EP1119767A1 - Verfahren und vorrichtung zur schnellen flüssigchromatographischen trennung von substanzgemischen und identifizierung von substanzen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur schnellen flüssigchromatographischen trennung von substanzgemischen und identifizierung von substanzen

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EP1119767A1
EP1119767A1 EP99952538A EP99952538A EP1119767A1 EP 1119767 A1 EP1119767 A1 EP 1119767A1 EP 99952538 A EP99952538 A EP 99952538A EP 99952538 A EP99952538 A EP 99952538A EP 1119767 A1 EP1119767 A1 EP 1119767A1
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EP
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separation
column
substances
collecting
way
Prior art date
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Withdrawn
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EP99952538A
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Lutz MÜLLER-KUHRT
Holger Gumm
Holger Notzke
Ralf; God
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Sepiatec GmbH
Original Assignee
Sepiatec GmbH
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Publication date
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Definitions

  • the invention relates to a method and a device for the rapid liquid chromatographic separation of substance mixtures and identification of substances according to the preambles of claims 1 and 5.
  • the problem in pharmaceutical research is to isolate pharmaceutically active substances from substance mixtures. Natural product extracts or mixtures of substances generated by combinatorial chemistry are tested for their potential effectiveness. From substance mixtures that have shown effectiveness, an attempt is then made to isolate the active substances using complex separation processes. The individual substances of the mixture isolated in this way are then subjected to a new activity test. The structure of the effective individual substances now found is examined in order to rule out possibly already known active substances.
  • a disadvantage of this method is that the effectiveness of individual substances can be suppressed in the test of the substance mixtures by means of superimposition effects and these remain undetected.
  • overlay effects can pretend to be effective and then it is searched in vain for these supposed active substances in the substance mixture in vain.
  • the invention is based on the object of offering a device and a method for liquid-chromatographic separation, isolation and identification of substances in the analytical and semi-preparative field, with which a test for the effect of substance mixtures is unnecessary and it is possible to separate substance mixtures faster than previously, isolate and identify the individual substances.
  • the invention has several advantages.
  • the substances no longer have to be tested twice, namely beforehand in the mixture of substances and after isolation.
  • the time-consuming and costly first test of the substance mixtures which is sometimes flawed, can be omitted.
  • the previously costly processing of known substances is no longer necessary.
  • the time and cost involved in determining a new active substance can be significantly reduced.
  • this procedure is safer because the test results on unknown individual substances are clear and all active substances present in the mixture are also recorded.
  • the substance mixtures to be investigated are processed in a two-stage separation.
  • the second chromatographic separation stage several fractions from the first separation step can be separated in parallel by the inventive connection of separation columns and solid-phase extraction columns (collecting columns) with the pump unit.
  • this device works much faster and therefore cheaper than known two-stage devices.
  • the individual substances are identified by known direct computer-controlled comparison of the chromatograms and spectra obtained from detectors and the retention area from the first separation step and the Retention time from the second separation step with information about known substances in a database.
  • Ultraviolet absorption, mass spectrometry, light scattering, fluorescence, infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance spectroscopy are possible as detection and identification principles.
  • the inclusion of further identification parameters such as B. Source and origin of the sample is possible. Since fewer tests are necessary to identify the substances in the mixture and to exclude substances that are already known, this system can be dimensioned on an analytical and semi-preparative scale. Analytical and semi-preparative systems are much cheaper to purchase and operate than the previously used preparative systems. Due to the lower consumption of solvents and buffer substances, the method and the device according to the invention are environmentally friendly due to the lower amounts of waste.
  • 2 shows a schematic illustration of the separation of a substance mixture in the first separation step and adsorption of fractions on the first collecting column battery
  • 3 shows a schematic illustration of the separation of a substance mixture in the first separation step and adsorption of fractions on the second collecting column battery
  • Fig. 6 is a schematic representation of a parallel separation of absorbed fractions in the second separation step
  • FIG. 7 shows a schematic illustration of the equilibration of a collecting column battery.
  • 1 to 7 show an example of the structure and flow diagram of a device according to the invention with a separation column and three subordinate separation lines.
  • a pump unit 2 which consists of three pumps 2.1 to 2.3, is via the 6-way 2-position valves 3.1 and 3.3 and the 3-way 2-position valve 5.7 with a charging column battery 6, a separation column 10, for the first separation stage and a second separation stage, which consists of three separation lines that can be operated in parallel, each of which is preceded by a 6-way, 2-position valve 3.5, 3.6 and 3.7, connected.
  • This makes it possible to transport the mobile phase in any desired composition one after the other and in parallel into all areas of the device.
  • Each dividing line has a collecting column battery 7, 8 and 9 and a separating column battery 11, 12 and 13.
  • the collecting column battery 7 contains the collecting columns 7.1 to 7.6 and the separating column battery 11 contains the separating columns 11.1 and 11.2.
  • the two other dividing lines shown are constructed identically.
  • Other variants with more feed columns 6.1 to 6.6 of the feed column battery 6, a plurality of separation columns 10, more than three collecting column batteries 7, 8 and 9, each with more than six collecting columns and more than three separation column batteries 11, 12 and 13 with more than six separation columns per battery are possible .
  • the separation column 10 is equilibrated.
  • the air from the Feeder battery 6 removed.
  • the air is removed from one of the dry-filled feed columns 6.1 to 6.6 with water, the next to be injected.
  • the separation column 10 is equilibrated with a suitable solvent by means of the pump 2.1, the 6-way 2-position valves 3.1 and 3.3.
  • the separation program is started. First the 6-way 2-position valves 3.3 and 3.5 are switched. The components of the mobile phase can be entered into the system by means of the pump unit 2 via a low pressure valve unit 1 with the low pressure valves 1.1 to 1.3. The mobile phase is transported via the low-pressure valve 1.1 of the pump 2.1 and the pump 2.1, whereby this system can be operated both isocratically and with a gradient. Via the 6-way 2-position valve 3.3 and the 7-way 6-position valves 4.1 / 4.2, the mobile phase of pump 2.1 is guided to the feed column 6.1 to 6.6 from which sample material is to be processed.
  • the sample to be separated is transferred from one of the feed columns 6.1 to 6.6 to the separation column 10.
  • Those emerging from the separation column 10 Separate test components pass through a 6-way 2-position valve 3.4 and the detector 14.1 to a T-piece 17, where water is mixed into the mobile phase via the pump 2.2 and the 6-way 2-position valve 3.1.
  • the amount of water mixed depends on the polarity of the substances to be separated.
  • the polarity of the mobile phase which is increased by water, now enables adsorption on the collecting columns 7.1 to 7.6 of the collecting column battery 7.
  • Via the 6-way, 2-position valve 3.5 adsorption onto the collecting column battery 7 is first carried out.
  • the collecting columns 7.1 to 7.6 are covered with fractions one after the other.
  • the separation column batteries 11, 12 and 13 are equilibrated.
  • 5 shows the equilibration of the separating column batteries 11, 12 and 13.
  • the mobile phase is led via the pump 2.1, the 6-way 2-position valve 3.1 and 3.5 to the separation columns 11.1 and 11.2 of the separation column battery 11. From there, the mobile phase is led into the waste via the 6-way 2-position valve 3.4, the detector 14.1 and a fraction collector 15.1.
  • the separation columns 12.1 and 12.2 of the separation column battery are equilibrated via the pump 2.2, the 6-way 2-position valves 3.1 and 3.6 as well as a detector 14.2 and fraction collector 15.2.
  • the separation columns 13.1 and 13.2 are equilibrated in parallel via the pump 2.3, the 6-way 2-position valve 3.7 and the 3-way 2-position valve 5.7 as well as a detector 14.3 and a fraction collector 15.3.
  • the mobile phase is guided to the collecting column battery 7 via the pump 2.1 of the pump unit 2 and the 6-way 2-position valves 3.1 and 3.5.
  • the first eluted fraction from the collecting column battery 7 (e.g. from collecting column 7.1) is conducted via the 6-way 2-position valve 3.5 to the separating column battery 11.
  • the separated components are then led to the detector 14.1 via the 6-way 2-position valves 3.5 and 3.4.
  • the software in the electronic control unit evaluates the signals with the aid of peak detection and directs the separated components into the corresponding vials of the fraction collector 15.1. At the same time, time control of the fraction collector 15.1 is also possible. This timing can be activated automatically if no peak passes the detector.
  • the mobile phase is conveyed to the collecting column battery 8 via the pump 2.2 and the 6-way 2-position valves 3.1 and 3.6.
  • the first eluted fraction from the collecting column battery 8 (e.g. from the collecting column 8.1) is conducted to the separating column battery 12 via the 6-way, 2-position valve 3.6.
  • one of the separating columns 12.1 or 12.2 can be switched on under software control.
  • the separated components are led to the detector 14.2.
  • the software evaluates the signals with the help of peak detection and then directs the separated components into the corresponding vials of the fraction collector 15.2.
  • This fraction collector 15.2 can also be time-controlled. This timing can be activated automatically if no peak passes the detector.
  • the third dividing line is activated with regard to the initiation of the separating step.
  • the mobile phase via pump 2.3 as well as the 3-way 2-position valve 5.7 and the 6-way 2-position valve 3.7 are used Collecting column battery 9 promoted.
  • the first eluted fraction from the collecting column battery 9 (e.g. from the collecting column 9.1) is led to the separating column battery 13 via the valve 3.7.
  • one of the separation columns 13.1 or 13.2 can be switched on using software control.
  • the separated components are led to the detector 14.3.
  • the subsequent fraction collector 15.3 is controlled as already described.
  • the separation column batteries 11, 12 and 13 are again equilibrated to prepare and separate the next fractions (cf.
  • FIG. 7 shows the equilibration of the collecting columns 7.1 to 7.6 of the collecting column battery 7.
  • the collecting columns 7.1 to 7.6 are rinsed with water and thus prepared for the next run. This is done sequentially via the pump 2.2, the 6-way 2-position valves 3.1, 3.5, 3.6, 3.7 and the 7-way 6-position valves 4.3 / 4.4 of the collecting column battery 7.
  • the equilibration of the collecting column batteries 8 and 9 is done analogously.
  • the 6-way 2-position valves 3.5 and 3.6 are switched and the 6-way 2-position valves 3.1, 3.5, 3.6, 3.7 and the 7-way 6-position valves 4.5 / 4.6 of the pump 2.2 Catchment Column battery 8, the collecting columns 8.1 to 8.6 are equilibrated.
  • the 6-way 2-position valves 3.6 and 3.7 are switched and via pump 2.2 the 6-way 2-position valves 3.1, 3.5, 3.6, 3.7 and the 7-way 6-position valves 4.7 / 4.8 the collecting column battery 9, the collecting columns 9.1 to 9.6 are equilibrated.
  • the 7-way 6-position valves 4.1 / 4.2 of the charging battery 6 are switched to the next charging column (e.g. 6.2) and the entire program sequence starts again.
  • chromatograms, retention data and spectra are collected via detectors 14.1, 14.2 and 14.3, processed directly in a computer and compared with the data of known substances. In this way, substances already known online can be identified and sorted out. In case of doubt, additional data that is obtained offline after separation and isolation can be used for identification.
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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen flüssigchromatographischen Trennung von Substanzgemischen und Identifizierung von Substanzen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur flüssichromatographischen Trennung, Isolierung und Identifizierung von Substanzen im analytischen und semipräparativen Bereich anzubieten, mit denen sich ein Test auf Wirkung von Substanzgemischen erübrigt und es schneller als bisher möglich ist, Substanzgemische aufzutrennen, die Einzelsubstanzen zu isolieren und zu identifizieren. Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit einem Verfahren und einer Vorrichtung, bei denen Substanzgemische in einer softwaregesteuerten schnellen flüssigchromatographischen Zweistufentrennung in der ersten Stufe vorgetrennt und in der zweiten Stufe die vorgetrennten und in Auffangsäulen abgelegten Fraktionen in mindestens zwei Trennlinien parallel fein aufgetrennt, die fein aufgetrennten Fraktionen parallel idenfiziert und parallel isoliert werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur schnellen flussigchromatographischen Trennung von Substanzgemischen und Identifizierung von Substanzen
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen flüssigchromato-graphischen Trennung von Substanzgemischen und Identifizierung von Substanzen gemäß den Oberbegriffen der Ansprüche 1 und 5.
Beispielsweise steht in der pharmazeutischen Forschung häufig das Problem aus Substanzgemischen pharmazeutisch aktive Stoffe zu isolieren. So werden Naturstoffextrakte oder auch durch kombinatorische Chemie erzeugte Substanzgemische auf eine mögliche Wirksamkeit getestet. Aus Substanzgemischen die eine Wirksamkeit gezeigt haben, wird dann versucht die wirksamen Substanzen mit Hilfe von aufwendigen Trennverfahren zu isolieren. Danach werden die so isolierten Einzelsubstanzen des Gemisches einem erneuten Wirkungstest unterzogen. Die nun gefundenen wirksamen Einzelsubstanzen werden auf ihre Struktur hin untersucht, um möglicherweise bereits bekannte Wirkstoffe auszuschließen. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß bei dem Test der Substanzgemische durch Überlagerungseffekte die Wirksamkeit von Einzelsubstanzen unterdrückt werden kann und diese so unerkannt bleiben. Ein weiterer Nachteil ist, daß durch Überlagerungseffekte eine Wirksamkeit vorgetäuscht werden kann und anschließend kostenintensiv vergeblich nach diesen vermeintlichen Wirkstoffen im Substanzgemisch gesucht wird. Schließlich erfolgt nachteiligerweise der Ausschluß bereits bekannter Substanzen erst nach der Durchführung von mindestens zwei Tests auf biologische Wirksamkeit und nach aufwendigen Isolationsverfahren, was sehr kostspielig ist. Zur Durchführung dieser Tests sind in der Regel große Substanzmengen nötig, d. h., daß Trennungen im präparativen Maßstab zu erfolgen haben. Präparative Anlagen sind aber von den Investitionskosten her teurer als analytische Anlagen. Ebenso verbrauchen präparative Anlagen zur Trennung erheblich mehr Lösungsmittel und Puffersubstanzen, was ihren Betrieb teuer macht und zusätzlich größere Entsorgungsprobleme und Umweltbelastungen hervorruft.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur flüssig- chromatographischen Trennung, Isolierung und Identifizierung von Substanzen im analytischen und semipräparativen Bereich anzubieten, mit denen sich ein Test auf Wirkung von Substanzgemischen erübrigt und es schneller als bisher möglich ist Substanzgemische aufzutrennen, die Einzelsubstanzen zu isolieren und zu identifizieren.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit den kennzeichnenden Teilen der Ansprüche 1 und 5.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben. Die Erfindung weist verschiedene Vorteile auf. Die Substanzen müssen nicht mehr doppelt, nämlich vorher im Substanzgemisch und nach der Isolierung getestet werden. Erfindungsgemäß kann der aufwendige und kostspielige und zum Teil fehlerbehaftete erste Wirkungstest der Substanzgemische entfallen. Statt dessen werden nach der kombinierten Isolierung und Identifikation nur potentiell neue Wirksubstanzen weiteren Tests unterzogen. Die bisher übliche kostspielige Bearbeitung bereits bekannter Substanzen entfällt. Der Zeit- und Kostenaufwand für die Ermittlung einer neuen Wirksubstanz kann erheblich reduziert werden. Zusätzlich ist diese Verfahrensweise sicherer, denn die Testergebnisse an unbekannten Einzelsubstanzen sind eindeutig und alle im Gemisch vorhandenen Wirksubstanzen werden auch erfaßt.
Die zu untersuchenden Substanzgemische werden in einer zweistufigen Trennung bearbeitet, dabei können durch die erfindungsgemäße Verschaltung von Trennsäulen und Festphasenextraktionssäulen (Auffangsäulen) mit der Pumpeneinheit in der zweiten chromatographischen Trennstufe mehrere Fraktionen aus dem ersten Trennungsschritt parallel getrennt werden. Somit arbeitet diese Vorrichtung erheblich schneller und damit kostengünstiger als bekannte zweistufige Vorrichtungen.
Die Identifikation der Einzelsubstanzen erfolgt durch an sich bekannten direkten computergesteuerten Vergleich der von Detektoren gewonnenen Chromatogrammen und Spektren sowie des Retentions- bereiches aus dem ersten Trennschritt und der Retentionszeit aus dem zweiten Trennschritt mit Informationen über bekannte Substanzen in einer Datenbank. Als Detektions- und Identifikationsprinzipien sind Ultraviolett-Absorption, Massen- spektrometrie, Lichtstreuung, Fluoreszenz, Infrarotspektroskopie und Kernspinresonanz- spektroskopie möglich. Die Einbeziehung weiterer Identifizierungsparameter wie z. B. Quelle und Herkunft der Probe ist möglich. Da weniger Tests zur Identifizierung der Substanzen im Gemisch und zum Ausschluß bereits bekannter Substanzen notwendig sind, kann diese Anlage im analytischen und semipräparativen Maßstab dimensioniert sein. Analytische und semipräparative Anlagen sind in der Anschaffung und im Betrieb wesentlich kostengünstiger als die bisher üblichen präparativen Anlagen. Durch den geringeren Lösungsmittel- und Puffersubstanzenverbrauch ist das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung aufgrund geringerer Abfallmengen umweltfreundlich.
Die Erfindung wird anhand einer Zeichnung und eines Ausführungsbeispieles näher erläutert.
Es zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Ablaufes des Equilibrierens im ersten Trennschritt und Spülen der Aufgabesäulenbatterie,
Fig. 2 eine schematische Darstellung des Auf- trennens eines Substanzgemisches im ersten Trennschritt und Adsorption von Fraktionen an der ersten Auffangsäulenbatterie, Fig. 3 eine schematische Darstellung des Auf- trennens eines Substanzgemisches im ersten Trennschritt und Adsorption von Fraktionen an der zweiten Auffangsäulenbatterie,
Fig. 4 eine schematische Darstellung des Auf- trennens eines Substanzgemisches im ersten Trennschritt und Adsorption von Fraktionen an der dritten Auffangsäulenbatterie,
Fig. 5 eine schematische Darstellung der Equili- brierung der Trennsäulenbatterien des zweiten Trennschrittes,
Fig. 6 eine schematische Darstellung einer parallelen Trennung absorbierter Fraktionen im zweiten Trennschritt und
Fig. 7 eine schematische Darstellung des Equili- brierens einer Auffangsäulenbatterie.
Fig. 1 bis Fig. 7 zeigen beispielhaft den Aufbau und das Ablaufschema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Trennsäule und drei nachgeordneten Trennlinien.
Eine Pumpeneinheit 2, die aus drei Pumpen 2.1 bis 2.3 besteht, ist über die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1 und 3.3 sowie dem 3-Wege-2-Positions-Ventil 5.7 mit einer Aufgabesäulenbatterie 6, einer Trennsäule 10, für die erste Trennungsstufe und einer zweiten Trennstufe, die aus drei parallel betreibbaren Trennlinien besteht, denen jeweils ein 6-Wege-2- Positions-Ventil 3.5, 3.6 und 3.7 vorgeordnet ist, verbunden. Damit ist es möglich, die mobile Phase in jeder gewünschten Zusammensetzung nacheinander und parallel in alle Bereiche der Vorrichtung zu transportieren .
Jede Trennlinie weist eine Auffangsäulenbatterie 7, 8 und 9 und eine Trennsäulenbatterie 11, 12 und 13 auf. Beispielhaft enthält die Auffangsäulenbatterie 7 die Auffangsäulen 7.1 bis 7.6 und die Trennsäulenbatterie 11 die Trennsäulen 11.1 und 11.2. Die beiden weiteren dargestellten Trennlinien sind identisch aufgebaut. Andere Varianten mit mehr Aufgabesäulen 6.1 bis 6.6 der Aufgabesäulenbatterie 6, mehrerer Trennsäulen 10, mehr als drei Auffangsäulenbatterien 7, 8 und 9 mit jeweils mehr als sechs Auffangsäulen und mehr als drei Trennsäulenbatterien 11, 12 und 13 mit mehr als sechs Trennsäulen pro Batterie sind möglich.
Im folgenden wird der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens beispielhaft beschrieben. Substanzgemischproben werden jeweils in einem Lösungsmittel gelöst und mit einem Adsorbenten versetzt. Anschließend wird das Lösungsmittel mittels eines Rotationsverdampfers entfernt, damit die mit Probenmaterial belegten Adsorbenten rieselfähige Eigenschaften erreichen. Die mit dem Substanzgemisch belegten Adsorbenten werden in die Aufgabesäulen 6.1 bis 6.6 der Aufgabesäulenbatterie 6 verfüllt und in die Aufgabesäulenbatterie 6 eingebaut. Die nun folgenden Programmablaufschritte werden über eine Software gesteuert.
Gemäß Fig. 1 wird die Trennsäule 10 equilibriert . Parallel dazu wird die Luft aus der Aufgabesäulenbatterie 6 entfernt. Über die Pumpe 2.3, das 3-Wege-2-Positions-Ventil 5.7 und über die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1 und 3.3 wird mit Wasser die Luft aus einer der trocken verfüllten Aufgabesäulen 6.1 bis 6.6 entfernt, die als nächstes injiziert werden soll. Gleichzeitig wird über die Pumpe 2.1, die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1 und 3.3 die Trennsäule 10 mit einem geeigneten Laufmittel equilibriert .
In Fig. 2 ist das Auftrennen des Substanzgemisches in der ersten Trennstufe an der Trennsäule 10 und die anschließende Adsorption der Fraktionen in einer Trennlinie mit den Auffangsäulen 7.1 bis 7.6 der Auffangsäulenbatterie 7 dargestellt.
Wenn die Luft aus einer der Aufgabesäulen 6.1 bis 6.6 entfernt ist, wird das Trennprogramm gestartet. Zunächst werden die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.3 und 3.5 geschaltet. Über eine Niederdruckventileinheit 1 mit den Niederdruckventilen 1.1 bis 1.3 können die Bestandteile der mobilen Phase mittels der Pumpeneinheit 2 in das System eingegeben werden. Über das Niederdruckventil 1.1 der Pumpe 2.1 und die Pumpe 2.1 wird mobile Phase transportiert, wobei dieses System sowohl isokratisch als auch mit einem Gradienten gefahren werden kann. Über das 6-Wege-2-Positions-Ventil 3.3 und die 7-Wege-6- Positions-Ventile 4.1/4.2 wird die mobile Phase von Pumpe 2.1 auf diejenige Aufgabesäule 6.1 bis 6.6 geführt, von der Probenmaterial bearbeitet werden soll. Von einer der Aufgabesäulen 6.1 bis 6.6 wird die zu trennende Probe auf die Trennsäule 10 überführt. Die aus der Trennsäule 10 austretenden getrennten Probekomponenten gelangen über ein 6-Wege- 2-Positions-Ventil 3.4 und den Detektor 14.1 zu einem T-Stück 17, wo über die Pumpe 2.2 und das 6-Wege-2- Positions-Ventil 3.1 Wasser der mobilen Phase zugemischt wird. Die Menge des zugemischten Wassers richtet sich dabei nach der Polarität der zu trennenden Substanzen. Die durch Wasser erhöhte Polarität der mobilen Phase ermöglicht nun die Adsorption auf den Auffangsäulen 7.1 bis 7.6 der Auffangsäulenbatterie 7. Über das 6-Wege-2-Positions- Ventil 3.5 wird zunächst auf die Auffangsäulenbatterie 7 adsorbiert. Dabei werden nacheinander die Auffangsäulen 7.1 bis 7.6 mit Fraktionen belegt.
In Fig. 3 ist die Adsorption weiterer Fraktionen an den Auffangsäulen 8.1 bis 8.6 der Auffangsäulenbatterie 8 dargestellt. Wenn alle Auffangsäulen der Auffangsäulenbatterie 7 mit Fraktionen belegt sind, schalten die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.5 und 3.6 die Auffangsäulenbatterie 8 in den Eluentenstrom. Nun werden nacheinander die Auffangsäulen 8.1 bis 8.6 mit Fraktionen belegt.
In Fig. 4 ist die Adsorption von Fraktionen an die Auffangsäulen 9.1 bis 9.6 der Auffangsäulenbatterie 9 dargestellt. Wenn alle Auffangsäulen 8.1 bis 8.6 der Auffangsäulenbatterie 8 mit Fraktionen belegt sind, schalten die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.6 und 3.7 die Auffangsäulenbatterie 9 in den Eluentenstrom. Nun werden nacheinander die Auffangsäulen 9.1 bis 9.6 mit Fraktionen belegt. In dem folgenden Ablaufschritt werden parallel die an den drei Auffangsäulenbatterien 7, 8 und 9 adsorbierten Fraktionen eluiert und auf entsprechend zugeordnete Trennsäulenbatterien 11, 12 und 13 weiter aufgetrennt.
Vor jeder Trennung werden die Trennsäulenbatterien 11, 12 und 13 equilibriert . In Fig. 5 ist die Equilibrierung der Trennsäulenbatterien 11, 12 und 13 dargestellt. Zur Equilibrierung wird mobile Phase über die Pumpe 2.1 das 6-Wege-2-Positions-Ventil 3.1 und 3.5 auf die Trennsäulen 11.1 bzw. 11.2 der Trennsäulenbatterie 11 geführt. Von dort wird die mobile Phase über das 6-Wege-2-Positions-Ventil 3.4 den Detektor 14.1 und einem Fraktionssammler 15.1 in den Abfall geführt. Parallel dazu werden die Trennsäulen 12.1 und 12.2 der Trennsäulenbatterie über die Pumpe 2.2 die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1 und 3.6 sowie einen Detektor 14.2 und Fraktionssammler 15.2 equilibriert. Ebenso werden dazu parallel die Trennsäulen 13.1 und 13.2 über die Pumpe 2.3 das 6-Wege-2-Positions-Ventil 3.7 und das 3-Wege-2-Positions-Ventil 5.7 sowie einen Detektor 14.3 und einen Fraktionssammler 15.3 equilibriert.
In Fig.6 ist die parallele Trennung der an den Auffangsäulenbatterien 7, 8 und 9 adsorbierten Fraktionen auf den Trennsäulenbatterien 11, 12 und 13 dargestellt. Zur Einleitung des Trennschrittes wird mobile Phase über die Pumpe 2.1 der Pumpeneinheit 2 und die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1 und 3.5 auf die Auffangsäulenbatterie 7 geführt. Die erste eluierte Fraktion aus der Auf angsäulenbatterie 7 (z. B. von Auffangsäule 7.1) wird über das 6-Wege-2- Positions-Ventil 3.5 zur Trennsäulenbatterie 11 geleitet. Dort kann wahlweise softwaregesteuert eine der Trennsäulen 11.1 oder 11.2 zugeschaltet werden. Die getrennten Komponenten werden dann anschließend über die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.5 und 3.4 zum Detektor 14.1 geführt. Die Software in der elektronischen Steuereinheit wertet die Signale mit Hilfe von Peakerkennung aus und lenkt die getrennten Komponenten in die entsprechenden Vials des Fraktionssammlers 15.1. Gleichzeitig ist auch eine Zeitsteuerung des Fraktionssammlers 15.1 möglich. Diese Zeitsteuerung kann automatisch aktiviert werden, wenn kein Peak den Detektor passiert.
Parallel dazu wird mobile Phase über die Pumpe 2.2 und die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1 und 3.6 zur Auffangsäulenbatterie 8 gefördert. Die erste eluierte Fraktion aus der Auffangsäulenbatterie 8 (z. B. von der Auffangsäule 8.1) wird über das 6-Wege-2- Positions-Ventil 3.6 zur Trennsäulenbatterie 12 geleitet. Dort kann wahlweise softwaregesteuert eine der Trennsäulen 12.1 oder 12.2 zugeschaltet werden. Die getrennten Komponenten werden zum Detektor 14.2 geführt. Die Software wertet auch hier die Signale mit Hilfe von Peakerkennung aus und lenkt dann die getrennten Komponenten in die entsprechenden Vials des Fraktionssammlers 15.2. Auch dieser Fraktionssammler 15.2 kann zeitgesteuert werden. Diese Zeitsteuerung kann automatisch aktiviert werden, wenn kein Peak den Detektor passiert.
Parallel zu den Abläufen in zwei Trennlinien wird die dritte Trennlinie hinsichtlich der Einleitung des Trennungsschrittes aktiviert. Dazu wird die mobile Phase über Pumpe 2.3 sowie das 3-Wege-2-Positions- Ventil 5.7 und das 6-Wege-2-Positions-Ventil 3.7 zur Auffangsäulenbatterie 9 gefördert. Die erste eluierte Fraktion aus der Auffangsäulenbatterie 9 (z. B. von der Auffangsäule 9.1) wird über das Ventil 3.7 zur Trennsäulenbatterie 13 geleitet. Dort kann wahlweise softwaregesteuert eine der Trennsäulen 13.1 oder 13.2 zugeschaltet werden. Die getrennten Komponenten werden zum Detektor 14.3 geführt. Die Steuerung des sich anschließenden Fraktionssammlers 15.3 erfolgt wie bereits beschrieben. Nachdem die jeweils ersten Fraktionen parallel bearbeitet worden sind, erfolgt zur Vorbereitung und der Trennung der nächsten Fraktionen erneut Equilibrierung der Trennsäulenbatterien 11, 12 und 13 (vgl. Fig. 5). Anschließend schalten die 7-Wege-6-Positions-Ventile 4.3/4.4, 4.5/4.6 und 4.7/4.8 an den Auffangsäulenbatterien 7, 8 und 9 weiter, so daß nun die zweiten Fraktionen bearbeitet werden können, wie in Fig. 6 dargestellt. Diese Vorgänge setzen sich solange fort bis alle Fraktionen bearbeitet worden sind.
Fig. 7 stellt das Equilibrieren der Auffangsäulen 7.1 bis 7.6 der Auffangsäulenbatterie 7 dar. In diesem Programmablaufschritt werden die Auffangsäulen 7.1 bis 7.6 mit Wasser gespült und so für den nächsten Lauf vorbereitet. Dies erfolgt sequentiell über die Pumpe 2.2, die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1, 3.5, 3.6, 3.7 sowie die 7-Wege-6-Positions-Ventile 4.3/4.4 der Auffangsäulenbatterie 7. Das Equilibrieren der Auffangsäulenbatterien 8 und 9 erfolgt analog. Die 6- Wege-2-Positions-Ventile 3.5 und 3.6 werden geschaltet und über die Pumpe 2.2 die 6-Wege-2- Positions-Ventile 3.1, 3.5, 3.6, 3.7 sowie die 7- Wege-6-Positionsventile 4.5/4.6 der Auffang- Säulenbatterie 8 erfolgt das Equilibrieren der Auffangsäulen 8.1 bis 8.6. Anschließend werden die 6- Wege-2-Positions-Ventile 3.6 und 3.7 geschaltet und über die Pumpe 2.2 die 6-Wege-2-Positions-Ventile 3.1, 3.5, 3.6, 3.7 sowie die 7-Wege-6- Positionsventile 4.7/4.8 der Auffangsäulenbatterie 9 erfolgt das Equilibrieren der Auffangsäulen 9.1 bis 9.6. Nach diesem Programmablauf werden die 7-Wege-6- Positions-Ventile 4.1/4.2 der Aufgabebatterie 6 auf die nächste Aufgabesäule (z. B. 6.2) geschaltet und der gesamte Programmablauf beginnt von vorn.
(Ablaufschritt 1: Equilibrieren der Trennsäule 10 und
Entlüften der Aufgabesäule 6.2, dargestellt in Fig. 1 usw. )
Nach Bearbeitung dieser zweiten Probe kann die folgende Aufgabesäule 6.3 in den Eluentenstrom geschaltet werden. Da bereits abgearbeitete Probeaufgabesäulen jederzeit durch neue ersetzt werden können, ist ein kontinuierlicher Betrieb mit einer unbegrenzten Anzahl von Proben möglich.
Während des ersten und zweiten Trennschrittes werden über die Detektoren 14.1, 14.2 und 14.3 Chromatogramme, Retentionsdaten und Spektren gesammelt, direkt in einem Rechner verarbeitet und mit den Daten bekannter Substanzen verglichen. Somit lassen sich bereits online bekannte Substanzen identifizieren und aussortieren. Im Zweifelsfall können noch weitere Daten, die offline nach Trennung und Isolierung gewonnen werden, zur Identifikation herangezogen werden. Bezugszeichenliste
1 Niederdruckventileinheit
1.1 Niederdruckventil
1.2 Niederdruckventil
1.3 Niederdruckventil 2 Pumpeneinheit
2.1 Pumpe
2.2 Pumpe
2.3 Pumpe
3 6-Wege-2-Positions-Ventil 3.1 6-Wege-2-Positions-Ventil
3.3 6-Wege-2-Positions-Ventil
3.4 6-Wege-2-Positions-Ventil
3.5 6-Wege-2-Positions-Ventil
3.6 6-Wege-2-Positions-Ventil 3.7 6-Wege-2-Positions-Ventil
4 7-Wege-6-Positions-Ventil
4.1 7-Wege-6-Positions-Ventil
4.2 7-Wege-6-Positions-Ventil
4.3 7-Wege-6-Positions-Ventil 4.4 7-Wege-6-Positions-Ventil
4.5 7-Wege-6-Positions-Ventil
4.6 7-Wege-6-Positions-Ventil
4.7 7-Wege-6-Positions-Ventil
4.8 7-Wege-6-Positions-Ventil 5 3-Wege-2-Positions-Ventil
5.1 3-Wege-2-Positions-Ventil
5.2 3-Wege-2-Positions-Ventil
5.3 3-Wege-2-Positions-Ventil 5.4 3-Wege-2-Positions-Ventil
5.5 3-Wege-2-Positions-Ventil
5.6 3-Wege-2-Positions-Ventil
5.7 3-Wege-2-Positions-Ventil
6 Aufgabesäulenbatterie 5.1 Aufgabesäule
5.2 Aufgabesäule
5.3 Aufgabesäule
5.4 Aufgabesäule
5.5 Aufgabesäule 5.6 Aufgabesäule
7 Auffangsäulenbatterie
7.1 Auffangsäule
7.2 Auffangsäule
7.3 Auffangsäule 7.4 Auffangsäule
7.5 Auffangsäule
7.6 Auffangsäule
8 Auffangsäulenbatterie 8.1 Auffangsäule 8.2 Auffangsäule
8.3 Auffangsäule
8.4 Auffangsäule
8.5 Auffangsäule
8.6 Auffangsäule 9 Auffangsäulenbatterie
9.1 Auffangsäulen
9.1 Auffangsäulen
9.2 Auffangsäulen
9.3 Auffangsäulen 9.4 Auffangsäulen 9.5 Auffangsäulen
9.6 Auffangsäulen
10 Trennsäule
11 Trennsäulenbatterie 11.1 Trennsäule
11.2 Trennsäule
12 Trennsäulenbatterie
12.1 Trennsäule
12.2 Trennsäule 13 Trennsäulenbatterie
13.1 Trennsäule
13.2 Trennsäule
14 Detektoren 14.1 Detektor 14.2 Detektor
14.3 Detektor
15 Fraktionssammler
15.1 Fraktionssammler
15.2 Fraktionssammler 15.3 Fraktionssammler
16 Abfall
16.1 Abfall
16.2 Abfall
17 T-Stück

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur schnellen flussigchromatographischen Trennung und Identifizierung von Substanzen dadurch gekennzeichnet, daß Substanzgemische in einer softwaregesteuerten schnellen flussigchromatographischen Zweistufentrennung in der ersten Stufe vorgetrennt und in der zweiten Stufe die vorgetrennten und in Auffangsäulen abgelegten Fraktionen in mindestens zwei Trennlinien parallel fein aufgetrennt, die fein aufgetrennten Fraktionen parallel identifiziert und parallel isoliert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der ersten Trennstufe die Vortrennung von Substanzgemischen nacheinander und in der zweiten Stufe die Feintrennung nacheinander und/oder parallel erfolgt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Detektor (14.1) sowohl nach der ersten Trennstufe als auch nach der zweiten
Trennstufe genutzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Trennlinien aufgetrennten und isolierten Substanzen einer weiteren Reinigungsprozedur insbesondere einer adsorptiven Reinigung unterzogen werden.
5. Vorrichtung zur schnellen flüssigchromatischen Trennung und Identifikation von Substanzen bestehend aus mehreren Trenn- und Auffangsäulen sowie Aufgabesystemen Detektoren- und
Fraktionssammler, deren Zusammenwirken über eine zentrale Steuereinheit steuerbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer Trennsäule (10) mehrere parallele flüssigchromatographische Trennlinien, bestehend aus je einer Kombination von Trennsäulenbatterien (11, 12, 13) mit Auffangsäulenbatterien (7, 8, 9), Detektoreinheiten (14) und Fraktioniersammlereinheiten (15), nachgeordnet sind, daß eine Pumpeneinheit (2) bestehend aus drei Pumpen (2.1,
2.2, 2.3) zur Förderung der mobilen Phase sowohl mit der Trennsäule (10) als auch mit den Trennlinien funktioneil verbunden ist und daß softwaremäßig schaltbare Mehrwegeventile zwischen den einzelnen Funktionseinheiten angeordnet sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß vor jeder Trennlinie je ein Mehrwegeventil (3.5,
3.6, 3.7) angeordnet ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß den Trennlinien nachgeschaltet weitere Auffangsäulen angeordnet sind.
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