分子标记引物。

背景技术

甘草(Glycyrrhizae Radix et rhizome)为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)多年生草本植物，是一种临床上应用非常广泛的重要中药材，以《中华人民共和国药典》中收录的甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)为药用甘草正品。但市场上胀果甘草和光果甘草较少，商品流通中主要以甘草为主。

刺果甘草(Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.)有效成分含量较低，未被收录在药典中。但有些地方以刺果甘草做为药用混入品，无疑影响了医疗过程中甘草的整体疗效。目前依靠传统方法很难将甘草和刺果甘草药材鉴定区分开。

在不同产地或同一产地都存在着形态特征不同的甘草类型，且种间、种内遗传变异多样，这对于种间亲缘关系和分类鉴定及有效成分的有效利用带来了很大的困难。因此，利用目前先进的仪器进行大量且有效的SSR开发，筛选药用甘草属植物特有的分子标记，用于不同物种间的鉴定具有重要意义。

目前利用分子标记对甘草属植物进行物种鉴定、遗传多样性分析等主要采用ISSR、RAPD、AFLP等标记，但ISSR和RAPD是简单的随机性分子标记，存在重复性和可靠性方面的缺陷，不能全面准确反映甘草属植物的遗传多样性；而AFLP分子标记多态性水平高，信息量大，但实验步骤繁琐，技术难度较高，并且对DNA质量要求较高。

SSR分子标记，也称微卫星DNA，其重复性与多态性较好，在基因组中丰度较高，实验操作简便省时，被称为第二代群体遗传学研究标记。因此，与上述分子标记相比，SSR作为共显性遗传标记，其多态性高、重复性好、信息量高、具有多等位基因的特性，且SSR分析对DNA含量及纯度要求不高，成为植物遗传多样性研究、品种鉴定、连锁图谱构建和系统发育研究中一种有效的分子标记。

SSR引物具有物种特异性，只能在同种或同属物种中通用。因此，针对某一物种的SSR分析，首先是开发特有的SSR分子标记引物，或者从别的物种上筛选引物。SSR引物的获得方法主要有四种：1、从已发表的文章中获得。这种方法最简单快捷，但由于SSR属内具有较强的物种特异性，SSR引物只能对该物种或近缘物种使用，对其他物种则具有盲目性。2、选用近缘物种SSR引物。但是从近缘物种获得SSR引物的效率较低。3、数据库搜寻法。刘越等利用NCBI公布的甘草属植物表达序列标签(EST)50666条，对乌拉尔甘草EST资源的SSR信息进行了分析，得出乌拉尔甘草EST-SSR的出现频率高，重复类型丰富，理论上表明这些EST-SSR具有较高的可用性，但实际实验没有应用研究。李晓岚等通过乌拉尔甘草表达序列标签(EST)数据库查找甘草属SSR位点，仅得到15对EST-SSR引物在甘草属内具有很好的适用性，这对于甘草分子遗传或物种有效鉴定是远远不够的。4、根据所研究物种的基因组序列，构建SSR文库，从中筛选出一套特异的SSR引物。目前主要是利用高通量测序进行引物开发，该技术能够以极低的单碱基测序成本，产出超高的数据量，并且可有效应用于非模式植物物种中新分子标记的开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘草属植物特有的SSR分子标记引物，以弥补目前甘草属SSR分子标记比较缺乏的不足，并实现对甘草和刺果甘草物种的有效鉴别。

本发明应用新一代高通量测序平台Illumina HiseqTM 2500，高效率获得较多的转录组信息，以进行甘草SSR标记的大量开发，并从中快速有效筛选出能够鉴定不同甘草物种的特有引物。

引物设计时，首先利用MISA软件对甘草转录组测序筛选得到的1kb以上的Unigenes 进行SSR搜索，搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复次数分别为10、6、5、5、5、5；再利用Primer6软件设计引物，引物设计原则为：引物长度18-22bp，PCR扩增最终产物长度150-350bp，Tm值50-60℃。引物设计完成后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

本发明提供的用于检测甘草属植物的SSR分子标记引物命名为G001，由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列分别如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示，具体如下：

G001 F：5’-TCGCTCTCGCTCTGACTT-3’；

G001 R：5’-TGGTGTGGCTGTGTATGTG-3’。

本发明所提供的SSR分子标记引物可以应用于甘草属植物物种的鉴定中，特别是可以应用于鉴定甘草和刺果甘草物种。

应用本发明SSR分子标记引物鉴定甘草属植物物种的方法具体包括：

1) 利用CTAB法提取待鉴定样本叶片的总DNA；

2) 以待鉴定样本叶片的总DNA为模板，用SSR分子标记引物进行PCR扩增；PCR扩增采用10μL SSR-PCR反应体系：PCR-Mix 4.5μL，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，双蒸水3.5μL；SSR-PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次，72℃延伸5min；

3) 取扩增产物进行电泳，读取扩增出的引物片段（bp）大小。

图2、3、4、5给出了不同甘草和刺果甘草样本的PCR扩增产物电泳结果。从4幅图中可以看出，甘草物种在分子量191-327bp范围内出现DNA扩增条带，而刺果甘草物种的DNA扩增条带则出现在分子量171-185bp的范围内，据此，可以实现对甘草物种和刺果甘草物种的鉴别。

进而，本发明根据不同物种引物片段的差异性，利用类平均法对不同居群甘草和不同物种甘草进行聚类分析，得到了明显居群（图6）和不同物种（图5）分类。

本发明利用提供的SSR引物序列，选择7个省份606个甘草和59个刺果甘草样本进行筛选，得到了不同于前人的具有高多态性的SSR分子标记。该SSR引物序列在样本中扩增稳定，重复性较好，条带清晰，且在甘草和刺果甘草两个物种中扩增出明显不同的条带大小。依据扩增出的条带大小差异，可以将甘草和刺果甘草明显区分开。在不同物种居群中进行聚类，同样得到明显的区分。因此，本发明所提供的SSR分子标记可以直接应用于更多甘草属植物的种质资源遗传多样性、物种分子鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种研究中。

随着国际市场需求与日俱增，长期的掠夺性开发和不合理采挖，已造成野生甘草栖息地的极大破坏，而人工栽培资源虽然在一定程度上可以缓解野生资源不足所带来的生产压力，但又面临着药材质量的下降等问题。同时，由于药用甘草分布范围较广，生态环境复杂，形成了药用甘草在种内和种间复杂的遗传变异，导致了属内种间亲缘关系和分类鉴定的复杂性，给甘草属植物种质资源的深入研究带来了困难。因此，本发明通过开发SSR分子标记并发掘物种特有的分子特征，可以为甘草种质资源的遗传多样性、分子鉴定、构建遗传图谱及分子辅助育种提供技术支撑，为今后优质甘草的栽培生产和确保甘草的临床疗效提供分子保障。

附图说明

图1为部分甘草和刺果甘草样本DNA琼脂糖电泳检测结果。

图2为SSR分子标记引物G001在部分内蒙甘草样本中的PCR扩增产物电泳结果。

图3为SSR分子标记引物G001在部分青海甘草和陕西甘草样本中的PCR扩增产物电泳结果。

图4为SSR分子标记引物G001在部分宁夏甘草和吉林甘草样本中的PCR扩增产物电泳结果。

图5为SSR分子标记引物G001在部分新疆甘草和内蒙刺果甘草样本中的PCR扩增产物电泳结果。

图6为基于引物G001构建的不同居群甘草和刺果甘草样本的UPGMA聚类图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案进行进一步的说明。本发明所述实施例仅用于解释本发明，而不应理解为对本发明范围的限制。在不背离本发明技术方案的前提下，对本发明所作出的本领域技术人员容易实现的任何改动，都应认为是本发明的内容。

实施例1：甘草SSR引物设计。

引物设计时，首先利用MISA软件对甘草转录组测序筛选得到的1kb以上的Unigenes 进行SSR搜索。搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复次数分别为10、6、5、5、5、5。再利用Primer6软件设计引物，引物设计的原则为：引物长度为18-22bp，PCR扩增最终产物长度为150-350bp，Tm值为50-60℃。引物设计完成以后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

实施例2：甘草基因组DNA提取。

采用CTAB法对甘草叶片基因组DNA进行提取。

1) 取0.025g干燥的植物叶片，在液氮中研成粉末，加入1.0mL预热至65℃的CTAB缓冲液，2%β-巯基乙醇，混匀，65℃保温1h，期间每隔10min摇匀一次。

2) 将冷却的离心管12000r/min离心10min，取上清液800µL，加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1(V/V/V))抽提10min，12000r/min离心10min。

3) 取上清液600µL，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1(V/V))抽提10min，12000r/min离心10min。

4) 取上清液400µL，加入2.5倍体积的-20℃遇冷无水乙醇混匀，-20℃静置20min。

5) 12000r/min离心10min，挑出絮状沉淀，加入500μL 70%乙醇清洗两次，12000r/min离心5min，弃去上清液，加入800μL无水乙醇漂洗10min，10000r/m离心5min，弃去上清液，室温下晾干后得到DNA，加入100μL TE溶解DNA，溶解后待用。

实施例3：琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取结果。

1）在电泳槽中注入适量0.5×TBE；对梳子和胶板进行组装。

2）在锥形瓶中加入适量琼脂糖和0.5×TBE（1%胶），置于微波炉中加热3～4min。

3）琼脂糖完全溶解后，待温度冷却至室温，滴入EB，摇匀后倒入胶板，凝胶。

4）待胶凝好后，开始点样。依据点样孔大小，选择5～10µL DNA样液，使之与2µL溴酚蓝充分混合后，依次在胶孔里点样。

5）点好样后，120V电压下恒压电泳30～45min，待溴酚蓝距离胶板底部约1cm左右时停止电泳。电泳完成后，在紫外凝胶成像仪下观察、照相并留存处理。

图1给出了部分甘草和刺果甘草DNA的1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果显示得到的DNA条带较为清晰，其中个别样本有拖尾现象，可能是RNA没有消化彻底，但整体看条带整齐，明亮，说明DNA完整性较好，可用于下一步SSR-PCR扩增反应。

实施例4：甘草SSR-PCR及产物检测。

1、甘草SSR-PCR反应

采用10μL甘草SSR-PCR反应体系：PCR-Mix 4.5μL，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，双蒸水3.5μL。SSR-PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次，72℃延伸5min。

2、甘草SSR-PCR产物检测

取20mL 5×930双链DNA Inlet Buffer，以80mL次微米过滤水稀释后加入样品板。吸取30μL/孔35bp/500bp Marker样品至样品板，并覆盖20μL矿物油，以减少实验过程中Marker的蒸发。吸取22μL 1×TE dilution buffer至样品孔，再吸取2μL DNA扩增产物样品至样品板，使用移液器混合样品。取适当体积FA双链DNA分离胶，加入染料混匀，将配制好的胶/染料混合物放入仪器的试剂室。在Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳仪上进行电泳，得到如图2、3、4和5所示的电泳结果。电泳结果通过PROSize^®2.0软件进行分析。

3、电泳条带统计

通过PROSize^®2.0软件直观分析扩增的条带bp大小，图2、3、4和5显示了引物G001在部分甘草和刺果甘草中的扩增结果。从图中可以看出，两种甘草物种扩增出的条带大小存在一定的差异，甘草的扩增条带大小范围在191-327bp，刺果甘草的扩增条带大小范围在171-185bp，说明引物G001可以明显的将两物种区分开。根据PROSize^®2.0软件提供的每个样本扩增的条带大小，进行数据读取，并记录在excel中，进行下一步的聚类分析。

实施例5：聚类分析。

通过对606个甘草和59个刺果甘草样本进行PCR-SSR电泳扩增结果统计，得到的SSR分子标记片段长度（bp）数据转换为0，1数据，输入NTSYS软件中，采用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)对甘草属植物样本进行遗传多样性分析，得到图6。结果显示，665个样本首先按物种分为两大组，即刺果甘草聚为一组，甘草聚为一组。在甘草一组中，甘肃甘草居群与吉林甘草居群优先聚类，并先与内蒙甘草居群聚为一支，后依次与陕西甘草居群、新疆甘草居群、宁夏甘草居群和青海甘草居群聚类。在刺果甘草一组中，首先以吉林刺果甘草居群与内蒙古兴安盟乌兰浩特市葛根庙刺果甘草居群（内蒙2刺果）聚类，后与另外两个内蒙古兴安盟乌兰浩特市科右前旗太本站镇刺果甘草居群（内蒙1刺果和内蒙3刺果）聚类。表明这对引物可以有效的用于甘草种间和种内种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中。

所述甘草为产于7个省份的606个甘草样本和59个刺果甘草样本，具体见表1。

表1 665个不同甘草样本明细

SEQUENCE LISTING

<110> 山西农业大学

<120> 用于检测甘草属植物的SSR分子标记引物

<160> 2

<170> Patentin version 3.2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TCGCTCTCGC TCTGACTT 18

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

TGGTGTGGCT GTGTATGTG 19

Claims (4)

1.用于检测甘草属植物的SSR分子标记引物G001，由核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示的下游引物组成。

2.权利要求1所述SSR分子标记引物G001在甘草属植物物种鉴定中的应用。

3.权利要求1所述SSR分子标记引物G001在鉴别甘草和刺果甘草物种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是甘草在分子量191-327bp范围内出现DNA扩增条带，刺果甘草在分子量171-185bp范围内出现DNA扩增条带。