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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Anti-Keuchhusten- und
Anti-Diphtherie-Immunglobulinen ausgehend von Standardplasma, in
welchem eine Lösung
der Cohn-Fraktion II (erhalten aus Standardplasma) einer Affinitätschromatographie
unter besonderen Bedingungen unterzogen wird.
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Stand der Technik
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Es
ist bekannt, dass Standardimmunglobuline normalerweise aus Standardplasmalösungen erhalten
werden (d. h. Plasma, das von gesunden, nichtimmunisierten Spendern
erhalten wurde) durch einen Fraktionierungsprozess bei tiefer Temperatur mit
Alkohol (z. B. gemäß der Methode
nach Cohn) der Cohn-Fraktion II (Immunglobulin-angereicherte Plasmafraktion);
ausgehend von dieser Fraktion werden unter Verwendung von klassischen
oder chromatographischen Reinigungstechniken die gewünschten
Immunglobulinkonzentrate erhalten.
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Weiterhin
ist bekannt, dass, wenn spezifische Immunglobuline erwünscht sind,
es notwendig ist, um deren Trennung gemäß bekannter Techniken zu erreichen,
Hyperimmunplasma zu verwenden (d. h. Plasma, das von immunisierten
Spendern geliefert wird), angereichert mit dem gewünschten
Immunglobulin.
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Tatsächlich ist
es unmöglich,
spezifische Immunglobuline ausgehend von Standardplasma herzustellen,
da die spezifische Immunglobulinkonzentration in einem solchen Ausgangsprodukt
so gering ist, dass es praktisch unmöglich ist, Konzentrate mit einem
geeigneten Titer herzustellen.
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Die
Verwendung von Hyperimmunplasma führt zu definitiv höheren Kosten
verglichen mit Standardplasma; darüber hinaus ist die Immunisierung von
Spendern in bestimmten Ländern
nicht erlaubt, so dass der Import von Hyperimmunplasma aus dem Ausland
erforderlich wird, was die Kosten und praktischen Arbeitsgänge weiter
vermehrt.
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EP-764
658 beschreibt ein Verfahren zur Trennung von verschiedenen Immunglobulinen
ausgehend von Standardplasma und Anwendung von Affinitätschromatographie.
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Es
sollte berücksichtigt
werden, dass die Isolierung von spezifischem Immunglobulin aus Standardplasma
unter Verwendung der Affinitätschromatographie
die Überwindung
einer Vielzahl von Problemen erforderlich macht, insbesondere:
- a) Definieren der Mengen und der Bedingungen für die Haftung
des Antigens an dem Harz;
- b) Definieren der optimalen Haftungsbedingungen des gewünschten
Immunglobulins an den Harz-Antigen-Komplex;
- c) Definieren der optimalen Bedingungen für den Erhalt einer quantitativen
Freisetzung des gewünschten
Immunglobulins während
der Elution, zum Sammeln dieses Immunglobulins.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung macht es möglich, spezifische Immunglobuline
ausgehend von Standardplasma zu isolieren, indem ein Verfahren angewandt
wird, bei dem eine Lösung
von Cohn-Fraktion II, erhalten aus Standardplasma, einer Affinitätschromatographie
unter passenden Bedingungen unterzogen wird.
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Wie
oben erwähnt,
ist das Ausgangsprodukt für
das Verfahren, gemäß der Erfindung,
die Cohn-Fraktion II (erhalten gemäß bekannter Techniken). Affinitätschromatographie
wird auf Chromatographie-Säulen
ausgeführt,
in welchen die aktivierte Matrix (Harz) mit einem Antigen derivatisiert
wurde, welches das gewünschte
Immunglobulin erkennen und spezifisch daran binden kann.
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Gemäß der Erfindung
können,
zum Beispiel, chemisch stabile, aktive Acrylharze verwendet werden,
die eine Verknüpfung
mit ausreichender Stabilität
mit den zu isolierenden Immunglobulinen bilden können.
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Zum
Beispiel werden Harze verwendet, in welchen die reaktive Funktion
für die
Antigenhaftung durch eine Oxiran-Gruppe dargestellt wird, da diese elektroneutral
mit dem Liganden ohne Freisetzung von Nebenprodukt reagiert; ein
Beispiel für
diesen Harztyp, der für
den vorliegenden Prozess von Nutzen ist, ist Eupergit C (hergestellt
von Rhom Pharma) oder Agaroseharze, die mit einem hydrophilen Spacer
derivatisiert und terminal funktionalisiert wurden, als N-Hydroxysuccinimidester,
was, unter schonenden Bedingungen, eine schnelle und effiziente Kopplung
mit Antigenen ermöglicht,
die eine Amin-Gruppe enthalten, und so die Bildung von sehr stabilen
kovalenten Bindungen ermöglicht
mit Bezug auf: Denaturierungsmittel, Detergentien, Hitze, Lösungsmittel, Säuren und
Basen (pH-Bereich 2–11). Diese
Harze weisen auch ausgezeichnete mechanische Eigenschaften auf,
die erhöhte
Flüsse
ermöglichen
und daher insbesondere für
Reinigungsprozesse in großem
Maßstab
von Nutzen sind. Ein Beispiel für
diese Harzart ist Affi-Prep10® (hergestellt von Bio-Rad).
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Insbesondere
die Harze mit Oxiran-Gruppe haben sich bei der Isolierung von Diphtherie-Immunglobulinen
als bevorzugt erwiesen; während
Agaroseharze für
die Isolierung von Keuchhusten-Immunglobulinen bevorzugt sind.
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Es
ist jedoch auch offensichtlich, dass andere bekannte gleichartige
Harze gemäß der Erfindung eingesetzt
werden können.
Die oben genannten Harze werden so mit einem spezifischen Antigen
für das gewünschte Immunglobulin
derivatisiert; solche Antigene sind bekannt und die Harzderivatisierung
wird gemäß bekannter
Techniken ausgeführt.
Von besonderer Bedeutung ist die maximale Menge an Antigen, die
an den Harz pro Volumeneinheit gebunden werden kann, um eine maximale
Immunglobulinausbeute zu erhalten; daher entspricht eine solche
Menge nicht notwendigerweise der maximalen Menge an Antigen, die
theoretisch pro Volumeneinheit an das Harz gebunden werden kann.
Für Keuchhusten
liegt das Verhältnis
Antigen/Harz (ausgedrückt
als mg Antigen pro ml Harz) zwischen 0,8–3 (ideal 1,5); für Diphtherie
3–5,5
(ideal 4,8). Das Harz wird in eine Chromatographiesäure gepackt;
das Verhältnis
Säulenhöhe/Durchmesser
sollte Idealerweise zwischen 1:1 und 3:1 betragen; die Säule wird
anschließend mehrmals
mit einem Phosphatpuffer gewaschen (pH 7,4). Sie wird dann mit einer
gegebenen Geschwindigkeit mit der Lösung beladen, die durch Lösen der Cohn-Fraktion
II erhalten wurde, um die chromatographische Trennung durchzuführen.
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Die
Kontaktzeit zwischen derivatisiertem Harz und Lösung sollte etwa 14–18 Stunden
betragen.
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Die
Säule wird
dann mit einer Phosphatpufferlösung
mit annähernd
neutralem pH-Wert gewaschen (gewöhnlich
7,0–7,6),
um alle ungebundenen Proteine zu eliminieren, und anschließend folgt
die Elution mit einem eindeutig sauren Glycinpuffer (pH-Wert gewöhnlich 2,0–3,0).
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Der
Phosphatpuffer beträgt
gewöhnlich
0,1 M und enthält:
0,0031 M Kaliumdihydrogenphosphat und 0,0069 M Dikaliumhydrogenphosphat
(pH 7,2); der Glycinpuffer besteht aus: 0,3 M Glycin und HCl qs (pH
von 2,5).
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Wird
auf diese Weise verfahren, ist es möglich, dass vorher an dem Substrat
fixierte Immunglobuline auf eine praktisch quantitative Weise gewonnen
werden.
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Normalerweise
werden 12–16
Lagen für
das Waschen verwendet (vorzugsweise 14). Die Elution wird mit einer
Durchflussgeschwindigkeit zwischen 3,5 und 7,5 cm/h durchgeführt.
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Das
gesammelte Eluat wird anschließend sofort
mit einem Phosphatpuffer (pH 9) und 40 % Maltose neutralisiert.
Schließlich
wird das Produkt gegen eine geeignete Pufferlösung filtriert, eingeengt und
lyophilisiert, gemäß bekannter
Techniken. Einige Beispiele werden unten wiedergegeben, um einige Hinweise
auf das erfindungsgemäße Prozessverfahren
zu bieten.
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Beispiel 1
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Isolierung von Anti-Keuchhusten-Immunglobulinen
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Herstellung der Cohn-Fraktion
II
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Ein
Satz an gefrorenen Standardplasmabeuteln, äquivalent zu 2.000 Litern,
werden bei einer Temperatur von 2–3 °C aufgetaut und zentrifugiert.
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Das überstehende
Plasma wird auf einen pH-Wert von 5,8–5,9 mit einem Acetatpuffer
(bestehend aus: 21,7 g/l Natriumacetat-trihydrat und 48 ml/l Essigsäure) mit
pH 4 eingestellt und bei -18 °C
mit 96 %igem Ethylalkohol versetzt, sodass eine Endkonzentration
von 19 % erhalten wird, wobei eine Plasmatemperatur von -5 bis -7 °C aufrechterhalten
wird. Die gesamte Lösung
wird 6 Stunden bei -7 °C
gerührt und
zentrifugiert. Der Niederschlag (etwa 60 g/l), der als Cohn-Fraktion
I + II + III bezeichnet wird, wird gesammelt.
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Etwa
60 kg der Paste, welche die oben genannten Fraktion I + II + III
enthält,
werden in Wasser bei einer Temperatur von 4 °C in einem Verhältnis von
1 kg Niederschlag pro 5 1 Wasser suspendiert.
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Der
pH-Wert der Lösung
wird mit 1M Phosphatpuffer (pH 4) auf 4,8 eingestellt. Nach etwa
2 Stunden Kontaktzeit bei einer Temperatur von 2 °C–4 °C, wird die
Lösung
weiter mit Wasser bei 4 °C
verdünnt,
bis eine Konzentration von 15 l/kg Paste erhalten wird.
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Der
pH-Wert der Lösung
wird unter Rühren mit
Phosphatpuffer auf 5,05–5,1
eingestellt und mit 96 %igem Ethylalkohol auf eine Konzentration
von 17 % aufgefüllt.
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Nach
Kontakt unter Rühren
für mindestens
6 Stunden bei einer Temperatur von -1 °C wird die Lösung einer Zentrifugation unterzogen;
der Niederschlag besteht aus den Cohn-Fraktionen I + III.
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Der Überstand
wird einer „Deep
Layer"-Filtration
unterzogen und es wird NaCl (3 g/l) zugegeben, der pH-Wert mit NaOH
(0,3 N) auf 7,25 eingestellt, und 96 %iger Ethylalkohol wird bis
zu einer Konzentration von 15 % zugegeben. Die Lösung wird mindestens 6 Stunden
lang bei 7 °C
gerührt
und zentrifugiert. Der gesammelte Niederschlag (etwa 15 g/l Plasma)
ist die Cohn-Fraktion II, die mit Immunglobulinen angereichert ist
(die Ausbeute, berechnet nach dem Anfangsplasma, beträgt etwa
5 kg Immunglobuline pro 1.0001 Plasma).
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Herstellung von Standardbatches
an Cohn-Fraktion II
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4
kg der Fraktion II, die wie oben beschrieben erhalten wurde, werden
in einem Verhältnis
von 1:6 in Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,8) gelöst und für 0,45 μm filtriert.
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Diese
klare Lösung
wird bei einem konstanten Volumen mit einem Ultrafiltrationssystem
unter Verwendung von Membranen K 100 (100.000 NMW) gegen drei Volumina
Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,8) diafiltriert.
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Die
endgültige
Lösung
wird, eingestellt auf eine Konzentration von 50 g/l, unter sterilen
Bedingungen filtriert und dann in 20 Aliquots von jeweils 1.200
ml geteilt.
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Reinigung von spezifischen
Anti-Keuchhusten-Immunglobulinen unter Verwendung der Affinitätschromatographie
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a) Derivatisierung des
Harzes
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1.100
ml Affi-Prep10®,
hergestellt gemäß den Angaben
des Herstellers, werden zu 370 ml Keuchhustenanatoxin mit einer
Proteinkonzentration von 2,7 mg/ml gegeben. Die Mischung wurde 3
Stunden langsam bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht
bei 4 °C
stehengelassen.
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40
ml 1 M Glycinpuffer (pH 8) werden zugegeben und die Lösung wird
1 Stunde langsam bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird filtriert und
mit 5 Volumina 0,01 M Phosphatpuffer gewaschen, enthaltend 0,15
M NaCl (pH 7,4). Eine an den Waschlösungen der Harze ausgeführt Proteindosierung
ergab, dass 1 mg Protein pro 1 ml Harz gebunden wurde.
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Die
Anatoxin/Harz-Bindung wird durch Behandlung mit Glutaraldehyd stabilisiert.
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Ein
Puffer, der 0,1 M Phosphat, 0,5 M NaCl, 0,05 % Glutaraldehyd (pH
7,6) enthält,
wird zu dem mit Anatoxin derivatisiertem Harz gegeben. Es wird 2 Stunden
langsam bei Raumtemperatur gerührt
und dann werden zu der fertigen Lösung 0,02 M Glycinpuffer gegeben.
Das Harz wird anschließend
filtriert und mit 0,1 M Phosphatpuffer, der 0,02 M Glycin enthält, gewaschen.
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b) Affinitätschromatographie
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Das
derivatisierte und stabilisierte Harz (wie oben beschrieben) wird
in eine 11 cm × 11
cm (d/h) große
Säule gepackt.
Vor jeder Chromatographie wird die Säule behandelt mit:
- – 15
Lagen an Puffer T1 (für
das erste Waschen)
- – 7
Lagen Puffer T2 für
die Leerelution
- – 15
Lagen Puffer T1 für
die Konditionierung
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Puffer
T1 besteht aus:
0,01 M Phosphatpuffer
0,15 M NaCl
pH
7,4
Puffer T2 (Glycinpuffer) besteht aus:
0,3 M Glycin
HCl
qs (pH 2,5)
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Ein
Aliquot der Immunglobulin enthaltenden Lösung (hergestellt wie vorher
beschrieben) wird mit einer Geschwindigkeit von 0,8 cm/h geladen,
für eine Kontaktzeit
von 16 Stunden. Es wird mit 15 Lagen T1-Puffer gewaschen. Die Elution
wird mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6,7 cm/h mit Puffer T2
durchgeführt,
wobei die entsprechenden Lösungen
an den registrierten Elutionspeaks gesammelt werden. Das Eluat wird
gesammelt und der pH-Wert direkt mit 1M K2HPO4 (pH 9) und 40 % Maltose neutralisiert,
wobei eine Lösung
mit pH > 6 und 10
% Maltose erhalten wird.
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Die
Eluatlösung,
mit eine Ultrafiltrationssystem mit einem Membran-Cutoff 100.000
NMW gegen 5 Volumina an sterilem und pyrogenfreiem, destilliertem
Wasser diafiltriert, wird mit 22 g/l Glycin und 3 g/l NaCl versetzt,
wobei der pH-Wert bei 6,80,1 gehalten wird.
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Der
auf diese Weise durchgeführte
Chromatographieprozess ermöglicht
es, 6.000 – 6.500
UELISA/1 an Plasma zu gewinnen (etwa 40 % der Beladung).
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Beispiel 2
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Isolierung von Anti-Diphtherie-Immunglobulinen
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Die
Cohn-Fraktion II, die das Ausgangsprodukt darstellt, wird wie in
Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
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Reinigung von spezifischen
Anti-Diphtherie-Immunglobulinen unter Verwendung der Affinitätschromatographie
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a} Derivatisierung des
Harzes
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2
g Eupergit C werden direkt in 8 ml Diphtherieanatoxinlösung (CRM
197) mit einer Proteinkonzentration von 5,4 mg/ml expandiert und
mit einem Titer (Flockungsmittel/ml) von etwa 1.874 lf/ml. Das derivatisierte
Harz wird in eine 16 × 45
mm (d/h) große
Säule gepackt.
Es wird in der Säule
ein Gesamtvolumen von 9 ml Harz mit 4,8 mg Gesamtprotein/ml Harz,
gleich 1.667 lf/ml erhalten.
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b) Affinitätschromatographie
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Die
Säule wird
behandelt mit:
- – 7 Lagen Puffer T3 für das erste
Waschen
- – 7
Lagen Puffer T2 für
die Leerelution
- – 7
Lagen Puffer T3 für
die Konditionierung
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Die
Puffer T2 and T3 sind wie vorher beschrieben.
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Teile
der Probenaliquots (hergestellt wie vorher beschrieben), 28,5 mg
Gesamtproteine/ml Harz, werden mit einer Geschwindigkeit von 0,117
cm/h beladen, für
eine Kontaktzeit von 16 Stunden. Es wird mit 14 Lagen Puffer T1
gewaschen. Die Elution wird mit einer Durchflussgeschwindigkeit
von 7,5 cm/h mit Puffer T2 durchgeführt, wobei die entsprechenden Lösungen an
den registrierten Elutionspeaks gesammelt werden.
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Das
Eluat wird in Fraktionen von jeweils 6 ml gesammelt und direkt mit
2 ml 1 M K2HPO4 (pH
9) und 40 % Maltose neutralisiert, wobei eine Lösung mit pH > 6 und 10 % Maltose
erhalten wird. Die erhaltene Ausbeute beträgt 30 % der Beladung.
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Offensichtlich
können
die Isolierungsverfahren der verschiedenen Immunglobuline, die oben
getrennt beschrieben wurden, nacheinander ausgeführt werden, indem das Eluat
nach der Isolierung eines Immunglobulins in eine Säule und
zu den Bedingungen der Elution, die für das nächste Immunglobulin geeignet
sind, überführt wird
und so weiter.