CN114895030A - 唾液中检测肝癌的标志物及其试剂盒 - Google Patents

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CN114895030A CN202210372547.9A CN202210372547A CN114895030A CN 114895030 A CN114895030 A CN 114895030A CN 202210372547 A CN202210372547 A CN 202210372547A CN 114895030 A CN114895030 A CN 114895030A
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Abstract

本发明涉及一种唾液中ORM1和AFP联合作为蛋白标志物在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用，并根据该应用建立诊断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测试剂或试剂盒。唾液中AFP和ORM1联合筛查肝癌的效能大于血液中AFP单独筛查的效能，能更准确的判断受试者是否为肝癌的疾病风险，且唾液检测为无创检测，受试者更容易接受，适用于长期的筛查和监测，以及早发现早治疗，以免耽误病情，提高患者生存率。

Description

唾液中检测肝癌的标志物及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及唾液中ORM1和AFP联合作为检测肝癌的标志物的应用及其试剂盒。
背景技术
肝癌在全球发病率排名第六，在男性中排名第五，女性中第九，病死率排名第三。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝癌病理类型，占90％。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是HCC最重要的危险因素。肝癌的发病率在过去十年中有所下降，但死亡率仍然很高。与晚期肝癌相比，早期肝癌的5年生存率通过有效治疗可大大提高，早期诊断对改善肝癌预后尤为重要。早期筛查和监测可作为影响肝癌预后的独立因素。目前常用B超和血清甲胎蛋白进行肝癌的筛查和检测。B超检测需要禁食至少8小时，检测的准确性受到肝脏特征(如肝脏质地异常)、患者特征(如肥胖)、操作者技术(如超声质量和经验)等条件的限制。
目前，有肝癌危险因素的人每3-6个月进行一次肝癌筛查，由于缺乏特异的临床症状和有效的筛查方式，高比例的HCC患者被发现时已进入晚期。但肝癌是一种进展迅速的癌症，确诊后的一年存活率仅为36％。因此，探索一种既经济又方便，对患者和医务人员都适用的肝癌筛查方法就显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种唾液中ORM1和AFP联合作为检测肝癌的标志物的应用及其试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.唾液中ORM1和AFP联合作为蛋白标志物在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用。
2.唾液中ORM1、AFP和其结合抗体或片段在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用。
进一步，在上述应用中，通过该产品检测受试者唾液中的ORM1和AFP蛋白含量，并与对照水平相比较，当受试者唾液中的ORM1和AFP蛋白含量在大于对照水平时，诊断为肝癌患者。
进一步，唾液中ORM1和AFP联合作为蛋白标志物在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用，所述产品为试剂、试剂盒或试纸。
进一步，唾液中ORM1和AFP联合作为蛋白标志物在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用，所述产品为ELISA试剂盒。
进一步，唾液中ORM1和AFP联合作为蛋白标志物在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用，所述唾液为唾液上清液。
3.一种判断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测产品，该检测产品中含有检测ORM1和AFP蛋白含量的试剂。
进一步，所述判断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测产品中，使用检测ORM1和AFP蛋白含量的试剂可适应胶体金法、电泳法、免疫荧光法、直接竞争ELISA法、间接竞争ELISA法、双抗体夹心ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法进行ORM1和AFP蛋白含量检测。
进一步，所述判断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测产品中，所述检测ORM1和AFP蛋白为检测唾液中的ORM1和AFP蛋白。
进一步，唾液中ORM1和AFP联合作为蛋白标志物在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用、或所述判断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测产品中，判断受试者为肝癌或非肝癌检测的指标具体为：受试者唾液中ORM1蛋白含量在2484ng/ml以上，且唾液中AFP蛋白含量在107.5pg/ml以上为肝癌。
本发明的有益效果在于：本发明采用iTRAQ蛋白质组学方法，通过比较肝癌组与非肝癌组，筛选出了152个唾液组间差异表达蛋白，再依次采用免疫印迹、免疫组化和酶联免疫吸附试验在肝癌组织和唾液验证这些差异蛋白，发现唾液中α-1-酸性糖蛋白1(orosomucoid 1，ORM1)和甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)在肝癌中表达显著增高(p<0.05)，并最终确定可定性肝癌的蛋白标志物。进一步采用统计学分析方法对唾液标志物的诊断效能进行统计分析，ORM1和AFP联合可作为检测肝癌的生物标志物，当唾液ORM1与AFP联合用于诊断肝癌时，曲线下面积(AUC)值为0.8726(95％置信区间：0.8104-0.9347)，敏感性为78.3％，特异性为88％。充分说明唾液中ORM1和AFP联合可作为检测肝癌的生物标志物有一定的准确性和可行性，可作为唾液蛋白标志物在制备诊断肝癌的各种产品中进行应用，实现快速、便捷且无创的检测诊断，使得受试者方便早期筛查和监测，以及早发现早治疗，以免耽误病情，提高生存率。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为各实验组蛋白质印迹验证结果，其中a：四组混合唾液样本中AFP、HP、ORM1、ARG1、COLT1、FCG3B和MMP9的代表性蛋白质印迹及其柱形图分析。b：四组个体唾液样本中AFP、HP、ORM1和MMP9的代表性蛋白质印迹及其柱形图分析。HCC：肝癌；LC：肝硬化；CHB：慢性病毒性乙型肝炎；NC：正常控制。数据显示为平均值±SD，*p<0.05，与肝硬化、慢性病毒性肝炎和正常对照相比。
图2为各实验组免疫组化验证结果，其中a：代表性免疫组化染色分析肝细胞癌组织和肿瘤邻近组织中AFP染色指数的差异。b：代表性免疫组化染色及分析ORM1在肝细胞癌组织和肿瘤邻近组织中染色指数的差异。c：肝细胞癌组织和肿瘤邻近组织中HP染色指数差异的代表性免疫组化染色分析。数据显示为带范围的中位数。
图3为各实验组ELISA验证结果，其中a：HCC、LC和CHB组中的血清AFP表达。b：HCC、LC、CHB和NC组中的唾液AFP表达。c：HCC、LC、CHB和NC组中唾液ORM1的表达。d：HCC、LC、CHB和NC组中唾液HP的表达。HCC：肝癌；LC：肝硬化；CHB：慢性病毒性乙型肝炎；NC：正常控制。数据显示为带范围的中位数。
图4为晚期肝癌(TNM III-IV)和早期肝癌(TNM I-II)中标志物的表达差异比较，其中a：早期和晚期肝癌之间的血清AFP表达差异。b：早期和晚期肝癌之间的唾液AFP表达差异。c：早期和晚期肝癌之间的唾液ORM1表达差异。d：早期和晚期肝癌之间的唾液HP表达差异。数据显示为带范围的中位数。
图5为不同疾病状态标志物的ROC分析。其中a：对照组为LC或CHB时血清AFP诊断HCC的受试者工作特征(ROC)曲线。b：对照组为LC或CHB时唾液AFP诊断HCC的ROC曲线。c：对照组为LC或CHB时唾液ORM1诊断HCC的ROC曲线。d：对照组为LC或CHB时唾液ORM1和唾液AFP联合诊断HCC的ROC曲线。HCC：肝癌；LC：肝硬化；CHB：慢性病毒性乙型肝炎。
图6为以对照组为LC、CHB、NC时唾液标志物诊断HCC的ROC曲线。其中a：唾液AFP在诊断HCC中的受试者工作特征(ROC)曲线。b：唾液ORM1在诊断HCC中的ROC曲线。c：唾液ORM1和唾液AFP联合诊断HCC的ROC曲线。HCC：肝癌；LC：肝硬化；CHB：慢性病毒性乙型肝炎；NC：正常控制。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
受试者选择
所有受试者于2021年4月1日至2021年10月31日在重庆医科大学附属第二医院传染病科和体检中心招募而来。本研究经重庆医科大学附属第二医院伦理委员会批准。在参与本研究之前，所有参与者均签署书面知情同意。本研究包括发现和验证队列，发现队列40名受试者，包括10名肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者(肝癌百分之90以上都是肝细胞癌，所以本发明都以HCC指代肝癌患者，以后同)、10名肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者、10名慢性乙型病毒性肝炎(Chronic viral hepatitis B,CHB)患者和10名健康受试者作为正常对照(Normal control,NC)。验证队列包括160名受试者，其中60名肝癌患者，40名肝硬化患者，40名慢性乙型肝炎患者，20名健康受试者作为正常对照(NC)。健康受试者为健康检查结果正常的个体，包括胸片、口腔、腹部超声、大便常规、血常规、肝肾功能、HBV、HCV抗原检测结果，无HIV、梅毒抗体。肝癌、肝硬化和慢性乙型肝炎病毒肝炎的诊断符合美国肝病研究协会、欧洲肝脏研究协会和亚太肝脏研究协会(12-14)。HCC均患者未接受抗癌治疗，所有HCC和LC患者均有乙肝病毒感染，无其他原因引起的口腔疾病或慢性肝病。
本研究共纳入200名受试者。表1为发现队列的人口统计学和临床特征，如表1所示，发现队列共有40名受试者，其中HCC组10名，LC组10名，CHB组10名，NC组10名。两组之间在性别和年龄方面没有统计学上的显著差异(p>0.05)。各组间AST、ALT、AFP、HBV-DNA水平因疾病状态不同而有所差异(p<0.05)。表2为验证队列的人口统计学和临床特征，如表2所示，验证队列共160人，其中HCC组60人，LC组40人，CHB组40人，NC组20人，各组间年龄和性别差异无统计学意义(p>0.05),组间AST、ALT、AFP、HBV-DNA水平差异有统计学意义(p<0.05)。
表1发现队列的人口统计学和临床特征
Figure BDA0003589398210000041
Figure BDA0003589398210000051
正态分布的定量变量以均数±标准差(SD)表示，两组间比较采用student's-t检验，多组间比较采用方差分析。非正态分布的定量变量用中位数(25和75个百分点)表示，两组之间采用Mann-Whitney U检验。a、HCC组VS LC组；b、HCC组VS CHB组；c，HCC组VS NC组。缩写：NC：正常对照；CHB：慢性乙型肝炎；LC：肝硬化；HCC：肝癌；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AFP：甲胎蛋白；NA：不可用。
表2验证队列的人口统计学和临床特征
Figure BDA0003589398210000052
正态分布的定量变量以均数±标准差(SD)表示，两组间比较采用student's-t检验，多组间比较采用方差分析。非正态分布的定量变量用中位数(25和75个百分点)表示，两组之间采用Mann-Whitney U检验。a、HCC组VS LC组；b、HCC组VS CHB组；c，HCC组VS NC组。缩写：NC：正常对照；CHB：慢性乙型肝炎；LC：肝硬化；HCC：肝癌；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AFP：甲胎蛋白；NA：不可用。
唾液标本采集
标本采集时间为上午8点至10点，采集前至少2小时避免进食、饮水和吸烟，并在采集前用清水漱口(15)。我们采用吐痰法采集唾液(16),受试者将唾液吐入预冷的15ml离心管中。4000g,4℃离心15分钟，将上清液转移至1.5mL试管中，进一步离心(12000g,10min,4℃)，完全去除细胞成分。按100:1的比例在唾液上清液中加入蛋白酶抑制剂，-80℃保存待用。
唾液蛋白提取与标记
在发现队列每组中10个唾液样本汇集在一起，获得每组一个混合样本。4组混合样品用冷丙酮沉淀，用Bradford法检测蛋白的蛋白浓度。将唾液蛋白悬浮液、变性、半胱氨酸阻断，并用胰蛋白酶消化。每组样品用iTRAQ标记试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.，Waltham,MA,美国)标记，并用不同的标签重复(NC组标记117和118；CHB标记119和121；LC标记为115和116；HCC标记为113和114)。
肽分离
样品的液相分离采用Shimadzu LC-20AB液相系统，色谱柱为5um 4.6x250mmGemini C18。在214nm波长处监测洗脱峰，每分钟收集一个组分。根据色谱洗脱峰图组合样品，得到20份样品，然后冻干。
高效液相层析
用流动相A(2％ACN,0.1％FA)重组干燥的肽样品，20000g离心10分钟，取上清。分离使用Thermo UltiMate 3000UHPLC(Thermo Fisher Scientific)进行。
质谱检测
用乙腈溶液将上述肽段结晶溶解后，再通过液相色谱以及串联质谱进行鉴定。正离子模式，捕获300-1800m/z离子信息。利用ProteinPilot2.0版蛋白定量分析软件以及IPIHUMAN数据库。取95％可信区间，且5％假阳性率(FDR)；蛋白识别要求至少2个uniquepeptides以上；蛋白质评分的选择阈值>1.3(17)。
唾液蛋白质组学
HCC组与LC组、CHB组、NC组比较，共鉴定出DEPs 1623个。在3个对照组中都存在，且满足变化倍数>1.3或<0.77(1/1.3)，肽段≥2的差异表达蛋白(differentially expressedproteins，DEPs)有152个。这152个DEPs有41个DEPs上调，111个DEPs下调。数据太多，只取前20和最后10个DEPs作为示意，如表3所示。
表3部分DEPs
Figure BDA0003589398210000071
Figure BDA0003589398210000081
实施例2目标蛋白选择
从iTRAQ结果中筛选出差异表达蛋白，并通过免疫印迹在混合和个人唾液样本中进行验证。选择在免疫印迹分析鉴定为肝癌组显著过表达的蛋白。最后，通过免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)发现肝癌组织和肝癌患者唾液中高表达的蛋白作为本研究的目标蛋白。
免疫印迹
提取的蛋白浓度通过BCA蛋白测定试剂盒测定(Beyotime Institute ofBiotechnology,Haimen,中国)。提取发现队列中4组混合唾液样本的蛋白质，后加入5X上样缓冲液(Beyotime,中国),100℃煮沸5分钟。蛋白质样品经10％SDS-PAGE电泳转移到PVDF膜上(Millipore Corporation,Bedford,MA,美国).用5％牛血清白蛋白和TBST在室温下封闭2小时。然后将膜放入一抗稀释液(1:1000；anti-AFP,ab169552,Abcam,英国；anti-ORM1,ab134042,Abcam,英国；anti-MMP9,ab246539,Abcam,英国；anti-Haptoglobin,ab256454,Abcam,英国；anti-Arginase,ab124917,Abcam,英国；anti-FCGR3B,A7894,ABclonal,中国；anti-COTL1,A4550,ABclonal,中国；anti-GAPDH,5174S,Cell Signaling Technology,美国)4℃孵育12小时，再将膜用1x TBST洗三次.将膜放入二抗稀释液中(1:5000；Santa CruzBiotechnology,美国)在常温下孵育1小时，再用1x TBST洗三次。以1:1的比例制备ECL试剂，使用ChemiDoc MP成像系统分析条带(Bio-Rad Laboratories)。
图1为各实验组代表性蛋白质印迹验证结果，并通过免疫印迹对四组混合唾液样本中的AFP、HP、ORM1、ARG1、COTL1、FCGR3B和MMP9的表达水平进行分析。AFP、ORM1、HP和MMP9在HCC组的表达明显高于非HCC组(p<0.05)(图1中a)。在发现队列中随机抽取3名受试者的唾液样本，并采用Western blot检测AFP、ORM1、HP、MMP9和ARG1的表达水平。只有AFP、ORM1和HP在HCC组中显著高于非HCC组(p<0.05)(图1中b)。
免疫组化
通过免疫印迹的结果，就一步利用组织芯片的免疫组化染色检测甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP),α-1-酸性糖蛋白1(α-1-acid glycoprotein 1，AGP1或者ORM1)和触珠蛋白(Haptoglobin，HP)在肝癌组织中的表达。组织芯片(OD-CT-DgLiv03-003,上海芯超,中国)，包括31个HCC组织和31个匹配的癌旁组织。将组织切片在二甲苯和乙醇梯度下复水，用双蒸馏水洗涤，在3％H2O2中浸泡10min，以淬灭内源过氧化物酶活性。用BSA封闭组织芯片30min，然后在AFP、ORM1和HP的一抗稀释液4℃条件下孵育过夜。使用DAKO EnVision+System,HRP(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)在200倍放大下检测AFP、ORM1和HP表达。核染色强度分为阴性、弱、中、强，分别用数字0、1、2、3表示。阳性细胞数分为0、1、2、3、4级，分别占细胞总数的0％、1％-25％、26％-50％、51％-75％、76％-100％。染色指数定义为核染色强度评分与阳性细胞数评分的乘积(范围:0-12)。
在肝癌组织和癌旁组织中比较AFP、ORM1和HP的表达水平，AFP、ORM1和HP的结果如图2所示。AFP和ORM1在肝癌组织中呈强染色，比较同一患者肝癌组织与正常癌旁组织的染色指数，发现肝癌组织中AFP和ORM1的表达明显高于正常组织(p<0.05)(图2中a，图2中b)。而HP染色强度和染色指数在肝癌组间无显著差异(p＝0.155)(图2中c)。
Elisa检测和实验指标检测
使用ELISA试剂盒对来自验证队列的160份唾液样本中AFP(ELH-AFP-1,Raybiotech,Peachtree Corners,GA,美国)和ORM1(243675,Abcam,英国)检测，ELISA试剂盒组分见表4和表5所示，操作方法参考常规双抗体夹心ELISA操作方法。用liaseroins.p.a.(意大利)自动化学发光分析仪测定血清AFP水平。唾液和血液测试由不同的研究人员在两个不同的实验室独立进行。由于标本是随机编号的，研究人员不知道患者的基本信息。
表4 AFP ELISA试剂盒组分：
Figure BDA0003589398210000091
Figure BDA0003589398210000101
表5 ORM1 ELISA试剂盒组分：
Item Quantity
Human alpha 1Acid Glycoprotein Capture Antibody 10X 600μL
Human alpha 1Acid Glycoprotein Detector Antibody 10X 600μL
Human alpha 1Acid Glycoprotein Lyophilized Recombinant Protein 2Vials
Antibody Diluent 5BI 6mL
Wash Buffer PT 10X 20mL
TMB Development Solution 12mL
Stop Solution 12mL
Sample Diluent NS 2x50mL
Anti-tag coated microplate(12x8well strips) 96Wells
Plate Seal 1
对血清AFP、唾液AFP、ORM1、HP进行定量分析(表6)。HCC组血清AFP水平高于LC和CHB组(p<0.001)(图3中a)。HCC组的唾液AFP水平高于非HCC组(p<0.001)(图3中b)。HCC组唾液ORM1水平高于非HCC组(p<0.001)(图3中c)。唾液HP在HCC组中的表达显著高于LC组(p＝0.018)，但在HCC组分别与CHB组和NC组比较，唾液HP的表达差异无统计学意义(p>0.05)(图3中d)。晚期肝细胞癌(TNM III-IV)血清AFP和唾液AFP水平显著高于早期肝细胞癌(TNM I-II)(p<0.001)(图4中a，图4中b)。唾液ORM1在晚期HCC组的表达显著高于早期HCC组(p＝0.02)(图4中c)。早期和晚期肝癌患者的唾液HP水平无显著差异(p＝0.182)(图4中d)。因此，我们以唾液中的AFP和ORM1作为目标蛋白，进一步研究这两种唾液蛋白在肝癌中的诊断作用。
表6各组中AFP、ORM1和HP的表达
Figure BDA0003589398210000111
非正态分布的定量变量用中位数(25和75个百分点)表示。缩写：NC：正常对照；CHB：慢性乙型肝炎；LC：肝硬化；HCC：肝癌；AFP：甲胎蛋白；ORM1：α-1-酸性糖蛋白1；HP：触珠蛋白；NA：不可用。
统计分析
所有实验都至少进行了三次。采用SPSS 20.0进行统计分析(IBM,Armonk,NY,美国)。正态分布的定量变量以均数±标准差(SD)表示，两组间比较采用Student’s-t检验，多组间比较采用方差分析。非正态分布的定量变量以中位数(25和75个百分点)表示，两组间采用Mann-Whitney U检验。多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验进行分析。对于分类变量，我们采用卡方检验分析组间差异和Spearson相关分析来确定两个连续变量(唾液AFP和血清AFP)之间的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析评价目标蛋白的诊断效能。对于两个标志物的联合诊断模型，我们使用二元逻辑回归模型。p值小于0.05为有统计学意义，所有显著性检验均为双侧检验。为便于统计分析，我们对其中部分数值进行了赋值。如果检测值超出检测范围上限，则由最高上限值赋值(例如临床指标血清AFP>1210ng/ml，则赋值血清AFP为1210ng/ml)；当然，对于唾液AFP，唾液ORM1和唾液HP若其超出Elisa检测上限，则将其稀释适当比例后再进行检测。如果检测值低于检测范围的下限，则用最低下限值的一半表示(例如用Elisa试剂盒检测不到唾液AFP，而此试剂盒的最低检测下限为6pg/ml，则赋值唾液AFP为3pg/ml)。
实施例3
我们绘制了血清AFP、唾液AFP、唾液AFP+ORM1的ROC曲线，根据约登指数(敏感性+特异性-1)评估截断值。图5为不同疾病状态标志物的ROC分析。其中：(a)对照组为LC或CHB时血清AFP诊断HCC的受试者工作特征(ROC)曲线。(b)对照组为LC或CHB时唾液AFP诊断HCC的ROC曲线。(c)对照组为LC或CHB时唾液ORM1诊断HCC的ROC曲线。(d)对照组为LC或CHB时唾液ORM1和唾液AFP联合诊断HCC的ROC曲线。HCC：肝癌；LC：肝硬化；CHB：慢性病毒性乙型肝炎。由图5可以看出，在慢性肝病不同阶段下，唾液AFP或唾液ORM1用于诊断HCC的曲线下面积(area under curve,AUC)值均低于血清AFP，而唾液AFP+ORM1联合诊断HCC的AUC值高于血清AFP。
图6是以对照组为LC、CHB、NC时唾液标志物诊断HCC的ROC曲线。其中(a)唾液AFP在诊断HCC中的受试者工作特征(ROC)曲线。(b)唾液ORM1在诊断HCC中的ROC曲线。(c)唾液ORM1和唾液AFP联合诊断HCC的ROC曲线。HCC：肝癌；LC：肝硬化；CHB：慢性病毒性乙型肝炎；NC：正常控制。由图6可知，当我们把LC组、CHB组和NC组作为对照组，唾液AFP的AUC是0.8169(95％置信区间CI:0.7440-0.8898)，在截断值为107.5pg/ml时，敏感性为61.67％,特异性为93％,阳性预测值(PPV)为84.1％，阴性预测值(NPV)为80.2％(图6中a,表7)。唾液ORM1的AUC为0.77(95％CI:0.6898-0.8502)，当截断点设为2484ng/ml时，其敏感性为53.33％，特异性为93％，PPV为82.1％，NPV为76.7％(图6中b，表8)。而唾液中AFP+ORM1联合的AUC为0.8726(95％CI:0.8104to 0.9347)，敏感性为78.3％，特异性为88％，PPV为79.7％，NPV为87.1％(图6中c，表9)。唾液中AFP和ORM1联合筛查肝细胞癌的效能大于血液中AFP单独筛查的效能，能更准确的判断受试者是否为肝细胞癌的疾病风险，且唾液检测为无创检测，受试者更容易接受，适用于长期的筛查和监测，以及早发现早治疗，以免耽误病情，提高患者生存率。
表7唾液AFP阳性对新诊断HCC的预测价值
Figure BDA0003589398210000131
表8唾液ORM1阳性对新诊断HCC的预测价值
Figure BDA0003589398210000132
表9唾液AFP联合ORM1阳性对新诊断HCC的预测价值
Figure BDA0003589398210000133
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.唾液中ORM1和AFP联合作为蛋白标志物在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用。
2.唾液中ORM1、AFP和其结合抗体或片段在制备检测肝癌或非肝癌的产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过该产品检测受试者唾液中的ORM1和AFP蛋白含量，并与对照水平相比较，当受试者唾液中的ORM1和AFP蛋白含量在大于对照水平时，诊断为肝癌患者。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂、试剂盒或试纸。
5.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为ELISA试剂盒。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述唾液为唾液上清液。
7.一种判断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测产品，其特征在于，该检测产品中含有检测ORM1和AFP蛋白含量的试剂。
8.根据权利要求7所述判断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测产品，其特征在于，使用检测ORM1和AFP蛋白含量的试剂可适应胶体金法、电泳法、免疫荧光法、直接竞争ELISA法、间接竞争ELISA法、双抗体夹心ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法进行ORM1和AFP蛋白含量检测。
9.根据权利要求7所述判断受试者是否属于肝癌或非肝癌的检测产品，其特征在于，所述检测ORM1和AFP蛋白为检测唾液中的ORM1和AFP蛋白。
10.根据权利要求1-6任一项所述的应用、或权利要求7-9任一项所述的产品，其特征在于，判断受试者为肝癌或非肝癌检测的指标具体为：受试者唾液中ORM1蛋白含量在2484ng/ml以上，且唾液中AFP蛋白含量在107.5pg/ml以上为肝癌。
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