DE3521679C2

DE3521679C2 -

Info

Publication number: DE3521679C2
Application number: DE3521679A
Authority: DE
Inventors: Hector Larkspur Calif. Us Juarez-Salinas; Gary Steven Livermore Calif. Us Ott
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1984-06-22
Filing date: 1985-06-18
Publication date: 1989-08-24
Also published as: US4704366A; JPH04234899A; JPH0543719B2; JPH0455440B2; DE3521679A1; GB2160530A; GB8515261D0; GB2160530B; JPS6112631A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Binden gemäß der Ansprüche 1 bis 5 bzw. zum Isolieren gemäß der Ansprüche 6 bis 9 von Immunoglobulin G-(IgG)-Molekülen. Diese Bindung bietet einen Bereich von Anwendungsmöglichkeiten bei immunologischen Verfahren, sowohl bei analytischen als auch präparativen Verfahren, und ist von besonderem Interesse bei der Reinigung von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, aus einer Ascites-Flüssigkeit.

Die Fähigkeit von Protein A, sich an den Fc-Abschnitt von IgG-Molekülen zu binden, wird in großem Umfange ausgenutzt als Basis für die Trennung von IgGs von anderen Proteinen durch Affinitätschromatographie. Bei diesen Trennungen wird das Protein A allgemein immobilisiert, indem man es an einen Festphasen-Träger, wie z. B. Agarose, bindet, und die Probe wird in Form einer Lösung in einem Puffer, der die Bindung anderer Proteine in dem Gemisch verhindert, aufgegeben. Die Immunoglobuline werden dann aus der festen Phase durch Eluieren unter Verwendung von Puffern mit einer geänderten Zusammensetzung gewonnen. Die dabei erzielte Trennung ist jedoch unvollständig.

Eine frühe Beschreibung der Bindung bestimmter Antikörper an Protein A findet sich bei Kronvall et al., "Journal of Immunology", 105 (5) : 1116 (1970). Ein Versuch, die Trennung zu verbessern, wurde von Mackenzie et al in "Journal of Immunology" 120 (5) : 1493 (1978), unternommen, bei dem ein kontinuierlich ansteigender NaSCN-Gradient bei niedrigem pH-Wert als Elutionspuffer in Verbindung mit einer Protein A-Sepharose 4B-Kolonne verwendet wurde. Die Bindung war gering für IgG₁ und IgG₂ und es fehlte, wie gefunden wurde, an der Reproduzierbarkeit.

Eine durch eine stufenweise Abnahme des pH-Wertes bei konstant niedriger Salzkonzentration charakterisierte Elutionssequenz wurde von Ey et al. in "Immunochemistry", 15 : 429 (1978), angewendet. Es wurde gefunden, daß eine beträchtliche Menge an IgG₁ in die nachfolgende Fraktion übergelaufen war und daß es auch hier an der Reproduzierbarkeit fehlte.

Chalon et al. in "Scand. Journal of Immunology", 9: 359 (1979), erzielten einen Teilerfolg in bezug auf die Trennung verschiedener IgGs von IgA und IgM durch Auflösen der Gemische in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung bei pH 7,3 und anschließende Einführung der Lösung in eine Kolonne, die Protein A-Sepharose 4B enthielt und mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Ohne Änderung des Puffers traten 2 peaks (Maximalwerte) auf, von denen der zweite nach dem Eluieren den größten Teil von IgG₁ enthielt. Die Ausbeuten variierten von 31 bis 73%.

Ferner wurden 16 verschiedene Eluierungsmittel für die Protein A-Sepharose 4B-Reinigung verschiedener IgGs von Bywater et al. in "Journal of Immunological Methods", 64: 1 (1983), untersucht. Bei keiner der untersuchten Proben wurde eine Verbesserung in bezug auf die Trennung oder Ausbeute gegenüber den älteren Verfahren festgestellt.

Aus den EP-A-00 16 552 und 00 79 221 ist die Verwendung von Protein A zur Isolierung gewisser Antikörper aus Antikörper- Mischpopulationen bzw. für die Entfernung von gewissen Plasmaspecies durch Perfusion bekannt. Aus keiner dieser Druckschriften ist jedoch die Verwendung eines anorganischen Salzes in einer bestimmten Mindestkonzentration bekannt.

Lindmark et al. in Journal of Immunological Methods, 62 (1983), 1-13 geben an, daß die Bindung von Immunoglobulinen an Protein A, das an Sepharose immobilisiert ist, durch den pH-Wert beeinflußt wird. Es ist jedoch nicht angegeben, daß eine Verbesserung durch Veränderung der Salzkonzentration erzielt werden kann.

Hurrell, in Immunological Methods, 62. Nr. 1 (1983), 51-52 gibt an, daß sich Protein A an Immunoglobulin G bindet. Auch in dieser Literaturstelle finden sich keine Hinweise auf eine mögliche Verbesserung durch Änderung der Salzkonzentration.

Lehninger in Biochemistry, (1970), 133-134 beschreibt die Löslichkeit von Proteinen im allgemeinen und wie diese durch verschiedene Faktoren, wie den pH-Wert und die Salzkonzentration, variiert werden kann. Es fehlen jedoch Angaben über die Stärke der Bindung von Proteinen an Immunoglobulinen.

Es wurde nun gefunden, daß die Bindungsaffinität von Protein A für IgGs im allgemeinen beträchtlich erhöht wird, wenn die Konzentration des inerten anorganischen Salzes mindestens 0,5 M beträgt. Die Erfindung betrifft somit Verfahren mit den Kennzeichnungsmerkmalen der Ansprüche 1, 5, 6 und 9. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erhöhung der Bindungsaffinität wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß man entweder das Protein A mit einer Salzlösung der ausgewählten Konzentration äquilibriert oder das Immunoglobulingemisch in einer solchen Lösung auflöst oder beides. Die ungewöhnlich feste Bindung, die dabei erhalten wird, ist besonders nützlich für die Abtrennung dieser Immunoglobuline von anderen Proteinen, z. B. solchen, wie sie normalerweise in einer Ascites-Flüssigkeit vorhanden sind.

Die vorliegende Erfindung ist ganz allgemein anwendbar auf IgGs, unabhängig von der Quelle, aus der sie stammen. Bevorzugte IgGs für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Maus-IgG₁, -IgG_2a und -IgG_2b. Die Proteine, von denen die interessierenden Spezies abgetrennt werden können, sind andere Immunoglobuline, wie z. B. IgM und IgE, und andere Proteine, wie z. B. Albumine. Die Bindungsaffinität dieser Proteine für Protein A ist bekanntlich viel geringer als diejenige von IgGs.

Es kann irgendein beliebiges, gegenüber den Immunoglobulinen, dem Protein A oder irgendeinem Träger, an den das Protein A gebunden ist, inertes anorganisches Salz, das in einem wäßrigen Medium löslich ist, verwendet werden. Beispiele sind Alkali- und Erdalkalimetallhalogenide und -sulfate. Positiv geladene Ionen, wie z. B. Ammoniumionen, können die Metallionen ersetzen. Die Salzkonzentration kann innerhalb des Bereiches von etwa 1,0 bis etwa 4,0 M, liegen. Der genaue pH-Wert der Lösung ist nicht kritisch und kann stark, d. h. in einem Bereich von etwa neutral bis zu schwach alkalisch variieren. Der pH-Wert kann somit größer als oder etwa gleich 7,0 sein, vorzugsweise etwa 8,5 bis etwa 9,5 betragen.

Das Salz wird vorzugsweise als Teil einer Pufferlösung verwendet, wobei der Puffereffekt erzeugt wird entweder durch das Salz selbst oder durch eine getrennte Komponente in dem Gemisch. Es können konventionelle Puffer verwendet werden, die in geeigneter Weise ausgewählt werden, um den gewünschten pH-Wert zu erzielen.

Für Immobilisierungszwecke wird das Protein A durch Verknüpfung (Vernetzung) an einen festen Träger, beispielsweise das Füllungsmaterial in einer Affinitätschromatographie-Kolonne, gebunden. Beispiele für feste Träger, an die das Protein A gebunden werden kann, umfassen Polyacrylamide, Cellulose und Agarose. Agarose wird im allgemeinen bevorzugt.

Wenn die Erfindung zur Verbesserung der Trennung in der Affinitätschromatographie angewendet wird, so wird die Kolonnenfüllung vorzugsweise durch wiederholtes Waschen mit einer eine hohe Salzkonzentration enthaltenden Pufferlösung äquilibriert, und auch das Probengemisch wird mit der gleichen Lösung verdünnt, bevor es auf die Kolonne aufgegeben wird. Die Verdünnung kann ebenfalls stark variieren, wobei Verdünnungen innerhalb des Bereiches von etwa 1 : 1 bis 1 : 20 bevorzugt sind. Wenn die Pufferlösung durch die Kolonne hindurchläuft, werden die nichtbindenden Proteine von der Pufferlösung mitgenommen, wodurch diese von den gebundenen Immunoglobulinen getrennt werden. Die Gewinnung der Immunoglobuline erfolgt dann durch Eluieren mit einem sauren Puffer, vorzugsweise mit einem pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 2,0 bis etwa 5,0, insbesondere von etwa 2,5 bis etwa 4,0.

Die Art der Kolonne ist nicht kritisch; so kann eine offene oder eine unter Druck stehende Kolonne verwendet werden. Die erfindungsgemäß auftretende feste Bindung erlaubt die Erzielung einer wirksamen Trennung durch Verwendung einer offenen Kolonne.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Zur Durchführung von Paralleltests wurde eine Reihe von bindenden Pufferlösungen hergestellt, z. B. eine mit einem Phosphat gepufferte Standard-Salzlösung (0,010 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,2). Die Trennkolonnen waren offene füllbare 1-ml-Kolonnen mit einem Durchmesser von etwa 1 cm und einer Höhe von 2 cm, die mit Affi-Gel®-Protein A gefüllt waren, bei dem es sich um ein gereinigtes Protein A, gekuppelt durch Amid-Bindungen an vernetzte Agarose-Perlen, handelte.

Für jeden Test wurde eine gefüllte Kolonne mit 5 Bettvolumina des bindenden Puffers in einer Strömungsrate von 0,5 ml/min äquilibriert. Aus Hybridomen, abgeleitet von SP2/O Myelom-Zellen (Knochenmarkszellen) und Milzzellen, die mit einem Gemisch von Humanerythrocyten der homozygoten Blutgruppen M und N immunisiert waren, wurde eine Probe einer Ascites-Flüssigkeit der Maus erhalten, die einen monoklonalen IgG₁-Antikörper (9A3) gegen Glycophorin A, einer Humanerythrocytenmembran, welche die M- und N-Blutgruppendeterminanten trägt, enthielt. Die Probe wurde im Verhältnis 1 : 10 mit dem bindenden Puffer verdünnt und in einem Volumen von 10 mg Gesamtprotein pro ml Affi-Gel®-Protein A auf die Kolonne aufgegeben. Dann wurde die Kolonne mit zehn Bettvolumina des bindenden Puffers gewaschen.

Die Immunoglobuline wurden anschließend aus der Kolonne mit drei Bettvolumina einer 1,0 M Natriumcitratlösung bei pH 3 eluiert und das Eluat wurde durch UV-Extinktion bei 280 nm analysiert. Der Prozentsatz der Gewinnung (entsprechend dem Prozentsatz der Bindung an das Agarose-Protein A) wurde bestimmt auf der Basis eines Extinktionskoeffizientenwertes von 1,4 Absorptionsmitteleinheiten pro mg/ml Immunoglobulin, ein Wert, der unter Anwendung eines Standardtests unter Verwendung einer überschüssigen Kolonnenfüllung zum Binden von Immunoglobulin bestimmt wurde, wobei eine 100%ige Bindung, bestätigt durch Gelfiltrationsanalyse des Ausgangseluats, erzielt wurde.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben, aus der hervorgeht, daß jeder untersuchte bindende Puffer eine Verbesserung gegenüber der mit einem Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS) ergab.

Bindungsfestigkeit von 9A3 (IgG₁) an Affi-Gel®-Protein A unter Verwendung verschiedener bindender Puffer
Bindender Puffer
% Bindung
1 M (NH₄)₂SO₄, pH 9,0
100
2 M Glycin, 1 M NaCl, pH 9,0	89
1 M (NH₄)₂SO₄, pH 8,5	84
1 M (NH₄)₂SO₄, pH 8,0	76
1 M (NH₄)₂SO₄, pH 7,0	71
0,5 M (NH₄)₂SO₄, pH 9,0	34
PBS, pH 8,2	16

Beispiel 2

Das Testverfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei diesmal jedoch ein einziger bindender Puffer in Verbindung mit einer Reihe von unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern des IgG-Typs verwendet wurde. Der bindende Puffer war 1 M (NH₄)₂SO₄ bei pH 9,0. Die Antikörper stammten alle aus SP2/O-Myelom-Zellen und sie bestanden aus: dem 9A3 des Beispiels 1; 10F7, einem IgG₁-Antikörper gegen Glycophorin A; DCMB, einem IgG₁ unbekannter Spezifität; HOPC-1, einem IgG_2a unbekannter Spezifität; und T4-1, einem IgG_2b unbekannter Spezifität. In jedem Falle wurde der Prozentsatz der Bindung verglichen mit demjenigen, der bei Verwendung der mit einem Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS) bei pH 8,2 erzielt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben, die eine eindeutige Verbesserung in jedem Falle zeigt.

Tabelle II

Bindungsfestigkeit verschiedener IgG-Antikörper an Affi-Gel®-Protein A

Claims

1. Verfahren zum Binden von Immunoglobulin G-Molekülen an Protein A in Gegenwart einer neutralen bis schwach alkalischen wäßrigen Lösung eines inerten anorganischen Salzes, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des inerten anorganischen Salzes mindestens 0,5 M beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung außerdem einen Puffer bei einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5 enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalihalogenid bzw. -sulfat darstellt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein A mit Agarose vernetzt ist.

5. Verfahren zum Binden von Immunoglobulin-Molekülen, ausgewählt aus der Gruppe Maus-IgG₁, -IgG_2a und -IgG_2b, an einen Komplex aus Protein A und Agarose, in Gegenwart einer neutralen bis schwach alkalischen wäßrigen Pufferlösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunoglobulin-Moleküle in einer ein Salz, ausgewählt aus der Gruppe Natriumchlorid und Ammoniumsulfat, in einer Konzentration von 1,0 bis 4,0 M enthaltenden Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5 mit Protein A in Kontakt gebracht werden.

6. Verfahren zum Isolieren von Immunoglobulin G-Molekülen aus einem Gemisch, das auch andere Proteine enthält, wobei (a) das Gemisch in Gegenwart einer neutralen bis schwach alkalischen wäßrigen Lösung eines inerten anorganischen Salzes durch eine Affinitätschromatographie-Kolonne mit einer festen Phase aus an einem festen Träger immobilisierten Protein A laufen gelassen wird, um die Immunoglobulin G-Moleküle selektiv an das Protein A zu binden und (b) die Immunoglobulin G-Moleküle von dem Protein A durch Hindurchlaufenlassen einer sauren Pufferlösung durch die Kolonne dissoziiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Salzlösung mit einer Konzentration von mindestens 0,5 M verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung außerdem einen Puffer mit einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5 enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der sauren Pufferlösung 2,5 bis 4,0 beträgt.

9. Verfahren zum Isolieren von monoklonalen Immunoglobulin G- Molekülen aus einer Ascites-Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) eine Affinitätschromatographie-Kolonne mit einer festen Phase aus einem an einen Agaroseträger gebundenen Protein A mit einer ein Salz, ausgewählt aus der Gruppe Natriumchlorid und Ammoniumsulfat, in einer Konzentration von 1,0 bis 4,0 M enthaltenden wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5 äquilibriert wird; (b) die Ascites-Flüssigkeit mit einer weiteren Menge der Pufferlösung unter Bildung einer Lösung, die auf 1 : 1 bis 1 : 20 verdünnt ist, kombiniert wird; (c) die verdünnte Lösung auf die feste Phase aufgebracht wird, um die Immunoglobulin G-Moleküle selektiv an das Protein A zu binden und den Rest der Ascites-Flüssigkeit hindurchlaufen zu lassen; (d) die Immunoglobulin G-Moleküle von dem Protein A durch Hindurchlaufenlassen einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4,0 durch die Kolonne dissoziiert werden; und (e) die Immunoglobulin G-Moleküle gewonnen werden.