CN105334328B - 一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含特异结合人瘦素蛋白leptin的核酸适体的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人瘦素蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的人瘦素蛋白，将其制备成为相应的试剂盒，将用于眼病的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。

Description

一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法。

背景技术

格雷夫斯病(Graves' disease)是一种常见病，女性发病率为1/1000人/年。除甲状腺功能亢进以外，25-50%患有格雷夫斯病的个体病情发展到在临床上累及眼睛，即甲状腺眼病。格雷夫斯眼病(Graves' Ophthalmopathy, GO或TAO)是甲状腺眼病的典型形式。虽然一些GO患者只患有轻微的眼睛不适，但是3-5%患有剧烈疼痛和炎症伴有复视乃至视力丧失。目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任何一种药物能有效治疗TAO，并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。

近年来的研究表明，人瘦素蛋白(rh-leptin)对TAO患者眼眶前脂肪成纤维细胞增殖、移行以及细胞分化过程中细胞内脂质形成具有重要的作用。因此，检测人瘦素蛋白的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测人瘦素蛋白的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。

核酸适体（Aptamer,又称适配体,适配子）是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment, SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合leptin的核酸适体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。

所述核酸适体与leptin蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

所述核酸适体可用于制备检测leptin的试剂盒。

利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的leptin，从而用于甲状腺相关眼病筛查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获leptin进行检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：

5’ -TAGACTATCATGTGACTT (N39) GAGTGCTCGATGCTACTAG-3’ ；N39代表 39 个随机核苷酸。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75 μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA 分子，然后与2ug leptin蛋白（利用CN100366738C公开的方法，表达得到的目的蛋白），37°C孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素，0. 55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0. 15% SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ1 DEPC水中；以RNA为模板 RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行12轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-15所示。具体序列如下所示：

leptin -1：

TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:1）

leptin -2：

TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:2）

leptin -3：

TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:3）

leptin -4：

TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:4）

leptin -5：

TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:5）

leptin -6：

TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:6）

leptin -7：

TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:7）

leptin -8：

TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:8）

leptin -9：

TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:9）

leptin -10：

TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:10）

leptin -11：

TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:11）

leptin -12：

TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:12）

leptin -13：

TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:13）

leptin -14：

TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:14）

leptin -15：

TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:15）

实施例2 蛋白结合适配子的性能测定

将RNA适配子分别取2.0μ g，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37°C 消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA ；通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的 RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（1-200nM)的leptin 37°C 孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与leptin的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(单位nM)
		leptin-1	10.9
leptin-2	10.8
		leptin-3	9.9
leptin-4	10.3
		leptin-5	10.5
leptin-6	9.6
		leptin-7	9.8
leptin-8	10.0
		leptin-9	10.3
leptin-10	9.9
		leptin-11	9.8
leptin-12	10.1
		leptin-13	10.6
leptin-14	9.7
		leptin-15	9.7
PBS空白对照	无结合能力

实施例3 所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白， 霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，Lp-PLA2蛋白, leptin，与14条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与leptin结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例4 所述适配子疾病的诊断

将14个适配子分别与12个格雷夫斯眼病患者以及正常人的血液混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的leptin蛋白的含量，通过分析发现，12个格雷夫斯眼病患者中leptin蛋白的含量相对于正常人显著增加2倍。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉李倩

〈120〉一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法

〈160〉15

〈210〉1

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -1：

TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG

〈210〉2

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -2：

TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:2）

〈210〉3

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -3：

TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:3）

〈210〉4

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -4：

TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:4）

〈210〉5

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -5：

TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:5）

〈210〉6

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -6：

TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:6）

〈210〉7

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -7：

TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:7）

〈210〉8

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -8：

TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:8）

〈210〉9

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -9：

TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:9）

〈210〉10

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -10：

TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:10）

〈210〉11

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -11：

TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:11）

〈210〉12

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -12：

TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:12）

〈210〉13

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -13：

TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:13）

〈210〉14

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -14：

TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:14）

〈210〉15

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉leptin -15：

TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQ ID NO:15）

Claims (1)

1.一种用于眼科疾病检测的试剂盒，其含有核酸适体，所述核酸适体为SEQ ID No：1所述，所述眼科疾病为格雷夫斯眼病。