DE3025078C2

DE3025078C2 -

Info

Publication number: DE3025078C2
Application number: DE3025078A
Authority: DE
Inventors: Timothy R. Kensington Calif. Us Zuffi
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-07-16
Filing date: 1980-07-02
Publication date: 1993-02-18
Also published as: DE3025078A1; JPS5616416A; JPH0133450B2; US4272521A

Description

Die Erfindung betrifft allgemein ein verbessertes Immunserumglobin (ISG)-Präparat, insbesondere ein ISG-Präparat, das im wesentlichen frei von vorhandener Prekallikrein-aktivierender Aktivität (PKA) und von PKA ist, die mit der Zeit aus einer speziellen PKA-Vorstufe gebildet wird.

Die Verabreichung von ISG an Patienten mit Agammaglobulinämie ist bekanntlich von großem klinischem Wert bei der Behandlung der Komplikationen von Infektionskrankheiten. Leider begrenzt der gegenwärtige Darreichungsweg durch intramuskuläre Injektion häufig ernsthaft die erreichbaren effektiven kreisenden Antikörperkonzentrationen. Darüber hinaus ist die direkte intravenöse Injektion großer ISG-Dosen häufig auf Grund unerwünschter vasomotorischer Reaktionen, die gelegentlich auftreten, nicht möglich. Der Ursprung dieser Reaktion wird gewöhnlich der Anwesenheit von IgG-Aggregaten, die Komplement binden und eine anaphylaktische Reaktion auslösen, zugeschrieben. Die mögliche Rolle der Kininsystemkomponenten wurde bisher nicht in Erwägung gezogen, obwohl auf die Anwesenheit von PKA in ISG hingewiesen worden ist.

In US 41 36 094 wird die Herstellung anderer Immunglobuline nach einem vielstufigen Verfahren beschrieben.

Bisher lagen keine Anzeichen dafür vor, daß irgendwelche speziellen PKA- Vorstufen zur PKA-Aktivität in im Handel erhältlichen ISG-Lösungen beitragen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sowohl existierende als auch potentielle PKA-Aktivität aus ISG-Lösungen durch Anwendung von Ionenaustauschkontakt entfernt werden kann, wobei sowohl existierende PKA-Aktivität als auch eine Kallikrein-aktivierbare Vorstufe zu PKA, deren Anwesenheit in solchen ISG-Lösungen bisher nicht bekannt war, entfernt werden. Einzelheiten des ISG-Reinigungsverfahrens und das hierbei gebildete Produkt werden nachstehend beschrieben.

Das gereinigte ISG-Präparat ist eine wäßrige ISG-Lösung, die sowohl von PKA als auch einer Kallikrein-aktivierbaren Vorstufe zu PKA, die als Faktor XII nachgewiesen worden ist, frei ist. Die Reinigungsmethode besteht darin, daß eine ISG-Lösung, von der angenommen wird, daß sie PKA und/oder Faktor XII enthält, mit einem Anionenaustauschmaterial unter Bedingungen, die genügen, um die Entfernung von im wesentlichen der gesamten PKA und des Faktors XII aus der ISG-Lösung zu gewährleisten, in Berührung gebracht wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen besteht das Reinigungsverfahren darin, daß die ISG-Lösung mit einem Anionenaustauscherharz (z. B. einer QAE- oder DEAE-Sephadex-Packung) unter Bedingungen, die genügen, um zu einer weniger als 1% der ursprünglichen Faktor-XII-Aktivität enthaltenden ISG-Lösung zu führen, in Berührung gebracht wird.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildung beschrieben. Diese Abbildung zeigt das DEAE- Sephadex-Chromatogramm einer frisch hergestellten Lösung von 5% ISG (Fraktion II, mit Aceton getrocknetes Pulver, in Puffer aus 0,05 TRIS, 0,05 NaCl, pH 8,1 gelöst) und veranschaulicht die jeweiligen Mengen von ISG (1) Faktor XII (2) und PKA-Aktivität (3), die unter den genannten Bedingungen abgetrennt wurden.

In der Abbildung sind die Nummern der Fraktionen des Chromatogramms (x-Achse) gegen die Unterschiede in der Absorption bei A₂₈₀ (erste y-Achse) bzw. die Aktivität von Faktor XII in mu/ml (zweite y-Achse) bzw. die direkte PKA-Aktivität in mu/ml (dritte y-Achse) bzw. die molare NaCl-Konzentration (vierte y-Achse) aufgetragen. Der Gradient der NaCl-Konzentration wird durch Kurve 4 dargestellt. Aus der Abbildung ist ersichtlich, daß die isolierte pre-PKA-Fraktion erhebliche Faktor XII-Aktivität aufweist, während sie gleichzeitig nur wenig PKA-Aktivität zeigt.

Den hier beschriebenen Feststellungen liegt die Untersuchung der verschiedensten ISG-Lösungen auf Anwesenheit von Kininkomponenten zu Grunde. Die Untersuchungen wurden durchgeführt, um diese Komponentenbeziehungen und die mögliche Bildung von vasoaktiven Stoffen zu verstehen.

Es wurde angenommen, daß die Identifizierung dieser Komponenten eine notwendige Voraussetzung dafür ist, eine Methode zu ihrer Entfernung und zur Herstellung einer ISG-Lösung, die frei von unerwünschten vasoaktiven Mitteln ist, zu finden.

Es war bekannt, daß ein signifikantes Maß von PKA-Aktivität gelegentlich in ISG-Lösungen beobachtet worden war. Die beobachtete Veränderlichkeit der Höhen der Aktivität und eine augenscheinliche Neigung zu erhöhter Aktivität nach Lagerung löste eine Untersuchung der Zeitabhängigkeit des Auftretens von PKA-Aktivität in frisch hergestellten ISG-Lösungen aus. Wenn die ISG-Lösung bei 37°C inkubiert wurde, zeigte sie eine allmählich zunehmende Höhe der PKA-Aktivität. Obwohl die Geschwindigkeit des Auftretens dieser Aktivität gering war, wurde festgestellt, daß sie über einen Zeitraum von mehreren Tagen bestehen blieb. Nach 7 Tagen bei 37°C zeigte sich ein mehr als 10facher Anstieg der Höhe dieser Aktivität.

Um zu ermitteln, ob dieses allmähliche Auftreten der PKA-Aktivität das Ergebnis einer allmählichen Aktivierung von Komponenten des Kininsystems über den Zeitraum der Untersuchung war, wurden die Wirkungen des Zusatzes von exogenen Enzymen untersucht. Die Ergebnisse der Inkubation von ISG-Lösungen zusammen mit PKA oder Kallikrein sind nachstehend in Tabelle I genannt.

In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bedeuten u/ml = Einheiten pro Milliliter und mu/ml = Millieinheiten pro Milliliter.

Tabelle I

Erzeugte PKA (mu/ml)

PKA ist wirkungslos in der Hervorbringung weiterer Bildung von PKA-Aktivität, jedoch beschleunigt Kallikrein drastisch das Auftreten von PKA. Diese hohe Geschwindigkeit der PKA-Erzeugung ist von der zugesetzten Kallikreinmenge abhängig, jedoch wurde in jedem Fall ein ähnlicher Grad der Aktivität erreicht. Ferner waren die endgültigen Höhen der PKA-Aktivität, die nach Inkubation mit Kallikrein ereicht wurden, mit der Höhe vergleichbar, die erreichbar ist, wenn ISG allein während einer viel längeren Zeit inkubiert wird. Diese Daten ließen darauf schließen, daß in ISG-Lösungen ein Vorrat ("pool") von PKA-Vorstufenmaterial vorhanden ist. Die Fähigkeit von Kallikrein, diese Vorstufe zu PKA zu aktivieren, ließ auf die mögliche Identität dieser Komponente mit dem auch als Hageman-Faktor bekannten Faktor XII schließen, und dies wurde versuchsweise bestätigt, indem die Höhen von Faktor XII und PKA vor und nach der Behandlung mit Kallikrein gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II genannt.

Tabelle II

Konzentrationen des Faktors XII (durch Gerinnungsbestimmung) und PKA-Konzentration der "Pre-PKA" enthaltenden vereinigten Fraktionen aus der Chromatographie der pulverförmigen Fraktion II an DEAE-Sephadex.

Die speziellen Materialien und Bestimmungsmethoden, die beim Reinigungsprozeß und zur Bestätigung der Anwesenheit des Faktors XII angewandt wurden, werden nachstehend beschrieben.

Materialien und Methoden

MES, Trizma®-Base (für die Herstellung von Tris-HCl verwendet), Benzoylargininärthylester von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, U.S.A.

p-Aminobenzamidin, ε-Aminocapronsäure, Dithiothreit und Jodacetamid von Aldrich Chem. Co., Milwaukee, Wisconsin.

DEAE-Sephadex, Concanavalin A-Sepharose, Sepharose CL-4B von Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey, U.S.A.

Plasma mit Faktor XII-Mangel von George King Laboratories, Overland Park, Kansas, U.S.A.

Thrombofax-Reagens (Rinderhirn-Cephalin) von Ortho Diagnostics, Inc., Raritan, New Jersey, U.S.A.

Das Prekallikrein(PK)-Substrat wurde hergestellt, indem frisch gewonnenes citriertes menschliches Plasma bei Raumtemperatur der weitgehenden Diafiltration gegen 0,05-molare Tris-HCl, pH 8,0, unterworfen und dann durch eine im gleichen Puffer äquilibrierte Säule von DEAE-Sephadex geleitet wurde. Die ungebundenen Fraktionen, die den größeren Teil der PK-Aktivität enthielten, wurden zusammengegossen und chargenweise mit Concanavalin A-Sepharos 2 Stunden bei Raumtemperatur adsorbiert. Die Concanavalin A-Sepharose wurde dann auf dem Büchnertrichter abgetrennt und mit Tris-Puffer gewaschen. Das gebundene PK wurde dann mit dem gleichen Puffer, der 0,2 M α-Methyl-D.glucosid enthielt, eluiert. Das durch diese Behandlung erhaltene PK-Substrat war im wesentlichen frei von Aktivierung, da nach 24 Stunden bei Raumtemperatur keine spontane Bildung von Kallikrein stattfand.

Prekallikrein-Aktivator (PKA)

PKA wurde aus der von Cutter Laboratories, Inc., Berkeley, California, bezogenen Cohn-Fraktion II hergestellt. Die pastenförmige frische Fraktion III wurde in 0,05-molarem Tris-HCl-Puffer bei pH 8,0 gelöst, und die Lösung wurde chargenweise an DEAE-Sephadex, das im gleichen Puffer äquilibriert war, adsorbiert. Das DEAE- Sephadex wurde auf einem Glasfrittentrichter entfernt und mit weiterem Ausgangspuffer und abschließend mit Ausgangspuffer, der 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen. Die mit dem 0,5 M NaCl enthaltenden Puffer erhaltenen, die PKA enthaltenden Waschflüssigkeiten wurden durch Ultrafiltration konzentriert und mit PBS-Puffer (0,05 M NaH₂PO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,5) durch Diafiltration ausgetauscht.

Benzamidin-EACA-Sepharose

Sepharose CL-4B (Pharmacia) wurde mit Cyanbromid bei pH 11,0 und Raumtemperatur aktiviert, und ε-Aminocapronsäure wurde über Nacht an das aktivierte Harz bei pH 9,5 gekuppelt. Nach gutem Waschen wurde der pH-Wert auf 5,6 eingestellt, und das Material wurde kurz vor der Zugabe von p-Aminobenzamidin mit Carbodiimid behandelt.

Kallikrein

Dieses Enzym wurde wie folgt hergestellt: Das gereinigte Prekallikreinpräparat wurde mit einer katalytischen Menge der konzentrierten PKA bei Raumtemperatur gemischt, worauf man die Umwandlung in Kallikrein bis zur Vollendung fortschreiten ließ. Dieses Gemisch wurde dann auf die in 0,05 Tris-HCl, pH 8,0, äquilibrierte Benzamidin-EACA- Sepharose-Säule aufgegeben. Nach kurzer Wäsche mit dem Puffer wurde mit linearem Arginingradienten gearbeitet. Die Kallikrein enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegossen, auf pH 6,0 eingestellt (mit 0,1 M MES-Puffer, pH 6,0, ausgetauscht) und durch Ultrafiltration auf 4,5 BAEE u/ml eingeengt. Die Ausbeute nach der Ultrafiltration betrug 93% und die spezifische Aktivität 16,8 BAEE-Einheiten pro A₂₈₀. Dieses Material wird als äußerst rein angegeben. Das SDS-PAGE des Präparats zeigte eine einzelne Bande vom Molekulargewicht 85.000.

Bestimmung auf PKA

Die Bestimmung auf PKA war eine gekoppelte Bestimmung, bei der das durch eine begrenzte Menge PKA aus Prekallikrein gebildete Kallikrein durch Anfangsgeschwindigkeitsbestimmung mit BAEE bestimmt wird. Das Prekallikrein-Substrat (50λ) und die auf PKA zu testende Probe (25λ) werden zusammen bei 37°C inkubiert. Nach 5 Minuten wird ein aliquoter Teil von 25λ abgenommen und mit 2 ml 0,05 mM BAEE in PBS-Puffer, pH 8,0, bei 37°C gemischt, und die Hydrolysengeschwindigkeit wurde kontinuierlich bei 253 mM in einem Spektrophotometer mit thermostatisiertem Küvettenhalter bei 37°C registriert.

Bei der Bestimmung wurde festgestellt, daß die Konzentration des Prekallikreinsubstrats so weit über dem K_m-Wert für das PKA-Enzym lag, daß die Geschwindigkeit der Umwandlung von Prekallikrein in Kallikrein von scheinbar (pseudo) erster Ordnung in Prekallikrein ist. Die Gleichung für die Berechnung der PKA-Konzentrationen

setzt somit eine Reaktionsgeschwindigkeit voraus, die der PK-Konzentration sowie der konstanten PKA-Konzentration proportional ist.

In dieser Gleichung ist "3" der Verdünnungsfaktor für die Probe im Inkubationsgemisch, t die Inkubationszeit, die konstant bei 5 Minuten gehalten wurde, K_t die nach der bestimmten Inkubationszeit gebildete Kallikreinmenge, d. h. die ΔA₂₅₃/Min., und PK_o ist die Ausgangskonzentration von Prekallikrein.

Diese Bestimmung ist empfindlich für PKA-Konzentrationen von 2 mu/ml und äußerst genau unterhalb eines Umsatzes von 60% PK in K.

Bestimmung der Pre-PKA-Aktivität (Faktor XII)

Die Bestimmung der Vorstufe von aktivem PKA erfolgt durch Inkubation von 0,9 ml Probe und 0,1 ml Kallikrein mit einer Konzentration von 4,5 BAEE-Einheiten/ml bei 37°C während einer genügenden Zeit, um vollständige Umwandlung in das aktive Enzym zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, daß etwa 400 Minuten die zulässige Mindestzeit sind. Nach dieser Inkubation wurden aliquote Teile von 25λ entnommen und der Bestimmung auf PKA in üblicher Weise unterworfen. Da nachweisbare Kallikrein-Aktivität in die Proben überführt wird, muß der gemessene ΔA₂₅₃-Wert durch Subtraktion dieses Hintergrundes korrigiert werden, bevor der PKA-Gehalt berechnet wird.

Faktor XII-Gerinnungstests

Der Faktor XII wurde auf seine Fähigkeit, die Gerinnungszeit von kongenital-defizientem Plasma zu korrigieren, in einem Fibrometer® unter Verwendung eines normalen gesammelten Plasmas als Kontrolle geprüft.

Beispiel Abtrennung von Pre-PKA aus der Immunglobulin fraktion von Immunserumglobulin

Eine 5%ige ISG-Lösung (200 ml) wurde an DEAE-Sephadex bei pH 8,1 in einem Puffer, der aus 0,05 M Tris-HCl und 0,05 M NaCl bestand, chromatographiert. Fraktionen von 7,5 ml wurden aufgefangen. Unter diesen Bedingungen wird der hauptsächliche Proteinpeak des Immunoglobulins nicht von der Säule zurückbehalten, wie die Abbildung zeigt. Ein Peak von Kallikrein-aktiviertem Pre-PKA wurde jedoch durch die Säule gebunden und in einem Salzgradienten in einer Gesamtkonzentration von 0,22 M NaCl eluiert. Es zeigte sich, daß diese Elutionseigenschaften den bereits für den Faktor XII genannten ähnlich waren.

Außerdem wurde auch ein Peak der PKA-Aktivität während des Salzgradienten eluiert. Diese Aktivität erwies sich als Salzkonzentration von 0,32 bis 0,34 M und war vom Peak des Pre-PKA-Materials gut getrennt. Die Bindung sowohl der PKA-Fraktion als auch der Pre-PKA-Fraktion an DEAE-Sephadex hatte absolut vollständige Entfernung dieser Aktivitäten vom ISG zur Folge. Dies wird durch die Abbildung und die nachstehende Tabelle III für ein frisch gelöstes ISG-Präparat deutlich gemacht. Eine Änderung der Reinheit der elektrophoretischen Wanderung von ISG als Folge der Chromatographie an DEAE-Sephadex wurde durch Immunelektrophorese gegen ganzes Antihumanserum nicht beobachtet.

Tabelle III

Relative Menge von Faktor XII und PKA in 5%igem ISG

Der Faktor XII oder "Pre-PKA" wurde durch Behandlung mit Kallikrein während einer zur vollständigen Aktivierung von PKA genügenden Zeit bestimmt.

Charakterisierung von Pre-PKA

Die durch Chromatographie an DEAE-Sephadex teilweise gereinigte Pre-PKA-Fraktion wurde als Faktor XII-Aktivität durch einen Gerinnungsversuch unter Verwendung von Plasma, dem der Faktor XII fehlte, getestet. Aus der Abbildung ist ersichtlich, daß die isolierte Pre-PKA-Fraktion erhebliche Faktor XII-Aktivität aufweist, während sie gleichzeitig nur wenig PKA-Aktivität zeigt. Die Identität des Pre-PKA mit Faktor XII wurde durch Immunelektrophorese gegen ein spezifisches Antiserum gegen Humanfaktor XII bestätigt.

Nach Inkubation des Faktors XII mit Kallikrein während einer genügend langen Zeit, um vollständige Aktivierung zu PKA sicherzustellen, wurde im wesentlichen keine Gerinnungsaktivität beobachtet. Die erreichte Höhe der PKA-Aktivität ist somit auf eine direkte Umwandlung des Faktors XII in PKA durch Kallikrein zurückzuführen. Dies stimmt mit der Aktivierungssequenz für das Kininsystem überein.

Wie vorstehend dargelegt, ermöglichte die Feststellung, daß sowohl PKA als auch der Faktor XII sich an DEAE- Sephadex bei pH 8,0 binden, die Abtrennung dieser beiden Aktivitäten von der größeren IgG-Fraktion von ISG. Dies hat die Herstellung von ISG zur Folge, das im wesentlichen frei von PKA-Aktivität und, was vielleicht noch wichtiger ist, frei von der Fähigkeit zur späteren Bildung von PKA aus dem Faktor XII ist. Es ist zu bemerken, daß auch andere bekannte Anionenaustauscherharze verwendet werden können (z. B. wurde mit QAE-Sephadex ähnliche Ergebnisse erhalten).

Die Anmelderin glaubt, daß das gereinigte ISG-Präparat gemäß der Erfindung sich für die intravenöse Verabreichung eignet, so daß die Notwendigkeit der chemischen Modifizierung von ISG für die intravenöse Anwendung ausgeschaltet wird.

Claims

1. Verfahren zur Entfernung des Faktors XII aus Immunserumglobulin präparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man das Präparat einer Anionenaustauscherchromatographie unterwirft, die man bei einer NaCl-Konzentration von weniger als etwa 0,2 M bei einem pH-Wert von etwa 8,1 durchführt.

2. Gereinigtes Immunserumglobulinpräparat hergestellt gemäß Anspruch 1, das im wesentlichen frei vom Faktor XII und Präkallikrein-aktivierender Aktivität (PKA) ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Faktors XII, gemessen als potentielle PKA, weniger als etwa 2 mu/ml beträgt.

3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge von PKA weniger als etwa 2 mu/ml beträgt.