CN105779459A

CN105779459A - 一种用于妇产科中胎膜破裂诊断用的适配子及其试剂盒

Info

Publication number: CN105779459A
Application number: CN201610217706.2A
Authority: CN
Inventors: 杨岭燕
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-10
Filing date: 2016-04-10
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明涉及一种能够特异性结合ICAM‑1的适体，所述适体具有较强的结合特性和稳定性；该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以ICAM‑1为靶目标，从随机文库中筛选出了能与ICAM‑1特异性结合的DNA适配子。本发明还涉及一种用于鉴定胎膜早破的试剂盒，所述试剂盒包含能够快速鉴定胎膜早破，具有极高的应用价值。

Description

一种用于妇产科中胎膜破裂诊断用的适配子及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于用于妇产科中胎膜破裂诊断用的适配子及其试剂盒。

背景技术

胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane,筒称ROM)可能在孕期随时发生，在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破(PROM)。足月后(37孕周)PROM发生率约为10％；足月前(37孕周前)PROM的发生率为2-3.5％。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素，是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。

现有技术中，采用金标准是诊断胎膜早破的一种准确方法，即在孕妇羊膜腔内注入染料(如美蓝)，若阴道内有被染料着色的液体流出即可诊断为胎膜早破，但采用金标准检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、患者自诉阴道有羊水流出、阴道分泌物pH值变为偏碱性(正常阴道分泌物pH值为4.5～5.5)、显微镜下查见阴道分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操作筒单，但准确性、敏感性均较低。

细胞间黏附分子-1(Intercellular Adhes1n Molecule I,简称ICAM-1,说明书下文中以“ICAM-1”表示细胞间黏附分子-1)属于黏附分子的免疫球蛋白超家族，是分子量76kD～114kD的单链糖蛋白。ICAM-1广泛表达在机体的血管内皮细胞、胸腺上皮细胞和其他种类的上皮细胞等非血源性细胞的表面，T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞等血源性细胞的表面，以及成纤维细胞的表面，与淋巴细胞的浸润有关。虽然在妊娠晚期(孕周28-40)，受胎膜和羊水中的单核细胞上ICAM-1的表达和中性粒细胞活化的影响，妊娠妇女的羊水中ICAM-1水平升高，但目前尚未发现以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测工具的报道。

ICAM-1是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质之一，含量为13.08±6.11ng/mL。胎膜早破时将有羊水从羊膜腔中渗漏至阴道，羊水中的ICAM-1则会出现在阴道分泌物/宫颈粘液(Cervical-Vaginal Fluid,CVF)中。蛋白芯片筛选实验发现：确诊的PROM产妇与确诊的非PROM产妇相比(两组产妇的年龄与妊娠周龄匹配，无基础疾病，无妊娠合并症)，阴道分泌物/宫颈黏液样本中ICAM-1的浓度具有明显差异。因此，可将ICAM-1作为胎膜早破的检测指标。

SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合ICAM-1的适配体具有较为重要的意义。

发明内容

本发明的技术方案通过以下步骤实现：

本发明的目的是提供一种ICAM-1的核酸适配体序列。

本发明中，所述的ICAM-1的核酸适配体(序列1-23)能够特异结合ICAM-1。

本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性结合ICAM-1的试剂盒。

从体外合成的随机寡聚DNA文库，(5′-ACTACGTGCAAGTCACCACA----N36----TGAACATGACGATTACGACC-3′)，其中N36为36个随机寡核苷酸；从中筛选出与ICAM-1特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1：ACTACGTGCAAGTCACCACA；引物P2：GGTCGTAATCGTCATGTTCA，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以ICAM-1为正筛靶标筛选与ICAM-1特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合ICAM-1的序列，本发明中命名为适配体ICAM-1-AP-1～23。序列如下：

ICAM-1-AP-1:ACTACGTGCAAGTCACCACACTCACTCAATCTTCACCCTCATTTACATTCCCTTTAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-2:ACTACGTGCAAGTCACCACAACATTTTATCCTAACATTACATCTTTCTTATCCTCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-3:ACTACGTGCAAGTCACCACACAATATTATCATTTCCCTACTCTATTCTCATCATCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-4:ACTACGTGCAAGTCACCACACCCAAACAAACTTTTTTACCGCTTCACATCCCTATTGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-5:ACTACGTGCAAGTCACCACATTCTCTTCAACATAAACACATCATTATTTTTCTATAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-6:ACTACGTGCAAGTCACCACATTACAACTCCCATACTTACGCACTAACCAATCACAAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-7:ACTACGTGCAAGTCACCACACACATTCAATCACTACAATCATCACACTTTAACCACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-8:ACTACGTGCAAGTCACCACACTCCATACCTATACCTCGTATCTCACTTTCCCTTTCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-9:ACTACGTGCAAGTCACCACACTTTTCTACCAACTCCTTATTCCTTCTTCACACCACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-10:ACTACGTGCAAGTCACCACACAACTCTATCCACTCTCCTCAACTCTAACTACAACTGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-11:ACTACGTGCAAGTCACCACACAAATCATTCTCATCTACACATTCCCCCTTTACTATGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-12:ACTACGTGCAAGTCACCACATATTCATCCCTCTTACTCGCAATCACTATTAAACCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-13:ACTACGTGCAAGTCACCACACAATTTTTAACCCACCACCCACAAAATCAACAATACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-14:ACTACGTGCAAGTCACCACATCACTCCTTATTCCCAAGCTATTTATAATATATAAAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-15:ACTACGTGCAAGTCACCACATACCCTATCCAAACAATCCTATCTCCCACCTATCCCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-16:ACTACGTGCAAGTCACCACACTATCCACAATTTTAATACCAAATCTCTAAATAAACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-17:ACTACGTGCAAGTCACCACAAATAAACCACCCCAACTATTATATATTACTTCTTCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-18:ACTACGTGCAAGTCACCACAATACTTTCATTCCACCTTATCACATATCCCCACTTCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-19:ACTACGTGCAAGTCACCACACTCACATTCATTACCCTCACCACATACCATACACCCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-20:ACTACGTGCAAGTCACCACATACTAAATCAAAACATTCTACTTACCCACTTTCTTTGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-21:ACTACGTGCAAGTCACCACACCCCTCAATTCCCTAACGAACTACAACCTCTATAATGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-22:ACTACGTGCAAGTCACCACAAATATTTCTTCCCTCCGCATACTTAAATAAAATCCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

ICAM-1-AP-23:ACTACGTGCAAGTCACCACATAACTTATCCCTACACCCAATCACACAACTTAATCCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离和定量检测ICAM-1，具有分离效果快，效率高，节省时间，节约成本的功效。具有极强的应用价值。

本发明的有益效果：(1)获得了一种能够特异高效结合ICAM-1的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。(2)以核酸适配子为基础可以制备成为特异性检测ICAM-1的试剂盒。

具体实施方式

实施例1:核酸适配体筛选

从体外合成的随机寡聚DNA文库，5′-ACTACGTGCAAGTCACCACA----N36----TGAACATGACGATTACGACC-3′。

所用引物:

F：5，-ACTACGTGCAAGTCACCACA-3

R：5，-GGTCGTAATCGTCATGTTCA-3

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。80μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与3ug ICAM-1蛋白37℃孵育40min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.7mol/L醋酸铵，l.6mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行16轮。将最后一轮筛选得到的适配子进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。测定得到序列如SEQID NO：1-23所示。

实施例2特异性高亲和力的ICAM-1结合适配子的获得

将RNA适配子分别取1.5μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的ICAM-1蛋白37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与ICAM-1蛋白的解离常数。结果如下：

实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析

从以上结果可以看出，本发明的23个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中也没有所述结合特性的适配子能够结合ICAM-1蛋白。

实施例4降解活性分析

分别采用人血白蛋白，RASAL1蛋白，IgG，血红蛋白与23条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与ICAM-1蛋白结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例6临床试验分析

将23个适配子分别用于检测同样的妊娠妇女阴道分泌物的临床样本，包括有胎膜早破组和健康对照组，其中胎膜早破组为100例，健康对照组为50例，产妇临床发动时的阴道分泌物作为待检样本。实验对象临床筛选标准：

胎膜早破组：(i)临产前观察到羊水漏出；

(ii)阴道分泌物样本抑试纸检测阳性；

(iii)羊齿植物叶状结晶检测阳性。

健康对照组：(i)临产前未观察到羊水漏出；

(ii)阴道分泌物样本抑试纸检测阴性；

(iii)羊齿植物叶状结晶检测阴性。

样本收集：采用常规的阴道分泌物收集方法来获得样本。

将150组妊娠妇女阴道分泌物加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡溶解。分别将偶联有磁珠的23组适配子与150组的阴道分泌物溶液混合孵育20分钟，而后磁分离，即可获得相应的分离的ICAM-1蛋白，通过检测发现，在100例胎膜早破组中，23组适配子检测到相对高浓度的ICAM-1蛋白的100组样品均为胎膜早破组的样品，而在健康组中没有检测到高浓度的ICAM-1蛋白，由此可见，可以实现100％的检测效果。具有极高的准确性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉杨岭燕

〈120〉一种用于妇产科中胎膜破裂诊断用的适配子及其试剂盒

〈210〉1

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-1

ACTACGTGCAAGTCACCACACTCACTCAATCTTCACCCTCATTTACATTCCCTTTAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉2

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-2

ACTACGTGCAAGTCACCACAACATTTTATCCTAACATTACATCTTTCTTATCCTCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉3

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-3

ACTACGTGCAAGTCACCACACAATATTATCATTTCCCTACTCTATTCTCATCATCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉4

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-4

ACTACGTGCAAGTCACCACACCCAAACAAACTTTTTTACCGCTTCACATCCCTATTGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉5

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-5

ACTACGTGCAAGTCACCACATTCTCTTCAACATAAACACATCATTATTTTTCTATAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉6

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-6

ACTACGTGCAAGTCACCACATTACAACTCCCATACTTACGCACTAACCAATCACAAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉7

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-7

ACTACGTGCAAGTCACCACACACATTCAATCACTACAATCATCACACTTTAACCACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉8

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-8

ACTACGTGCAAGTCACCACACTCCATACCTATACCTCGTATCTCACTTTCCCTTTCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉9

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-9

ACTACGTGCAAGTCACCACACTTTTCTACCAACTCCTTATTCCTTCTTCACACCACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉10

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-10

ACTACGTGCAAGTCACCACACAACTCTATCCACTCTCCTCAACTCTAACTACAACTGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉11

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-11

ACTACGTGCAAGTCACCACACAAATCATTCTCATCTACACATTCCCCCTTTACTATGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉12

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-12

ACTACGTGCAAGTCACCACATATTCATCCCTCTTACTCGCAATCACTATTAAACCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉13

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-13

ACTACGTGCAAGTCACCACACAATTTTTAACCCACCACCCACAAAATCAACAATACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉14

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-14

ACTACGTGCAAGTCACCACATCACTCCTTATTCCCAAGCTATTTATAATATATAAAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉15

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-15

ACTACGTGCAAGTCACCACATACCCTATCCAAACAATCCTATCTCCCACCTATCCCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉16

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-16

ACTACGTGCAAGTCACCACACTATCCACAATTTTAATACCAAATCTCTAAATAAACGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉17

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-17

ACTACGTGCAAGTCACCACAAATAAACCACCCCAACTATTATATATTACTTCTTCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉18

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-18

ACTACGTGCAAGTCACCACAATACTTTCATTCCACCTTATCACATATCCCCACTTCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉19

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-19

ACTACGTGCAAGTCACCACACTCACATTCATTACCCTCACCACATACCATACACCCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉20

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-20

ACTACGTGCAAGTCACCACATACTAAATCAAAACATTCTACTTACCCACTTTCTTTGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉21

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-21

ACTACGTGCAAGTCACCACACCCCTCAATTCCCTAACGAACTACAACCTCTATAATGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉22

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉ICAM-1-AP-22

ACTACGTGCAAGTCACCACAAATATTTCTTCCCTCCGCATACTTAAATAAAATCCAGGTCGTAATCGTCATGTTCA

〈210〉23

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400ICAM-1-AP-23

ACTACGTGCAAGTCACCACATAACTTATCCCTACACCCAATCACACAACTTAATCCGGTCGTAATCGTCATGTTCA

Claims

1.一种适体，其特征在于：能够检测胎膜早破。

2.如权利要求1所述的适体，其特征在于：能够特异性结合ICAM-1。

3. 如权利要求1-2任一项所述的适体，其特征在于：其序列为包括SEQ ID No.1-23任一条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

4.权利要求1-3任一项所示的适体在检测ICAM-1的应用。

5.权利要求1所示的适体用于制备检测胎膜早破的试剂盒应用。

6.一种检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一项所述的适体。