DE3311888C1 - Verfahren zur Gewinnung einheitlicher Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate, die bei dem Verfahren gewonnenen Produkte und ihre Verwendung - Google Patents

Description

• Zur Reinigung der Meerrettichperoxidase wird die rohe Präparation in salzfreier Lösung mit Hydroxylapatit behandelt, wobei eine Meerrettichperoxidase erhalten wird, die direkt für die Konjugation nach der Methode von Nakane und Kawaoi verwendet wird. Hierbei wird wie folgt vorgegangen: Kommerziell erhältliche Peroxidase des Reinheitsgrades II [Reinheitszahl (RZ) ca. 1, RZ entspricht OD403/OD275 (OD = optische Dichte)], wird in destilliertem Wasser (Aqua destillata) zu 0,05-0,2 g/ml gelöst und gegen den ca. 100fachen Überschuß Aqua destillata dialysiert. Es wird eine Hydroxylapatit-Säule in Aqua destillata bereitgehalten, deren Bettvolumen 25-50 ml pro Gramm Rohperoxidase beträgt. Die dialysierte Rohperoxidase wird mit 0,5 bis 1,5 Säulenvolumina pro Stunde durch die Hydroxylapatitsäule gepumpt; es wird mit Aqua destillata nachgewaschen. Der Durchbruchpeak mit Absorption bei 403 nm wird aufgefangen und über eine zweite Hydroxylapatit-Säule in Aqua destillata gepumpt, deren Bettvolumen 5 bis 10 ml pro Gramm Rohperoxidase beträgt. Die Pumpgeschwindigkeit beträgt 0,5 bis 1,5 Säulenvolumina pro Stunde, es wird mit Aqua destillata nachgewaschen. Der Durchbruchspeak wird erneut aufgefangen, die RZ der so erhaltenen Meerrettich-Peroxidase beträgt 2,9-3,2. Die Reinigung wird bei 0-30"C, vorzugsweise bei 4-10"C durchgeführt.
• Für die Kopplung mit HRPO können beliebige Immunoglobuline, z. B. Kaninchen-lgG, Ziegen-lgG, Human-lgG eingesetzt werden. Alternativ können IgG-Bruchstücke, z. B. F(ab')2-Bruchstücke, F(ab)-Bruchstükke für die Kopplung verwendet werden.
• Die Elution erfolgt mit Phosphatlösungen, z. B. Kaliumphosphat- oder Natriumphosphatlösungen, gegebenenfalls unter Zusatz eines weiteren Elektrolyten, wie NaCI, KCI, Na2SO4, mit Gradienten von 0 bis 0,15 M, wobei die Konzentration von der Art des Antikörpers, wie der der Tierspezies oder des Immunglobulinbruchstücks, weitgehend unabhängig ist. Die Gradienten können je nach gewünschtem Trennungsgrad linear, stufenförmig oder gekrümmt sein.
• Als IgG-Präparation können Handelspräparate eingesetzt werden. Alternativ können aus Serum nach bekannten Methoden hergestellte IgG-Präparationen Verwendung finden.
• Wird beispielsweise vorgereinigte HRPO mit Kaninchen-IgG nach der Methode von Nakane und Kawaoi gekoppelt und das Reaktionsgemisch auf eine Hydroxylapatit-Säule gegeben, so erhält man im Durchbruchfreie HRPO und hochmarkierte Konjugate ohne immunologische Aktivität, während Konjugate mit einem Konjugationsgrad von 2,5 und darunter sowie freies IgG adsorbiert werden. Bei Elution mit Natriumphosphatlösungen steigender Konzentration (0 bis 0,15 M, linearer Gradient) werden zunächst die Konjugate in der Reihenfolge des abnehmenden Konjugationsgrades und schließlich das freie IgG eluiert.
• Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt einerseits in der Isolierung von Konjugaten einheitlichen Konjugationsgrades (Schwankungsbreite beliebig einstellbar, zweckmäßig geringer als 0,5) und andererseits in der Isolierung definierter Konjugate aus Konjugationsansätzen, die unterschiedlich verlaufen.
• Die erfindungsgemäß erhaltenen Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate können als solche oder in Form eines Kits (Testbestecks) für den gewünschten Zweck vertrieben werden. Werden sie als Kit verkauft, so erhält dieser neben den Konjugaten noch weitere übliche Zusätze, wie ein Nachweisreagenz für Peroxidase z. B. ein Chromogen, und gegebenenfalls ein Reaktionsgefäß, das mit Antigen oder Antikörper beschichtet ist.
• Die folgenden Arbeitsvorschriften dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
• 1. Vorbereitung der HRPO 5 g Meerrettich-Peroxidase [Reinheitsgrades II (RZ ca. 1)] wurden in 50 ml Aqua destillata gelöst und über Nacht gegen 5 1 Aqua destillata dialysiert. Es wurde eine Säule von 5 cm Durchmesser und 7 cm Höhe aus Hydroxylapatit in Aqua destillata gepackt (Bettvolumen 137 ml). Die dialysierte Rohperoxidase wurde mit 100 ml/h durch die Säule gepumpt; es wurde mit Aqua destillata nachgewaschen, bis der Durchbruchsgipfel mit Absorption bei 403 llm eluiert war. Der Durchbruchsgipfel wurde vereinigt (75 ml) und mit 50 ml/h über eine zweite Hydroxylapatit-Säule in Aqua destillata (3 cm Durchmesser; 5 cm Höhe; Bettvolumen 35 ml) gepumpt; es wurde wieder mit Aqua destillata gewaschen. Die Gipfelfraktionen mit Absorption bei 403 Fm wurden wiederum vereinigt (80 ml). Die OD403 wurde zu 45,7; die OD275 zu 15,2 bestimmt. Daraus ergibt sich eine RZ von 3,0 und eine Peroxidase-Konzentration von 21,8 mg/ml (OD403 1% = 21). Die Reinigung wurde bei 4 bis 10"C durchgeführt Die HRPO wird dann so eingestellt, daß eine Lösung von 5 mg/ml in 0,3 M NaHCO3 vorliegt, z. B. 1 Volumen der vorstehend erhaltenen HRPO-Lösung wird mit 1,3 Volumina 1 M NaHCO3 und 2,1 Volumina destilliertem Wasser gemischt und ergibt 4,4 Volumina, die 5 mg HRPO/ml 0,3 M NaHCO3 enthalten.
• Die eingestellte HRPO-Lösung wird mit 0,1 Teilen ihres Gesamtvolumens (V) einer 1 %gen Fluordinitrobenzol-Lösung in absolutem Ethanol versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung wird mit dem Volumen V einer 0,06 M NaJO4-Lösung in destilliertem Wasser versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung mit dem Volumen V einer 0,16 M Lösung von Ethylenglykol in destilliertem Wasser versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Der gesamte Ansatz wird ca. 12 Stunden gegen drei Wechsel von 250 Volumina einer 0,01 M Na,s Hos CO3-Lösung dialysiert (10 mol 1 M NaHCO3-Lösung und 10 ml 1 M Na2CO3-Lösung auf 2 Liter mit destilliertem Wasser auffüllen).
• 2. Vorbereitung der Antikörper-Lösung Das Antikörperpräparat besteht entweder aus IgG einer beliebigen Tierspezies, z. B. Kaninchen, oder einem entsprechenden Fragment, z. B. dem F(ab')n-Fragment. Für IgG ist die einzusetzende Gesamtmenge gleich der HRPO-Menge (in mg Protein); für F(ab')2 ist es 2/3 der HRPO-Menge.
• Die Antikörperpräparation wird auf 5 mg/ml in 0,01 M NaI,s Ho5C03, gegebenenfalls durch Dialyse, eingestellt.
• 3. Kopplungsreaktion (Konjugatherstellung) Die gemäß 1. und 2. vorbereiteten Lösungen werden vereinigt und vor Licht geschützt 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
• 4. Hydroxylapatit-Chromatographie Es wird eine gepackte Hydroxylapatit-Säule bereit gehalten (in destilliertem Wasser; ca. 0,3 ml gepacktes Gel je mg eingesetztes HRPO).
• Der Kopplungsansatz wird unverzüglich mit hoher Pumpgeschwindigkeit auf die Säule gegeben. Die Eluation erfolgt mit einem linearen Gradienten von 0-0,15 M Na-Phosphat pH 6,8 (Laufzeit 16 Stunden, Pumpgeschwindigkeit ca. 1 Säulenvolumen/Stunde). Es werden 5 Fraktionen pro Stunde aufgefangen.
• 5. Physikalische Charakterisierung In Quarzküvetten werden die OD403 und die OD275 bestimmt und geeignete Pools gebildet.
• Der Konjugationsgrad wird aus dem Verhältnis OD403/OD275 nach Tabelle 1 ermittelt Tabelle 1 Ermittlung des Konjugationsgrades (Moleküle Peroxidase pro Molekül Antikörper) aus dem Verhältnis OD403/OD27s OD403/OD275 Konjugat mit Konjugat mit IgG (Fab')2-Fragment 0 0 0 0,1 0,26 0,18 0,2 0,53 0,37 0,3 0,83 0,56 0,4 1,15 0,77 0,5 1,50 1,0 0,6 1,87 1,25 0,7 2,27 1,52 0,8 2,72 1,83 0,9 >3 2,15 1,0 >3 2,5 1,1 >3 2,9 1,2 >3 >3 Die Ermittlung der Konjugationsgrade basiert auf den folgenden Voraussetzungen: A. Molekulargewicht IgG = 150 000 Molekulargewicht (Fab')2 = 100 000 Molekulargewicht Peroxidase = 40 000 B. Die optischen Dichten von wäßrigen Lösungen, enthaltend 1 mg Protein, betragen für OD27s OD40s IgG 1,4 0 (Fab')2 1,4 0 Peroxidase 0,7 2,1 6. Testbesteck (Kit) für die Bestimmung von Antikörpern gegen Streptolysin-O in menschlichem Serum Der Kit umfaßt: a) die Lösung eines erfindungsgemäß hergestellten Konjugaten aus Meerrettich-Peroxidase und Kaninchen-IgG, welches gegen. menschliches IgG gerichtet ist, gegebenenfalls in lyophilisierter Form, b) einen 0,1 molaren Tris-Citrat-Puffer pH5 zur Durchführung des Peroxidase-Nachweises, c) eine Stammlösung von 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin in Dimethylsulfoxid [0,1 g/ml] als Chromogen zur Durchführung des Peroxidase-Nachweises, d) eine Lösung von Wasserstoffperoxid [3%ig] zur Durchführung des Peroxidase-Nachweises, e) eine mit Streptolysin-O beschichtete Mikrotiterplatte als antigen-beschichtetes Reaktionsgefäß, f) einen 0,1 M Tris-HCI-Puffer pH 7,8, der 0,10/0 Tween 20 enthält, als Verdünnungsmittel für die zu untersuchenden Serumproben und für das Peroxidase-Antikörper-Konjugat.

Claims (5)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Gewinnung einheitlicher Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate aus durch Koppelung von Antikörpern und Meerrettichperoxidase erhaltenen Reaktionsgemischen, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch einer chromatografischen Trennung an Hydroxylapatit in zunächst salzfreier Lösung mit anschließender Elution durch einen von 0 auf 0,15 M Phosphat ansteigenden Konzentrationsgradienten unterzogen wird.
2. 2. Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate mit einem Konjugationsgrad, der eine Schwankungsbreite von weniger als 0,5 in der Präparation aufweist, erhalten nach Anspruch 1.
3. 3. Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate mit einem Konjugationsgrad von 2,0 bis 2,5, erhalten nach Anspruch 1.
4. 4. Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate mit einem Konjugationsgrad von 1,0 bis 1,2, erhalten nach Anspruch 1.
5. 5. Verwendung von nach Anspruch 1 hergestelltem Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugat in Testbestecken für die Bestimmung von Antikörpern gegen Streptolysin-O in menschlichem Serum.

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einheitlicher Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate, die so gewonnenen Produkte und ihre Verwendung.

   Konjugate aus Meerrettichperoxidase (horse radish peroxidase: HRPO) und Antikörpern, vorzugsweise der Immunoglobulin(IgG)-Klasse, finden verbreitete Anwendung in der Immunhistochemie und auf dem Gebiet der Enzymimmunoassays. Zu ihrer Herstellung sind eine Reihe von Verfahren in der Literatur beschrieben.

   Vorteilhaft erscheint das von Nakane und Kawaoi [J.

   Histochem. Cytochem. 22(1979)1084-91] angegebene Verfahren, wobei die Glykoprotein-Natur der Meerrettichperoxidase ausgenutzt wird. Zunächst werden die freien Aminogruppen der Peroxidase mit Fluordinitrobenzol blockiert, wonach durch Oxidation mit Periodat im Glykosid-Anteil reaktive Aldehydgruppen erzeugt werden, die nach Entfernung überschüssigen Fluordinitrobenzols mit den Aminogruppen des anschließend zugefügten Immunoglobulins unter Ausbildung Schiffscher Basen eine kovalente Bindung eingehen.

   Ein Vorteil der Methode besteht darin, daß wegen der Blockade der Aminogruppen des Enzyms praktisch kei- -ne Quervernetzung auftritt. Ein Nachteil derartiger Kopplungsreaktionen ist jedoch, daß neben dem erwünschten Enzym-Antikörper-Konjugat im Reaktionsprodukt unumgesetzte Peroxidase und unumgesetzter Antikörper auftreten. Die Abtrennung überschüssigen Enzyms wird wegen der beträchtlichen Unterschiede im Molekulargewicht (MG 40.000 für Peroxidase, MG 150.000 für IgG) verhältnismäßig leicht durch Gelpermeationschromatographie erreicht. Die Unterschiede im Molekulargewicht reichen jedoch nicht für eine Abtrennung des unumgesetzten IgG vom Konjugat aus.

   Für die Abtrennung des unumgesetzten IgG wurde von Arends [J. immunol. Meth. 25(1979)171-75] die Affinitätschromatographie an Concanavalin-A-Sepharo- sesäulen beschrieben. Aufgrund seines geringen Kohlenhydratanteils bindet der unkonjugierte Antikörper nicht an die Matrix, während das Antikörper-Enzym-Konjugat über seinen Kohlenhydratanteil an die Säule bindet. Für die Abtrennung der unumgesetzten Ausgangsmaterialien sind für jede Konjugatpräparation somit 2 Trennschritte erforderlich.

   Nakane und Kawaoi geben ferner an, daß die Brauchbarkeit des erhaltenen Konjugates für unterschiedliche Anwendungen (Histologie, Enzymimmunoassay) vom Konjugationsgrad (Mole Enzym pro Mol Antikörper) abhängt, wobei für die Histologie ein Konjugationsgrad von um 1 optimal erscheint, während für den Enzymimmunoassay höhere Konjugationsgrade bis zu ca. 2,3 vorteilhaft sind. Noch höhere Konjugationsgrade führen zur Beeinträchtigung sowohl der enzymatischen als auch der immunologischen Aktivität des Konjugats. Dabei ist zu berücksichtigen, daß das Konjugationsprodukt ein Gemisch darstellt, in dem verschieden hoch markierte Konjugate nebeneinander vorliegen, so daß die oben angegebenen Konjugationsgrade sich auf den Durchschnittswert des Konjugationsgrades beziehen.

   Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines einfachen Verfahrens, mit dem sowohl die Abtrennung nicht umgesetzter Ausgangsmaterialien (Peroxidase, Antikörper) als auch die Auftrennung der gebildeten Peroxidase-Antikörper-Konjugate entsprechend ihrer Zusammensetzung in einem Arbeitsgang erreicht wird.

   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung einheitlicher Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate aus durch Koppelung von Antikörpern und Meerrettichperoxidase erhaltenen Reaktionsgemischen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reaktionsgemisch einer chromatografischen Trennung an Hydroxylapatit in zunächst salzfreier Lösung mit anschließender Elution durch einen von 0 auf 0,15 M Phosphat ansteigenden Konzentrationsgradienten unterzogen wird.

   Die Erfindung betrifft weiterhin Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate mit einem Konjugationsgrad, der eine Schwankungsbreite von weniger als 0,5 in der Präparation aufweist, bevorzugt einen Konjugationsgrad von 2,0 bis 2,5, besonders bevorzugt von 1,0 bis 1,2, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten worden sind.

   Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugate in Testbestecken für die Bestimmung von Antikörpern gegen Streptolysin-O in menschlichem Serum.

   Bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Reaktionsgemische eingesetzt, die durch Umsetzung von an Hydroxylapatit gereinigter Meerrettichperoxide und Antikörpern, Immunoglobulin-Antikörpern oder IgG-Fragmenten erhalten worden sind.

   Meerrettichperoxidase wird als ein Gemisch verschiedener Isoenzyme isoliert, dessen Hauptanteil überraschenderweise in salzfreier Lösung nicht an Hydroxylapatit absorbiert wird. Dagegen werden Immunglobuline an Hydroxylapatit gebunden und erst bei Phosphat-Konzentration von 0,09 bis 0,12 M weitgehend unabhängig von der Spezies wieder eluiert.