ITFI970140A1 - Processo per la separazione di immunoglobuline specifiche da plasma standard e loro utilizzo per trattamenti terapeutici - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale avente per titolo:
" Processo per la separazione di immunoglobuline specifiche da plasma standard 'e loro utilizzo per trattamenti terapeutici"
Campo·dell'invenzione-La presente invenzione si riferisce ad un processo per la produzione di immunoglobuline. specifiche a partire da Plasma Standard in .cui una soluzione di frazione II di : Cohn (ottenuta da. Plasma Standard).è sottoposta a cromatografia di affinità in particolari condizioni.
Stato.dell'arte
E' noto che le immunoglobuline standard‘vengono normalmente ottenute da soluzioni di plasma' standard (cioè plasma ottenuto da 'donatori sani non immunizzati) attraverso un processo di frazionamento a freddo con alcool (ad esempio secondo il metodo di Cohn) della frazione II di Cohn (frazione di plasma arricchita in immunoglobuline) da cui , utilizzando tecniche di purificazione . classiche cromatografiche vengono preparati i concentrati di immunoglobuline voluti.
E' altresì· noto- che qualora si vogliano ottenere immunoglobuline specifiche'è necessario utilizzare, per la loro 'separazione secondo tecniche note, del plasma iperimmune (cioè plasma fornito :da ".-donatori immunizzati) arricchito nell'immunoglobulina.voluta.
E' infatti impossibile preparare immunoglobuline specifiche dal plasma ' standard in quanto la 'concentrazione di immunoglobulina specifica in detto prodotto di partenza è 'talmente'bassa da rendere impossibile la preparazione di concentrati a titolo idoneo.'
L'utilizzo di plasma iperimmune comporta tuttavia costi nettamente superiori rispetto al Plasma Standard ed inoltre in alcuni Paesi non è consentito immunizzare i donatori edè quindi necessario importare plasma iperimmune dall'estero con aggravio ulteriore dei costi e delle procedure.
D'altra parte per realizzare l'isolamento di immunoglobuline specifiche da un Plasma Standard per via cromatografica è necessario risolvere numerosi problemi,,in particolare:
a) definire- le quantità e le condizioni di attacco dell'·antigene alla .resina;
b) definire le condizioni ottimali per l'attacco della immunoglobulina voluta al'complesso resinà-antigene
c) definire le condizioni ottimali per ottenere il distacco quantitativo della immunoglobulina voluta al momento della eluizióne per la raccolta dell.'immunoglobulina stessa.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
La presente invenzione consente'di superare i problemi suddetti, e rende' quindi possibile l'isolamento di immunoglobuline specifiche a partire da plasma standard per mezzo di un processo in cui una soluzione della frazione II di Cohn, ottengta da plasma "standard, viene sottoposta a cromatografia di affinità in opportune condizioni.
Come detto sopra il prodotto di partenza per il processo secondo 'l'invenzione è la frazione II di Cohn ottenuta secondo metodologie note.
La cromatografia di affinità·'.è eseguita su colonne cromatografiche in cui la matrice’(resina) attivata è stata derivatizzata con un antigene capace dì riconoscere e di legare specificamente l'immunogiobulina voluta.
Secondo l'invenzione si possono utilizzare, ad esempio, resine attive di tipo acrilico·chimicamente stabili capaci di formare un legame sufficientemente--stabile con le immunoglobuline da isolare.
Si sono’ad.esempio utilizzate resine in cui la funzione reattiva per l'attacco dell'antigene è costituita .da un gruppo ossiranico in quanto esso reagisce con il ligando in maniera elettroneutrale e senza alcun rilascio di sottoprodotti; una resina,di questo tipo utile per il presente processo è ad esempio Eupergit C<R >(prodotta dalla Rhom Pharma) oppure resine di agarosio.derivatizzate con uno spaziatore idrofilico terminalmente funzionalizzato come N-idrossisuccinimmido estere che permette, in condizioni blande, un rapido ed efficiente coupling con antigeni contenenti un gruppo amminico.e consente quindi il formarsi di legami covalenti'molto stabili' rispetto a: denaturanti, detergenti, calore,,solventi, acidi e basi nel range di pH fra 2 e 11. Queste,resine possiedono inoltre ottime proprietà meccaniche che consentono flussi elevati e sono quindi particolarmente utili per processi di purificazione su larga scala. Un esempio di resina del tipo suddetto è Affi-Prep10<R >(prodotta dalla Bio-Rad).
In particolare le resine del.tipo a gruppi ossiranici si sono rivelate preferibili per l'isolamento dell'immunoglobuline del tetano e della difterite; mentre le resine agarosio sono preferite per l'isolamento dell'immunoglobulina della pertosse. E' ovvio tuttavia che altre resine analoghe note possono essere utilizzate secondo l'invenzione.
Le resine-suddette vengono quindi derivatizzate.con un antigene specifico per 1'immunoglobulina desiderata; detti antigeni sono noti e la derivatizzazione della resina viene compiuta con metodologie note.’
Particolarmente importante è,- -la. massima quantità di antigene che è possibile legare alla resina per unità di volume,in modo da avere la massima-resa in immunoglobuline, detta quantità -quindi non corrisponde necessariamente alla massima quantità di antigene -teoricamente legabile alla resina per unità di volume.
Nel caso della pertosse il 'rapporto antigene/resina (espresso come mg di antigene .per ml di resina) è compreso fra 0,8.- 3 (preferibilmente 1,.5 nel caso del tetano detto rapporto è 8 - 16 (preferibilmente'.Il ); nel caso della difterite il rapporto è di'3 - 5,5 ‘(preferibilmente 4,8).
La resina viene quindi impaccata in una colonna' per cromatografia; preferibilmente il.rapporto altezzà/diametro della colonna è compreso fra.1:1 e 3:1 ; la colonna è quindi lavata'ripetutamente con tampone fosfato (pH 7.4).·
La colonna viene quindi caricata, ad una velocità determinata, con la soluzione ottenuta per dissoluzióne della frazione II di Cohn per effettuare la separazione cromatografica.
E' preferibile che il tempo di contatto fra resina derivatizzata e soluzione sia di circa-14 - 18 ore.
La colonna ,viene quindi lavata con"una soluzione tampone fosfato ,a pH quasi neutro (compreso normalmente fra 7.0 e 7.6) in modo da eliminare'tutte le proteine che'non sono state legate e quindi si procede all'eluizione con un tampone glieina a pH nettamente acido (normalmente compreso fra 2.0 e 3.0).
Normalmente il tampone fosfato ha concentrazione 0.1 M ed è costituito da:·Potassio fosfato monobasico 0.0031 M e potassio fosfato bibasico 0.0069 M .(pH 7.2); mentre il tampone glieina è costituito "da': Glieina 0.3 M e HC1 quanto basta a pH 2.5.
Nel caso della immunoglobulina àhti-tetanica il tampone glieina vantaggiosamente contiene, anche diossano. 10% .in volume sul volume di glieina.
Operando in -queste condizioni è possibile recuperare in modo praticamente quantitativo le immunoglobuline precedentemente fissate al substrato
Per il lavaggio si utilizzano normalmente 12 - 16 letti di colonna (preferibilmente 14). :
L'eluizione è condotta con una velocità di flusso compresa fra 3,5 e 7,5 cm/h.
L'eluato raccolto viene quindi immediatamente neutralizzato con un tampone fosfato (pH 9) e maltosio 40%.
Infine il-prodotto viene diafiltrato contro una soluzione tampone idonea, concentrato e liofilizzato secondo tecniche note.
A scopo puramente indicativo .vengono,ora.riportati alcuni esempi specifici di realizzazione dèi processo secondo l'invenzione.
EsempioΊ
Isolamento di immunoglobuline anti-pertosse -Preparazione della frazione II di Cohn
Un pool di sacche di plasma Standard congelato, corrispondente a 2000 litri viene scongelato fino a una temperatura di 2 - 3°C e centrifugato.
Il plasma supernatante viene portato a pH 5.8 - 5.9 con tampone acetato pH 4 (costituito da: sodio acetato triidrato 21,7 g/1 e acido acetico 48 ml/1) e addizionato di alcool’etilico 96% a temperatura"-18°C fino ad ottenere una concentrazione finale del 19%.mantenendo la temperatura del plasma a--5 - -7°C.
Il tutto è lasciato .in .agitazione per 6 ore :alla temperatura di -7°C e centrifugato: Si raccoglie il precipitato.(circa 60 g/lt) denominato frazione I+ΙΙ+ΙΙΙ di. Cohn.
Circa 60 kg di pasta costituita dalla Frazione I+II+III suddetta vengono sospesi in acqua alla temperatura di 4°C nel rapporto di 1 kg di precipitato per 5 lt di acqua.
Il pH della soluzione è portato a 4.8 con tampone fosfato 1 M (pH 4).
Dopo contatto di circa 2 ore alla temperatura di 2° - 4°C la soluzione viene ulteriormente diluita con acqua a 4°C fino alla concentrazione di 15-litri/kg di pasta.
La soluzione sotto agitazione viene portata a pH 5,05 - 5,1 con tampone .fosfato e addizionata,di alcool etilico 96% fino ad ima concentrazione del -17%..
Dopo contatto sotto agitazione, per almeno 6 ore, alla temperatura di ,.-1°C la soluzione è sottoposta.,a centrifugazione; il precipitato è 'costituito dalle Frazioni I III di Cohn.
II supernatante è filtrato su strati di profondità ed addizionato di NaCl (3 g/1), portato a pH 7.25 con NaOH (0:3..N) ed addizionato di alcool,etilico 96% fino alla concentrazione del 15%. la sospensione viene lasciata in agitazione per almeno 6 ore a 7°C e centrifugata. Il precipitato raccolto (circa 15 g/1 di plasma) è la Frazione II di Cohn arricchita in immunoglobuline (la resa calcolata sul plasma iniziale è di circa 5 kg di immunoglobuline per 1000 1 di plasma).
Preparazione di lotti-di Frazione"!! di Cohn Standard 4 kg di'Frazione II ottenuta come sopra descritto, vengono solubilizzati in rapporto 1:6 in tampone sodio fosfato bibasico .0.1 M pH 6.8 e filtrati per 0.45 μπι.
La soluzione, così chiarificata, è diafiltrata, a volume costante, .su sistema di ultrafiltrazione utilizzando membrane K 100 (100.000 n.m.w.·) co»n.tro tre volumi .di tampone sodio fosfato bibasico 0.1 M pH 6.8.
La soluzione'finale,·portata alla concentrazione di 50 g/1 viene filtrata sterilmente e quindi aliquotata in 20 aliquote da 1200 mi ciascuna.
Purificazione tramite .cromatografia di . affinità delle immunoglobuline specifiche·anti'-pertosse
a) Derivatizzazione della resina
1100 mi di Affi-Prep 10 <R >preparati secondo le istruzioni allegate dalla casa madre, vengono addizionati-a 370 mi di soluzione di anatossina della pertosse alla concentrazione proteica di 2,7 mg/ml. La ·miscela viene lasciata sotto lenta agitazione per 3 ore a temperatura ambiente e quindi lasciata riposare per una notte'a 4°C.
Si aggiungono 40 ml di tamponò'glieina 1 M (pH8) e si lascia sotto' blanda agitazione per 1 ora a temperatura ambiente.
Si filtra la miscela e si lava con 5 volumi di tampone fosfato 0.01 M contenente NaCl .0.15 M pH 7.4. Dal dosaggio delle proteine, effettuato sulle soluzioni di lavaggio della resina risulta che si è legato 1 mg di proteina/ml di resina.
Si stabilizza il legame anatossina/resina per trattamento con glutaraldeide.
Si aggiunge alla resina derivatizzata con anatossina- un tampone- contenente fosfato 0.1 M, NaCl 0.5 M, glutaraldeide 0.05% (pH 7.6)'. Si, 'lascia sotto blanda agitazione per 2 ore a temperatura ambiente e quindi si aggiunge'tampone glicina 0.02 M nella soluzione finale. La resina viene lavata infine su filtro con tamponè fosfato 0.1 M contenente glicina 0.02 M.
b) Cromatografia di affinità
La resina derivatizzata e stabilizzata’come -suddetto viene impaccata in una colonna di dimensioni 11 x 11 cm (d/h). Prima di ogni cromatografia la colonna viene trattata con: - 15 letti di tampone TI (per il-lavàggio iniziale)'
- 7 letti di tampone T2 per la eluizione in bianco
- 15 letti..di tampone TI per il;condizionamento
Il tampone TI è costituito da-:
Tampone fosfato-0.01 M
NaCl 0.15 M .
pH 7.4 .'
Il tampone T2-(tampone-glicina) è costituito da:
Glicina -0.3 M
HC1 q.b. a pH 2.5
Un'aliquota,di soluzione contenente immunoglobuliria (come preparata precedentemente) viene caricata ad una velocità di 0.8 cm/h, per un tempo di contatto pari a 16 ore.
Si lava con 15 letti di tampone Tl.
Si eluisce al- flusso di 6.7 cm/h con tampone T2, raccogliendo le soluzioni corrispondenti al picco di eluizione registrato.'L'eluato viene- raccolto ed il.pH immediatamente neutralizzato con' K2HP04 1. M (pH 9) e maltosio 40% ottenendo soluzioni di pH > 6 èmaltosio 10%. La soluzione eluita, diafiltrata contro 5 volumi di acqua distillata sterile e apirogena su sistema diultrafiltrazione con membrana cut-off 100.000 n.m.w., viene addizionata con gliciria '22 ,g/1 e NaCl 3 g/1 mantenendo il pH a 6.8 ± 0.1.
Il processo cromatografico così 'operato consente un recupero-di 6.000 - 6.500 UELISA/1 di plasma (circa 40% del caricato);
Esempio 2
Isolamento di immunoglobuline ariti-tetano
La frazione II di Cohn che costituisce il prodotto di partenza-è preparata come descritto nell'Esempio 1.
Purificazione tramite cromatografia di affinità delle immunoglobuline specifiche anti-tetanoa) Derivatizzazione della resina
500;g di Eupergit CR vengono espansi dirèttamente in 3,51 di soluzione di anatossina tetanica a concentrazione proteica di 6.6 mg/ml e-con titolo in unità flocculanti/ml di circa 2.700 Lf/ml. La miscela viene lasciata a riposo a temperatura -ambiente'per 24 ore. quindi la resina è recuperata per filtrazione e ripetutamente lavata. La resina risulta derivatizzata con 11-·mg di proteine e con circa 4.700 Lf/ml di resina.
b) Cromatografia di affinità
Si è usata una colonna.di 11 'x 21 citi (d/h) contenente 21 di resina derivatizzata come precedentemente descritto. La colonna viene trattata con:.
- 7 letti di tampone TI per il lavaggio iniziale
- 7 letti di tampone T3.per la eluizione in bianco
- 7 letti di tampone TI per il condizionamento
Il tampone·T3 è costituito da:
glieina 0.3 M
HCl q.b. a pH 2.5
Diossano.10% (V/V)
Aliquote del campione come -precedentemente preparato vengono caricate, in ragione di circa 27 mg di proteina totaie/ml di resina, alla velocità di 0.7 cm/h, per un tempo di contatto pari a 16 ore.. ;
Si lava con 14 letti di tampone Tl.·
Si eluisce al flusso di 3.5 cm/h con tampone T2, raccogliendo le soluzioni corrispóndenti ,al 'picco di eluizione registrato.
l'eluato 'viene raccolto- ed il pH ..immediatamerite neutralizzato con K2HP04 1 M (pH -9) e maltosio 40% ottenendo soluzioni con pH >'6 alla concentrazione finale di maltosio 10%.
La soluzione eluita, diafiltrata contro 5 volumi di acqua distillata sterile e apirogena su sistema di ultra-filtrazione con membrana cut-off .100.000 n.m.w., opportunamente concentrata in modo da ottenere almeno 1000 UELISA/ml viene addizionata con glicina 22 g/1, NaCL 3 g/1 ed il pH'mantenuto a 6.8 ± 0.1.
Il processo cromatografico così operato consente un recupero di 3.000 - 3.700 UELISA/1 di plasma ,(circa'52% del caricato).
Esempio 3 :
Isolamento di immunoglobuline anti-difterite
La frazione·II di Cohn che costituisce il prodotto-di partenza è preparata come descritto nell'Esempio 1;
Purificazione tramite cromatografia di .affinità delle immunoglobuline specifiche antidifferite
a).Derivatizzazione della resina
2 g di Eupergit CR vengono espansi direttamente in 8 mi di soluzione di anatossina difterica' (CRM 197) ' a concentrazione proteica di 5.4 mg/ml e con titolo in'unitàflocculanti/ml di circa .1874 -Lf/ml..
La resina derivatizzata e lavata viene quindi impaccata in colonna 16 x 45 mm (d/h). Si'ottiene così un -volume di complessivi·9 mi di resina in.colonna con 4.8 mg di proteine totali/ml di resina pari a.1667 lf/ml.
b) Cromatografia di affinità'
La colonna viene trattata con:
- 7 letti di tampone T3 per il lavaggio iniziale
- 7 letti di tampone T2 per la eluizione in bianco
- 7 letti di tampone T3 per il/condizionamento I tamponi T2 e T3 sono come precedentemente descritti.' Porzioni di aliquota del campione --come precedentemente preparato vengono caricate in ragione di 28.5 mg di proteine totali/ml di resina alla velocità di 0.117 cm/h per un tempo-di contatto pari a 16 ore.
Si lava con 14 letti di tampone TI.
Si el-uisce al flusso di .7.5 cm/h con tampone T2 raccogliendo le -soluzioni corrispondènti al picco -di eluizione'registrato.
L'eluato viene raccolto in frazioni di 6 mi ciascuna ed immediatamente neutralizzato con 2 mi di K2HP041 M pH 9 e maltosio 40% ottenendo soluzioni di-:pH > 6 e maltosio 10%.' La resa ottenuta è del 30% del caricato.
Ovviamente i processi di. --isolamento -delle varie immunoglobuline sopra descritti ' separatamente possono essere eseguiti in sequenza trasferendo 1'eluato dopo l'isolamento di una immunoglobulina in una colonna e alle condizioni' .-di eluizione adatte per l'immunoglobulina successiva e così di seguito.
Claims (3)
- RIVENDICAZIONI'. 1. Processo' per. la separazione ' di immunoglobuline specifiche a partire da plasma standard' in cui una soluzione,di frazione II di Cohn, ottenuta da plasma standard, è sottoposta à cromatografia di affinità utilizzando un tampone fosfato,a-pH neutro come tampone di lavaggio ed un.tampone glieina a pH acido.come eluente per 1'immunoglobulina specifica.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui si utilizzano matrici attivate dérivatizzate con un antigene specifico pèr 1'immunoglobulina.-.voluta.-3. Processo secondo la rivendicazione 2 in cui la matrice derivatizzata è resina attiva di tipo acrilico o-una resina di agarosio. 4. Processo secondo la rivendicazione 3 in cui-la resina di tipo acrilico presenta un gruppo ossiranico come funzione attiva per l'attacco dell'antigene. 5. Processo secondo la rivendicazione-2 in cui il· rapporto antigene resina è compreso fra 0,8 e' 16 (mg antigene/ml resina). 6. Processo secondo la rivendicazione 5 in cui'il contattò fra resina derivatizzata e soluzione è di 14 -.18.ore. 7. Processo secondo, .la 'rivendicazione. 6 il. cui l'immunoglobulina specifica è eluita con un tampone a pH compreso fra 2.0 e 3.0. . 8. Processo -secondo la rivendicazione 1 ' in cui 1'immunoglobulina isolata è l'immunoglobulina antipertosse. 9. Processo secondo la -rivendicazione 8 in cui la resina utilizzata è una resina agarosio. 10. Processo secondo ìa-rivendicazione 9 in cui il rapporto antigene/resina è 0,8 - 3 (mg antigene/ml resina). 11. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui 1'immunoglobulina isolata e' 1'immunoglobulina antidifterite. 12'. Processo secondo la rivendicazione 11.in cui la resina utilizzata è una resina' acrilica attivata con gruppi ossiranici... 13. Processo secondo,la rivendicazione 12'i cui il rapporto antigene/resina è 3 -5,5 (mg èntigene/mi resina). 14. .Processo secondo la rivendicazione 1 in cui, 1'immunoglobulina isolata è 1'immunoglobulina anti-tetano. 15. Processo secondo al rivendicazione 14 in cui la resina utilizzata è' una resina acrilica attivata 'con .gruppi ossiranici. 16.· Processo secondo la rivendicazione 15 in cui il rapporto antigene/resina è .8 — 16 (mg antigene/ml resina). 17. Procèsso secondo le rivendicazioni 8, 11 e 14 i cui il tampone fosfato è costituito da: . 0,0031 M'potassio fosfato bibasico 0,0069'Μ potassio fosfato bibasico pH 7.2. 18. Processo secondo le rivendicazioni .8 e 1-1 in cui il tampone di eluizione è costituito da:· glieina 0.
- 3 M HC1 quanto basta a pH 2.5. 19. Processo -secondo la rivendicazione 14 in cui il tampone di eluizione è costituito da: glieina 0;.-3M HC1 quanto basta a pH 2.5 Diossano. 10% V/volume di glicina).. 20. Processo per la separazione, di immunoglobuline specifiche a partire;da plasma standard'in cui una frazione. Il di Cohn, ottenuta da .plasma standard, è processata cromatograficamente in più stadi eseguiti sequenza adattando -per ogni stadio le condizioni di colonna e di eluizione alla immunoglobulinà·' che.·si vuole separare nel relativo stadio.
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