NO843872L - Ekspresjon av plasmodium falciparum polypeptider fra klonet cdna - Google Patents

Description

"EKSPRESJON AV PLASMODIUM FALCIPARUM POLYPEPTIDER

FRA KLONET cDNA"

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA-molekyler omfattende kunstig konstruerte polynukleotid-sekvenser som hovedsakelig tilsvarer alle eller en del av plasmodium falciparum budbringer RNA (mRNA) eller genomisk DNA

(gDNA), og oppfinnelsen vedrører spesielt polynukleotid-sekvenser som koder for minst et protein eller en del derav. Oppfinnelsen vedrører spesielt DNA-molekyler omfattende kunstig konstruerte polynukleotid-sekvenser som koder for hele eller en del av et eller flere proteiner som forekommer i P. falciparum, eller en forløper eller modifikasjon derav. Slike DNA-molekyler er i stand til å bli uttrykt som et eller flere polypeptider.

Av de fire species av plasmodium som bevirker malaria

i mennesker er P. falciparum den viktigste og er en hovedårsak til barnedødelighet i tropiske land. Det er anslått at i Afrika alene bevirker malaria en million dødsfall pr. år og at over hele verden lever 2.000 millioner mennesker i områder hvor det er mulighet for overføring av malaria-parasitter. Immunitet mot malaria utvikles sakte slik at gjentatte infeksjoner bevirker vesentlig sykelighet i barn som lever i endemiske områder. Voksne personer som har vokst opp i endemiske områder vil ofte ha detekterbare parasitter i sitt blod, men lider sjelden av alvorlig sykdom selv om malaria-smitte er en bidragende årsak til voksen-anemi og kan bevirke andre alvorlige sykdommer.

I mange land er malaria blitt et mer alvorlig sykdoms-problem i løpet av det siste tiår. Dette skyldes flere faktorer som inkluderer sammenbrudd i malaria-kontroll-programmer, at det er dukket opp insekticid-resistens i moskito-vektorene og viktigst er at det er oppstått stammer av P. falciparum som er resistente mot kloroquin som er en nøkkelmedisin anvendt for prevensjon og behandling av smitten.

P. Falciparum er en enkeltceller organisme av familien plasmodiidae, av orden plasmodiia, underklasse haemosporidia; subfylum sporozoa; og fylum protozoa.

(Pathology of Protozoal and Helminthic Diseases, utgitt av R.A. Marcial-Rojas, Williams & Wilkins, Baltimore 1971).

Som andre plasmodia har P. falciparum en komplisert livs-syklus. Smittetrinnet til mennesker (sporozoite) injiseres i blodet når en hunmoskito suger blod. I

løpet av minutter invaderer sporozoiter leverceller og undergår inne i disse celler et trinn med modning og ukjønnet formering som resulterer i produksjon av hundreder av merozoiter fra en sporozoite. Til slutt går levercellen i stykker og slipper ut morozoiter som så kan initiere en annen ukjønnet syklus i blodet ved å invadere røde blodlegemer (RBC).

Som i levercellen modnes parasitten inne i RBC og undergår ukjønnet formering til å frembringe tallrike merozoiter som når de slippes inn i blodet, etter brudd i det infiserte RBC, kan invadere en annen RBC og initiere en annen ukjønnet syklus. Av grunner som ikke er klart forstått resulterer modning inne i RBC leilighetsvis i dannelse av hånlige eller hunlige gameter. Når disse kjønnede trinn inntas med blod av en moskito fusjonerer de til å initiere en prosess med kjønnet formering med sluttresultat tusener av sporozoiter i spyttkjertelen i moskitoen som hver er i stand til å reinfisere et menneske.

Immun-responsen mot malaria-infeksjon er kompliert. Både antistoff og celle-medierte immunresponser forekommer og responser er rettet mot komponenter av flere av livs-syklustrinnene. Seraene fra antatt immune individer inneholder antistoffer som gjenkjenner mer enn et hundre forskjellige polypeptid-antigener i ukjønnede blodtrinn av P. falciparum. Antistoffer til ukjønnede blodtrinn- antigener har antiparasittiske virkninger, men hvilke av de mange spesifisiteter som er vertsbeskyttende er ikke sikkert fastslått.

Det er ganske mange tegn som tyder på at de ukjønnede blodtrinn av P. falciparum har to typer av antigener som kan være mål for beskyttende immunresponser. Antigener av en type er felles for alle isolater av P. flaciparum slik at immunresponser med disse spesifisiteter indusert ved infeksjon med et isolat eller stamme av P. falciparum vil være like effektive mot andre isolater eller stammer. Antigener av den annen type varierer imidlertid i forskjellige isolater eller stammer av P. falciparum. Verts-beskyttende immunresponser retter mot disse antigener vil således være begrenet i sin virkning. En eller flere av disse responser av begrenet spesifisitet svarer for den iakttagelse at ekspondering for et isolat av P. falciparum gir bedre beskyttelse mot angrep med det homologe isolat enn med heterologe isolater.

Et system for kontinuerlig dyrking av de ukjønnede blodformer av P. falciparum in vitro er tilgjengelig, men det vil imidlertid ikke være mulig å frembringe tilstrekkelige mengder av de passende antigener som kreves for en vaksine fra dyrkede parasitter. Videre dyrkes parasitter in vitro i human RBC og i et medium supplert ved humanserum og det ville således være vanskelig å

sikre at parasittantigener avledet fra kulturer var fri for humanantigener som kunne indusere autoimmunitet i immuniserte individer.

Under anvendelse av de metoder som er utviklet i løpet av de siste ti år er det nå mulig å innføre DNA (deoksy-ribonuklein-syre) som koder for ikke-bakterieproteiner i celler ved mellomkomst av et plasmid eller bakteriofag (se f.eks. Burrell, C.J. et al, Nature, 279, 43-47,

1979). Generelt omfatter konstruksjonen av de rekombinante DNA-molekyler trinnene med å avlede den DNA-modell som koder for det ønskede protein fra det

ikke-bakterielle opphav og sette inn dette stykke av heterolog DNA i et kloningsmiddel, som f.eks. en bakteriofag, og deretter infisere en passende bakterievert med den modifiserte bakteriofag. En generell drøftelse av manipulering av gener som fører til dannelsen av rekombinant DNA ble publisert av S. Cohen i Scientific American, 233, 24-33, 1975.

Mange ikke-bakterielle gener er blitt innført i og formert i bakterier som f.eks. Escherichia coli, og mange ikke-bakterielle proteiner er blitt uttrykt av bakterier under anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, inklusive haemagglutinin av influensa-viruser (Porter A.G. et al, Nature, 282, 471-477, 1979), videre heptatitis B. virus-protein (Burrell, C.J. et al 1979, loe. eit.), og muse-immunoglobulin tunge kjeder (Kemp. D.J. & Cowman,

A.F., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 1981, 78, 4520-4524). Til tross for det betraktelige arbeid som er gjennomført

i de senere år med rekombinant DNA-forskning har det vært en resultatpause som tilskrives umiddelbar og praktisk anvendelse på området med rekombinant DNA som involverer manipulering av protozoisk genetisk material.

Et forsøk på produksjon av vaksiner for indusering av immunitet mot plasmodia-antigener, omhandlet i europeiske patentansøkninger nr. 0062924 og 0071705, begge i navnet The Wellcome Foundation Limited, har vært basert på bruken av monoklonale antistoffer for å definere visse antigener med molekylvekt og immuno-fluorens-farvemønstre og å isolere disse antigener for bruk ved immunisering. Den foreliggende oppfinnelse er imidlertid basert på en fullstendig forskjellig metode ved å anvende rekombinante DNA-metoder ved fremstilling av antigeniske polypeptider.

Den foreliggende oppfinnelse muliggjør syntese av individuelle polypeptider hovedsakelig ekvivalente med naturlig forekommende plasmodium-proteiner, spesielt P. falciparum-proteiner som gjenkjennes som antigener av definerte sera. Ved en spesiell utførelsesform tilveie bringer oppfinnelsen syntese av polypeptider hovedsakelig ekvivalente med en familie av plasmodium-antigener som refereres til som S antigener. S antigener finnes i sera pasienter under den akutte fase av en malaria-infeksjon og slippes også inn i mediet når P. falciparum dyrkes in vitro. Forskjellige isolater av P. falciparum erkarakterisert

ved S antigener som kan variere i antigenisitet og molekylvekt. Immunresponser rettet mot S antigener kan være en komponent av den verts-beskyttende isolat-begrensede immunitet som er nevnt i det foregående. Ved en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen syntese av andre polypeptider som er felles for alle isolater av P. falciparum og kan derfor simulere immunresponser som er verts-beskyttende mot alle isolater.

Oppfinnelsen muliggjør også syntese av P. falciparum polypeptider enten som individuelle sådanne eller som fusjonsprodukter av to eller flere polypeptiddeler. I tillegg muliggjør den foreliggende oppfinnelse midler hvormed den samtidige syntese av immunogene proteiner som normalt kodes for av forskjellige varianter av P. falciparum kan gjennomføres.

Ved et aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et DNA-molekyl omfattende en nukleotidsekvens hovedsakelig tilsvarende hele eller en del av P. falciparum RNA. Foretrukket koder nukleotidsekvensen for minst et polypeptid av P. falciparum. Et slikt DNA-molekyl er i stand til å uttrykkes som et polypeptid som kan gjenkjennes som hovedsakelig tilsvarende et P. falciparum protein. Ved et spesielt aspekt av oppfinnelsen er DNA molekylet i stand til å uttrykkes som et polypeptid som kan gjenkjennes som hovedsakelig tilsvarende S-antigen ved sitt antigeniske slektsskap med S-antigenet som slippes ut i dyrkingssupernatantene av P. falciparum stammer.

Ved en alternativ utførelsesform kan nukleotid-sekvensen kode for hele eller en del av minst to P. falciparum polypeptider som hvert er avledet fra et forskjellig

isolat, stamme eller variant av P. falciparu.

Som eksemplifisering på dette aspekt av oppfinnelsen kan polynuleotidsekvensene karakteriseres ved at minst en del derav har en eller flere partielle base-sekvenser hovedsakelig som vist i fig. 1 og 2. Den spesielle sekvens vist i fig. 1 er blitt identifisert som tilsvarende en del av S-antigenet av P. falciparum FC27. Den spesielle sekvens vist i fig. 2 er i stand til

å uttrykkes som et polypeptid med en relativ molekylmasse (Mr) på 140.000 som er felles for alle isolater av

P. falciparum og som øyensynlig, men ikke eksklusivt, befinner seg på membranen av ny-ivaderte røde blodlegemer.

Det skjønnes at polynukleotid-sekvensene ved dette

aspekt av oppfinnelsen kan oppnås fra naturlige, syntetiske eller halvsyntetiske kilder. Videre kan disse polynukleotid-sekvenser være naturlig forekommende sekvenser eller de kan være beslektet ved mutasjon, inklusive enkle eller multiple basesubstitusjoner, delesjoner, inskudd og inversjoner, med slike naturlig forekommende sekvenser, hele tiden på betingelse av at det DNA-molekyl som omfatter en slik sekvens kan uttrykkes som et polypeptid som fremviser antigenisiteten av et eller flere antigener av P. falciparum.

Nukleotid-sekvensen kan ha ekspresjons-kontrollsekvenser beliggende ved siden av, idet slike kontrollsekvenser er avledet enten fra P. falciparum nukleinsyre eller fra en heterolog kilde.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et rekombinant DNA-molekyl omfattende en eksepresjons-kontrollsekvens med promoter-sekvenser og initiator-sekvenser som heri definert og en nukleotid-sekvens som hovedsakelig koder for hele eller en del av minst et protein av P. falciparum, idet nukleotid-sekvensen befinner seg i 3'-stilling til

promoter- og initiator-sekvensene.

Ved et ytterligere aspekt tilveiebringes en verts-celle inneholdende et rekombinant DNA klonings-middel og/eller et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i det foregående.

Ved ytterligere aspekter tilveiebringes fusjonerte polypeptider omfattende polypeptid-sekvenser som fremviser P. falciparum antigenisitet som den C-terminale sekvens,

og et ytterligere polypeptid, f.eks. et polypeptid som kodes for av DNA i et kloningsmiddel, som den N-terminale sekvens fusjonert dertil. Et slik fusjonert polypeptid kan fremstilles av en vert-celle transformert eller infisert med et rekombinant DNA klonings-middel som beskrevet i det foregående og det kan deretter isoleres fra verts-cellen til å gi det fusjonerte polypeptid hovedsakelig fritt for andre verts-celle-proteiner.

Oppfinnelsen vedrører også syntetiske peptider eller polypeptider som fremviser antigenisiteten av hele eller en del av i det minste et antigen av P. falciparum. Som anvendt heri betyr betegnelsen "syntetisk" at peptidene eller polypeptidene er blitt fremstilt ved hjelp av kjemiske eller biologiske midler, f.eks. ved hjelp av kjemiske synteser eller ved rekombinante DNA-metoder som fører til biologisk syntese. Slike polypeptider kan selvfølgelig oppnås ved spaltning av et fujsonert polypeptid som beskrevet i det foregående og separering av det ønskede polypeptid fra det ytterligere polypeptid som kodes for av DNA i kloningsmidlet ved metoder som er vel kjent på området. Alternativt, når først aminosyre-sekvensen i det ønskede polypeptid er blitt etablert, f.eks. ved bestemmelse av nukleotid-sekvensen som koder for det ønskede polypeptid, kan polypeptidet produseres syntetisk, f.eks. ved hjelp av den velkjente Merrifield fast-fase-syntese-metode (A. Marglin og R.B. Merrifield, Annu. Rev. Biochem. 39, 841 (1970)).

Det forståes at polypeptid-sekvenser som fremviser antigenisitet-egenskapen til antigener for P. falciparum vil ha anvendelse i serologisk diagnose og ved fremstilling av enkle eller multivalente vaksiner mot P. falciparum ved hjelp av metoder som er velkjent på området med vaksinefremstilling.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et DNA-molekyl som hovedsakelig koder for i det minste et polypeptid av P. falciparum omfattende:

(a) P falciparum enkelttrådet RNA isoleres

(b) en første enkelttråd av DNA komplementær til

enkelttråden av P. falciparum RNA fremstilles

(c) en annen enkelttråd av DNA komplementær til

og hydrogenbundet til den første DNA-tråd fremstilles for å fremstille en dobbelttrådet

DNA.

Den således fremstilt dobbelttråd av DNA kan inskytes i

et kloningsmiddel etter behandling av kloningsmidlet med en restriksjons-endonuklease, idet fri ender av kloningsmidlet forenes med DNA-molekylet slik at det dannes et rekombinant kloningsmiddel. Dette kan i sin tur innføres i en passende verts-celle f.eks. ved transformering eller infeksjon.

Det forståes også at det P. falciparum DNA som innskytes

i kloningsmidlet og som koder for polynuleotid-sekvenser som kan uttrykkes som et polypeptid som fremviser antigenisitet av et eller flere antigener av P. falciparum kan avledes fra kromosomal DNA av P. falciparum ved behandling av slik DNA med en passende restriksjons-endonuklease .

Som anvendt heri har de ovenfor anførte betegnelser følgende betydninger: Nukleotid: En enhet av DNA eller RNA omfattende en sukkerdel (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig heterosyklisk base. Basen er knyttet til sukkerdelen via det glykosidiske karbon (1' karbon av pentose) og basen karakteriserer nukleotidet. De fire DNA-baser er adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og tymin (T). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil (U).

Rekombinant DNA: - en hybrid dobbelttrådet DNA-sekvens omfattende minst to dobbelttrådede DNA-nukleotid-sekvenser idet den første sekvens ikke finnes sammen i naturen med den annen sekvens.

Kloningsmiddel: - ikke-kromosomalt dobbelttrådet DNA

som kan formeres når den anbringes inne i en en-cellet mikroorganisme.

Bakteriofag: - kloningsmiddel avledet fra virus eller bakterier som kan infisere visse stammer av bakterier.

Plasmid: - kloningsmiddel avledet fra virus eller bakterier.

Strukturelt gen: - en sekvens av DNA-nukleotider som koder for en sekvens av aminosyrer som er karakteristisk for et spesifikt polypeptid.

Promoter- sekvenser: - sekvenser av DNA-nukleotider som styrer initiering, hastighet eller størrelse for transkirpsj on.

Initiator- sekvenser: - sekvenser av DNA-nukleotider som styrer initieringen av transskripsjon.

Transskrips i on: - den prosess hvorved RNA-polymeriase bringes til å bevege seg langs DNA-sekvensen under dannelse

av budbringer-RNA.

Translås i on: - prosessen med å frembringe et polypeptid fra budbringer-RNA.

Operon: - et eller flere strukturelle gener som koder for polypeptid-ekspresjon som foregås av initiator-sekvenser.

Ekspres i on; - prosessen involvert i å produsere et polypeptid fra et strukturelt gen.

Lysogeni: - integreringen av bakteriofag-nukleocid-sekvenser i et bakterielt genom.

Oppfinnelsen skal beskrives ytterligere med henvisning til de vedføyde figurer hvori: Figur 1 viser nukleotidet og tilsvarende aminosyresekvens av et klon nummerert som Agl6 som tilsvarer S-antigenet av isolat FC27. Figur 2 viser en delsekvens av et klon nummerert som Agl3 - sekvensen er blitt anordnet til å vise at dette klon inneholder begge 24 base-repeteringer (8 aminosyrer) og 12 base-repeteringer (4 aminosyrer). Figur 3 er et skjematisk diagram av konstruksjonen av en bakterifag-vektor og bibliotek fra P. falciparum og ekspresjon av polypeptidene avledet derfra. Figur 4 viser deteksjon med human-immunsera av rekombinante E. coli kloner som uttrykker polypeptider som fremviser P. falciparum antigenisitet. Figur 5 viser (A) en sekundær seleksjon under anvendelse av humane immunsera av de positive kloner selektert i figur 3, sammenlignet med (B) hybridisering av 32p merket cDNA fra P. falciparum mRNA til et duplikat-sett av de samme kloner, og

Figur 6 viser deteksjonen av de fusjonerte P. falciparum

- 3-galaktosidase-polypeptider ved hjelp av Coomassi-farving (A), med anti-3-galaktosidase-antistoffer (B) og også med human-antistoffer til malaria-antigener (C).

Figur 7 viser en analyse med en-dimensjonal polyakrylamid-gel-elektroforese av protein-sammensetningen av klonet (identifisert som klon Agl6 og inneholdende den rekombinante fag Xamp3-Agl6) som uttrykker et polypeptid som antigenisk er beslektet med S-antigenet av isolat FC27 (vei 2). Analysene av det halvrensede protein oppnådd ved fraksjonering av den uoppløselige pellet

(vei 3) oppnådd fra et bakterielysat på "Sepharose"

CL6B i nærvær av 0,1% natrium-dodecyl-sulfat og 1 mM ditiotreitol er illustrert i vei 4. For sammenligning viser vei 1 analyse av protein-sammensetningen av et bakterie-klon inneholdende ikke-rekombinant fag. Figur 8 viser deteksjonen av klon Agl6 med anti-serum fra en kanin immunisert med fusjonsprotein fra klonet Agl6. Fra en total av 78 antigen-positive kloner på det samme filter reagerer klon Agl6 spesifikt med anti-serumet. Dette indikerer at immunisering av en kanin med fusjons-proteinet fra klon Agl6 har indusert anti-stoffer til P. falciparum-komponenten av fusjons-proteinet. Figur 9 viser i panel A deteksjon av S-antigener i dyrkings-supernatantene for P. falciparum isolat FC27 (vei 1) og klonet parasitt-linje E12 (vei 2) med Papua New Guinea (PNG) serum inneholdende antistoffer til S antigener. De identiske antigener detekteres med anti-serum fra en kanin immunisert med fusjons-protein av klon Agl6 (panel B). Figur 10 (A til E) viser den spesifikke farving av modne P. falciparum parasitter når kanin-antiserum fremstilt mot fusjons-proteinet fra klon Agl6 anvendes ved indirekte immunofluorescens. Figurene 11 - 14 den spesifikke farving av P. falciparum blod-trinns-parasitter når indirekte immuno-fluorescens utføres under anvendelse av anti-sera fremstilt mot kloner Agl3, Ag23, Ag63 henhv. Agl44.

Generell metodikk

En rekke forskjellige metoder er tilgjengelige for fremstilling av det rekombinante DNA-molekyl i samsvar med oppfinnelsen, hvorav en omfatter trinnene med å syntetisere en enkelttrådet DNA-kopi (cDNA) av RNA

renset fra et isolat av hel P. falciparum under anvendelse av et revers transcriptase-enzym. Etter at den opprinnelige RNA-tråd er blitt avbygget omdannes cDNA til en dobbelttråd (ds cDNA) som så behandles for å fjerne eventuelle løkker av DNA som er blitt dannet under anvendelse av f.eks. et nuklease-enzym. En alternativt metode for fremstilling av den dobbelttrådede cDNA er via kjemisk syntese under anvendelse av metoder som er vel kjent på området.

Når først den dobbelt-trådede cDNA er blitt fremstilt er det neste trinn å innskyte den i et kloningsmiddel, som f.eks. kan være et bakterie-plasmid eller bakteriofag. Dette kan oppnås ved først å spalte DNA av det rensede kloningsmiddel, f.eks. A amp3 (beskrevet i det følgende) under anvendelse av et restriksjons-endonuklease-enzym som f.eks. EcoRI, som spalter DNA ved seter hvor komplementære nukleotider er anordnet i rotasjonsmessig symmetri. Det dobbelttrådede P. falciparum cDNA kan så innskytes mellom og knyttes til de åpne ender av kloningsmidlet ved forening av syntetiske oligo-nukleotider til butt-endet ds cDNA og gjøre de nye ender sammenhengende ved enten endonuklease eller endonuklease-behandling, før ligering med passende linearisert kloningsmiddel. Alternativt kan andre metoder som er vel kjent på området anvendes.

Når først den dobbelttrådede P. falciparum cDNA er blitt tilpasset med DNA av kloningsmidlet blir en passende vert, f.eks. en bakterie, transformert, infisert eller lyso-genisert med det rekombinante kloningsmiddel slik at verten tillater å uttrykke P. falciparum ds cDNA og derved frembringe et polypeptid eller polypeptider som kan fremvise P. falciparum antigenisitet.

Der er flere vert-klonings-middel-kombinasjoner som kan anvendes for ekspresjonen av P. falciparum polypeptider. F.eks. inkluderer brukbare kloningsmidler bakterieplasmider som f.eks. pAT 153, (Twigg, A.J. Nature, 283, 216-218, 1980), pBR 322, (Sutcliffe, J.G. Cold Spring Harbour Symposium for Quantitative Biology, 43, 77-90, 1978)

andre E. coli plasmider og bredere verts-område-plasmider.

Bakteriofager som f.eks. de mange derivater av fag A, og spesielt >amp 3, kan også være egnet. Verter som kan anvendes inkluderer bakterier som stammer av E. coli K. 12, f.eks. E. coli HB101 (Boyer H.W. et al, J. Mol. Biol., 41, 459-472, 1969) E. coliv1776, (Curtiss, R et

al, Ann Report Dep. of Microbiology University of Alabama, 1976, 96-106), E. colix2282 og E. coli MRC1, stammer av Bacillus subtilus og Pseudomonas, såvel som gjærarter og andre sopparter, og andre encellede organismer. Alternativt kan eucayotiske celler som f.eks. mammal-celler anvendes. Det må imidlertid forventes at ikke alle verter vil være like effektive.

Inne i hvert kloningsmiddel kan forskjelliger seter være tilgjengelige for inskyting av P. falciparum ds cDNA,

idet hvert sete erkarakterisert veddet restriksjons-endonuklease-enzym som spalter DNA. F.eks. spalter enzymet EcoRI således bakteriofag A amp 3 i genet som koder for 3-galactosidase.

Seleksjonen av setet på kloningsmidlet for innskyting av P. falciparum ds cDNA kan styres av en rekke faktorer, f.eks. størrelsen av polypeptidet som skal uttrykkes og lokaliseringen av promoter- og initiator-sekvenser. Ikke alle seter vil følgelig være like effektive for et gitt polypeptid.

Det er vesentlig at P. falciparum ds cDNA som innskytes

i kloningsmidlet kan leses i den korrekte fase. For å oppnå dette kan det være nødvendig å innskyte supplerende nukleotider f.eks. mellom utgangspunktene for transskripsjon og translasjon av det P. falciparum ds cDNA fragment som ekspresjonen ønskes for. Addering av slike nukleotider må selvfølgelig ikke danne en nukleotid-sekvens som kan avbryte translasjonen.

Ekspresjon av P. falciparum ds cDNA som er blitt innskutt i et kloningsmiddel som i sin tur har vært anvendt for å transformere, infisere eller lysogenisere en passende vert-celle, kan detekteres ved tilsynekomsten av en funksjon som er spesifikk for proteinet, dvs. immunologisk aktivitet i tilfellet av P. falciparum. Flere metoder er tilgjengelig, f.eks. den hovedsakelig immunologiske koloni-seleksjonsmetode omhandlet av D.J. Kemp og A.F. Cowman i Proe. Nat. Acad. Sei. USA 1981, 78, 4520-4525. En alternativ teknikk er å injisere inn i et forsøksdyr den rå bakterieekstrakt eller rensede fusjonerte polypeptid som er avledet fra en kultur av bakterier transformert med et passende oppbygget kloningsmiddel og å teste for dannelse av passende antistoffer. Et annet alternativ er å gjennomføre en immunopresipitering av en rå ekstrakt av bakteriecellene. Enda en metode er "Maxicell Technique" beskrevet av Sancar et al i J. Bact. 1979, 137, 692-693.

Arten av polypeptidet fremstilt som et resultat av ekspresjon av verten av det rekombinante DNA-molekyl i samsvar med oppfinnelsen vil avhenge av innskuddspunktet i DNA for kloningsmidlet, slik at det i praksis kan dannes et fusjonert polypeptid som omfatter et polypeptid kodet for av P. falciparum ds cDNA og et ytterligere polypeptid kodet for av DNA av kloningsmidlet. Hvis således f.eks., bakteriofagen A amp 3 spaltes ved hjelp av EcoRI kan et kondensert polypeptid omfattende en del av 3-galaktosidase enzymet og polypeptidet kodet for av P. falciparum ds cDNA uttrykkes. Det kondenserte polypeptid kan deretter spaltes selektivt slik at det ønskede P. falciparum polypeptid separeres fra den overflødige aminosyresekvens. Spaltning kan gjennomføres utenfor verten etter høsting av mikrobekulturen ved hjelp av metoder som er vel kjent for den fagkyndige på området. Spaltning kan være nødvendig for at P. falciparum ekspresjons-produktet kan utøve den ønskede antigeniske aktivitet, men under høsting av mikrobekulturen kan det forhold at en overflødig aminosyresekvens er knyttet til det ønskede P. falciparum polypeptid hjelpe til med å forhindre nedbrytning av ekspresjonsproduktet av endogene enzymer. Alternativt kan spaltning gjennomføres inne i verten og dette kan oppnås ved at man i kloningsmidlet innskyter DNA som koder for de ønskede spaltningsenzymer.

Fremstillingen av et fusjonsprodukt av et polypeptid som kodes for av P. falciparum ds cDNA og en del av f.eks. 3-galaktosidase-enzym kan øke stabiliteten av det

hybride protein i E. coli og endog øke immunogenisiteten av P. falciparum proteinet.

Alternativt kan passende nukleotid-sekvenser, avledet f.eks. fra P. falciparum RNA, innskytes før P. falciparum ds cDNA for å sikre at P. falciparum ds cDNA ikke kan uttrykkes alene, og ikke som et fusjonsprodukt med et vert-polypeptid.

Når vert-celler eller rekombinant DNA kloningsmidler inneholdende minst noe P. falciparum ds cDNA er blitt identifisert, som forklart i det foregående, kan den rekombinante kloningsmiddel-DNA renses og deretter analyseres for å bestemme hvor mye av P. falciparum ds cDNA er blitt innskutt. For å gjøre dette behandles den rekombinante kloningsmiddel-DNA med flere forskjellige restriksjons-endonukleaser, f.eks. EcoRI, Pst 1, Sal 1, Bgl II, Barn Hl, Hind III og Hinf 1, og behandlings-produktene kan analyseres ved hjelp av elektroforese, etterfulgt av sekvensering av fragmentene under anvendelse av metoden beskrevet i av Maxam og Gilbert i Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 1977, 74, 560-564.

De forskjellige DNA-molekyler kan være nyttige som en prøve for in vitro diagnose av nærvær i biologiske prøver av P. falciparum og kan spesielt anvendes for å definere isolatet som bevirker et utbrudd av malaria. For dette formål kan DNA-molekylene merkes på kjent måte med en radioaktiv isotop. Når først rekombinant DNA-kloningsmidler som uttrykker polypeptider tilsvarende de naturlige P. falciparum immunogener er blitt identifisert kan de uttrykte polypeptider syntetisert med disse kloningsmidler, f.eks. som et fusjonsprotein med 3-galaktosidase, isoleres hovedsakelig fri for forurensende verts-celle-komponenter ved hjelp av metoder som er vel kjent for de fagkyndige på området. Isolerte proteiner som delvis inneholder aminosyre-sekvenser tilsvarende en del eller det hele av et naturlig immunogen av P. falciparum kan anvendes for å lage monospesifikke men polyklonale antisera ved immunisering av kaniner, mus eller andre dyr under anvendelse av veletablerte metoder.

I tillegg kan ekspresjons-produktet av det rekombinante kloningsmiddel anvendes for serologisk diagnose og ved fremstilling av enkle eller multivalente vaksiner mot P. falciparum ved hjelp av metoder som er vel kjent på området med vaksinefremstilling. Slike vaksiner er effektive ved å stimulere antistoffer i vaksinerte dyr og dermed beskytte mot plasmodia.

Tradisjonelle vaksineblandinger kan omfatte de antigeniske polypeptider sammen med kjente tilsetningsmidler som aluminiumhydroksyd, i forbindelse med en farmasøytisk tålbar bærer. Egnede bærere inkluderer flytende media som saltløsning egnet for bruk som bærere for innføring av polypeptidene i en pasient.

En alternativ vaksineblanding kan omfatte et virus eller mikroorganisme i assosiasjon med en farmasøytisk tålbar bærer, idet det i viruset eller mikroorganismen er innført et DNA-molekyl i samsvar med den foreliggende oppfinnelse for stimulering av en immunrespons rettet mot polypeptidene som det er kodet for av det innførte DNA-molekyl .

Ytterligere særegenheter og trekk ved oppfinnelsen er beskrevet i de etterfølgende eksempler som illustrerer oppfinnelsen uten at rammen for oppfinnelsen begrenses.

EKSEMPEL 1 Fremstilling av cDNA kloner som uttrykker

naturlige immunoqener av P. falciparum.

Reagenser

DNA polymerase I, EcoRl og Xbal fra Boehringer Mannheim GmbH, EcoRl metylase, BstNl, endonukleaser Bal 31 og Sl, kalv-intestinal fosfatase og T4 ligase var fra New England Biolabs, Bethesda, Md. Revers-transskriptase var gave fra J. Beard, Life Sciences Inc., St. Petersburg, Fla. EcoRl linkere (CGGAATTCCG) var fra New England Biolabs, Xbal linkere (CTCTAGAG) var fra Armsham, England. 3-galactosidase (kromatografisk renset) var fra P.L. Biochemicals Inc. Milwaukee, Wis.

Stammer

Bakteriofag-stammer/\gtll og E. coli stammer RY1073 og RY1082 vargenerøse gaver fra T. Huynh, R. Young og

R. Davis (Stanford).

P. falciparum mRNA

P. falciparum isolat FCQ27/PNG (FC27) oppnådd fra Madang-området i Papua New Guinea ble dyrket in vitro (Chan. P. et al SE Asian J. Trop. Med. Public Health 11:435-440 1980). Anrikede parasitt-preparater ble fremstilt ved lysis av erythrocytter med Saponin (Zuckerman, A. et al Bull W.H.O. 37:431-436 1967). RNA ble fremstilt derfra og poly A<+>RNA selektert ved hjelp av oligo dT cellulose-kromatografering.

Enzym- reaks i oner

Metodene var som i Maniatis et al "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour, 1982.

Oppbygning av cDNA- kloner i Agt 10

mRNA (~1 ug) ble kopiert inn i cDNA med revers transskriptase og dobbelttrådet cDNA ble så fremstilt med DNA polymerase I. Etter behandling med nuklease Sl ble ds cDNA metylert med EcoRl metylase og ligert til 0,5 ug fosforylerte EcoRl linkere med T4 ligase. Blandingen ble så behandlet med 20 enheter EcoRl i 90 min. ved 37°C og fraskjonert med elektroforese på en 1% agarose-gel i 50 mM Tris, 20 mM NaOAc 2mM EDTA pH 8,2. DNA mellom 0,6 og 2,0 kb ble gjenvunnet ved elektroforese på Schleicher og Schuel NA45 membran-filter og eluering i

IM NaCl, 50 mM fri base arginin ved 70°C i 1 time etterfulgt av etanol-utfelling og prøver (20 ng) ble ligert til EcoRl-spaltet AgtlO DNA (1 ug), innført i fag og platebehandlet på E. coli RY1073 (Young R. og Davis R, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, under trykk). Omtrent 2 x IO<5>rekombinanter ble oppnådd og~40% av disse hybridiserte

32

detekterbart til p-cDNA fra P. falciparum.

Oppbygning av>amp3

DNA (5 ug) fra pBR322 ble spaltet med EcoRl og BstNl. Etter behandling med 0,3 enheter exonuclease Bal31 i 30 sek. ble DNA ligert til Xba linkere som ovenfor, spaltet med 100 enheter Xbal og fraksjonert på en 1% agarose-gel.~l,7kb fragmentet ble gjenvunnet og ligert til 1 ug av Xbal spaltet gtll (Young R. og Davis R.

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, under trykning) DNA og innført som ovenfor. E. coli RY1082 ble infisert med fagen og platebehandlet på L plater inneholdende ampicilling (30 ug/ml). En amp R koloni ble valgt og vist å være lysogenisk for en lac<+>temperatur-sensitiv fag (betegnet Åamp3) identisk med Agtll med unntagelse av at den inneholdt et~1,7 kb fragment innskutt i Xbal setet.

Innskyting av cDNA fra ^ gtlO i fr amp 3

DNA (500 ug) fremstilt fra plate-bestander av AgtlO-cDNA bibliotek dyrket på E. coli (600 r ~, m,+) ble spaltet med EcoRl (1000 enheter) i 2 timer ved 37 oC og

32

1/50 av den totale mengde ble merket med p-dATP og Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I. Etter fenol-ekstraksjon ble merket og umerket DNA blandet og sentrifugert i 18 timer ved 37.000 RPM på en 10-40% glycerol-gradient i 10 mM Tris/HCl pH 7,4, ImMEDTA og 300 mM NaOAc. cDNA-fragmentene ble detektert som en radioaktiv topp godt separert fra vektorfragmentene og gjenvunnet ved hjelp av etanol-utfelling.

Ukuttet A amp 3 DNA (50 ug i 100 pl) ble ligert i

4 timer ved 15°C for å forsegle og beskytte de kohesive ender mot etterfølgende fosfatase-behandling. Ligasen ble så inaktivert ved 70°C i 10 min., NaCl og Tris/HCl pH 7,4 ble tilsatt til 50 mM og 100 mM og DNA spaltet med EcoRl (500 enheter) i 4 timer. DNA ble behandlet med kalve-mavefosfatase (0,02 enheter), fenolekstrahert og etanolutfelt. Prøver (1 pg) ble ligert i 16 timer ved 15°C til et 4 ganger molart overskudd av innskuddene fra ^gtlO biblioteket i et 10 ul system og innført som ovenfor. E.coli RY1082 ble så infisert med fag i innfyllingsblandingen i 30 min. ved 30°C, inkubert ved 30°C i ytterligere 30 min. etter tilsetning av L-væske (1 ml) for å tillate ekspresjon av 3-laktamase og platebehandlet på nitrocellulosefiltere på L-plater inneholdende 30 pg/ml ampicillin ved 30°C. Omtrent 5 x 10 4 amp R kolonier ble oppnådd fra 6 ug vektor.

Selekslon av A amp3 - P. falciparum cDNA bibliotek med antistoffer til P. falciparum

kolonier ble kopiert til nitrocellulose-filtere

(Hanahan, D. og Meselson, M. Gene 10, 63-67 (1980)) dyrket i 1-2 timer ved 30°C på CY plater inneholdende 30 ug/ml ampicilling og indusert ved 42°C i 1,5 time. Koloniene ble lyset ved å anbringe filterene på 3 mm papir mettet med 1% NaDodSO^i f^O i 15 min. og deretter innført 1 en atmosfære mettet med CHCl^i ytterligere 15 min. Filterene ble vasket ved vugging i 10 mM Tris.HCl,

0,15 M NaCl, pH 8,4, 3% bovin-serum-albumin (BSA) i 2 timer og deretter Tris:NaCl alene i 1 time ved romtemperatur. De ble så behandlet med affinitets-rensede antistoffer til P. falciparum (25 jug/ml) i BSA: Tris:NaCl i 2 timer, vasket to ganger i Tris:NaCl og

to ganger i Tris:NaCl inneholdende 0,05% "Triton X-100"

125

behandlet med I-merket protein A fra S. aureus

(40 uCi/ug; 0,4 pCi/ml) i BSA:Tris :NaCl i 1 time, vasket tørket og auto-radiografert med en intensiverende skjerm i 16 timer.

Fremstilling og rensing av sera

Serum ble samlet med informert samtykke fra voksne personer fri for P. falciparum i det endemiske Madang-område i Papua New Guinea. IgG isolert på protein A-sepharose fra hvert serum ble testet for inhibering av vekst for P. falciparum in vitro (Brown, G.V. et al,

Infect. Immun. 39: under trykning 1983) og fem

inhiberende sera ble slått sammen. Antistoffene ble renset ved hjelp av to cykler med adsorbsjon av P. falciparum (isolat FC27) proteiner bundet til CNBr-aktivert Sepharose. Saponin-anrikede parasitter ble ultralydbehandlet i PBS og sentrifugert ved 2000g i 10 min. Supernatanten ble innstilt til omtrent 20 mg/ml med PBS og konjugert til CNBr-sepharose. Bundne anti-stoffer ble eluert med 0,IM glycin, 0,15M NaCl, pH 2,6

og deretter med en gang innstilt til pH 7,4 med 2M Tris-HCl pH 7,4.

Analyse av proteiner ved hjelp av Western- avtrykk

Protein-ekstrakter av induserte A amp3 - P. falciparum kloner ble fremstilt og fraksjonert på 7,5% akrylamid-NaDoSO^-geler. Proteiner fra gelene overført elektroforetisk til nitrocellulose og inkubert ved romtemperatur i BSA:Tris:NaCl i 1 time før reaksjon i 90 min. med kanin-anti-3-galactosidase eller anti-malaria-antistoffer.

Antistoffer til E. coli i begge reagenser ble fjernet

ved inkubasjon av 100 ul kanin-serum eller 0,5 til 1,0 mg human IgG med 1 ml sonikat av A amp3 infisert E. coli i 1 time ved 4°C, etterfulgt av sentrifugering med (L2000g, 10 min.) og supernatanten fortynnet med BSA:Tris:NaCl til 50 ml. Nitrocellulose-platene ble så vasket, reagert med I-merket protein A, vasket på nytt og autoradiografert som ovenfor. Kanin-antiserum til 3-galactosidase ble fremstilt med kommersielt tilgjengelig enzym (P-L Biochemicals Inc., porsjon 535 - 3). Injeksjon av 0,5 mg 3-galactosidase i fullstendig

Freund's tilsetningsmiddel (subkutant og intramuskulært) ble etterfulgt med 4 ukers mellomrom av 0,5 mg i ufull-stendig Freund's tilsetningsmiddel. Serum samlet 2 uker etter den siste injeksjon ble anvendt etter ut-absorbering av antistoffer til antigener i E. coli RY1082 som ovenfor.

RESULTATER OG DRØFTELSER

Strategien for oppbygning av et ekspresjons-bibliotek fra P. falciparum mRNA, basert på ?v gtll-ekspresjonssystemet til Young og Davis er vist i fig. 3. cDNA klonet inn i det eneste EcoRl sete nær 3'-enden av 3-galactosidase-genet av X gt 11 kan uttrykkes som polypeptider fusjonert til 3-galactosidase. E. coli-kolonier som er lysogeniske for de temperatursensitive rekombinanter kan så dyrkes ved den tillatte temperatur etterfulgt av induksjon av fagen ved 42°C for å oppnå høyere ekspresjonsnivåer. Høyfrekvens-lysogeniske E. coli-stammer ble anvendt for

å sikre at de fleste kolonier oppnådd etter infeksjon med fag er lysogener. Imidlertid er en vesentlig andel av koloniene alltid ikke-lysogene og er lac og er vanskelig å sjeldne fra rekombinante lysogener. 3-laktamase-gen fra pBR322 ble innført i ,Agtll (se fig. 3 og materialer og metoder) og utviklet en fag betegnet

Aamp3. Lysogener av/\amp3-cDNA gir amp R-lac kolonier som lett kan sjeldnes fra parentale amp R-lac+ kolonier på plater inneholdende ampicillin og 5-brom-4-klor-3-indolyl-3-D-galactosid, mens ikke-lysogener drepes. Videre kan Aamp3 lysogener direkte selekteres fra celler infisert med fag fra en innfyllings-reaksjon, som eliminerer behovet for forstørring av en fag-bestand.

For å forhindre at religerte parentale molekyler overveier i biblioteket ble den EcoRl-kuttede/^amp3 vektor behandlet med fosfatase. På grunn av at dette markert reduserte klonings-effektiviteten ble først cDNA forsterket ved å klone den inn fag-vektoren A gtlO

(fig. 3). DNA fra Agt10-cDNA-fag-samlingen ble så spaltet med EcoRl og frigitt cDNA ble isolert og ligert til fosfatase-behandlet EcoRl-spaltet Aamp3 DNA for å utvikle det endelige ekspresjons-bibliotek. Denne metode resulterte i et bibliotek på ~5xl0 4 lysogeniske amp R kolonier hvorav =98%var lac- og =50%hybridiserte

32

detekterbart til p cDNA fra P. falciparum.

Identifisering av E. coli kolonier som uttrykker

P. falciparum antigener

For deteksjon av kolonier som uttrykker antigener av

P. falciparum ble induserte kolonier lysert in situ med NaDodSO^og kloroformdamp under betingelser som tillater binding av proteiner direkte til nitrocellulosen. Etter behandling med BSA ble filterene behandlet med antistoffer

125

etterfulgt av I-merket protein A fra S. aureus som binder til antistoffer lokalisert ved setet for en koloni. Lignende metoder er nylig blitt beskrevet.

Antistoffer fra immune individer i det endemiske Madang-området av Papua New Guinea ble anvendt for deteksjon av P. falciparum antigener. IgG fraksjonene av de individuelle sera som inhiberte vekst av P. falciparum in vitro ble slått sammen. IgG-samlingen inneholdt antistoffer mot mange P. falciparum proteiner, men reagerte også sterkt med E. coli og nødvendiggjorde anrikning av antistoffene ved hjelp av affinitetskromatografering på P. falciparum proteiner og deplesjon av anti E. coli aktiviteten (materialer og metoder).

Resultatet av en slik seleksjon på et filter inneholdende omtrent 10 Aamp3-cDNA-kolonier er vist i fig. 4. Flere kolonier har øyensynlig reagert med IgG og gir signaler med varierende intensitet. Ingen slik variasjon sees med normal IgG selv om begge IgG gir en bakgrunns-reaksjon med alle kolonier. Kloner i området av signalene (generelt 3-10 kolonier) ble platebehandlet for enkle kolonier og valgt tilfeldig triplikat slik at noen skulle være positive idet resten tilveiebragte negative kontroller. En vesentlig andel reagerte også her med det immune IgG men ikke med normalt IgG. Signalene var reproduserbare i triplikatene og intensiteten av positive - signaler i enhver rad (som alle skriver seg fra den samme opprinnelige positiv) var karakteristisk.

De antiqen- positive kolonier inneholder P. falciparum cDNA- sekvenser

Det ble testet en kopi av koloniene vist i fig. 5A ved

32

koloni-hybridisering med p cDNA for å fastslå om de positive kloner inneholdt P. falciparum cDNA sekvenser. Alle av de antigen-positive kloner hybridiserte

(fig. 5B). Graden varierte markert og der var intet forhold mellom utstrekningen av immunologisk reaktivitet og hybridisering. Det meste synes å være avledet fra mRNA med moderat rikelighet. Forskjellene i graden av hybridisering indikerer at de positive kolonier avledes fra forskjellige mRNA.

P. falciparum antigener uttrykt som polypeptider

fusjonert til 3- galactosidase

Proteiner fra lysater av induserte antigen-positive

og negative kloner ble undersøkt ved hjelp av gel-elektroforese. Farving med Coomassie-blått viste at noen kloner, både antigen-positive og -negative, frembragte rikelige mengder av særegne polypeptider større enn 3-galactosidase (f.eks. kloner Agl3, Ag23 og C9 i fig. 6). Når proteinene ble overført fra geler til nitrocellulose ved hjelp av metoden med "Western avtrykk" og bedømt med anti-3-galactosidase-serum reagerte alle disse enestående store polypeptider sterkt (fig. 6). Polypeptider med lavere molekylvekt var også påvist.

Disse kan være nedbrytningsprodukter eller de kan

utvikles ved internt initiering eller for tidlig terminering.

Når Western-avtrykk ble bedømt med affinitets-renset anti-P. falciparum IgG falt resultatene i tre klasse

(fig. 6). For det første reagerte det store polypeptid

i klon Agl3 sterkt og viste at det inneholder en P. falciparum antigen-sekvens såvel som 3-galactosidase

og følgelig er et antigenisk fusjonert polypeptid. Ingen reaksjon ble iakttatt med et lignende stort 3-galactosidase-

polypeptid i det antigen-negative klon C9 (fig. 6). Følgelig uttrykker dette klon et fusjonert polypeptid som ikke gjenkjennes som et antigen. I andre antigen-positive kloner, f.eks. klon Ag23 i fig. 6, reagerte det store polypeptid og i tillegg var det en masse av mindre,

antatt nedbrutt material. Dette polypeptid er tilsynelatende ustabilt i E. coli RY1082 selv om denne stamme inneholder lon'" mutanten som reduserte nedbrytningen.

I en tredje klasse av kloner var ingen reaktive polypeptider påviselig med immun-human IgG. Dette kan være resultatet av sterk nedbrytning, eller kan reflektere manglende evne for polypeptidet til å bibeholde antigenisiteten etter koking i NaDodSO^. Den mulighet kan ikke utelates at disse siste kloner er falsk-positiver i koloni-seleksj onssystemet.

EKSEMPEL 2 Produksjon av P. falciparum S antigener

ved hjelp av rekombinant DNA- teknologi

Av 78 antigen-positiver E. coli-kolonier fremstilt som beskrevet i det foregående og undersøkt initialt inneholdt en (Agl6) et stort, spesielt rikelig fusjons-protein .

Isolering av fusjons- protein fra klon Agl6

E. coli lysogenisk for amp3-Agl6 rekombinant fag ble dyrket i L-væske opp til en densitet på OD^qq^0,6 ved en temperatur på 30 C. Fagen ble indusert ved inkubering av kulturene ved 45°C i 15 min. Etter denne induksjon ble kulturene inkubert i ytterligere 90 min. ved 39°C og bakteriene ble så høstet ved sentrifugering i 10 min. ved 3000 x g.

Bakterier høstet fra 1 liters kulturer ble resuspendert i

20 ml Tris-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA,

50 mM NaCl) og lysert ved tilsetning av 0,25 mg/ml lysozym og inkubasjon i 30 min. Til bakterielysatet ble tilsatt "Triton X-100" (endelig konsentrasjon 0, 2%), et like stort volum Tris-buffer, inneholdende 20 mM MgCl2

og en ug/ml DNase (deoksyribonuklease, grad I,

Boehringer Mannheim, BRD). Etter inkubasjon ved romtemperatur 10 min. ble celle-debris pelletisert ved sentrifugering ved 4000 x g. 4000 x g supernatanten ble så sentrifugert i 30 min. ved 40.000 x g for å sedimentere det uoppløselige fusjonsprotein sammen med annet partikkelformet material. Pelleten ble solubilisert i 5 ml 0,1 M NaP04buffer, pH 6,4, inneholdende 2% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) og 10 mM ditiotreitol (DTT) ved koking i 2 min. og ble fylt på en kolonne av "Sepharose CL6B" (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ., som ble ekvilibrert og eluert med 0,2 M NaPO^buffer, pH 7,4 inneholdende 0,1% SDS og 1 mM DTT. Prøver av fraksjonene som eluerte fra sepharose-kolonnen ble undersøkt ved hjelp av 1-dimensjonal SDS polyakrylamid-gel-elektroforese (PAGE). De som inneholdt fusjonsproteinet ble slått sammen, avsaltet ved passering over en PD10 dialyserings-kolonne (Pharmacia) ekvilibrert med 1 mM 3-merkaptoetanol i ^2^ frysetrøket.

Fremstilling av antisera

Kaniner ble injusert subkutant og intramuskulært med frysetørket fusjonsprotein (0,5 mg) suspendert i 1 ml fosfat-bufferet saltløsning (PBS) og emulgert i et like stort volum av Freund's komplette tilsetningsmiddel. Kaninene mottok en annen injeksjon 4 uker senere med

0,5 mg av det samme antigen emulgert i Freund's ufullstendige tilsetningsmiddel og ble tappet for antiserum 2 uker senere.

Antisera ble også dannet i mus. I dette tilfelle ble bakterier fra omtrent 1 ml av en indusert kultur lysert i fosfat-bufferet saltløsning ved hjelp av 4 cykluser med frysing og tørking, emulgert i et like stort volum av Freund's komplette tilsetningsmiddel og injisert intra- peritonealt og subkutant i hunmus BALB/c. Musene mottok en annen injeksjon 4 uker senere med den samme mengde av bakterie-lysat uten tilsetningsmiddel og deretter tappet for antiserum.

Immunoavtrykk ( Western avtrykk)

Antigener frigitt i dyrkingsmediet ved P. falciparum isolater som dyrkes in vitro ble fraksjonert på en-dimensjonale SDS-polyakrylamid-geler (SDS-PAGE), elektroforetisk overført til nitrocellulose og prøvet med antistoffer dannet mot fusjonsproteinet eller PNG-serum hovedsakelig under anvendelse av metodene beskrevet av Burnette W.N. 1981, Analyt. Biochem. 112, sidene 195-203.

Immunofluorescens

Antiserum dannet mot fusjonsproteinet isolert fra klon Agl6 (kanin anti-Agl6 serum) ble testet for reaktivitet mot P. falciparum isolat FC2 7 ved å anvende metoden med indirekte immunofluroescens. Lufttørkede, tynne utstrykninger av parasittholdige røde blodlegemer ble fiksert i aceton/metanol (90:40, volum:volum) i 15 min. ved romtemperatur. De tørkede utstrykninger ble reagert med passende fortynnet (1:100 til 1:1000) kanin-anti-Agl6 serum i 30 min. ved romtemperatur. Etter tre 15 min. vaskinger i PBS ble utstrykningene inkubert med en 1:40 fortynning av fluorescein-konjugert saue-anti-kanin immunoglobulin i 30 min. ved romtemeratur. Etter tre 15 min. vaskinger i PBS ble platene oversvømmet med 90% glyserol og deretter undersøkt under et mikroskop under anvendelse av ultrafiolett bestråling.

Nukleinsyre- sekvenserinq

cDNA-inskuddet av klon Agl6 ble subklonet inn i fag-vektoren M13 mp9 (Messing J., Crea R., og Seeburg p.H.

1981, Nucl. Acids. Res., 9, sidene 209-321) og sekvensert i henhold til metoden med dideoksynukleotid-kjede-terminering (Sanger F., Coulson S.R., Barrel B.G., Smith A.J.H., og Roe B.A., 1980, J. Mol. Biol.

143, sidene 167-178).

RESULTATER OG DRØFTELSER

Karakterisering av klon Aql6

Under anvendelse av metodene beskrevet i eksempel 1 ble klon Agl6 identifisert som en antigen-positiv E. coli koloni som inneholdt et rikelig stort fusjonsprotein.

Den rekombinante fag Aamp3 Agl6 inneholder et P. falciparum cDNA-innskudd på 830 base-par. Base-sekvensen i klon Agl6 vises i fig. 1 og indikerer at det antigen som kodes for av denne partielle polynukletid-sekvens har en homolog gjentatt struktur på 11 aminosyrer gjentatt tandem-messig 2 3 ganger.

Isolering av Agl6 fus ions- protein

Dette fusjonsprotein var uoppløselig og kunne anrikes

ved lysering av induserte organismer og nedsentrifugering av uoppløselig material. Denne pellet ble solubilisert ved oppvarming i en buffer inneholdende 2% SDS og 10 mM DTT og en enkel passering over en Sepharose CL6B gel-filtreringskolonne ga fusjonsprotein fritt for hoved-andelen av proteinene i det opprinnelige E. coli lysat (fig. 7).

Klon Agl6 tilsvarer S- antigenet i P. falciparum FC27

En kanin immunisert med det halv-rensede fusjonsprotein oppnådd fra klon Agl6 frembragte antistoffer som reagerte med klon Agl6 og ikke andre E. colo-kolonier inneholdende enten annen rekombinant bakteriofag eller den ikke-rekombinante fag^amp3 (fig. 8). Dette fusjonsprotein induserte således en antistoff-respons primært rettet mot det terminante uttrykt i P. falciparum-delen av proteinet.

Avgjørende bevis på at Agl6 klonet tilsvarte en del av isolatet FC27 S antigenet ble oppnådd ved hjelp av Western-avtrykksforsøk. Isolat FC27 har et S antigen

(Mr 220.000) som er det dominante antigen som detekteres når dyrkings-supernatanter analyseres ved hjelp av Western-avtrykksmetoden under anvendelse av selekterte

sera fra naturlig immune Papua New Guinea-boere. En klonal populasjon (E12) av P. falciparum avledet fra isolat FC27 ved hjelp av grense-fortynnings-dyrking uttrykker et større men antigenisk beslektet S-antigen

(Mr omtrent 250.000). Når ekvivalente dyrkings-supernatanter ble analysert ved hjelp av Western-avtrykksmetoden under anvendelse av anti Agl6 serum som prøve var S-antigenene av isolat FC27 og klon E12 de eneste detekterte antigener (fig. 9).

Assosiering av antigenet med modne parasitter

Anti-Agl6 serum ble anvendt ved indirekte immunofluorescens-forsøk for å vise at det tilsvarende antigen i isolat etter 27 var assosiert med modne ukjønnede trinn i den røde blod-celle. Farvingsmønsteret (fig.10) hvori merozoitene inne i den segmenterte schizont kom klart til syne er i samsvar med at S-antigenet befinner seg inne i den parasitoforøse vacuole og mulig også på merozoit-overflaten.

EKSEMPEL 3 Fremstilling av andre naturlige malaria-immunogener

Prosessene anvendt i eksempel 1 for fremstilling av rekombinant bakteriefag og for seleksjon av E. coli kloner som fremstiller malaria-antigener, og i eksempel 2 for karakterisering av et klon med hensyn til det parasitt-antigen det tilsvarer, ble gjentatt for å identifisere kloner som frembringer andre antigener av P. falciparum.

RESULTATER

Tilgjengelige nukleotid-sekvens-data på et av disse ytterligere kloner er gitt i fig. 2. Informasjon vedrørende molekylvekten, trinn og stamme-spesifisitet og ultrastrukturen lokalisering av disse antigener er gitt i fig. 11 - 14 og i tabellene 1-4.

Claims (27)

1. DNA-molekyl karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som hovedsakelig tilsvarer hele eller en del av P. falciparum RNA.

2. DNA-molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at nukleotidsekvensen koder for minst et polypeptid av P. falciparum.

3. DNA-molekyl som angitt i krav 2, karakterisert ved at nukleotidsekvensen koder for hele eller en del av minst to polypeptider av P. falciparum, idet polypeptidene er avledet fra et eller flere isolater, stammer eller varianter av P. falciparum.

4. DNA-molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at nukleotidsekvensen koder for et polypeptid av P. falciparum som hovedsakelig tilsvarer et S-antigen av P. falciparum.

5. DNA-molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at nukleotidsekvensen er karakterisert ved at minst en del derav omfatter en partiell basesekvens hovedsakelig som vist i fig. 1.

6. DNA-molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at nukleotidsekvensen er karakterisert ved at minst en del derav omfatter en partiell basesekvens hovedsakelig som vist i fig. 2.

7. DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som kan uttrykkes som minst et polypeptid som fremviser antigenisiteten av av et P. falciparum-antigen.

8. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som angitt i krav 1-7 operativt knyttet til en ekspresjons-kontrollsekvens.

9. Rekombinant DNA-molekyl som angitt i krav 8, karakterisert ved at ekspresjons-kontrollsekvensen inkluderer promoter-sekvenser og initiator-sekvenser og hvori nukleotid-sekvensen befinner seg i 3' i forhold til promoter- og initiator-sekvensene.

10. Rekombinant DNA-kloningsmiddel eller vektor, karakterisert ved at den kan uttrykke hele eller en del av minst et polypeptid eller protein av P. falciparum og at den har innskutt deri en nukleotid-sekvens som angitt i krav 1-7, idet sekvensen er operativt knyttet til en ekspresjons-kontrollsekvens.

11. Rekombinant DNA-kloningsmiddel som angitt i krav 10, karakterisert ved at ekspresjons-kontrollsekvensen inkluderer promoter-sekvenser og initiator-sekvenser <p> g hvori nukleotidsekvensen befinner seg i 3'-stilling til promoter- og initiator-sekvensene.

12. Rekombinant kloningsmiddel som angitt i krav 10, karakterisert ved at nukleotidsekvensen og ekspresjons-kontrollsekvensen er innført i en bakteriofag.

13. Rekombinant DNA-kloningsmiddel som angitt i krav 12, karakterisert ved at bakteriofagen er bakteriofag amp 3.

14. Vertscelle karakterisert ved at den inneholder et rekombinant DNA-molekyl som angitt i krav 8, eller et rekombinant DNA-kloningsmiddel eller vektor som angitt i

15. Syntetisk peptid eller polypeptid, karakterisert ved at det fremviser antigenisiteten av hele eller en del av minst et P. falciparum antigen.

16. Syntetisk peptid eller polypeptid som angitt i krav 15, karakterisert ved at det fremviser antigenisiteten av hele eller en del av et S-antigen av P. falciparum.

17. Syntetisk peptid eller polypeptid som angitt i krav 15, karakterisert ved at det hovedsakelig tilsvarer hele eller en del av et av antigenene karakterisert i fig. 7 - 14 og i tabellene 1-4.

18. Kondensert polypeptid, karakterisert ved at det omfatter en polypeptidsekvens som fremviser antigenisiteten av et P. falciparum antigen som den C-terminale sekvens og et ytterligere polypeptid som den N-terminale sekvens fusjonert dertil.

19. Fusjonert polypeptid som angitt i krav 18, karakterisert ved at det ytterligere polypeptid er et polypeptid som kodes for av DNA i et rekombinant DNA-kloningsmiddel eller vektor.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonert polypeptid som angitt i krav 18, karakterisert ved trinnene med å dyrke en vertscelle som angitt i krav 14 og utvinne det nevnte fusjonerte polypeptid fra dyrkingen.

21. Fusjonert polypeptid, karakterisert ved at det er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten i krav 20.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som angitt i krav 15, karakterisert ved trinnene med å spalte et fusjonert polypeptid som angitt i krav 21 og separere det ønskede polypeptid fra det nevnte ytterligere polypeptid.

23. Polypeptid, karakterisert ved at det er fremstilt ved hjelp av metoden i krav 22.

24. Blanding for stimulering av immunresponser mot P. falciparum antigener i et pattedyr, karakterisert ved at det omfatter minst et polypeptid som fremviser antigenisiteten av et P. falciparum antigen, sammen med en farmasøytisk tålbar bærer derfor.

25. Blanding som angitt i krav 24, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et tilsetningsmiddel.

26. Blanding for stimulering av immunresponser mot P. falciparum antigener i et pattedyr, karakterisert ved at den omfatter et virus eller mikroorganisme i assosiasjon med en farmasøytisk tålbar bærer, idet viruset eller mikroorganismen har innskutt deri et DNA-molekyl omfattende en nukleotid-sekvens som kan uttrykkes som minst et polypeptid som fremviser antigenisiteten av et P. falciparum antigen.

27. Fremgangsmåte for stimulering av immunresponser mot P. falciparum antigener i et pattedyr, karakterisert ved tilførsel av en blanding som angitt i krav 24 til pattedyret. SAMMENDRAG DNA-molekyler omfattende kunstig oppbyggede polynukleotid-sekvenser hovedsakelig tilsvarende hele eller en del av plasmodium falciparum budbringer RNA (mRNA) eller genomisk DNA (gDNA), spesielt DNA-molekyler omfattende kunstig oppbyggede polynukleotidsekvenser som koder for hele eller en del av et eller flere proteiner som forekommer i P. falciparum, eller en forløper eller modifikasjon derav. Slike DNA-molekyler kan uttrykkes som et eller flere polypeptider. Syntetiske peptider eller polypeptider som fremviser antigenisiteten av hele eller en del av minst et P. falciparum antigen. Blandinger for stimulering av immunresponser mot P. falciparum antigener i et pattedyr omfattende minst et polypeptid som fremviser antigenisiteten av et P. falciparum antigen, sammen med en farmasøytisk tålbar bærer derfor.