CN109142565A - 基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法 - Google Patents

基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109142565A
CN109142565A CN201810844897.4A CN201810844897A CN109142565A CN 109142565 A CN109142565 A CN 109142565A CN 201810844897 A CN201810844897 A CN 201810844897A CN 109142565 A CN109142565 A CN 109142565A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
differential protein
screening technique
premature rupture
phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810844897.4A
Other languages
English (en)
Inventor
王建东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Seven Days Biological Polytron Technologies Inc
Original Assignee
Chongqing Seven Days Biological Polytron Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Seven Days Biological Polytron Technologies Inc filed Critical Chongqing Seven Days Biological Polytron Technologies Inc
Priority to CN201810844897.4A priority Critical patent/CN109142565A/zh
Publication of CN109142565A publication Critical patent/CN109142565A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明属于医疗保健技术领域，具体提供了一种基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法。该筛选方法通过结合iTRAQ技术和2DLC‑MS/MS技术，实现了胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的快速高关联度全面筛选，并经过进一步的鉴定分析，所筛选出的差异蛋白IGFBP‑1、AFP、PRL和LZM可作为胎膜早破诊断的生物标志物，具有较高的灵敏度和特异性。

Description

基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选 方法
技术领域
本发明属于医疗保健技术领域，具体涉及一种基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法。基于此筛选方法，本发明还提供了通过该筛选方法获得的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白，并进一步提供了所述差异蛋白作为生物标志物在制备诊断胎膜的产品中的应用。
背景技术
胎膜早破是指临产前胎膜破裂，是常见的产科并发症，发生率为2.7％-7％[谢幸,苟文丽.妇产科学.第8版[M].人民卫生出版社,2013:133-135.]。胎膜早破可对孕妇及胎儿造成严重不良后果[ACOG Practice Bulletin No.188:Prelabor Rupture of Membranes[J].Obstetrics&Gynecology,2018,131(1):e1.]。胎膜早破导致的围产儿死亡率高达2.5-11％，是围产儿发病和死亡的重要原因，及时准确的诊断胎膜早破对孕妇及胎儿的预后有着极其重要的影响。目前临床的诊断方法很多，但诊断的灵敏度及特异度有限，导致部分患者有漏诊及误诊可能。若得不到及时诊断及治疗，将会导致感染，胎盘早剥，早产，羊水过少，脐带脱垂，胎儿窘迫、胎肺发育不良以及胎儿受压综合征等严重的临床后果。
蛋白质组学技术的发展为我们寻找特异的标志物成为可能。很多学者已经用各种蛋白质组学技术[Michel P E,Crettaz D,Morier P,et al.Proteome analysis of humanplasma and amniotic fluid by Off‐GelTM isoelectric focusing followed by nano‐LC‐MS/MS[J].Electrophoresis,2006,27(5‐6):1169-1181..]、[Rüetschi U,RosénKarlsson G,et al.Proteomic analysis using protein chips to detect biomarkersin cervical and amniotic fluid in women with intra-amniotic inflammation[J].Journal of proteome research,2005,4(6):2236-2242.e]、[Thadikkaran L,CrettazD,Siegenthaler M A,et al.The role of proteomics in the assessment ofpremature rupture of fetal membranes[J].Clinica Chimica Acta,2005,360(1-2):27-36.]寻找胎膜早破特异的生物标志物。但是目前披露的筛选胎膜早破生物标志物的方式方法都存在一些缺陷，导致无法获得灵敏度高、特异性好的生物标志物。
iTRAQ技术以其可以同时对多个样本进行检测、定量灵敏、反应速度快、标记率高、重复率较高，使其得到大量的应用。本发明期望借助iTRAQ技术和2DLC-MS/MS技术实现高灵敏度、较好特异性的胎膜早破生物标志物的筛选。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的首要目的在于提供一种基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法，以期通过该筛选方法获得高灵敏度、较好特异性的胎膜早破生物标志物。
基于前述首要目的，本发明首先提供基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法，包括以下步骤：
S1、制定BSA标准品的标准曲线，并采用Bradford法测定样品蛋白质浓度；
S2、取样品加入蛋白酶酶解，对酶解得到的肽段进行iTRAQ标记；
S3、分离标记后的肽段，并进行质谱分析；
S4、对肽段进行分析并与国际人类蛋白数据库进行比对鉴定，筛选出差异大于1.3倍的差异蛋白。
根据本发明的具体实施例，还优选包括步骤：对S4中的差异蛋白进一步进行生物信息学分析，利用DAVID数据库对差异蛋白进行细胞成分、分子功能和生物学进程聚类分析，进一步筛选出高差异性的差异蛋白。
根据本发明的具体实施例，S1的具体步骤为：制定BSA标准品的标准曲线，准备0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μl的标准品(0.2μg/μl BSA)，然后添加PBS至最终体积为20μl。将0μl作为空白对照，然后把样品稀释至测量范围内，每个样品各取20μl至管中。再分别加入180μl的蛋白测试试剂，混匀后置于37℃30min。然后在595nm下用酶标仪测定其吸光度，根据标准曲线计算出样品浓度。
根据本发明的具体实施例，S2中的酶解具体步骤为：各取100微克浓缩样本溶解于20μl 8MUrea溶液，5mM TCEP还原1小时，半光氨酸阻断10分钟，加入三倍体积pH 8.5TEABbuffer，胰蛋白酶37℃酶解过夜。进一步的，S2中的iTRAQ标记具体步骤为：胰蛋白酶酶解消化后，用真空离心泵抽干肽段，接着用0.5mol的TEAB复溶肽段，然后对肽段进行iTRAQ标记，115和119、113和117分别定量标记实验组和对照组的蛋白，置于室温下培养2小时，标记样本加入同一试管，C18萃取柱脱盐，真空冷冻干。
根据本发明的具体实施例，S3中分离的具体步骤为：第一维强阳离子柱分离：在高效液相色谱仪中将标记好的样品加到强阳性离子交换柱，混合样品先经过A相缓冲液重新溶解上样，所述A相缓冲液pH为2.6，并含有10mmol/L的KH2PO4以及25％的乙腈；再经B相缓冲液以0～80％的浓度梯度、200μl/min流速洗脱60min，所述A相缓冲液pH为2.6，并含有10mmol/L的KH2PO4、25％乙腈和350mmol/L的KCl；根据峰型和时间共收取20个梯度，紫外检测波长设置：214nm/280nm；第二维反相液质联用质谱分析：收集的20个梯度真空离心浓缩后，用50μl PRLC A相高效液相缓冲液溶解，A相高效液相缓冲液含有5％乙腈和0.1％甲酸；经过填充Zorbax300SB-C18的反相色谱柱富集；再经B相高效液相缓冲液以5％～35％的浓度梯度、300nl/min流速洗脱90min，B相高效液相缓冲液含有95％乙腈和0.1％甲酸。进一步的关联改进，S3中质谱分析的具体步骤为：洗脱下的样品，通过电喷雾源直接进入Q-star质谱仪，进行一级质谱和串联质谱分析；质谱分析设定标准：MS扫描范围400～1800；MS/MS扫描100～2000；IDA采集模式：一个图谱选择四个最强的母离子进行串级扫描。
根据本发明的具体实施例，通过前述筛选方法，本发明另一目的还提供了通过该筛选方法获得的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白，该差异蛋白为IGFBP-1、AFP、PRL或LZM；进一步的，其中的IGFBP-1和AFP作为差异蛋白具有了更高的差异性，更适合于作为胎膜早破的生物标志物。
根据本发明的具体实施例，通过前述筛选方法获得的差异蛋白，本发明进一步验证了其作为胎膜早破的生物标志物的可行性。并且确征，差异蛋白IGFBP-1、AFP、PRL或LZM可作为生物标志物用于制备诊断胎膜的产品，尤其是其中的IGFBP-1和AFP，更适合作为生物标志物用于制备诊断胎膜的产品。
通过以上技术方案，本发明的有益效果是：
本发明首次在胎膜早破领域将iTRAQ技术和2DLC-MS/MS技术有机的结合在一起，用于筛选胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白，具有筛选快速、结果全面、筛选准确定高的优点。
通过该筛选方法，最终获得了高灵敏度和高特异性的胎膜早破生物标志物IGFBP-1、AFP、PRL和LZM。
附图说明
图1是分子功能途径的差异蛋白GO功能注释；
图2是生物学过程的差异蛋白GO功能注释；
图3是细胞组分的差异蛋白GO功能注释；
图4是Western-blot检测结果图；
图5是不同样品中IGFBP-1的ELISA检测结果；
图6是不同样品中AFP的ELISA检测结果；
图7是不同样品中LZM的ELISA检测结果；
图8是不同样品中PRL的ELISA检测结果；
图9是用Medcalc软件绘制的AFP诊断胎膜早破的ROC曲线；
图10是用Medcalc软件绘制的IGFBP-1诊断胎膜早破的ROC曲线；
图11是用Medcalc软件绘制的PRL诊断胎膜早破的ROC曲线；
图12是用Medcalc软件绘制的LZM诊断胎膜早破的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。
实施例：
本实施例提供一种基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法，本实施例中并且对筛选得到的差异蛋白进行了进一步的鉴定和验证分析，以判定所筛选得到的差异蛋白作为胎膜早破生物标志物的可行性。本实施例的具体方案内容如下：
一、材料与方法
1.临床资料
标本来自2017年3月-2017年6月就诊于首都医科大学附属北京妇产医院的60例患者，本实施例研究内容及研究方案均得到首都医科大学附属北京妇产医院伦理委员会批准。符合以下条件者入组：1)孕34周及以上孕妇；2)无胎膜早破；3)无阴道出血；4)无恶性肿瘤；5)无胎儿畸形及胎儿染色体异常。这些患者在签署知情同意书后入组。30例为对照组，30例患者行人工破膜，为实验组。对照组与实验组临床信息见下表1，两组的平均年龄、体质指数、分娩孕周等均无统计学差异。
阴道分泌物收集：用无菌棉棒在阴道后穹窿蘸取分泌物停留10秒后，将棉棒放入1ml生理盐水中5分钟后，离心后取上清液-20°保存。尿液来自正常孕妇清晨中段尿，离心后取上清液-20°保存，血清来自正常孕妇空腹静脉血，静置30分钟后离心，上清液-20°保存，精液来自门诊常规精液检查，离心后取上清物-20°保存。
表1.实验组与对照组一般情况比较
胎膜早破(30)例 正常孕妇(30)例 P值
年龄(岁) 31.45±4.51 31.59±5.29 0.897
怀孕次数 2.31±1.20 1.85±0.09 —
分娩次数 0.42±0.51 0.57±053 —
分娩孕周(周) 38.05±0.56 39.42±0.97 0.527
体质指数(Kg/㎡) 23.49±3.48 22.42±2.22 0.213
胎膜早破病史 0.052±0.22 0.14±0.37 0.154
2.iTRAQ标记结合2DLC-MS/MS技术筛选差异蛋白
2.1蛋白质浓度Bradford定量
制定BSA标准品的标准曲线，准备0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μl的标准品(0.2μg/μl BSA)，然后添加PBS至最终体积为20μl。将0μl作为空白对照，然后把样品稀释至测量范围内，每个样品各取20μl至管中。再分别加入180μl的蛋白测试试剂，混匀后置于37℃30min。然后在595nm下用酶标仪测定其吸光度，根据标准曲线计算出样品浓度。
2.2蛋白质酶解及iTRAQ标记
各取100微克浓缩样本溶解于20μl 8MUrea溶液。5mM TCEP(ABI)还原1小时，半光氨酸阻断10分钟，加入三倍体积pH8.5TEAB buffer(Sigma)，胰酶37℃酶解过夜。待胰蛋白酶消化后，用真空离心泵抽干肽段，接着用0.5mol的TEAB复溶肽段，然后对肽段进行iTRAQ标记，115和119，113和117分别定量标记实验组和对照组的蛋白，置于室温下培养2小时，标记样本加入同一试管，C18萃取柱脱盐，真空冷冻干，用SCX柱液相分离混合的标记后的肽段。
2.3肽段分离及质谱
第一维强阳离子柱(SCX)分离：在高效液相色谱仪中将标记好的样品加到强阳性离子交换柱(polysulfoethyl column，2.1mm×100mm，5μ，200A)，混合样品先经过A相缓冲液(10mmol/LKH2PO4，25％乙腈，pH2.6)重新溶解上样；再经B相缓冲液(10mmol/L KH2PO4，25％乙腈，350mmol/L KCl，pH2.6)以0～80％的浓度梯度、200μl/min流速洗脱60min；根据峰型和时间共收取20个梯度(紫外检测波长设置：214nm/280nm)。第二维反相液质联用质谱分析(RPLC-MS)：收集的20个梯度真空离心浓缩后，用50μl PRLC A相高效液相缓冲液(5％乙腈，0.1％甲酸)溶解，经过填充Zorbax300SB-C18的反相色谱柱富集；再经B相高效液相缓冲液(95％乙腈，0.1％甲酸)以5％～35％的浓度梯度、300nl/min流速洗脱90min；洗脱下的样品，通过电喷雾源直接进入Q-star质谱仪，进行一级质谱(MS)和串联质谱(MS/MS)分析；质谱分析设定标准：MS扫描范围400～1800；MS/MS扫描100～2000。IDA采集模式：一个图谱选择四个最强的母离子进行串级扫描。
2.4数据分析：利用Protein Pilot软件(版本3.0)对MS/MS肽段进行分析，International Swissprot 090210，human)数据库中搜寻蛋白质并定量。选择差异大于1.3倍的蛋白进行生物信息学分析，利用DAVID数据库对差异蛋白进行细胞成分、分子功能和生物学进程聚类分析。
3.Western验证差异蛋白
用Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit试剂盒，按照试剂盒说明去除阴道分泌物以及血清中的高丰度蛋白[Zhang Y,Cai Y,Yu H,et al.ITRAQ-Basedquantitative proteomic analysis identified HSC71 as a novel serum biomarkerfor renal cell carcinoma[J].BioMed research international,2015,2015..]。以Bradford的方法测定蛋白浓度，分别取30μg加入预先配制的10％聚丙烯酰胺凝胶对应孔中，100V进行电泳分离，用湿转方法将蛋白转至PVDF膜，5％的牛奶封闭，加入稀释好的一抗(一抗1∶1000配置)4℃过夜,并经TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的兔二抗(1∶5000配置)，室温反应2小时后，ECL发光。
4.、ELISA验证差异蛋白
分别用PRL、AFP、IGFBP-1、LZM的ELISA试剂盒(abcam,ab213789,ab193765,ab108508,ab103617)进行验证，样本分5组,分别为胎膜早破孕妇阴道分泌物(AF)、正常孕妇阴道分泌物(VF)、正常孕妇血清、正常孕妇尿液、男性精浆，操作步骤严格按照ELISA试剂盒流程进行各项操作。
二、结果
1.iTRAQ分析差异蛋白：通过质谱鉴定及蛋白质数据库检索，共鉴定出标记蛋白4783种，设置筛选差异蛋白标准为：在2次重复标记中均被检测到的蛋白；蛋白质的鉴定基于2或2个以上特异性肽段的检测；在2次标记中比值≥1.3(t检验,P<0.05)。共选出差异蛋白161个，其中上调蛋白88个(如下表2所示)，下调蛋白73个，其中LZM、IGFBP-1、PRL、AFP等蛋白在胎膜早破患者阴道分泌物中水平明显升高。
表2表达上调的88个蛋白
2.利用DAVID数据库对以上88个水平升高的蛋白进行GO注释，其中主要涉及细胞组成、生物学过程及分子功能途径。如图1～3所示，88种蛋白中，主要涉及11种分子功能，10种生物学过程，10种细胞组分。分子功能主要涉及酶调节、补体激活以及转运。在生物学过程种主要涉及蛋白代谢及免疫反应。细胞组分主要为细胞外基质以、外泌体、溶酶体等。
3.Western blot验证
选择4个差异显著的蛋白IGFBP-1、AFP、PRL、LZM，进行Western blot验证。用考马斯亮蓝染胶确定蛋白上样量。Western blot结果如图4所示，图4中：VF正常孕妇阴道分泌物，AF胎膜早破孕妇阴道分泌物。结合图4，IGFBP-1、AFP、PRL、LZM在胎膜早破患者阴道分泌物中水平明显高于正常孕妇，结果均与质谱结果相符。在尿液以及精液中，四种蛋白的浓度较低，明显低于胎膜早破患者阴道分泌物的浓度。
4.酶联免疫吸附试验(ELISA)结果
4.1利用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测IGFBP-1、AFP、PRL、LZM分别在正常孕妇阴道分泌物、胎膜早破孕妇阴道分泌物、尿液、精浆及血浆中的浓度。结果如图5所示，IGFBP-1浓度在胎膜早破组明显高于对照组，为对照组4.5倍，p＜0.05，差异有统计学意义。如图6所示，AFP在胎膜早破组浓度为对照组的7倍，P值小于0.05，差异有统计学意义。如图7和8所示，LZM、PRL在胎膜早破孕妇分泌物中浓度明显高于正常孕妇。这四种蛋白在尿液及精液中浓度很低，与western blot结果相符。
4.2四种蛋白诊断胎膜早破的ROC曲线
以30例正常孕妇阴道分泌物浓度为对照组，30例胎膜早破孕妇阴道分泌物中标志物浓度作为实验组，用Medcalc软件绘制诊断胎膜早破的受试者工作特征曲线。如图9所示，结果显示当AFP阈值为30.75ng/ml时，其诊断PROM的灵敏度为96.7％，特异度为80.0％，ROC曲线下面积为0.95(95％CI 0.873-0.993,P＜0.05)。如图10所示，当IGFBP-1阈值为45.38ng/ml时，其诊断PROM的灵敏度为87.1％，特异度为90.3％，ROC曲线下面积为0.938(95％CI 0.903-0.993,P＜0.05)。如图11所示，当PRL阈值为26.23ng/ml时，其诊断PROM的灵敏度为100％，特异度为58.1％，ROC曲线下面积为0.824。如图12所示，当设置LZM浓度为430.28ng/ml时，其诊断PROM的灵敏度为76.7％，特异度为76.7％，ROC曲线下面积为0.789(95％CI 0.665-0.0884,P＜0.05)。
三、结论：
胎膜早破病因很多，大部分学者认为与感染、宫腔压力增高、羊膜受力不匀等有关。Menon R[Menon R,Richardson L S.Preterm prelabor rupture of the membranes:adisease of the fetal membranes[C]//Seminars in perinatology.WB Saunders,2017,41(7):409-419..]等认为炎症氧化应激轴、胎膜微裂缝的重构、衰老的激活与裂缝重构的平衡等在胎膜早破中有的重要作用。临床上诊断胎膜早破的方法很多[Eskicioglu F,GurE B.Diagnostic modalities in premature rupture of membranes[J].Int J WomensHealth Reprod Sci,2015,3(02):89-92.s]，比如病史及查体、阴道酸碱度测定、阴道液涂片、羊膜镜、羊膜腔灌注、超声检查[Gupta R,Nagarsenkar A.Using SonographicallyEstimated Myometrial Thickness in Prediction of Latency Interval in Cases ofPreterm Premature Rupture of Membranes(PPROM)[J].The Journal of Obstetricsand Gynecology of India,2016,66(6):431-435.)]及生化检查[Palacio M,Kühnert M,Berger R,et al.Meta-analysis of studies on biochemical marker tests for thediagnosis of premature rupture of membranes:comparison of performance indexes[J].BMC pregnancy and childbirth,2014,14(1):183..]、[Ghasemi M,Jaami R,Alleyassin A,et al.The value of urea,creatinine,prolactin,and beta sub-unitof human chorionic gonadotropin of vaginal fluid in the diagnosis ofpremature preterm rupture of membranes in pregnancy[J].Turkish journal ofobstetrics and gynecology,2016,13(2):62..]等等。但这些诊断方法容易受到干扰，容易误诊及漏诊，并且有导致感染、医源性胎膜早破的可能。蛋白质组学的发展为疾病为我们寻找生物标志物提供更多的可能。
本研究将iTRAQ应用筛选胎膜早破生物标志物，筛选出88种生物标志物，用ELISA试剂盒对AFP、IGFBP-1、PRL、LZM验证，结果显示胎膜早破孕妇阴道分泌物中AFP、PRL、IGFBP-1、LZM浓度均较正常孕妇阴道分泌物浓度高。AFP、IGFBP-1曲线下面积分别为0.959，0.938。PRL、LZM的ROC曲线下面积分别为0.789，0.824，诊断PROM的准确性稍差。AFP、IGFBP-1灵敏度特异度相对较高，诊断的准确性高，是诊断胎膜早破的可靠的生物标志物。除了AFP、PRL、IGFBP-1、LZM之外，通过本发明的筛选方法还可发现许多与胎膜早破相关的蛋白，可能是诊断胎膜早破的特异度灵敏度较高的蛋白，有望通过进一步研究及验证，进而进一步利于胎膜早破的诊断。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (10)

1.基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制定BSA标准品的标准曲线，并采用Bradford法测定样品蛋白质浓度；
S2、取样品加入蛋白酶酶解，对酶解得到的肽段进行iTRAQ标记；
S3、分离标记后的肽段，并进行质谱分析；
S4、对肽段进行分析并与国际人类蛋白数据库进行比对鉴定，筛选出差异大于1.3倍的差异蛋白。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：对S4中的差异蛋白进一步进行生物信息学分析，利用DAVID数据库对差异蛋白进行细胞成分、分子功能和生物学进程聚类分析，进一步筛选出高差异性的差异蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，S1的具体步骤为：制定BSA标准品的标准曲线，准备0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μl的标准品(0.2μg/μl BSA)，然后添加PBS至最终体积为20μl。将0μl作为空白对照，然后把样品稀释至测量范围内，每个样品各取20μl至管中。再分别加入180μl的蛋白测试试剂，混匀后置于37℃30min。然后在595nm下用酶标仪测定其吸光度，根据标准曲线计算出样品浓度。
4.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，S2中的酶解具体步骤为：各取100微克浓缩样本溶解于20μl 8MUrea溶液，5mM TCEP还原1小时，半光氨酸阻断10分钟，加入三倍体积pH 8.5TEAB buffer，胰蛋白酶37℃酶解过夜。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，S2中的iTRAQ标记具体步骤为：胰蛋白酶酶解消化后，用真空离心泵抽干肽段，接着用0.5mol的TEAB复溶肽段，然后对肽段进行iTRAQ标记，115和119、113和117分别定量标记实验组和对照组的蛋白，置于室温下培养2小时，标记样本加入同一试管，C18萃取柱脱盐，真空冷冻干。
6.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，S3中分离的具体步骤为：第一维强阳离子柱分离：在高效液相色谱仪中将标记好的样品加到强阳性离子交换柱，混合样品先经过A相缓冲液重新溶解上样，所述A相缓冲液pH为2.6，并含有10mmol/L的KH2PO4以及25％的乙腈；再经B相缓冲液以0～80％的浓度梯度、200μl/min流速洗脱60min，所述A相缓冲液pH为2.6，并含有10mmol/L的KH2PO4、25％乙腈和350mmol/L的KCl；根据峰型和时间共收取20个梯度，紫外检测波长设置：214nm/280nm；第二维反相液质联用质谱分析：收集的20个梯度真空离心浓缩后，用50μl PRLC A相高效液相缓冲液溶解，A相高效液相缓冲液含有5％乙腈和0.1％甲酸；经过填充Zorbax300SB-C18的反相色谱柱富集；再经B相高效液相缓冲液以5％～35％的浓度梯度、300nl/min流速洗脱90min，B相高效液相缓冲液含有95％乙腈和0.1％甲酸。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，S3中质谱分析的具体步骤为：洗脱下的样品，通过电喷雾源直接进入Q-star质谱仪，进行一级质谱和串联质谱分析；质谱分析设定标准：MS扫描范围400～1800；MS/MS扫描100～2000；IDA采集模式：一个图谱选择四个最强的母离子进行串级扫描。
8.一种权利要求1～7任一权利要求所述筛选方法筛选得到的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白，其特征在于，为IGFBP-1、AFP、PRL或LZM。
9.权利要求8所述的差异蛋白作为生物标志物在制备诊断胎膜的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的差异蛋白为AFP或IGFBP-1。
CN201810844897.4A 2018-07-27 2018-07-27 基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法 Pending CN109142565A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810844897.4A CN109142565A (zh) 2018-07-27 2018-07-27 基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810844897.4A CN109142565A (zh) 2018-07-27 2018-07-27 基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109142565A true CN109142565A (zh) 2019-01-04

Family

ID=64799061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810844897.4A Pending CN109142565A (zh) 2018-07-27 2018-07-27 基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109142565A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109613268A (zh) * 2019-01-09 2019-04-12 新疆医科大学 一种阴茎勃起功能障碍患者血清中差异蛋白体系及其筛选方法和应用
CN110018256A (zh) * 2019-04-24 2019-07-16 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法
CN112730692A (zh) * 2021-01-08 2021-04-30 首都医科大学附属北京朝阳医院 用于预测胎膜早破的生物标记物和方法
CN114047277A (zh) * 2022-01-10 2022-02-15 天津云检医学检验所有限公司 用于预测早产的尿液代谢物特征及早产预测试剂盒
WO2023102786A1 (zh) * 2021-12-08 2023-06-15 深圳华大基因股份有限公司 基因标志物在预测孕妇早产风险中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611319A (zh) * 2006-11-09 2009-12-23 普罗特奥格尼克斯公司 对宫颈-阴道液体进行蛋白质组分析从而在怀孕雌体中检测宫内感染或确定早产危险
CN103865950A (zh) * 2012-12-11 2014-06-18 刘东旭 人源胰岛素样生长因子结合蛋白1在毕氏酵母中的诱导表达及纯化方法、相关抗体制备和应用
CN105779459A (zh) * 2016-04-10 2016-07-20 杨岭燕 一种用于妇产科中胎膜破裂诊断用的适配子及其试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611319A (zh) * 2006-11-09 2009-12-23 普罗特奥格尼克斯公司 对宫颈-阴道液体进行蛋白质组分析从而在怀孕雌体中检测宫内感染或确定早产危险
CN103865950A (zh) * 2012-12-11 2014-06-18 刘东旭 人源胰岛素样生长因子结合蛋白1在毕氏酵母中的诱导表达及纯化方法、相关抗体制备和应用
CN105779459A (zh) * 2016-04-10 2016-07-20 杨岭燕 一种用于妇产科中胎膜破裂诊断用的适配子及其试剂盒

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEERT ZEGELS等: "Use of cervicovaginal fluid for the identification of biomarkers for pathologies of the female genital tract", 《PROTEOME SCIENCE》 *
LEONARDO PEREIRA: "Identification of Novel Protein Biomarkers of Preterm Birth in Human Cervical Vaginal Fluid", 《JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH》 *
QIANG OU等: "An iTRAQ approach to quantitative proteome analysis of cerebrospinal fluid from patients with tuberculous meningitis", 《BIOSCIENCE TRENDS.》 *
ROBERTO ROMERO等: "Isobaric labeling and tandem mass spectrometry: A novel approach for profiling and quantifying proteins differentially expressed in amniotic fluid in preterm labor with and without intra-amniotic infection/inflammation", 《THE JOURNAL OF MATERNAL-FETAL AND NEONATAL MEDICINE》 *
周晓花等: "生化检查在胎膜早破诊断中的应用进展", 《中国实用妇科与产科杂志》 *
欧强: "结核性脑膜炎患者脑脊液定量蛋白质组学研究", 《中国优秀博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109613268A (zh) * 2019-01-09 2019-04-12 新疆医科大学 一种阴茎勃起功能障碍患者血清中差异蛋白体系及其筛选方法和应用
CN109613268B (zh) * 2019-01-09 2021-10-22 新疆医科大学 一种阴茎勃起功能障碍患者血清中差异蛋白体系及其筛选方法和应用
CN110018256A (zh) * 2019-04-24 2019-07-16 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法
CN112730692A (zh) * 2021-01-08 2021-04-30 首都医科大学附属北京朝阳医院 用于预测胎膜早破的生物标记物和方法
WO2023102786A1 (zh) * 2021-12-08 2023-06-15 深圳华大基因股份有限公司 基因标志物在预测孕妇早产风险中的应用
CN114047277A (zh) * 2022-01-10 2022-02-15 天津云检医学检验所有限公司 用于预测早产的尿液代谢物特征及早产预测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109142565A (zh) 基于iTRAQ技术的胎膜早破孕妇阴道分泌物差异蛋白的筛选方法
Scotchie et al. Proteomic analysis of the luteal endometrial secretome
KR101219519B1 (ko) 렉틴을 이용한 암 진단 방법
CN111989090A (zh) 循环微粒的分层自发性早产风险的用途
CN110286234A (zh) 尿液中妊娠糖尿病的蛋白质标志物及其在早期诊断中的用途
CN111505312A (zh) 一组子宫内膜受容性的生物标志物、其筛选方法及应用
EP1914553A1 (en) Method for identifying women with an increased risk of foetal growth retardation
WO2024183386A1 (zh) 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用
JP6336957B2 (ja) 乳癌の判定法
CN115436640B (zh) 适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质
CN112903851A (zh) 一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆代谢分子标志物及其应用
CN111505311A (zh) 一组胚胎反复种植失败的生物标志物、其筛选方法及应用
WO2014160237A2 (en) Methods of prognosing preeclampsia
CN103267851B (zh) 一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法
Zangar et al. A rational approach for discovering and validating cancer markers in very small samples using mass spectrometry and ELISA microarrays
EP1914548A1 (en) Method for identifying women with an increased risk of preterm delivery
CN113125757B (zh) 一种用于母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于母猪早期妊娠检测的方法
Araki et al. Hypertensive disorders of pregnancy: strategy to develop clinical peptide biomarkers for more accurate evaluation of the pathophysiological status of this syndrome
Maeno et al. Development of a novel and rapid measurement system for growth differentiation factor-15, progranulin, and osteopontin in uterine sarcoma
WO2017011876A1 (en) Glycoform biomarkers
CN102959398B (zh) 含有以HpαR为有效成份的肺癌诊断用标记
CN112695088A (zh) 标志物、检测试剂、检测产品和诊断系统
CN112881690B (zh) 呼吸道合胞病毒相关的蛋白标记物tpi1及检测试剂盒
CN114895030A (zh) 唾液中检测肝癌的标志物及其试剂盒
WO2010150804A1 (ja) 破水および羊水塞栓症の検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190104