DE4002044A1 - Thiophile adsorbentien - Google Patents

Thiophile adsorbentien

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DE4002044A1
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Bernard Nopper
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Yeda Research and Development Co Ltd
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Description

Die Erfindung betrifft neue Matrices auf der Basis von Siliciumdioxid, die ein thiophiles Adsorbens zur Ver­ wendung in einem HPLC-System und in jedem anderen System, bei dem ihre Charakteristika zur Reinigung von Proteinen und insbesondere von monoklonalen Antikörpern genutzt werden kann, sind.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung von solchen thiophilen Adsorbentien zur Verfügung gestellt.
Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Reini­ gung von Immunglobulinen und von monoklonalen Antikörpern zur Verfügung gestellt.
Die Reinigung von verschiedenen Proteinarten und insbe­ sondere von Immunglobulinen, bringt viele Probleme mit sich und das insbesondere dann, wenn ein sehr hoher Rein­ heitsgrad gefordert ist. Dies ist besonders schwerwiegend, wenn hochgereinigte Antikörper und insbesondere monoklona­ le Antikörper zur Verfügung gestellt werden müssen.
Monoklonale Antikörper (MAks) finden viele Anwendungen in der Biotechnologie. Dazu gehören Affinitätschromatographie, das sogenannte drug targeting, Inmundiagnostica, das soge­ nannt epitope mapping usw. Zu diesen Zwecken ist es nötig, gereinigte MAk-Präparate zu verwenden. Es war schwierig, MAks zur Homogenität zu reinigen. Die meisten Maushybridoma­ zellinien erzeugen MAks, die zur IgG1 Klasse gehören und die ziemlich schlecht an Protein-A-Sepharose binden. Übliche Reinigungsverfahren, wie z.B. Ionenaustauschchro­ matographie oder die Chromatographie an Hydroxylapatit erfordern Zeit und die gereinigten MAks sind oft mit Albumin und Transferrin verunreinigt.
Es werden neue Matrices auf der Basis von Siliciumdioxid zur Verfügung gestellt, die ein thiophiles Adsorbens zur Verwendung in einem HPLC-System und in jedem anderen System, in dem ihre Charakteristika zur Reinigung von Proteinen und insbesondere von monoklonalen Antikörpern verwendet werden können, sind.
Es wird ferner ein Verfahren zur Herstellung von solchen thiophilen Adsorbentien zur Verfügung gestellt.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Reinigung von Immunglobulinen und von monoklonalen Antikörpern zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein thiophiles Adsor­ bens zur Verwendung in der high performance liquid chro­ matography (HPLC) für eine einstufige Reinigung von Immun­ globulinen, MAks usw. Das thiophile Adsorbens eignet sich zur Reinigung von allen Unterklassen von IgG aus Mäusen oder Ratten. Die MAks werden in relativ kurzer Zeit (10 Minuten) gereinigt, und das Verfahren kann leicht auf einen präparativen Maßstab angewendet werden.
Die Herstellung der Siliciumdioxidkugeln als Adsorbens wurde in drei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde Siliciumdioxid (LiChrosorb Si 60 , LiChrosphere Si 300 oder Kieselgel 60) unter wasserfreien Bedingungen si­ lanisiert nach dem Verfahren von Larsson et al. (Larsson, P.O., Adv. Chromatogr. 21, 41-85 (1983) ). Das Harz wurde anschließend mit Toluol, Aceton und Diethylether gewa­ schen und vakuumgetrocknet. Die Anzahl der in das Harz eingeführten Epoxidgruppen wurde durch Titration bestimmt. In der zweiten Stufe wurden die Epoxidgruppen mit Natrium­ hydrogensulfid in 0,2 M 10 Tris-Puffer, pH 8,5 eine Stunde lang bei Raumtemperatur gespalten. Das Harz wurde an­ schließend mit Wasser, Methanol, Aceton und Diethylether gewaschen. Die Durchschnittszahl der Thiolgruppen be­ trug etwa 850 µmol/g trockenes Siliciumdioxid. In der dritten Stufe wurde das Siliciumdioxid eine Stunde mit einem großen Überschuß von Divinylsulfon (1,5 ml/g Sili­ ciumdioxid) in 0,2 M Tris-Puffer, pH 8,5 gerührt. Das mit Divinylsulfon aktivierte Siliciumdioxid wurde anschließend auf einem Sinterglastrichter mit Wasser, Aceton, Diethyl­ ether gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Die Menge der in dem Divinylsulfon aktivierten Silicium­ dioxid vorhandenen Doppelbindungen wurde durch 30minütiges Rühren von 100 mg in 5 ml 0,05 M Phosphat-Puffer, pH 7,5, der 250 mg Dithiothreit enthielt, bestimmt. Die Anzahl der auf dem Siliciumdioxid vorhandenen Thiolgruppen wurde bestinmt und die auf dem Siliciumdioxid vorhandene Ligan­ denkonzentration erwies sich als etwa 800 µMol Ligand pro Gramm trockenes Siliciumdioxid.
In der letzten Stufe der Herstellung des Harzes wurde das Divinylsulfon aktivierte Siliciumdioxid 45 Minuten lang mit einem großen Überschuß 2-Mercaptoethanol in dem glei­ chen Tris-Puffer wie oben beschrieben behandelt. Die Harze wurden anschließend mit Wasser, Aceton, Diethylether gewaschen, getrocknet und unter Vakuum gelagert.
Die Erfindung betrifft auch effektive Homologe davon.
Zwei verschiedene Matrices auf der Basis von Silicium­ dioxid wurden als thiophile Adsorbentien zur Verwendung in einem HPLC System entwickelt. Siliciumdioxid wurde so modifiziert, daß es entweder zwei Schwefelatome (im Text als 2S-Siliciumdioxid bezeichnet) oder drei Schwefel­ atome (im Text als 3S-Siliciumdioxid bezeichnet) enthielt. Der 2S-Siliciumdioxidadsorbent wurde durch Kopplung von 2-Mercaptoethanol an Divinylsulfon aktiviertes primäre Hydroxygruppen enthaltendes Siliciumdioxid hergestellt. Die allgemeine Struktur von 2S-Siliciumdioxid lautet:
-O-Si-(CH₂)₃-O-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-SO₂-(CH₂)-S-(CH₂)₂-OH
Wenn jedoch das 2S-Siliciumdioxid in dem HPLC-System ver­ wendet wurde, waren die eluierten Immunglobuline mit Albumin gemäß der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese verunreinigt. Um die adsorptiven Eigenschaften des thio­ philen Adsorbenten zu verbessern, wurden ein Harz auf der Basis von Siliciumdioxid mit 3 Schwefelatomen (3S-Silicium­ dioxid) hergestellt (Schema 1). Dementsprechend wurde si­ lanisiertes Epoxidgruppen-haltiges Siliciumdioxid mit einem 10fachen Überschuß an NaSH behandelt, um Thiolgruppen quantitativ einzuführen.
Das thiolhaltige Siliciumdioxid wurde anschließend durch Substitution mit Divinylsulfon weiter modifiziert. Das System wurde optimiert, indem man das Verschwinden von freien SH-Gruppen, und das Erscheinen von Doppelbindungen bestimmte.
Fig. 1 zeigt die Optimierung des Systems. Die Anzahl der in das thiolhaltige Siliciumdioxid eingeführten Doppel­ bindungen war maximal, wenn 1,5 ml Divinylsulfon pro Gramm Siliciumdioxid verwendet wurden. Diese Menge ent­ spricht gut der maximalen Zahl der Thiolgruppen oder der ursprünglichen Epoxidgruppen, die zur Substitution vor­ handen waren (etwa 800 µMol/g trockenes Siliciumdioxid). Im abschließenden Modifikationsschritt wurde 2-Mercapto­ ethanol eingeführt, bis Doppelbindungen nicht länger nachgewiesen werden konnten.
Das thiophile Adsorbens macht die Verwendung von anderen Mitteln zur Reinigung von Antikörpern fast überflüssig. Es wurde Siliciumdioxid, das primäre Hydroxylgruppen ent­ hielt, verwendet und durch analoge Reaktionen, die für Sepharose verwendet werden, in die thiophile Struktur, die 2-Siliciumdioxid genannt wurde, umgewandelt. Es wurde gefunden, daß dieses Adsorbens nur einen Teil der aufgetragenen Antikörper bindet und daß die eluierte Frak­ tion immer noch andere Proteine (z.B. Serumalbumin) ent­ hält, das unspezifisch bindet. Um die Effizienz des Ad­ sorbens zu erhöhen und mit dem Wissen um die Bedeutung der Schwefelgruppen, wurde eine weitere Thioetherbindung in den Siliciumdioxidträger eingeführt und zwar in glei­ cher Entfernung von der Schwefelgruppe, aber auf der an­ deren Seite. Zu diesem Zweck wurde ein einfaches Ver­ fahren zur Öffnung des Epoxyringes unter Verwendung von NaSH entwickelt. Diese Reaktion ermöglicht die Einführung einer Thiolgruppe in Siliciumdioxid, ohne den Spacer an den Siliciumdioxidkügelchen zu vergrößern, was bei Verwen­ dung eines Bis-Mercaptoethan- oder DTT-Reagens die Folge wäre (solche Spacer können nicht-spezifische Adsorptionen erhöhen).
Die Reaktion von NaSH mit der Epoxygruppe auf dem Silicium­ dioxid erwies sich als quantitativ und daher wurde eine große Menge Thiolgruppen in den Träger eingeführt. Eine große Menge Divinylsulfon kann unter milden Reaktionsbe­ dingungen eingeführt werden, um das Thiolsiliciumdioxid in den thiophilen Adsorbenten umzuwandeln (Reaktion von Divinylsulfon mit Hydroxylgruppen bei hohem pH und Tem­ peratur). Das in dieser Studie entwickelte 3S-Silicium­ dioxid (Schema 1) erwies sich als ausgezeichnetes Ad­ sorbens für die meisten erhältlichen Immunglobuline. Der Grund, weshalb der thiophile Träger eine solch hohe Spezifität für Antikörper besitzt und die Identität der Reste auf dem Antikörper, die für diese ungewöhnliche Wechselwirkung verantwortlich sind, müssen noch bestimmt werden. Mittels eines einfachen Systems der Adsorption und Elution kann dieser Träger als Universaladsorbens für Inmunglobuline dienen, da er eine breitere Spezifi­ tät als die, die für immobilisierte Formen von Protein A und G gefunden wurde, zeigt.
Diese Studie beschreibt die Reinigung von Immunglobulinen in einem HPLC-System in kleinem Maßstab (mg Mengen). Da die Reaktionen relativ einfach sind, die Materialien billig sind, kann dieses Verfahren leicht auf Reinigung von Antikörpern in großem Maßstab unter Verwendung von präparativer HPLC angepaßt werden.
Proteinbestimmung und Gelelektrophorese
Die Reinheit der durch HPLC getrennten Proteine wurde durch SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 10%igen Gels bestimmt. Aliquote (10 µg) der chromato­ graphischen Fraktionen wurden unter reduzierenden Be­ dingungen aufgebracht und die Elektrophorese wurde über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Proteine wurden durch Anfärbung mit Coomassiebrillantblau sichtbar gemacht.
HPLC-Chromatographie
Ein HPLC-Chromatographiesystem von Waters Associates (Mil­ ford, MA, USA, Modell 6000 A) und ein konstanter UV-Detek­ tor (Modell 441) mit einer Betriebswellenlänge von 280 nm und einem Injektor (Modell U 6K) wurden für die HPLC Chro­ matographie verwendet. Die Aufschlemmung von aktiviertem Siliciumdioxid in 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,4 wurde in rostfreie Stahlsäulen bei 103,4 bar (1500 p.s.i,) gepackt. Proben (100 µl bis 250 µl, Ascitesflüssigkeit, Kulturüberstand von Antikörper-sezenierenden Klonen oder Seren von ver­ schiedenen Spezies, wie z.B. Mensch, Maus, Ratte oder Pferd) wurden in einer mobilen Phase, die 0,5 M Na2SO4 und 0,05 M (NH4)2SO4 enthielt und auf pH 8,0 eingestellt war (Adsorptionspuffer), injiziert. Die Säule wurde mit Adsorptionspuffer gewaschen bis nicht-adsorbiertes Ma­ terial eluiert war. Die adsorbierten Immunglobuline wur­ den mit 0,1 M Citrat-Puffer (pH 3,0) eluiert. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Pro­ teinkonzentration in jeder Fraktion wurde anschließend bestimmt. Jede Fraktion wurde auf Antikörperaktivität mittels zeitauflösender Immunfluoreszenz und auf Reinheit mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getestet.
Bestimmung der Kapazität
Die Kapazität des thiophilen Siliciumdioxids wurde durch Mehrfachinjektionen bestimmt. Die Injektionen (250 µl Ascitesflüssigkeit) wurden wiederholt, bis die O.D. des Effluenten größer war als die der anfänglichen Auftragung. Der Antikörpergehalt wurde anschließend in den eluierten Peaks photometrisch (durch O.D.) gemessen.
Der 3S-Siliciumdioxidadsorbent bindet Immunglobuline des Menschen, des Pferds, der Ratte, des Kaninchens ebenso wie Mausascites mit den Unterklassen IgG1, IgG2a oder IgG2b (Tabelle 1). Die einzige Unterklasse, die schlecht adsorbiert wurde, war Maus IgM. Es scheint, daß die bi­ valente Struktur der Immunglobuline zur spezifischen oder selektiven Adsorption auf dem thiophilen Adsorbenten notwendig ist.
Im folgenden sind optimale Bedingungen zur Reinigung von monoklonalen Antikörpern gegen βhCG angegeben:
Monoklonale Antikörper gegen βhCG wurden verwendet, um die Bedingungen zur Reinigung von monoklonalen Antikör­ pern aus Mausascitesflüssigkeit unter Variation der pH Bedingungen und Salzkonzentrationen zu optimieren. Ta­ belle 2 zeigt die Antikörperaktivität von verschiedenen monoklonalen Antikörpern bei einer niedrigen Salzkonzen­ tration in der mobilen Phase (50 mM NaH2PO4 pH 8,0). Das SDS-Gel (Fig. 2) der entsprechenden Fraktionen zeigt, daß die eluierte Fraktion mit Albumin verunreinigt ist. Wenn der pH auf 7,0 abgesenkt wurde, ist die Wiederge­ winnung des Antikörpers von den modifizierten Silicium­ dioxidkügelchen sehr gering.
Die meiste Antikörperaktivität findet sich in dem her­ ausfließenden Peak (Tabelle 2). Das SDS-Gel zeigt auch eine unspezifische Adsorption von anderen Proteinen zu­ sätzlich zu den Immunglobulinen. Auf der anderen Seite wird, wenn in der mobilen Phase der pH bei 8,0 gehalten wird und die Salzkonzentration auf < 500 mM erhöht wird, der Antikörper völlig adsorbiert und kann mit Citrat­ puffer (pH 3,0) ohne signifikanten Aktivitätsverlust elu­ iert werden (Tabelle 2).
Dementsprechend wurden die folgenden Bedingungen für an­ schließende Untersuchungen gewählt: durchschnittlich wur­ den 100 bis 250 µl klare unverdünnte Ascitesflüssigkeit aus Mäusen verwendet. Die Säule wurde 2 Minuten mit Ad­ sorptionspuffer equilibriert. Die Proben wurden injiziert, anschließend wurde gewaschen, bis kein Protein mehr nach­ weisbar war (im allgemeinen 5 Minuten). Die Immunglobuline wurden anschließend mit Citratpuffer (pH 3,0) eluiert.
Fig. 3 zeigt das SDS Polyacryamidgel einer Gruppe von MAks (vergleiche auch Tabelle 1). Das Gel zeigt die Banden der schweren und leichten Ketten in den eluierten Frak­ tionen. Die gereinigten Fraktionen zeigen klar dominieren­ de Banden und die Verunreinigungen sind gering. Das Gel zeigte auch, daß verschiedene MAks, die sich von Ratten oder Mäusen ableiten, und verschiedene Unterklassen unter diesen Bedingungen gereinigt werden können.
Die Säule kann verwendet werden, um die Antikörper direkt aus Seren oder Ascitesflüssigkeit zu isolieren und um die Antikörper, die vorher durch andere Methoden ge­ reinigt wurden, zu verbessern, z.B. durch Protein-A Sepharose. Die Aktivität einer gereinigten IgG Fraktion eines polyklonalen anti-hCG Antikörpers aus Kaninchen, der in der zeitauflösenden Fluoreszens eine niedrige Aktivität besaß, wurde durch Passage durch die Silicium­ dioxidsäule erhöht (Fig. 4). Monoklonale anti-LH Anti­ körper aus Ratten (Klon 1F10), die nach üblichen Verfah­ ren schwierig zu reinigen sind, können leicht mittels des erfindungsgemäßen HPLC-Systems gereinigt werden, wie in diesem Fall Aktivitätsmessungen belegen (SDS-Gel nicht gezeigt). Ein Testosteron-3-BSA Antikörper (IgM) könnte auch teilweise gereinigt werden (Tabelle 2, ob­ wohl ein Teil der Aktivität in der eluierten Fraktion erschien).
Kapazität und Stabilität
Nach Entwicklung der optimalen Bedingungen für Adsorption und Elution der Antikörper wurde die Kapazität der Säule überprüft. Mittels Mehrfachinjektionen von Ascitesflüssig­ keit wurde gezeigt, daß sie nicht weniger als 20 mg/g be­ trug. Das LiChrosphere Si 300 mit einer Porengröße von 3000 nm und einer Teilchengröße von 10 µm wurde verwen­ det. Die 3S-Siliciumdioxidkügelchen sind sehr stabil. Nach 300 Läufen mit verschiedenen Proben konnte keine Verän­ derung in der Kapazität oder Selektivität beobachtet werden. Die Siliciumdioxidkügelchen konnten von den adsor­ bierten Proteinen durch Hydrolyse der letzteren mit star­ ker saurer 0,5 M HCl für 60 Minuten gereinigt werden. Sie konnten wieder ohne Veränderung des Verfahrens verwendet werden.
Legenden zu den Figuren
Es zeigen:
Fig. 1 die Bestimmung der Doppelbindungen an Divinylsulfon-modi­ fiziertem Siliciumdioxid. Thiolhaltiges Siliciumdioxid wurde mit ansteigenden Mengen Divinylsulfon umgesetzt und die Menge der eingeführten Doppelbindungen wurde, wie beschrieben, überprüft.
Fig. 2 eine Charakterisierung der Antikörperreinheit nach Auf­ bringung auf 3S-Siliciumdioxid bei pH 7,0 und niedriger Salzkonzentration. Proteinproben von 20 µg wurden der SDS-PAGE unterworfen (10%iges Gel, Proben nach Sieden, reduzierende Bedingungen). Bande 1: M.W. Marker; Bande 2: Ascitesflüssigkeit von anti βhCG (# B 5); Bande 3: Effluent von # B₅; Bande 4: Eluent von # B5; Bande 5: Effluent von anti-LH (# 1F10); Bande 6: Eluent von # 1F10. Pfeile zeigen die schwere und leichte Kette an.
Fig. 3 eine Charakterisierung der Antikörperreinheit nach Auf­ bringen auf 3S-Siliciumdioxid bei pH 8,0 und hoher Salz­ konzentration. Proteinproben von 20 µg wurden der SDS-PAGE unterworfen (10%iges Gel, Proben nach Sieden, reduzieren­ de Bedingungen). Bande 1: M.W. Marker; Bande 2: Ascites­ flüssigkeit von anti-hCG (# E11); Bande 3: Effluent von # E11; Bande 4: Eluent von # E11; Bande 5: Effluent von # 6E2; Bande 6: Eluent von # 6E2; Bande 7: Effluent von # B4 und Bande 8: Eluent von # B5.
Fig. 4 die Antikörperaktivität eines mittels Protein A-gereinig­ ten anti-hCG IgGs aus Kaninchen nach HPLC Reinigung auf 3S-Siliciumdioxid. -o-o, Antikörperaktivität nach Reinigung mittels Protein A; x----x, Antikörperaktivität nach Reinigung mittels HPLC; x-x, Antikörperaktivität in dem Effluenten von 3S-Sili­ ciumdioxid. Die Antikörperaktivität wurde durch zeitauf­ lösende Fluoreszenz bestimmt.
Tabelle 1
Charakteristika der erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörper*) (MAk)
Tabelle 2
Effizienz der Antikörperreinigung auf schwefelhaltigem Siliciumdioxidharz unter verschiedenen Adsorptionsbedingungen

Claims (8)

1. Thiophile Substanz der Formel: und Homologe davon.
2. Verfahren zur Herstellung der thiophilen Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Siliciumdioxid unter wasserfreien Bedingungen sila­ nisiert, unter Vakuum trocknet, die Epoxygruppen mit einem Überschuß an Natriumhydrogensulfid spaltet, das erhaltene Produkt mit Divinylsulfon umsetzt, und mit einem Überschuß 2-Mercaptoethanol behandelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man etwa 10fachen Überschuß an Natriumhydrogensulfid verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man einen großen Über­ schuß an Divinylsulfon verwendet und daß man die Reaktion in Tris-Puffer durchführt.
5. Verfahren zur Herstellung von thiophilem Silicium­ dioxid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß man im wesentlichen wie zuvor und wie in den Beispielen beschrieben, vorgeht.
6. Säule für die HPLC-Chromatographie und für die prä­ parative Arbeit in großem Maßstab, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie als aktives Material ein Produkt nach Anspruch 1 enthält.
7. Verfahren zur Reinigung von Proteinen und insbe­ sondere von Immunglobulinen und monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Substanzen in gelöster Form durch eine Säule, die eine thiophile Substanz nach Anspruch 1 enthält, passieren läßt und daß man das gewünschte Produkt abtrennt.
8. Verfahren zur Reinigung von monoklonalen Anti­ körpern, dadurch gekennzeichnet, daß man wie zuvor und wie in jedem Beispiel beschrieben, vor­ geht.
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