CN103562725B - 川崎病的诊断标志物和治疗靶点 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于诊断和治疗川崎病的组合物和方法。更具体地，KD患者的蛋白质组富集安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C，所述蛋白用作KD的生物标志物(和潜在的治疗靶点)。因此，使用本文中提供的组合物和方法检测这些生物标志物可为递送至受试者的疗法提供信息。

Description

川崎病的诊断标志物和治疗靶点
联邦政府资助
本发明是部分地在由国卫卫生研究院授予的项目号U01HL068285、RR02172、U01HL068270、U01HL068269、U01HL068292、U01HL068290、U01HL068288、U01HL068281和U01HL068279下利用联邦政府资助进行的。美国联邦政府具有本发明的某些权利。
相关申请的交叉参考
本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2011年4月15日提交的美国临时申请号61/475,936和2011年12月22日提交的美国临时申请号61/579,007的利益，将所述美国临时申请的每一个的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明提供了与川崎病(KD)相关的诊断标志物和治疗靶点。更具体地，KD患者的蛋白质组富集安眠蛋白A(meprin A)、细丝蛋白B和细丝蛋白C，所述蛋白用作KD的生物标志。因此，使用本文中提供的组合物和方法检测这些生物标志物可为递送至受试者的疗法提供信息。
背景技术
川崎病(KD)是病因学未知的系统性脉管炎。虽然川崎病是发达国家获得性小儿心脏病的最常见病因，并且仍然是主要医学问题，因为其体征和症状模拟许多其它儿童热性疾病。决定性诊断标志物的不存在限制了怀疑的KD的临床评价的准确性，从而发病率显著增加。反过来，其分子发病机制的不完全理解阻碍了需要用来改善疗法的合理靶点的鉴定。
发明内容
本实施方案提供了用于诊断和治疗KD的标志物。KD患者但非具有模拟病况的患者的尿蛋白质组富集细胞损伤蛋白，例如细丝蛋白和踝蛋白、免疫调节剂例如补体调节剂CSMD3、免疫模式识别受体muclin和免疫细胞因子蛋白酶安眠蛋白A。在KD患者的血清和尿中均检测到细丝蛋白C、细丝蛋白B和安眠蛋白A的显著升高。安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C相较于目前在盲法病例-对照研究(blinded case-control study)中使用的疾病标志物显示优良的诊断性能。值得注意地，安眠蛋白A富集在KD的小鼠模型的冠状动脉损伤中。总而言之，尿蛋白组特征谱显示KD的新型分子标志物，包括细丝蛋白C、细丝蛋白B和安眠蛋白A。
因此，本发明的一个方面提供了至少一种对于有此需要的受试者的KD的诊断和监控是特异性的生物标志物。
该方面的一个实施方案，提供了尿和血清生物标志物细丝蛋白C，其在KD患者中显著升高。
该方面的另一个实施方案提供了尿和血清生物标志物安眠蛋白A，其在KD患者中显著升高。
该方面的另一个实施方案提供了尿和血清生物标志物细丝蛋白B，其在KD患者中显著升高。
该方面的另一个实施方案提供了一小组生物标志物，其每一个在KD患者中升高，并且在KD的诊断和预后中提供了比较值。在该方面的一个实施方案中，KD生物标志物小组包括细丝蛋白B、细丝蛋白C或安眠蛋白A。此类实施方案还可包括对于总蛋白质或标准化蛋白(normalizing protein)是特异性的试剂；或可进行测量总蛋白质或标准化蛋白的量或浓度的测定法以提供可针对其对一小组生物标志物进行标准化的量或浓度，以允许各种比较，例如在受试者样品之间，或在一系列在不同时间点分离一个受试者的样品之间的比较。
在本发明的一个实施方案中，存在于生物样品例如尿或血清中的KD生物标志物水平(例如，细丝蛋白C或安眠蛋白A的量或浓度)通过将测试样品或其制剂与试剂例如基于抗体的试剂接触来测量，所述试剂特异性结合至少一种KD生物标志物或其部分，其中试剂与可在测定法中用于测定生物标志物水平(例如，量或浓度)的生物标志物形成复合物。本领域技术人员已知的任何方法可用于评估生物标志物水平。例如，KD生物标志物水平可利用ELISA、多重珠粒测定法(multiplex bead assay)或质谱来评估。
一个实施方案提供了用于诊断受试者的KD的测定，包括分析获自受试者的生物样品的至少一种选自安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的生物标志物的水平，其中生物标志物的水平相较于标准化蛋白的参照水平的大于2倍的升高表示受试者患有KD。
在另一个方面，本发明提供了最优化KD治疗的治疗效果的方法。因此，在该方面的一个实施方案中，方法包括(a)测量一小组生物标志物(包括安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C)中至少一种生物标志物的水平(例如，量或浓度)；(b)将至少一种生物标志物的水平与至少一种生物标志物的参照水平相比较，其中样品的一小组生物标志物(包括安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C)中至少一种生物标志物的水平相较于所述至少一种生物标志物的参照水平的升高表示需要给受试者施用KD的治疗性治疗。在一些实施方案中，生物样品是尿样品。在一些实施方案中，生物样品是血清。
在该方面的另一个实施方案中，方法包括将生物样品(获自受试者)与至少一种对于一小组生物标志物(包括至少细丝蛋白C、细丝蛋白B或安眠蛋白A)中的至少一种生物标志物是特异性的试剂接触；(b)使用对于至少一种试剂是特异性的测定测量至少一种生物标志物的量或浓度；和(c)将至少一种生物标志物的量或浓度与至少一种生物标志物的参照水平相比较，其中样品的一小组生物标志物(包括细丝蛋白C、细丝蛋白B或安眠蛋白A)中的至少一种生物标志物的量或浓度相较于所述至少一种生物标志物的参照量或浓度的增加，表示需要给受试者施用KD的治疗性治疗。在一些实施方案中，生物样品是尿样品。在一些实施方案中，生物样品是血清。
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括用于鉴定或测量生物样品的至少一种KD生物标志物例如细丝蛋白C、细丝蛋白B或安眠蛋白A的工具。试剂盒包括用于装载生物样品(例如，尿样品或血清样品)的容器和至少一种试剂，例如抗体或其部分，所述试剂特异性结合至少一种KD生物标志物以用于测定生物样品例如尿样品或血清样品的至少一种KD生物标志物的量、浓度或存在。
在该方面的一个实施方案中，试剂盒包括至少一种特异性结合至少一种KD生物标志物的抗体或其部分，和用于固定的抗体或其部分。在一个这样的实施方案中，一种抗体被固定在固相上，并且至少一种对于至少一种生物标志物是特异性的抗体被可检测地标记。试剂盒可包括抗-安眠蛋白A、抗-细丝蛋白B或抗-细丝蛋白C抗体或其部分。
另一个方面涉及计算机可读存储介质，计算机可读存储介质具有在其上记录以定义用于在计算机上执行用于诊断至少一个个体的KD的方法的软件模块的计算机可读指令，计算机可读存储介质包括：(a)用于存储和访问代表针对获自至少一个个体的生物样品测定的至少一种生物标志物的水平和标准化蛋白的水平的数据的指令；(b)用于通过标准化模块将至少一种生物标志物的水平针对标准化蛋白的量标准化，从而产生至少一种生物标志物的标准化水平的指令，(c)用于使用比较模块将至少一种生物标志物的标准化水平与存储在存储装置上的参照数据相比较的指令，其中比较步骤产生被检索的内容，和(d)用于为用户显示一页被检索的内容的指令，其中被检索的内容显示至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD。标准化蛋白可以是总蛋白或特定蛋白质。在一个实施方案中，生物样品是尿样品。在一个实施方案中，生物样品是血清。
本文中还描述了用于获得获自至少一个个体的生物样品的数据的计算机系统，系统包括：(a)装载生物样品的样品容器；(b)被构造来测定报道分子信息的测定模块，其中报道分子信息包括(1)代表试剂与标准化蛋白的结合的信息，和(2)代表试剂与至少一种生物标志物的结合的信息；(c)被构造来存储来自测定模块的数据输出的存储装置；(d)被构造来将代表试剂与至少一种生物标志物的结合的报道分子信息针对代表试剂与标准化蛋白的结合的报道分子信息标准化的标准化模块；(e)适合于将获自标准化模块的数据与存储装置上的参照数据相比较的比较模块，其中比较模块产生被检索的内容；和(f)用于为用户显示一页被检索的内容的显示模块，其中被检索的内容显示至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD。在一个实施方案中，标准化蛋白是特定蛋白质。在一个实施方案中，标准化蛋白是总蛋白。在一个实施方案中，生物样品是尿样品。在另一个实施方案中，生物样品是血清。
附图说明
图1显示KD患者展示与非KD患者或具有通常存在的尿蛋白的患者不同的独特的尿蛋白组。15个个体的尿蛋白组(列)的热图显示相较于非KD患者在KD患者中检测到的前10种蛋白质(行)的贝叶斯分析的结果。阴影梯度表示对应于尿蛋白丰度的MS/MS谱的数目(质谱计数)。
图2举例说明川崎病患者，但非具有模拟病况的患者具有显著升高的安眠蛋白A和细丝蛋白C的血清和尿水平，这显示了怀疑患有KD的患者的盲法研究的优良诊断性能。图2A-2C：在怀疑患有KD的患者的盲法病例对照研究中使用安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的特异性ELISA测量的尿浓度的箱形图(Box plot)，显示了KD患者(居中)相较于非KD病况患者(左)和接受静脉内γ球蛋白治疗后的KD患者(IVIg,右)的显著升高的安眠蛋白A和细丝蛋白C的浓度。P<0.05。水平条表示每一个比较组的平均值。图2D：与常用标志物红细胞沉降率(ESR，第三左线)和血清C反应性蛋白(CRP，右线)相比较的尿安眠蛋白A(第一左线)、细丝蛋白B(第二左线)和细丝蛋白C(第四左线)的受者工作特征曲线。所测量的诊断标志物的受者工作特征曲线下面积(AUC)的值和它们的95%的置信区间(CI)。图2E-2F：KD患者(右)相较于模拟病况的非KD患者(左)的使用安眠蛋白A(图2E)和细丝蛋白C(图2F)的特异性ELISA测量的血清浓度的箱形图。p<0.05。
图3显示与KD患者的疾病活性相关的尿细丝蛋白C和安眠蛋白A。图3A-3B：5个KD患者的尿安眠蛋白A(图3A)和细丝蛋白C(图3B)，如在诊断时、治疗后24-48小时以及完全临床反应后1个月收集的匹配的样品中测量的。图3C：在初始呈现后5.5个月经历KD的复发的一个患者的尿安眠蛋白A水平。图3D：显示对应于初始疗法的患者(左，反应者)对需要重复治疗的患者(右，非反应者)的尿细丝蛋白C水平的散布图。
图4显示安眠蛋白A在川崎病小鼠模型的冠状动脉损伤中富集。图4A-4B：冠状动脉的苏木精和伊红染色的切片的显微照片显示单核细胞(箭头)在KD-垂死的动物(图4B)但非对照动物(图4A)中的浸润。图4C-4D：冠状动脉的安眠蛋白A免疫组织化学染色的切片的显微照片显示安眠蛋白A在垂死的动物(图4D)但非对照动物(图4C)的冠状动脉的单核浸润物中的富集。图4E：垂死(右)小鼠中安眠蛋白A的血清水平相较于对照(左)小鼠升高。
图5显示了使用受者工作特征(ROC)分析获得的反映组合的安眠蛋白A和细丝蛋白C的诊断性能的数据。这些双重KD生物标志物的使用在KD诊断中提供了高水平的灵敏性和特异性。
图6A-C显示比较KD小鼠模型的安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的血清水平的数据。
具体实施方式
应当理解，本发明不限于本文中描述的特定的方法、方案和试剂等，这样其可变化。本文中使用的技术仅仅是为了描述特定实施方案，并且无意限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求定义。
如本文和权利要求中使用的，除非明确地另有所指，否则单数形式包括复制所指物，并且反之亦然。除非例如用“任一”修饰，否则术语“或”是包含性的。除在操作实施例中外，或其中另外地指出，否则所有表达本文中使用的成分或反应条件的量的数字应当理解为在所有情况下由术语“约”修饰。
确定的所有专利和其它出版物为了描述和公开的目的通过引用明确地并入本文，例如，此类出版物中描述的可能结合本发明使用的方法。在本申请提交日期之前仅提供了这些出版物的公开内容。在这一点上不应当解释为承认发明人不享有先于由于在先发明或出于任何其它原因的此类公开。关于日期的所有声明或关于这些文献的内容的陈述基于对于申请人是可获得的信息，并且不构成对这些文献的日期或内容的正确性的承认。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然任何已知的方法、装置和材料可用于本发明的实践或测试，但在这方面的方法、装置和材料描述于本文中。本实施方案提供了用于KD的诊断和治疗的新型生物标志物。简而言之，高精度质谱蛋白质组学用于分析KD患者的临床尿样品的超过2,000种独特蛋白质。分析显示KD患者但非具有模拟病况的患者的尿蛋白质组富集细胞损伤的标志物例如细丝蛋白和踝蛋白、免疫调节剂例如补体调节剂CSMD3、免疫模式识别受体muclin和免疫细胞因子蛋白酶安眠蛋白A。在两个KD患者的独立组群(由总共192个患者组成)的血清和尿中检测到细丝蛋白C和安眠蛋白A的显著升高。在怀疑患有KD的69个患者的盲法病例对照研究中，安眠蛋白A和细丝蛋白C相较于目前使用的疾病的标志物展示更优良的诊断性能，受者工作特征曲线下面积分别为0.99(0.96-1的95%的置信区间)和0.94(0.89至0.99的95%CI)。值得注意地，安眠蛋白A在KD小鼠模型的冠状动脉损伤中富集。总而言之，尿蛋白质组特征谱显示KD的新型分子标志物，包括细丝蛋白C和安眠蛋白A。这些和其它蛋白质可改善怀疑患有KD的儿童的临床评价的诊断准确度，导致新型治疗靶点的鉴定，和允许KD的生物分类的发展。
KD是病因学未知的系统性脉管炎，其显示延长的发热和皮肤粘膜炎症，包括口腔粘膜的炎症、非渗出性结膜炎、疹、极端变化和通常单侧的颈淋巴结病。Burns等人,118J.Pediatr.680(1991)。虽然川崎病在美国和欧洲人群中具有约1/10,000的发病率，但其是发达国家的获得性小儿心脏病的最常见病因，并且继续为医学问题，因为其体征和症状模拟许多其它儿童热性疾病。Baker等人,154J.Pediatr.592(2009)；Taubert等人,119J.Pediatr279(1991)。此外，KD的流行在亚洲特别高；2/1,000的5岁以下的日本儿童发生川崎病。Nakamura等人,20J.Epidemiol.302(2010)。
准确性诊断的延迟导致增加的来自KD的并发症的死亡率和发病率。Wilder等人,26Pediatr.Infect.Dis.J.256(2007)；Suda等人,123Circulation1836(2011)。具体地，在没有及时治疗的情况下，多至25%的患者可产生冠状动脉扩张或微动脉瘤，具有死亡和长期病态的相关风险。McCrindle等人,116Circulation174(2007)。重要地，在本发明之前，不存在用于KD早期鉴定和诊断的特殊病症测试。Gedalia,9Curr.Rheumatol.Rep.336(2007)；Dedeoglu&Sundel,33Rheum.Dis.Clin.N.Am.555(2007)。临床算法的使用已改善了KD的诊断，但它们准确性仍然有限。Yellen等人,125Pediatrics e234(2010)。改善KD的临床评价的可靠性的尝试集中在炎症的临床和一般实验室标志物上。Lin等人,121J.Pediatr.924(1992)；Chow等人,34Zhonghua Min Guo Xiao Er Ke Yi Xue Hui Za Zhi77(1993)；Ebihara等人,164Eur.J.Pediatr.427(2005)；Peng等人,8Zhongguo Dang Dai Er Ke ZaZhi208(2006)；Suganami等人,50Pediatr.Int.264(2008)。然而，可能由于KD的病理生理学中的非特异性关系(这被认为是由感染性触发者与夸大的炎症反应之间的相互作用引起的)，性能不足。Rowley等人,6Nat.Rev.Microbiol.394(2008)。
本实施方案使用基于发现的方法，所述方法在蛋白质组学规模上鉴定KD病理生理学改变。之所以研究尿是由于尿相较于血清的丰度和相对分析简单性。先前，高精度质谱以充足的深度测量尿蛋白质组，从而鉴定局部和全身性生物标志物，和发现改善的疾病的诊断标志物。Rai等人,5Proteomics3467(2005)；Pisitkun等人,5Mol.Cell Proteomics1760(2006)；Adachi等人,7Genome Biol.R80(2006)；Woroniecki等人,26Am.J.Nephrol.258(2006)；Oetting等人,47Am.J.KidneyDis.898(2006)；Zimmerli等人,7Mol.CellProteomics290(2008)；Kentsis等人,55Ann.Emerg.Med.62(2010)。
本实施方案提供了经验证的KD的诊断标志物(在前瞻性小儿组群中鉴定的)。从怀疑患有KD的儿童收集的尿样品的高精确度质谱蛋白质组表征鉴定了个体尿蛋白质组的差异。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)验证两个独立的患者组群的尿和血清中的候选诊断标志物。随后在怀疑患有KD的儿童的盲法前瞻性研究中评价它们的诊断性能。
初始受试者研究招募69个受试者，所述受试者显示发热并且担心可能的KD。与KD的流行病学和表现的先前研究一致，研究群体主要是男性，平均年龄3岁，呈现表1中描述的体征和症状。
表1.显示怀疑患有KD的患者的体征、症状、诊断
45个患者(65%)最终被诊断为患有KD。KD患者接受利用高剂量的阿司匹林和静脉内γ球蛋白的治疗，13个患者(28%)因缺乏初始临床反应而需要重复治疗。1个患者(2%)最初对疗法作出反应，但在初始呈现后6个月产生再发性疾病。24个无KD患者中有12个(50%)经发现具有非特异性病毒征合征，其余患者经发现具有多种可模拟KD的病况，如表2中显示的：
表2.69个研究患者的最终诊断
基于在研究开始时收集的以下15个样品的分析鉴定KD的候选诊断标志物并且基于可用性对其进行选择：6个KD样品(3个无冠状动脉扩张，3个具有冠状动脉扩张)，6个非KD样品(两个具有非特异性病毒综合征，3个具有腺病毒，以及1个具有肾盂肾炎)，和3个从对治疗完全反应后1个月的KD患者(恢复期KD)收集的匹配样品。该分析显示与先前研究类似的聚集尿蛋白质组的组织和物理来源(Kentsis等人,3Proteomics Clin.Appl.1052(2009))，并且鉴定了2,131种独特的蛋白质。3个比较组的分析导致在KD患者、但非不具有KD的任何患者或其中KD已完全消退的患者的尿中鉴定超过190种蛋白质。分析候选KD标志物的丰度以鉴定在KD患者中富集最多的候选KD标志物，按相对丰度和盛行率(prevalence)的顺序对它们进行评级(图1)。鉴定的标志物包括多种与内皮和心肌细胞损伤相关的蛋白质，例如细丝蛋白和肌联蛋白(titin)，以及免疫调节剂例如DMBT1和安眠蛋白A。
验证使用商购可得的ELISA选择的候选KD标志物，分析细丝蛋白C和安眠蛋白A的尿水平。通过测量它们在患者尿中的浓度来评估细丝蛋白C和安眠蛋白A的KD诊断性能，研究者对于患者的最终诊断是盲的。KD患者中的安眠蛋白A和细丝蛋白C的尿浓度相较于不具有KD的患者显著升高(分别地，21.7ng/ml对3.8ng/ml的平均细丝蛋白C，和57.1ng/ml对12.4ng/ml的平均安眠蛋白A，p<0.05,图2A-2B)，表S2：
表S2.KD患者尿中的安眠蛋白A和细丝蛋白C显著升高
对发热的年龄、性别、种族和持续时间的控制不影响安眠蛋白A和细丝蛋白C的评价的统计显著性。值得注意地，相较于不具有KD的患者，具有KD的不完全呈现的患者中的尿安眠蛋白A和细丝蛋白C也显著升高，仅满足3/4常规的主要诊断标准(分别地，28.5ng/ml对3.8ng/ml的平均细丝蛋白C，以及38.2ng/ml对12.4ng/ml的平均安眠蛋白A，两者p<0.05)。
使用受者工作特征(ROC)分析法分析所有69个患者的安眠蛋白A和细丝蛋白C的诊断性能。这些标志物的ROC曲线显示相较于目前使用的实验室标志物例如红细胞沉降率(ESR)和C反应性蛋白(CRP)更优良的诊断性能，安眠蛋白A和细丝蛋白C分别具有0.99(0.96-1.0的95%CI)和0.94(0.89至0.99的95%CI)的曲线下面积值(图2C-2D,5)。
安眠蛋白A和细丝蛋白C与对疗法的反应之间的关系通过测量它们在匹配的系列样品中的尿浓度来评估。在疗法开始之前诊断时、利用高剂量阿司匹林和静脉内γ球蛋白治疗后24-48小时以及在对治疗完全临床反应后1个月在5个可对其收集匹配的样品的患者中收集这些数据。在所有研究的患者中，尿安眠蛋白A和细丝蛋白C水平与对治疗的反应相关(单因素方差分析p<0.05，图3A-3B)。
具体地，尿安眠蛋白A在一个KD患者中是不可测量的，所述患者最初对治疗反应但其疾病在初始呈现后5.5个月复发。尿安眠蛋白A的重复升高与KD的复发相关(图3C)。同样地，因缺乏初始临床反应而需要利用静脉内γ球蛋白重复治疗的患者在呈现时具有比对初始疗法作出反应的患者显著更高量的细丝蛋白C(平均64ng/ml对20ng/ml,p<0.05,图3D)。
受到这些发现的鼓舞，安眠蛋白A和细丝蛋白C的验证扩展至患者的独立组群。因此，分析112个KD患者的血清样品(作为最近的小儿心脏网络研究的部分收集的)，将其与最初怀疑患有KD但最终诊断为具有非KD热性疾病的11个患者相比较(图2E-2F)。通过使用ELISA，KD患者的血清中的安眠蛋白A和细丝蛋白C相较于非KD对照显著升高(分别地，217ng/ml对6.6ng/ml的平均细丝蛋白C，和1,363ng/ml对14.8ng/ml的平均安眠蛋白A，两者p<0.05)，表S3：
表S3.KD患者的血清中的安眠蛋白A和细丝蛋白C显著升高
因为安眠蛋白A是调节多种免疫细胞因子的蛋白酶，因此，使用复制KD的几个特征的冠状动脉炎的小鼠模型研究安眠蛋白A在KD发病机制中的潜在参与。Lehman等人,48Clin.Immunol.Immunopathol.108(1988)。在该模型中，垂死的小鼠产生导致冠状动脉微动脉瘤的全身性单核脉管炎。使用特异性安眠蛋白A抗体的免疫组织化学分析显示安眠蛋白A在具有冠状动脉炎的小鼠的血管损伤中富集，但不在对照小鼠中富集(图4A-4D)。同样地，循环安眠蛋白A的水平在具有冠状动脉炎的小鼠的血清中相较于对照小鼠显著升高(平均4.7ng/ml对0.3ng/ml,p<0.05,图4E)。也参见图6。
KD，儿童的急性特发性脉管炎，如果未得到快速地诊断和治疗，将引起显著的发病率和死亡率。与超声心动描记术组合的临床算法的使用已改善KD的诊断评价的精确度。与迅速治疗相结合，这导致来自冠状动脉瘤的死亡率和并发症的显著下降。然而，在本发明之前，主要诊断挑战仍然存在，因为用于诊断KD的临床标准对于该病况不是特异性的，并且显著亚组的KD儿童缺乏疾病的几个临床表现(不完全KD)。
几个早期研究已寻求鉴定KD的生物标志物，目的在于改善评价可能的KD的诊断准确度。急性相反应物例如外周血白细胞计数、ESR和CRP水平是临床上最有用的。这些标志物在它们的特异性和灵敏性方面仍然不足(Xiu-Yu等人,24J.Clin.Lab.Anal.385(2010)；Huang等人,31Pediatr.Cardiol.1209(2010))，如在本文中确认的(图2C-2D)。最近鉴定改善的诊断标志物例如骨保护素、利尿钠肽和血管内皮生长因子的尝试也产生了有限的改善，这可能是因为对于不同的表征KD的免疫机制的不充分特异性。Simonini等人,32J.Rheumatol.2233(2005)；Kaneko等人,Pediatr Cardiol,(2011)；Ebata等人,75Circ.J.1455(2011)。
最近发展的质谱法的高精度和灵敏性促进了本文中描述的更加准确和灵敏的新型诊断标志物的发现。相较于对初怀疑患有KD但最终证明具有其它热性疾病的患者，KD患者的尿蛋白质组允许构建由超过190个独特候选KD标志物组成的KD的分子病理生理学特征谱(图1)。这些分子包括内皮和心肌损伤(踝蛋白、细丝蛋白、桥粒核心糖蛋白、遮蔽蛋白(obscurin)、肌联蛋白)、白细胞活化(AMICA1、CAECAM、CXCL12、GDF15、LAIR1)、病原体免疫识别(DMBT1、ABCB9)和细胞因子调节(CSMD3、安眠蛋白A)的标志物。
如本文中提供的，独特地存在于KD患者的尿中的几种免疫调节分子。在这些分子当中有安眠蛋白A，一种在牵涉KD的发病机制的炎性细胞因子(包括IL-1和IL-6)的激活和降解中起作用的金属蛋白酶。Chow等人,1993；Herzog等人,31Cytokine394(2005)。类似地，DMBT1，也称为muclin或gp340，是识别多种细菌和病毒抗原的先天性免疫清道夫受体。Madsen等人,16Innate Immunol.160(2010)。最后，ABCB9，也称为TAPL，是在免疫抗原呈递中起作用的转运蛋白。Bangert等人,392Biol.Chem.61(2011)。许多鉴定的KD标志物，如果适当地验证(如我们已在此处进行的)，可以不仅代表诊断标志物，而且还可代表新型治疗靶点。总而言之，表S1中所列的可在Proteome Commons(于proteomecommons.org在线)获得并且包含190个新型候选KD标志物的鉴定的蛋白质组提供了KD的分子生理学特征谱。由该分子特征谱牵涉的患者的先天性和适应性免疫反应的组分的相互作用还可阐明介导KD的致病机制。
重要的是，怀疑患有KD的患者的该前瞻性盲法研究确认了细丝蛋白C和安眠蛋白A在KD患者而非具有多种模拟病况的患者的血清和尿中显著升高(图2)。两个标志物都显示了相较于目前使用的实验室测试更优良的诊断性能(图2)。细丝蛋白C在肌细胞中占优势的表达表明，细丝蛋白C代表了伴随KD的亚临床心肌炎的灵敏性和特异性标志物。事实上，弗兰克心肌细胞损伤的标志物例如肌钙蛋白已被发现与心肌炎的临床或超声心动图证据无关。Checchia等人,22Pediatr.Cardiol.102(2001)；Sato等人,Intl.J.Cardiol.(2011年7月19日)。此外，相较于完全反应的患者，对初始疗法无反应的KD患者中细丝蛋白C的升高的水平表明细丝蛋白C是KD活性的标志物(图3D)。
类似地，安眠蛋白A是调节多种炎性细胞因子，包括生物活性IL-1β(一种至关重要的促炎细胞因子)的蛋白酶(Herzog等人,(2005)，其多态性与对KD的治疗的抗性相关(Weng等人,74Circ.J.544(2010))。因此，安眠蛋白A可促成KD的初始、增殖或补偿免疫机制。安眠蛋白A对KD的病理生理学的潜在贡献通过其在KD小鼠模型的冠状损伤中的富集(图4)和与KD患者的疾病活动性的相关性(图3)得以强调。
这些发现的KD标志物籍以在患者的尿中积累的机制以及它们与KD的病理生理学关系为本实施方案提供了立即功用。此外，目前发现的尿蛋白标志物可在具有肾或泌尿系统疾病或极度脱水的患者中具有临床关联性。更广泛地，此处所示的方法推进了针对至临床实践的直接转化专门设计的蛋白质组学表征范例，其用于广泛的常见和罕见人病况。参见，例如，Kentsis等人,3Proteomics Clin.Appl.1052(2009)；Kentsis,55AnnalsEmerg.Med.62(2010)。
总而言之，此处显示的工作为改善KD的诊断、阐明其病理生理学以及指导疗法打开了许多潜在方法。具体地，安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C作为KD的特异性和灵敏性标志物的确认，如本文中提供的，能够使它们临床用于例如通常可获得的ELISA，以改善KD的诊断的准确度和时效性。此外，本发明的描述的分子生理学特征谱和验证的诊断标志物现允许将改善患者成层的KD的生物分类和允许个体化治疗。
因此，本发明的一个方面提供了至少一种对于有此需要的受试者的KD的诊断和监控是特异性的生物标志物。本发明的一个实施方案提供了尿和血清生物标志物细丝蛋白C，其在KD患者中显著升高。该方面的另一个实施方案提供了尿和血清生物标志物安眠蛋白A，其在KD患者中显著升高。该方面的另一个实施方案提供了尿和血清生物标志物细丝蛋白B，其在KD患者中显著升高。
术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指动物例如哺乳动物，例如人。术语“哺乳动物”包括人、非人灵长类动物(例如，猿、猴)、狗、猫、马、牛、猪、大鼠、仓鼠、豚鼠和小鼠。
术语“样品”或“生物样品”是指获自受试者的以健康或疾病状态存在的生物液体(biological fluid)、组织或细胞的样品。这类样品包括但不限于尿、全血、血清、血浆、痰、唾液、羊水、淋巴液、组织或细针活组织检查样品、腹膜液、脑脊髓液，以及包括来自细胞裂解物的上清液、裂解的细胞、细胞提取物和细胞核提取物。在一些实施方案中，全血样品进一步被加工成血清或血浆样品。在一些实施方案中，样品采自人受试者，在可选择的实施方案中，样品采自哺乳动物。必要时，可将样品预处理以便贮存或保存，通过在适当的缓冲液中稀释或必要时浓缩。可使用许多具有生理pH的标准含水缓冲液(使用多种缓冲剂之一例如磷酸盐、Tris等)的任一种。可将样品贮存以待以后用于本文中公开的测定。贮存可以在+4℃或例如在-20℃或-80℃冷冻。
“生物标志物”、“尿生物标志物”或“血清生物标志物”是指个体中内源表达的或在来自个体的生物样品中发现或隔离的蛋白质或多肽。术语“KD生物标志物”在整个说明书中用作用于本文中描述的方法的一种类型的生物标志物的实例。KD生物标志物是指安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C的至少一种。对于用于诊断KD的生物标志物例如安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C的每一种，提及的生物标志物蛋白质还包括此类蛋白质的结构域或片段以及其物种、变体、同源物、等位基因形式、突变形式和等同物。
“试剂”可以是允许检测或定量生物样品的总蛋白质、样品例如生物样品中的标准化蛋白(例如，肌动蛋白)或KD生物标志物的水平、浓度、表达水平或活性的蛋白质结合剂。此类试剂包括但不限于抗体(“抗体”包括抗体的部分例如表位或抗原结合肽、互补位、功能性CDR；重组抗体；嵌合抗体；三抗体(tribody)；中间抗体(midibody)；或其衍生物、类似物、变体、部分或片段)、蛋白质结合剂、小分子、重组蛋白、肽、适体、avimers和其蛋白质结合衍生物、部分或片段。短语“对于至少一种生物标志物是特异性的试剂”是指直接或间接允许检测或定量生物标志物的水平、量、浓度或表达水平的生物标志物结合剂。此类试剂包括但不限于抗体或其部分、蛋白质结合剂、小分子、重组蛋白、肽、适体、avimers和其蛋白质结合衍生物或片段。在结合特异性生物标志物、标准化蛋白或总蛋白质后试剂形成“试剂-生物标志物复合物”、“试剂-标准化蛋白复合物”或“试剂-总蛋白复合物”。
“报道分子信息”是指来源于表示试剂对样品中的KD生物标志物的结合或与其的复合物形成，即“试剂-生物标志物复合物”、“试剂-标准化蛋白复合物”或“试剂-总蛋白质复合物”的形成的信号的数据。信号可包括例如光、荧光、比色或显示对KD生物标志物、标准化蛋白或总蛋白质的结合的其它可检测信号。
短语“至少一种生物标志物的水平高于标准化蛋白水平的升高”是指超过存在于生物样品中的标准化蛋白的水平或参照水平的至少一种生物标志物的水平(例如，浓度或量)。术语生物标志物的“增加的浓度”、“水平的升高”、“更高的水平”或“更高的浓度”是指相对于标准化蛋白的水平或相对于参照水平，在统计上显著的或显著高于在不同时间点在对照或参照样品中，在来自相同受试者的样品中发现的该生物标志物的水平的生物标志物的水平。短语“至少一种生物标志物高于标准化蛋白的浓度的水平的升高”是指比存在于生物样品中的标准化蛋白的浓度或量大的至少一种生物标志物的浓度或量。“更高水平”或“水平的升高”可以是例如1.2倍或更高，例如高至至少1.8倍，高至至少1.9倍，高于至少2倍(即，≥2倍)，高至至少3倍，高至至少4倍等，包括其间的数值。类似地，约0.78的AUC值可被认为是统计上显著的。为了进行比较，测试样品和对照样品来自相同样品类型；即，获自相同生物来源(例如，尿或血清)。对照或参照样品还可以是标准样品，其包含相同浓度的通常在从健康个体获得的生物样品中发现的KD生物标志物。或者，对照可以是在患者的生物样品中发现的标准化蛋白，其可用于标准化KD生物标志物。
在一个实施方案中，术语生物标志物的“更高水平”或“水平的升高”是指相较于参照值或标准化蛋白值，来自受试者的样品的至少一种生物标志物的水平的至少5%的升高。生物标志物的水平的升高可以为至少10%、至少15%、至少20%、至少35%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%，包括其间的数值；高于参照水平(例如，来自不具有KD的个体的样品的相同生物标志物的水平)至少1倍、至少1.2倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍(即≥2倍)、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多，包括其间的数值。
在另一个实施方案中，相较于参照水平，至少一种生物标志物的水平的降低为至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或甚至100%(即，不存在)，包括其间的数值。在可选择的实施方案中，“标准化水平的差异”是指相较于参照水平，至少一种生物标志物的水平的统计上显著的改变(上升或下降)。
“标准化生物标志物的水平”等是指表示样品中生物标志物(例如，细丝蛋白B、细丝蛋白C或安眠蛋白A)的水平的数据值的转化(通过将其除以代表样品的总蛋白质或标准化蛋白的水平的表达数据值)，从而允许在多个样品间比较标准化的生物标志物值或将标准化的生物标志物值与一个或多个参照样品或参照值比较。
“标准化蛋白”或“标准化因子(normalizing factor)”是指针对其对目标生物标志物的水平进行标准化以允许比较不同生物样品中的目标蛋白质的量的蛋白质。在一些实施方案中，不同的生物样品来自不同的受试者。在其它实施方案中，不同的生物样品来自相同的受试者，但在不同的时间点后。通常，标准化蛋白是组成型表达的并且在至少两个将对来自其的样品进行分析的生理状态或病况(例如给定的疾病和非疾病状态)之间不被差异调节。因此，例如，标准化蛋白在疾病例如KD存在或不存在的情况下变化不显著(即，<15%、<10%、<7%、<5%、<4%、<3%、<2%、<1%或更少，包括其间的数值)。在一个实施方案中，相较于一系列稀释度的预测的关系(例如，通过线性回归预测的)，基于在一系列样品稀释度上测量的蛋白质的相关性程度(例如，重复之间最小量的散布或最小标准差)选择标准化蛋白。例如，可选择对于在一系列稀释度上评估的测量的蛋白质水平具有最高相关性程度(例如，相较于经历相同测量的蛋白质样品的另一种蛋白质)的标准化蛋白。“最高程度的相关性”是指相较于在一系列稀释度上的预测的关系小于2的在一系列稀释度上进行的蛋白质测量(例如，重复测量)的标准差；优选标准差为<1.5、<1、<0.5、<0.1、<0.01、<0.001或更小(包括其间的数值)，包括为0的标准差(例如，测量的和预测的值相同)。在一些实施方案中，标准化蛋白是“持家基因”(编码组成型表达的并且是基本维持和基本细胞功能所必需的蛋白质的基因)的产物。持家基因通常不以细胞或组织依赖性的方式表达，最常见地由给定的生物体的所有细胞表达。由持家基因编码的标准化蛋白的一些实例包括例如肌动蛋白、微管蛋白、GAPDH等等。在一个实施方案中，持家基因产物用作标准化蛋白。
可用于测定生物标志物或标准化蛋白的水平的多种测定形式。测定形式的实例包括已知的技术例如Western印迹分析、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(Immunoradiometric assay)(IRMA)、化学发光免疫测定例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、多重珠粒测定、荧光抗体法、被动血细胞凝集、质谱(例如MALDI/TOF(时间飞行)、SELDI/TOF)、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱、核磁共振光谱学以及HPLC-串联质谱(HPLC-MS/MS)。一些免疫测定可通过使用适当的仪器例如用于化学发光免疫测定的Siemens Bayer ACS180TMChemistry分析仪(可以例如从Block Scientific.,Inc.,Bohemia,NY广泛获得的)来容易地自动化进行。
RIA和ELISA为生物标志物的浓度或水平的测定提供了检测灵敏度、快速性、准确性、可能的方法自动化的益处。通常参见，Kazi等人,13J.Coll.Physicians Surg.Pak22(2003)；Ohkuni等人,1289Intl.Cong.Ser.71(2006)；Mitchell等人,5Mol.Microbiol.1883(1991)；Kashyap等人,60J.Clin.Invest.171(1977)。还可使用抗体阵列或抗体芯片。参见，例如，美国专利申请公布No.2003/0013208、No.2002/0155493、No.2003/0017515；美国专利No.6,329,209、No.6,365,418。根据医生的偏好以及基于本公开内容，其它技术根据需要可用于检测本文中描述的KD生物标志物以实践本文中描述的方法。
本发明的预后方法也用于确定KD患者的适当治疗过程。治疗过程是指在KD诊断或治疗后对于患者采用的治疗措施。例如，在KD诊断后，可通过施用高剂量的阿斯匹林或施用免疫球蛋白来治疗受试者。
本发明还涉及用于检测和预后KD的评价的商业试剂盒。试剂盒可以以本领域技术人员公知的任何构型存在，用于进行一个或多个本文中描述的用于检测或定量至少一种KD生物标志物(例如，细丝蛋白B、细丝蛋白C或安眠蛋白A)的方法。试剂盒是方便的，因为它们提供许多(如果不是全部的话)用于进行测定法的必需试剂，所述测定法用于检测测试生物样品(例如，尿样品或血清样品)的至少一种KD生物标志物，例如本文中描述的。此外，可利用试剂盒中包括的标准或多个标准例如预定量的至少一种KD生物标志物同时进行测定法，以便测试的结果可被定量或验证。
在具体实施方案中，试剂盒包括用于检测尿样品的至少一种KD生物标志物的水平的工具。试剂盒可包括具有至少一种KD生物标志物结合剂固定在其上的“浸渍片(dipstick)”，所述结合剂特异性结合KD生物标志物蛋白。随后可使用例如利用比色试剂或放射性同位素可检测地标记的第二抗体来检测特异性结合的KD生物标志物。
在其它实施方案中，测定试剂盒可包括用于竞争性和非竞争性测定、放射免疫测定(RIA)、多重珠粒测定、生物发光和化学发光测定、荧光测定(fluorometric assay)、夹心测定、免疫放射分析技术、斑点印迹、酶联测定(包括ELISA)、微量滴定板或免疫细胞化学的组分。对于每一个试剂盒，测定的灵敏性、精确性、可靠性、特异性和重现性通过本领域技术人员公知的方法来确定。
本发明的其它方面提供了用于通过测定至少一种KD生物标志物(例如，细丝蛋白B、细丝蛋白C或安眠蛋白A)的水平来监控或改善KD的治疗功效的方法。
因此，在该方面的一个实施方案中，方法包括(a)测量一小组生物标志物(包括安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C)中至少一种生物标志物的水平(例如，量或浓度)；和(b)将至少一种生物标志物的水平与至少一种生物标志物的参照水平相比较，其中样品中至少一种生物标志物的水平相较于参照水平的升高表示需要给受试者施用KD的治疗性治疗。在一些实施方案中，生物样品是尿样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。
在该方面的另一个实施方案中，方法包括将获自受试者的生物样品与至少一种对于一小组生物标志物(包括安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C)中的至少一种生物标志物是特异性的试剂接触；(b)使用对于至少一种试剂是特异性的测定法测量生物标志物的水平；和(c)将生物标志物的水平与生物标志物的参照水平相比较，其中样品中生物标志物的水平相对于生物标志物的参照水平的升高表示需要给受试者施用KD的治疗性治疗。在一些实施方案中，生物样品是尿样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。
在该方面的另一个实施方案中，提供了用于监控KD受试者的治疗功效的方法，所述方法包括：(a)从在第一时间点获自受试者的生物样品测定一小组生物标志物(包括安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C)中的至少一种生物标志物的水平(例如，量或浓度)；(b)从在第二时间点获自受试者的样品测定所述生物标志物的水平；和(c)将第二时间点的生物标志物的水平与第一时间点的生物标志物的水平相比较，其中所述第二时间点的至少一种生物标志物的水平或浓度的增加表示治疗对于所述受试者是有效的，其中所述第二时间点的至少一种生物标志物的水平或浓度的增加对于所述受试者是无效的。在一些实施方案中，生物样品是尿样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。
给定的KD治疗的功效可由熟练的临床医生例如使用本文中论述的标准来测定。治疗可包括例如施用高剂量的阿斯匹林或施用静脉内免疫球蛋白。“有效量”的KD治疗是使KD或KD症状减轻、缓和或消退持续至少一段时间即暂时(如果不是永久性的话)的充足量的治疗。
本发明从而提供了进行用于评估个体是否患有KD的方法的系统(例如，包括用于引起计算机系统的计算机可读介质)。因此，另一个方面涉及计算机可读存储介质，计算机可读存储介质具有在其上记录以定义用于在计算机上执行用于诊断至少一个个体的KD的方法的软件模块的计算机可读指令，计算机可读存储介质包括：(a)用于存储和访问代表针对获自至少一个个体的生物样品测定的至少一种生物标志物的水平和标准化蛋白的水平的数据的指令；(b)用于通过标准化模块将至少一种生物标志物的水平针对标准化蛋白的水平标准化，从而产生至少一种生物标志物的标准化水平的指令，(c)用于使用比较模块将至少一种生物标志物的标准化水平与存储在存储装置上的参照数据相比较的指令，其中比较步骤产生被检索的内容，和(d)用于为用户显示一页被检索的内容的指令，其中被检索的内容显示至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD。标准化蛋白可以是总蛋白。在一个实施方案中，生物样品是尿样品。在一个实施方案中，生物样品是血清。
可选择的实施方案包括用于获得从至少一个个体获得的生物样品的数据的计算机系统，系统包括：(a)装载生物样品的样品容器；(b)被构造来测定报道分子信息的测定模块，其中报道分子信息包括(1)代表试剂与标准化蛋白的结合的信息，和(2)代表试剂与至少一种生物标志物的结合的信息；(c)被构造来存储来自测定模块的数据输出的存储装置；(d)被构造来将代表试剂与至少一种生物标志物的结合的报道分子信息针对代表试剂与标准化蛋白的结合的报道分子信息标准化的标准化模块；(e)适合于将获自标准化模块的数据与存储装置上的参照数据相比较的比较模块，其中比较模块产生被检索的内容；和(f)用于为用户显示一页被检索的内容的显示模块，其中被检索的内容显示生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD。在一个实施方案中，标准化蛋白是特定蛋白质。在一个实施方案中，标准化蛋白是总蛋白。在一个实施方案中，生物样品是尿样品。在另一个实施方案中，生物样品是血清。
本文中描述的系统和计算机可读介质仅仅是用于进行评估个体是否患有慢性肾损伤的方法的本发明的举例说明性实施方案，并且无意限定本发明的范围。机器的模块或用于计算机可读介质的模块，可假定许多构型。例如，功能可提供于单个机器上或分布在多个机器上。本文中描述的系统和计算机可读介质的变化是可能的，并且意在落入本发明的范围内。
本发明的方面和实施方案提供了KD的第一验证的诊断生物标志物；用于急救护理科、住院部和诊室医生的准确、快速和低/非侵袭性测试以及分析和即时检查的组合物、试剂盒和方法。本发明的方面和实施方案在评价的准确性和及时性上有利的，其可通过低成本、广泛的至临床实践的整合，缩短不必要的住院、治疗或手术。
实施例
实施例1.研究设计、参与者和结果
在两个时期进行研究。对于发现期，将来自6个KD患者(包括具有或不具有冠状动脉扩张的患者)的尿样品与来自6个最初怀疑患有KD但最终诊断为模拟KD的热性疾病的患者的尿样品相比较。发现分析还包括在完成治疗和症状消退后从KD患者收集的3个个体间对照样品。验证期招募对其评价可能的KD的患者，但在最终诊断确定之前。作为川崎病的小儿心脏网终研究的部分收集的从独立的验证组群收集的血清样品。参见Newburger等人,356New Engl.J.Med.663(2007)。
对于所有研究患者，将尿收集为清洁收集样品。利用研究编号标记样品以便所有分析是盲法的。在6小时的收集内将样品于-80℃贮存。凝固用于血清收集的血液样品，按照标准方法离心，在30分钟的收集中将血清于-80℃贮存。
研究在三级护理儿科医院进行，并且由Children’s Hospital Boston Committeeon Clinical Investigation批准。按照临床病史和体格检查招募正对其可能的KD进行评价的18岁以下的患者。合格患者具有至少4天的发热和4个或更多个KD的临床标准(Newburger等人,110Circulation2747(2004))，或对于近端右冠状动脉或冠状动脉左前降支具有2.5或更多的冠状动脉z-评分，如通过二维超声心动图测量的。此外，基于专家建议招募具有仅满足3个诊断临床标准的KD的不完全表现的患者。如果患者具有预先存在的肿瘤、肾或泌尿系统疾病或怀孕，则将他们排除。儿科急救医学或风湿病医生从医疗护理提供者获得书面知情同意和年龄超过7岁的儿童的同意。
最终的诊断由单个三级护理机构的儿科风湿病专家按照公布的KD诊断标准来确定。Newberger等人,2004。对于作为儿科心脏网络研究的部分招募的患者，使用相同标准来确定最终诊断。Newburger等人,356New Engl.J.Med.663(2007)。对于未住院的患者，在使用脚本问题(scripted question)或根据确定患者是否已具有任何随后的医疗护理的医疗图表综述评价后6-8周，通过电话确认结果。对于经发现未患KD的患者，基于临床评价确定非特异性病毒综合征的诊断，如果无特异性病原体被鉴定的话。所有研究的患者接受最终的结果。使用标准化病例报告形式跟踪临床和实验室数据。
实施例2.尿蛋白分析和免疫测定
为了发现KD的候选标志物，使用超速离心、蛋白质沉淀、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和反相液相层析分级分离解冻的5ml尿等分，如所详细公布的。Kentsis等人,3ProteomicsClin.Appl.1052(2009)。使用偶联至混合线性离子阱-傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQFT Ultra,Thermo Scientific,Waltham,MA)的纳流HPLC系统(Eksigent,Dublin,CA)将个体尿蛋白级分经历液相色谱串联质谱。对于每一个MS/MS波谱，提取200个最强的峰，通过使用MASCOT(2.1.04版,Matrix Science)针对人国际蛋白质索引数据库(3.69版,http://www.ebi.ac.uk/IPI)进行搜索。通过搜索由靶IPI数据库的反相蛋白质序列组成的诱饵数据库进行鉴定准确性的评估。Elias&Gygi,4Nat Methods207(2007)。以在肽水平上低于1%的假发现率，仅将基于两个或更多个独特肽鉴定的蛋白质包括在分析中。分析的个体尿蛋白质组可在Proteome Commons(http://proteomecommons.org)上公开获得。除了细丝蛋白B、细丝蛋白C和安眠蛋白A外，表S1中所示的其它标志物也可用于KD的诊断。
使用酶联免疫吸附测定(USCN Life Science,Wuhan,China)测量细丝蛋白C和安眠蛋白A的浓度。测定法的最低检测限分别为0.1ng/ml和0.06ng/ml，对于两个测定法质量控制样品的变动系数小于10%。
统计分析：通过如所描述的简约蛋白质分组(Kentsis等人,2009)，利用合计以计算蛋白质谱计数的个体肽计数装配发现尿蛋白质组。如在QSpec(Choi等人,7Mol.CellProteomics2373(2008))中执行的贝叶斯统计用于分析标准化蛋白质谱计数以鉴定在来自川崎病患者的样品中但非在来自非川崎病患者的样品中或在完成治疗后川崎病患者的个人内对照样品中统计上显著地富集的蛋白质。使用标准方法(STATA,10.1版,StataCorp)计算受者工作特征和多变量线性回归模式。所有统计测试使用对数变换测量的比较来进行双尾检验。
表S1.在川崎病患者的尿中独特地鉴定的蛋白质
实施例3.冠状动脉的尿模型和安眠蛋白A免疫组织化学
使用基于B组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的细胞壁提取物(LCWE)的腹膜内注射的冠状动脉炎的已建立的鼠模型。Lehman等人,48Clin.Immunol.Immunopathol.108(1988)。生长B组干酪乳杆菌，如所描述的那样制备细胞壁提取物(LCWE)。Schulte等人,183J.Immunol5311(2009)。简而言之，用含250μg LCWE的磷酸缓冲盐溶液(PBS)或用单独的盐水注射6周龄C57/BL6小鼠。14天后，处死小鼠，在系列切片(7μm)中鉴定冠状动脉炎，用福尔马林固定，用苏木素和伊红染色。为了进行免疫组织化学分析，用含0.3%PBS的过氧化氢预处理切片30分钟。将安眠蛋白A(克隆F-20,Santa Cruz Biotech.,Santa Cruz,CA)或同种型对照抗体(山羊血清,Santa Cruz Biotech.)以1:100用于含0.5%PBS的牛血清白蛋白中，进行1小时。随后洗涤切片，将缀合有生物素化抗-山羊辣根过氧化物酶的第二抗体(Vector Lab,Burlingame,CA)以1:500施用30分钟，洗涤，随后用缀合有链霉抗生物素蛋白的辣根过氧化物酶(BD Biosciences,San Diego,CA)以1:1,000染色30分钟。按照制造商的说明书(Vector Lab)，使用SK-4100DAB试剂盒检测免疫组织化学染色。

Claims (19)

1.用于检测至少一种生物标志物的水平的试剂在制备用于川崎病(KD)的体外诊断的诊断剂中的用途，所述生物标志物选自于安眠蛋白A。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，进一步选择额外的生物标志物细丝蛋白C来制备用于KD的体外诊断的诊断剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其中由获自受试者的生物样品对所述生物标志物进行分析。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述生物样品是尿或血清。
5.根据权利要求1所述的用途，其中将所述至少一种生物标志物的水平与标准化蛋白的参照水平相比较，作为受试者患有KD的表征。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述标准化蛋白的参照水平是(a)未患有KD的个体的生物标志物的水平；(b)所述受试者样品的持家基因蛋白的水平；或(c)所述生物样品的总蛋白的水平。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述生物标志物的水平使用特异性结合所述生物标志物的基于抗体的结合剂来检测。
8.一种用于检测KD的试剂盒，其包括用于检测生物样品中的KD生物标志物的试剂，其中所述试剂盒检测KD生物标志物细丝蛋白C和安眠蛋白A。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述生物样品是尿或血清。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述试剂包括结合细丝蛋白C的试剂和结合安眠蛋白A的试剂。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂是抗体或其部分。
12.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述试剂包括标准量的细丝蛋白C和标准量的安眠蛋白A。
13.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述试剂包括用于标准化的蛋白质标准。
14.根据权利要求10所述的试剂盒，其还包括结合根据权利要求10所述的试剂的第二试剂。
15.根据权利要求11所述的试剂盒，其还包括结合根据权利要求11所述的抗体的第二试剂。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中可检测地标记所述第二试剂。
17.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述检测还包括测量检测的生物标志物的水平。
18.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述试剂盒是ELISA试剂盒。
19.用于评估个体是否患有KD的计算机系统，所述系统包括：
(a)一种固定的计算机可读存储介质，其具有在其上记录以定义用于在计算机上执行用于诊断至少一个个体的KD的方法的软件模块的计算机可读指令，所述计算机可读存储介质包括：
(i)用于存储和访问代表至少一种选自细丝蛋白B、细丝蛋白C和安眠蛋白A的生物标志物的水平，和针对获自至少一个个体的生物样品测定的标准化蛋白的水平的数据的指令；
(ii)用于通过标准化模块将所述至少一种生物标志物的水平针对标准化蛋白的水平标准化，从而产生所述至少一种生物标志物的标准化水平的指令，
(iii)用于使用比较模块将所述至少一种生物标志物的标准化水平与存储在存储装置上的参照数据相比较的指令，其中所述比较步骤产生被检索的内容，和
(iv)用于为用户显示一页被检索的内容的指令，其中被检索的内容显示所述至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD；
(b)装载生物样品的样品容器；
(c)被构造来测定报道分子信息的测定模块，其中报道分子信息包括：
(1)代表试剂与标准化蛋白的结合的信息，和
(2)代表试剂与至少一种生物标志物的结合的信息；
(d)被构造来存储来自测定模块的数据输出的存储装置；
(e)被构造来将代表试剂与至少一种生物标志物的结合的报道分子信息针对代表试剂与标准化蛋白的结合的报道分子信息标准化的标准化模块；
(f)适合于将获自标准化模块的数据与存储装置上的参照数据相比较的比较模块，其中比较模块产生被检索的内容；和
(g)用于为用户显示一页被检索的内容的显示模块，其中被检索的内容显示至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD，
并且其中，所述存储装置、标准化模块、比较模块、以及显示模块执行所述固定的计算机可读存储介质上的指令。
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