CN101762704A - 一种单克隆抗体制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对筛选克隆化步骤进行改进的新的单克隆抗体制备方法。使用该方法由于在ELISA筛选阳性克隆株的包被过程中，除了一般用预定抗原进行ELISA筛选阳性克隆株的步骤外，加入了与包被抗原有相近抗体结合位点的多个抗原进行ELISA筛选的步骤，排除了特异性不高的阳性克隆株；从而使最终得到的单克隆抗体特异性增强，大大减少制备抗体在使用过程中出现的交叉反应。本发明还公开了利用该方法进行cTnI的制备，包括用含有Myo、FABP、CK-MB、CRP、NTB五种抗原的混合蛋白溶液进行阳性克隆株的筛选。

Description

一种单克隆抗体制备方法及其应用

技术领域：

本发明涉及细胞生物学领域，具体的，本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，以及该种单克隆抗体制备方法在制备cTnI单克隆抗体中的应用。

背景技术：

抗体是机体在受抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody)。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody)。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

目前，大多数的实验室制备抗体大多采用的是单克隆抗体技术，即用预定抗原免疫正常的balb/c小鼠，用免疫小鼠的脾脏细胞和体外培养的无限制的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。利用ELISA技术筛选能够稳定分泌抗预定抗原的抗体的细胞株，最终将获得的细胞株通过体外培养或者诱生小鼠产生腹水得到需要的单克隆抗体。其中在筛选的过程中，得到产物的针对性就最终决定了得到的目标单克隆抗体是否可以有效的使用。一般实验室采用的筛选方法是：用预定免疫的抗原包被ELISA板条，4℃过夜后加入封闭液，4℃过夜，洗板。在ELISA板条中加入细胞培养上清，反应1.5小时后洗板，然后加入酶标二抗，经过显色和终止，通过450nm和630nm吸光值筛选得到具有稳定分泌所需抗体的克隆株细胞。因此，筛选克隆化在单克隆抗体的生产过程中直接导致了最终产物的针对性和有效使用率。

传统的ELISA筛选阳性克隆株的方法虽然被广泛的应用，但是，在实际的操作过程中，由于采用的是预定抗原的包被，包被抗原单一，因此筛选得到的阳性克隆株较多。尤其是在一些相近指标的筛选过程中，经常得到互相交叉反应严重的单克隆抗体株。无法满足实际的免疫检验的需要，同时浪费了大量筛选的时间和原材料。最终产物的有效利用率偏低。在这种情况下，研发了一种新的单克隆抗体的筛选方法。

心肌肌钙蛋白I(cTnI)在鉴别诊断患者出现的急性胸部疼痛中已成为一种有效手段。在描述不稳定心绞痛患者的高危人群时，有较高的预报价值。目前，市场上的心肌损伤的标志物一般包括：心肌肌钙蛋白I(cTnI)，肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)，肌红蛋白(Myoglobin，Myo)脂肪酸结合蛋白质(FABP)，N端-脑利纳肽(NT-proBNP，NTB)，C反应蛋白(CRP)，肌球蛋白轻链(MLC)和重链蛋白(MHC)等。其中CK-MB、Myo、FABP、NTB、CRP及cTnI六个指标在诊断急性心肌梗死的检验中极其灵敏。当患者出现急性心肌梗死(AMI)时，在病发的各个阶段，上述6个指标在血清中的浓度会有相应的变化。因此针对心肌梗死的各个阶段的诊断指标之间的区分在临床实验中就显得尤为重要。

由于cTnI和其它5种心肌损伤标志物有相近的抗原结合位点，在做ELISA测试时容易出现假阳性(交叉反应严重)。因此需要可以制备高特异性的cTnI单克隆抗体的方法。

发明内容：

为了解决现有技术中得到的单克隆抗体交叉反应严重的问题，本发明提供一种针对筛选克隆化步骤进行改进的新的单克隆抗体的制备方法。

本发明提供一种新的单克隆抗体制备方法，包括筛选克隆化过程，所述的筛选克隆化过程，包括两个部分：

包被过程1：用预定抗原包被ELISA板条，通过反应和ELISA检测后，筛选得到OD值(450nm，630nm双波长检测得到的吸光度值)＞1的阳性克隆株；

包被过程2：用与预定抗原有相近抗体结合位点的多种抗原对阳性克隆株进行筛选，通过反应和ELISA检测，排除OD值＞0.3的克隆株；

上述两个包被步骤的使用顺序不限。

本发明还提供运用上述的单克隆方法制备cTnI单克隆抗体的应用，以解决现有的单克隆抗体制备方法获得的cTnI单克隆抗体特异性不强的问题。

所述的制备cTnI单克隆抗体的制备方法包括筛选克隆化过程，所述的筛选克隆化过程，包括两个部分：

包被过程1：用cTnI抗原包被ELISA板条，筛选得到检测OD值＞1的阳性克隆株；

包被过程2：用与cTnI抗原有相近抗体结合位点的Myo、FABP、CK-MB、CRP、NTB共5种抗原对阳性克隆株进行筛选，通过反应和ELISA检测，排除OD值＞0.3的克隆株；

上述两个包被步骤的使用顺序不限。

所述的包被过程1中，所述的cTnI抗原浓度为0.5-3ug/ml。

所述的包被过程2中，所述的混合包被抗原中单个抗原的浓度为0-2ug/ml。

本发明提供了一种针对筛选克隆化步骤进行改进的新的单克隆抗体的筛选方法。使用该方法由于在ELISA筛选阳性克隆株的包被过程中，除了一般用预定抗原进行ELISA筛选，筛选阳性克隆株的步骤外；加入了与包被抗原有相近抗体结合位点的多个抗原进行ELISA筛选步骤，排除了特异性不高的阳性克隆株，从而使最终得到的单克隆抗体特异性增强，大大减少在使用过程中出现的交叉反应。

说明书附图：

具体实施步骤：

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

用目标抗原心肌肌钙蛋白I(cTnI)免疫Balb/c小鼠，取出效价高的小鼠脾脏的B淋巴细胞与HGPRT-/TK-(次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶缺陷)、不分泌抗体的骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选出杂交瘤，再经有限稀释法克隆抗体分泌阳性杂交瘤，在动物体内生产单克隆抗体。最后在体外通过ELISA和Western Blot等鉴定手段完成对抗体株的鉴定工作。

实施例1：动物免疫

先制定免疫方案，确定免疫剂量，免疫途径，免疫时间，免疫小鼠数量。然后根据免疫方案，取250ul，1.0mg/ml的cTnI抗原，用500ul生理盐水稀释后，加入与上述溶液相同体积的弗氏佐剂。用D60-2F型电动搅拌机进行乳化，15分钟后，将上述溶液用2.5ml一次性注射器按0.3ml/只接种于8周龄的Balb/c小鼠皮下。第一次免疫用弗氏完全佐剂稀释抗原；第二次免疫3周后进行，用弗氏不完全佐剂稀释抗原。

第三次免疫为最后一次冲击免疫，在第二次免疫3周后实施，只用生理盐水稀释抗原。按0.3ml/只接种于小鼠皮下。

实施例2：细胞融合

骨髓瘤细胞的准备：

于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养，融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内，1000r/min离心6分钟，弃去上清，加入20ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于20ml不完全培养基，混匀待用。

脾淋巴细胞的准备：

取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏)，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心6分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。

在50ML离心管中混合10⁸个脾细胞和10⁷个对数生长的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞，补加不完全培养基至30mL，充分混匀。1000r/min离心6分钟，上清尽量除净，洗涤2次。在1min之内加入0.7mlPEG，边加边搅拌，置37℃水浴1min，后在2min内加入1ml DMEM培养基，轻轻搅拌，2min内加入4mlDMEM，余下的10ml培养基可较快加入。800rpm离心10min，去上清。加入25ml HAT培养基中，边加边碾散细胞团，加入到昨日铺有滋养细胞的96孔板中，50ul/孔，置37℃二氧化碳培养箱中培养。

实施例3：杂交瘤细胞筛选及克隆化

杂交瘤细胞筛选

1.包被：把Myo、FABP、CK-MB、CRP、NTB各抗原用包被液稀释成2ug/ml(其它实施例中总浓度不超过10ug/ml为佳)；免疫的cTnI抗原单独包被，1ug/ml，100ul/孔加至酶标板，37℃2小时或4℃过夜；

2.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

3.封闭：用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔200ul，37℃放置1.5小时；

4.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

5.加样品：将细胞培养上清，分别加入用混合抗原包被好的酶标板，和用预定抗原cTNI单独包被好的酶标板，70ul/孔，37℃放置1小时。(同时做阴性对照孔及阳性对照孔)；

6.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；；

7.加酶标二抗：为酶标羊抗小鼠IgG，用封闭液稀释(1∶10000)，100ul/孔，37℃放置1小时；

8.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

9.加显色液TMB：即用即配，100ul/孔，37℃放置15分钟；

10.终止反应：于各反应孔中加入2M的硫酸，50ul/孔；

11.酶标仪读数：450nm，630nm波长测定；

结果判断：

(1)用混合抗原Myo、FABP、CK-MB、CRP、NTB共同包被的酶标板，经反应检测，凡是OD值超过0.3的视为假阳性，会产生交叉反应，该克隆株应剔除；

(2)用cTnI抗原单独包被的酶标板，经反应检测，凡是OD值大于1的作为高分泌性的阳性克隆株予以保留；

(3)符合以上两个条件的克隆株作为筛选得到的cTnI阳性克隆株。

杂交瘤细胞克隆化：

1.将筛选得到的细胞株制成细胞悬液，加入计数板中；

2.计数计数板中四大格细胞数，计算出细胞悬液的浓度。细胞悬液浓度(个/ml)＝四大格细胞总数/4×稀释倍数×10⁴；

3.根据细胞浓度，计算出细胞取120个细胞所需上述细胞悬液的体积，加入5.5ml完全培养基中；

4.将上述溶液混匀加入事先铺好饲养细胞的96孔板中，50ul/孔，置37℃，二氧化碳培养箱中培养。

实施例4：杂交瘤细胞的冻存

细胞冻存：

1.收集cTnI细胞于离心管中，混匀后取出10ul于计数板中计数；

2.将上述细胞悬液离心1200rpm，6分钟；

3.去上清，根据计数结果，加入预冷的冻存液悬起细胞；

4.按照2-3×10⁶个细胞/ml冻存液加入细胞冻存管中；

5.将加有细胞的冻存管先置-20℃半小时，然后转入-70℃冰箱过夜，最后转入液氮容器长期保存。

实施例5：腹水制备及纯化

腹水制备：

1.在接种细胞前3天至14天接种石蜡油或降植烷于正常的6-8周龄balb/c小鼠腹腔，0.3-0.5ml/只；

2.收集细胞于离心管中，计数；

3.1200rpm离心6分钟；

4.去上清，用适量DMEM培养基或PBS重悬细胞；

5.将上述细胞悬液按2-3×106个细胞/0.3ml接种于预先接种石蜡油的小鼠腹腔；

6.接种细胞后一周，密切关注小鼠生长情况；

7.待小鼠腹水长至足够多，小鼠濒临死亡时，断颈处死小鼠；

8.将小鼠腹部皮肤剪开一小口，用手将皮肤撕开，暴露出腹膜；

9.用镊子夹住腹膜向上提地，然后剪开一小口，用吸管将腹水吸出，置离心管中；

10.5000rpm离心10分钟，将上清分装，置-70℃冰箱保存。

抗体纯化：

1.样品准备：1mlcTnI腹水，离心(5000rpm，10min，4℃)，取上清，加入5倍体积的PB，用10ml针筒先用玻璃滤纸过滤掉粗颗粒，然后用0.22um滤器过滤；

2.将Protein G柱从4℃取出，组装于蠕动泵相连(连接处不能漏液)：

①连接管道；

②20ml去离子水清洗通道，除去气泡；

③20ml PBS平衡管道；

④连接层析柱(与FPLC)：解下柱子上端接口，滴几滴PBS以除去气泡，与通道接口相连，打开柱子下端盖子；

⑤10cv PB平衡柱子，接上柱子后流速要控制在1ml/min；

3.上样并收集流出液(用以检测柱是否达到饱和/柱的寿命已到)；

4.用10cv PB洗去未结合的杂蛋白；

5.洗脱：用10cv的甘氨酸洗脱并收集，约0.3ml/管(EP管中预先加入9ul Tris-HCl PH9.0)，共收集10管，于紫外分光光度计上检测260nm及280nm的吸光度，OD280＞2.0的收集并于PBS中透析过夜；

6.如果还需上样，回到2⑤；

7.用10cv经0.22um滤膜过滤的去离子水过柱，使柱内达中性；

8.用5-10cv的20％乙醇过柱，在柱内充满乙醇时拆柱保存于4℃；

9.样品透析后先存于4℃，待检测浓度后分装。

本实施例中从小鼠腹腔诱生腹水的步骤亦可改用体外细胞培养，具体方法是将克隆株细胞以20％小牛血清的培养基培养，收集培养上清，用上述的方法纯化分离即可。

实施例6：抗体纯品交叉度鉴定

1.包被：把cTnI、Myo、FABP、CK-MB、CRP、NTB分别用包被液稀释至所需浓度，各抗原浓度为1ug/ml，100ul/孔加至酶标板，37℃2小时或4℃过夜；

2.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

3.封闭：用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔200ul，37℃放置1.5小时；

4.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

5.加样品：将细胞培养上清加入包被好的酶标板(双筛)，70ul/孔，37℃放置1小时。(同时做阴性对照孔及阳性对照孔)；

6.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

7.加酶标二抗：为酶标羊抗小鼠IgG，用封闭液稀释(1∶10000)，100ul/孔，37℃放置1小时；

8.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

9.加显色液TMB：即用即配，100ul/孔，37℃放置15分钟；

10.终止反应：于各反应孔中加入2M的硫酸，50ul/孔；

11.酶标仪读数：450nm，630nm波长测定；

经过交叉反应测定后，可以明显发现，cTnI抗体纯品与相近心血管指标之间的交叉反应程度极低，基本可以确定为与心血管相近5指标之间无交叉，相比传统的抗体筛选方法，在抗体交叉度鉴定中，得到的抗体纯品针对cTnI的针对性强。

实施例7：Western-blot检测抗体纯度

1.按照SDS-PAGE配制方法，配制12％的分离胶和5％的积层胶；

2.样品前处理，1ug抗原于上样缓冲液按体积1∶1混合，煮沸10分钟，使蛋白充分变性，此为一孔的上样量；

3.上样跑胶；

4.跑胶结束，断电后取出胶放入转膜缓冲液中，剪出与胶相同大小的NC膜1张和4张滤纸；

5.将胶，NC膜和滤纸按2张滤纸，NC膜，胶，2张滤纸的顺序摆放(注意，两边的滤纸不能接触，以免发生短路)，然后放入转膜夹中；

6.将转膜夹放入电转仪中，注意有NC膜的在正极，有胶的在负极(因为蛋白质带负电，在电流的作用下会向正极移动，这样才能达到将胶上的蛋白质转移至膜上的目的)；

7.通电，将电压调至120-150V；

8.2小时后，取出NC膜，置含有1×丽春红溶液的平皿中染色；

9.剪下目的条带，并编上号码，置事先配好的3％的奶粉溶液室温封闭过夜；

10.弃去封闭液，加入一抗，37℃振荡，反应1小时；

11.弃去反应液，用洗液洗涤三次，每次10min(洗液为0.1M Tris-HCl，PH7.5，含0.5‰Tween-20)；

12.加入二抗(用封闭液稀释)，37℃振荡，反应40min；

13.弃去反应液，用洗液洗涤四次，每次10min；

14.显色(显色液为4mgDAB+5ml Tris-HCl PH7.5+2.5ul 30％H₂O₂现配现用)；

15.拍照存档。

经过新方法筛选出来的cTnI抗体，Western-blot的结果显示特异性强，与其他相近指标之间无相互交叉，生产得到的目的抗体株针对性相对明确，目的性更强，因此得到最终产物的效率也得到提高。

Claims (4)

1.一种单克隆抗体制备方法，包括筛选克隆化过程，其特征在于，所述的筛选克隆化过程，包括两个部分：

包被过程1：用预定抗原包被ELISA板条，通过反应和ELISA检测后，筛选得到OD值(450nm，630nm双波长检测得到的吸光度值)＞1的阳性克隆株；

包被过程2：用与预定抗原有相近抗体结合位点的多种抗原对阳性克隆株进行筛选，通过反应和ELISA检测，排除OD值＞0.3的克隆株；

上述两个包被步骤的使用顺序不限。

2.一种应用如权利要求1所述的方法制备cTnI单克隆抗体的方法，所述的制备方法包括筛选克隆化过程，其特征在于，所述的筛选克隆化过程，包括两个部分：

包被过程1：用cTnI抗原包被ELISA板条，筛选得到检测OD值＞1的阳性克隆株；

包被过程2：用与cTnI抗原有相近抗体结合位点的Myo、FABP、CK-MB、CRP、NTB共5种抗原对阳性克隆株进行筛选，通过反应和ELISA检测，排除OD值＞0.3的克隆株；

上述两个包被步骤的使用顺序不限。

3.如权利要求2所述的制备cTnI单克隆抗体的方法，其特征在于，所述的包被过程1中，所述的cTnI抗原包被浓度为0.5-3ug/ml。

4.如权利要求2所述的制备cTnI单克隆抗体的方法，其特征在于，所述的包被过程2中，所述的混合包被抗原中单个抗原的包被浓度为0-2ug/ml。