KR19990082086A - 엠에스에이1 펩타이드의 첨가에 기초한 말라리아 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 주요한 분열소체(merozoite) 표면 항원 1(MSA1)에 실질적으로 상응하는 단백질 또는 그것의 면역원성 부분을 발현시키는 백시니아 비루스계로 구성된 말라리아 키메릭(chimeric) 펩타이드에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, MSA1 펩타이드는 MSA1의 아미노산 1047부터 1640에 상응하는 593 아미노산 펩타이드이고 시그날 펩타이드 및/또는 앵커(anchor) 펩타이드와 결합된다. MSA1 서열과 결합한 시그날 및 앵커(anchor) 서열을 모두 가지는 키메릭(chimeric) 펩타이드가 예방 접종된 숙주로부터 면역 반응을 유도하는데 가장 효과적이었다.
Description
말라리아를 예방하거나 치료하는 것은 특히 개발도상국에서, 오랫동안 도전적인 건강 문제였고, 기생충의 약물내성이 급속히 발달했기 때문에 말라리아 백신의 개발 필요가 높아졌다. 최근 10년 동안 꾸준히 진보했지만, 적당한 전달 매체와 항원 보균자의 선택을 포함해서, 여전히 몇가지 문제를 극복해야 한다.
제2차 세계대전 후 말라리아는 잠잠해졌다고 믿었지만, 최근의 발생은 그 질병이 상승하고 있다는 것을 시사한다. 말라리아는 다시 세계적으로 이병률(罹病率)/사망률의 주요한 원인이고 위험한 환경에 위협이 증가하고 있음을 나타낸다. 3억명의 말라리아 환자가 매년 새로 생기고, 감염자의 대략 1%가 사망하는 것으로 추정된다. 그 기생충의 약물내성 균종이 전세계에 퍼지므로써 그 질병을 막기 위해 사용되는 예방 치료는 효과가 없게 되었다. 완벽한 벡터 보호는 전적으로 가능하지 않고 모기의 관련된 종을 근절시키기 위한 모든 시도들이 실패했다.
말라리아원충(Plasmodium) 속의 원생동물의 4가지 종이 인간에서 발견된다. 그 4가지 종은 삼일열원충(Plasmodium vivax), 사일열원충(Plasmodium malariae), 열대열원충(Plasmodium faciparum) 및 난형열원충(Plasmodium ovale)를 포함한다. 이들 중에서, 열대열원충(Plasmodium faciparum)이 가장 잘 말라리아의 병원(病原)이 되고 종종 사망으로 이끈다. 그것이 전세계에 퍼진 말라리아 인간 환자의 약 절반의 원인이다.
말라리아에서, 그 질병은 너무나 대단해서 몇몇의 기생충 단백질에 대한 중요한 항체 반응에도 불구하고 감염 후 회복이 그 환자에게 의미심장한 보호를 주지 않는다. 기생충이 보호 반응의 발달에 적당한 항원을 가지지 않거나 그 기생충이 숙주 면역 체계를 피하는 메커니즘을 발전시켰다는 관습적인 지혜가 있었다. 최근의 증거는 면역 보호가 방사선을 조사(照射)한 포자소체(sporozoite)를 사용해서 가능하다는 것을 나타냈기 때문에, 위에 설명한 후자의 가설이 더 합리적인 설명이다.
말라리아 기생충의 생활환(環)은 방해가 전염성 과정을 중지할 수 있는 몇 단계가 있다. 분열소체(merozoite)에 의한 적혈구의 침입이 이 단계들 중에 포함된다. 유리된 분열소체(merozoite)는 말라리아의 생활환에서 제한된 수명 (1-2시간)을 가지고 초기에 발생하지만, 그 질병의 유전에 원인이 되는 유리된 분열소체(merozoite)와 후 단계 유성(有性) 형태의 출현이 적혈구 단계에 의존하기 때문에, 분열소체(merozoite)는 백신이 생산될 수 있는 잠재적으로 매력적인 대상(그리고 아마도 유일한 대상)이다.
말라리아 기생충의 일반적인 생활환은 인간과 다른 동물 말라리아 기생충과 같아서, 인간 기생충으로 정확한 해독을 하는 설치류 종에 대한 모델 스터디를 할 수 있다. 예를 들면, 설치류 말라리아 기생충 균종 플래즈모우디엄 버게이 안카(Plasmodium berghei Anka)는 열대열원충(Plasmodium falciparum) (인간 기생충의 잘 연구된 변형)의 FCR-3 균종에 매우 유사한 병리를 가진다. 게다가, 인간의 기생충의 혈액 단계는 침입 과정과 적혈구 상태에 미치는 항체/억제자의 효과를 연구하기 위한 계(系)를 공여하는 실험실 (인간의 적혈구에서)에서 성장될 수 있다.
말라리아 기생충의 생활환에서, 인간은 아노펠레스(Anopheles) 암모기에 물려서 말라리아에 감염된다. 그 모기는 숙주에 침을 삽입하고 그렇게 하면서, 그 모기의 타액(唾液)에 존재하는 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 포자소체(sporozoite) 형태를 주입한다.
인간 숙주에 주입된 포자소체(sporozoite)는 간의 실질(實質) 조직 세포 (간장세포)와 대식세포(macrophage)를 포함해서, 많은 숙주 조직 세포 속을 통과한다. 생활환의 이 시점에서 그 유기체는 아직 적혈구에 들어가지 못했기 때문에 이 상태는 적혈구외 사이클(exoerythrocytic cycle)로 알려져 있다. 간장세포에 들어간 후, 포자소체(sporozoite)는 영양형(trophozoite)으로 변형되고, 다발성분열(schizogony)을 배양하고 겪으며, 분열소체(merozoite) 조직을 파열하고 유리시킨다. 이 과정은 대략 7-10일 걸리고, 종에 따라서는, 숙주가 아무런 효과를 느끼지 않는 동안, 몇 번 반복될 수도 있다. 열대열원충(Plasmodium falciparum)에서, 이 반복은 일어나지 않는다. 배양 기간 후, 간 또는 다른 조직 세포들이 파열하고 수많은 분열소체(merozoite)를 혈류에 방출한다.
그후 곧, 분열소체(merozoite)를 지닌 혈액이 적혈구에 침입하고, 거기에서 그것들이 생활환의 적혈구 상태(erythrocytic phase)에 들어간다. 적혈구 내에서, 어린 말라리아의 원충(原蟲)은 적색의 핵과 환상의(ring-shaped) 청색 세포질을 가지고 있다. 말라리아의 원충은 분열소체(merozoite)로 분열하고, 적혈구에서 달아나서 다른 적혈구에 들어가고 번식 과정을 반복할 수 있다. 이 기간은 대략 48시간 지속된다.
적혈구 사이클(erythrocytic cycle)의 48시간 동안, 수컷과 암컷 생식모세포들이 적혈구에서 형성된다. 이 생식모세포들이 또한 분열소체(merozoite)와 함께 적혈구로부터 나온다. 인간 숙주가 말라리아와 연관된 증상들을 경험하는 것은 이 기간 동안이다. 적혈구로부터 분출한 분열소체(merozoite)는 혈류에서 불과 몇 시간 동안만 산다. 생식모세포들은 숙주의 혈류에서 며칠 이상 산다.
그 생식모세포들은 모기 속에서만 짝지을 수 있다. 따라서, 열대열원충(Plasmodium falciparum)이 제2의 인간 숙주를 감염시킬 포자소체(sporozoite)를 생산하기 위해서, 모기는 먼저 생식모세포들이 있는 인간 숙주를 물어야 한다. 이 생식모세포들이 큰 배우자로 성숙하고, 모기의 위(胃)에서 짝짓고 접합자(接合子)를 생산한다. 그 접합자 (단상접합자(ookinete))는 활발하고 위 또는 중장(中腸) 속벽을 통하여 움직인다. 장 속에서, 단상접합자(ookinete)는 둥글게 되고 낭포체(oocyst)라 불리우는 포낭(包囊)을 형성하는데, 수백개의 포자소체(sporozoite)가 발생한다. 그후 포자소체(sporozoite)가 모기 전체에 침입하고 모기가 혈액을 먹을 때 그것들 중 다수가 다음 숙주를 감염시키기에 유리한 위치에 있는 타액선(腺)에 들어간다. 그후 생활환은 또 다른 인간 숙주에서 반복될 뿐이다.
열대열원충(Plasmodium falciparum)의 생활환 동안, 분열소체(merozoite)에 의한 적혈구 침입의 억제가 말라리아에 대한 효과적인 백신을 개발하는 열쇠이다. 일단 기생충이 적혈구에 들어가면, 면역계에 노출이 악화된다.
과거에, 살아있는 백시니아 비루스(vaccinia virus)가 천연두를 성공적으로 근절시키는 백신으로서 사용되었고, 바이러스의 항원을 발현시키는 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)는 면역이 된 동물에서 강한 항체 반응을 일으켜서, 질병에 대해서 보호하는 것으로 나타났다 (Arita, I. , Nature, 1979, 279, 293-298) . 더욱이, 고도로 면역반응을 유발하는 백시니아 비루스(vaccinia virus) 단백질을 가진 잠재성 면역원의 공동 제시가 그 특정 면역체에 대해서 강한 면역 반응을 일으킬 수 있다는 것이 동물 모델에서 보여졌다 (Moss and Flexner, Annals of the New York Academy of Sciences, 86-103; Mackett and Smith, J. Gen. Virol., 1986, 67, 2067-2082; Houard, et al., J. Gen. Virol., 1995, 76, 421-423; Fujii, et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 1339-1344; Rodrigues, et al. J. Immunol., 1994, 153, 4636-4648). 따라서, 살아있는 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)를 백신으로 이용하는 것은 대장균(E. coli), 효모 또는 곤충 발현 체계에서 재조합 단백질의 준비할 때 현재 일어나는 많은 항원 발현과 전달 문제를 극복할 수 있을지도 모른다. 180kb 백시니아 비루스 게놈(vaccinia virus genome)내 몇 곳에 이질적인 유전자를 삽입한 전달 벡터가 만들어졌다 (Earl and Moss, Current Protocols in Molecular Biology, 1993, 16. 17. 1-16. 17. 16). 또한, 25kb를 초과하는 이질적인 DNA가 백시니아 비루스 게놈(vaccinia virus genome)에 삽입될 수 있다고 보고되었다 (Smith and Moss, Gene, 1983, 25, 21-28). 올바른 가공 처리(processing) (Chakrabarta, et al., Nature, 1986, 320, 535-537)와 적당한 해독후 변형(post-translational modification) (Hu, et al., Nature, 1986, 320, 537-540; Ball, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 246-250; de la Salle, et al., Nature, 1985, 316, 268-270), 운반과 분리 (Ball, et al., Proc. Natl. Acad. Scienc. USA, 1986, 83, 246-250과 Langford, et al., Mol. Cell. Biol. 1986, 6, 3191-3199)는 발현된 단백질의 주요한 구조를 의한다. 게다가, 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus) 백신은 상대적으로 값이 싸고 저장, 운송 및 전달이 쉬운 이점이 있고, 말라리아가 가장 만연한 개발도상국에서 특히 중요한 특징이 있다.
기생충이 면역계에 노출되는 무성(asexual) 혈액 주기에서 분열소체(merozoite)가 유일한 단계이기 때문에 분열소체(merozoite)의 표면에 있는 단백질이 면역 반응에 좋은 대상이고 좋은 말라리아 백신이 될 것 같다. 다발성분열(schizogony) 동안 합성된 주요한 분열소체 표면 항원1(merozoite surface antigen1) (MSA1)에 전구체(precursor)인 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 190kD 당단백질은 혈액단계 말라리아 백신으로 전도유망할 것으로 생각된다 (Blackman, et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1991, 49, 29-34; Perrin, et al., J. Exp. Med., 1984, 160, 441-451; Siddiqui, et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 3014-3018; Perrin, et al., Immunol. Rev., 1982, 61, 245-269). 고분자량 전구체(precursor)는 분열소체(merozoite) 표면에 복합체로 남아 있는 88kD, 30kD, 38kD 및 42kD 조각으로 처리 가공된다 (Holder, et al., Parasitology, 1987, 94, 199-208; McBride and Heidrich, Mol. Biochem. Parasitol., 1987, 23, 71-84). 그 복합체는 42kD 앵커 조각(anchor fragment)의 분열에 의해 막으로부터 방출되고, 19kD 카르복실 말단 조각은 분열소체(merozoite) 막에 남아 있고 침입된 적혈구 속으로 운반된다 (Blackman, et al., supra; Blackman, et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1991, 49, 35-44). 처리 가공되지 않은 열대열원충(P. falciparum)의 완성된 MSA1은 감염에 대한 부분적이거나 완전한 보호를 제공하는데 사용되어졌고 (Blackman, et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1991, 49, 29-34; Perrin, et al., J. Exp. Med., 1984, 160, 441-451; Siddiqui, et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 3014-3018), 인간에서 대단히 면역반응을 유발한다 (Perrin, et al., Immunol. Rev., 1982, 61, 245-269). 바큘로비루스(baculovirus)에서 발현되는 것처럼, MSA1의 C말단 처리 조각에 대한 토끼 항체가 시험관 내에서 기생충 성장을 강하게 억제한다. 이 항체들은 동종성 및 이종성 기생충을 비슷한 정도의 효율로 억제할 수 있었다 (Hui, et al., Infect. Imm. , 1993, 61, 3403-3411).
조지타운 대학의 이전의 연구에서, 열대열원충(P. falciparum)에 대한 추정상의 적혈구 수용기(受容器)인 글라이코포린(glycophorin) A에 대항하는 일련의 단클론성 항체(monoclonal antibodies) (mAbs)가 준비되었다. 2B10이라 지명된 mAbs 중의 하나가 MSA1이 인간 적혈구에 결합하는 것을 막고 열대열원충 분열소체(P. falciparum merozoite)가 인간 적혈구에 침입하는 것을 억제할 수 있다 (Su, et al., Infect. Imm., 1993, 151, 2309). 2B10의 앤타이이디오타입(anti-idiotype) 항체가 웨스턴 블랏(western blot)에서 MSA1의 C말단(1047-1640aa) 부위를 인식했고 (Su, et al., J. Immunol., 1995) 분열소체(merozoite)처럼 글라이코포린(glycophorin) A 자리를 인식하는 것 같다.
본 발명은 N말단에 시스날 단백질과 C말단에 앵커(anchor) 서열을 포함한 단백질을 암호화하는 DNA 부분에 연결된 벡터로 구성된 신규한 DNA 구조물에 관한 것이다.
더 상세히, 본 발명은 인간에서 열대열원충(Plasmodium falciparum)에 의해 일으켜지는 말라리아의 예방과 치료에 유용한 백신에 관한 것이다.
이 연구는 다아파(DARPA)에 의해 지지받았다. 정부가 그 발명의 권리를 보유한다.
도 1은 MSA1C-(Si,A), MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A) 및 MSA1C-(nSi,nA)에 대응하는 서열을 포함하는 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus) 구조에 대한 그림이다.
도 2-5는 MSA1C-(Si,A), MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A) 및 MSA1C-(nSi,nA)에 대한 유전자 서열을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 4가지 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 대한 그림이다 즉 rv-MSA1-(Si,A); rv-MSA1-(Si,nA); rv-MSA1-(nSi,A); rv-MSA1-(nSi,nA). 이 도면은 다른 MSA1 구조를 발현시키는 재조합 백시니아 비루스 게놈(vaccinia virus genome)에 대한 도표이다. TKl및 TKR은백시니아 비루스 싸이미딘 카이네이즈 유전자(vaccinia virus thymidine kinase gene)의 오른쪽과 왼쪽 부분; LacZ는 베타갈락코시데이즈 유전자(beta-galacosidase gene). Si는 MSA1의 시그날 부분(signal region); nSi는 MSA1의 시그날이 아닌 부분(no signal region); A는 MSA1의 앵커 부분(anchor region); nA는 앵커가 아닌 부분(no anchor region).
도 7은 항(anti)-MSA1C-A 마우스 혈청(mouse serum)을 탐침(探針, probe)으로 사용한 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus) 발현 단백질과 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 감염된 BSC-1 세포로부터 발현된 단백질의 웨스턴 블랏 (Western blot) 분석으로부터 얻은 결과도이다. A는 rV.V-MSA1C-(Si,nA) 감염 세포들의 과립(pellet); B는 rV.V-MSA1C-(Si,nA) 감염 세포들의 상청액(supernatant); C는 rV.V-MSA1C-(Si,A) 감염 세포들의 과립(pellet); D는 rV.V-MSA1C-(Si,A) 감염 세포들의 상청액; E는 rV.V-MSA1C-(nSi,nA) 감염 세포들의 과립(pellet); F는 rV.V-MSA1C-(nSi,nA) 감염 세포들의 상청액; G는 rV.V-MSA1C-(nSi,A) 감염 세포들의 과립(pellet); H는 rV.V-MSA1C-(nSi,A) 감염 세포들의 상청액; I는 WR 감염 세포들의 과립(pellet); J는 WR 감염 세포들의 상청액.
도 8은 불침투성 감염 세포들(non-permeabilized infected cells)의 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로부터 얻은 결과도이다. 전처리된 커버슬립(coverslip) 위에 48시간 동안 심은 힐라(HeLa) 세포가 M. O. I. 5에서 재조합 및 와일드타입 백시니아 비루스(wild-type vaccinia virus)에 감염되었다. 그 세포들을 항(anti)-MSA1C-A 혈청(serum)으로 찾았고 FITC 염소 항마우스(goat anti-mouse)로 레이블(label)했다. A, B: rV.V-MSA1C-(Si,nA) 감염 세포; C, D: rV.V-MSA1C-(Si,A) 감염 세포; E, F: rV.V-MSA1C-(nSi,nA) 감염 세포; G, H: rV.V-MSA1C-(nSi,A) 감염 세포; I, J: WR 감염 세포.
도 9는 본 발명의 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 피부 내 면역이 된 토끼에서 얻은 결과도이다. 토끼 5마리가 재조합 및 와일드타입 백시니아 비루스(wild-type vaccinia virus)에 피부 내 면역이 되었고, 한 마리가 rV.V-MSA1C-(Si,A)에 정맥 내 면역이 되었다. 피부 내 면역은 0, 21, 47 및 68일에 발생했고, 정맥 내 면역은 0, 47, 68일에 발생했다. 33, 54 및 78일에 취한 혈액 샘플(blood samples)을 trpE-MSA1C-A 단백질 (대장균(E. coli)으로부터 발현되고 정제된 MSA1의 C말단) 항체에 대해 효소결합면역흡착검사(ELISA) 분석을 했다. 혈청이 복제되었다. (+)rV-MSA1C-(Si,A); (△)rV-MSA1C-(Si,A); (○)rV-MSA1C-(Si,nA); (X)rV-MSA1C-(nSi,nA); (◇)rV-MSA1C-(nSi,A); (∫)WR.
도 10은 본 발명의 백시니아 비루스(vaccinia virus)로 접종된 Balb/c 쥐에서 얻은 결과도이다. Balb/c 쥐는 0, 21, 42 및 63일에 재조합 및 와일드타입 백시니아 비루스(wild-type vaccinia virus)로 복강내 접종되었다. 11, 31, 51, 73, 93, 123, 147, 167 및 187일에 취한 혈액 샘플(blood samples)을 trpE-MSA1C-A 단백질 (대장균(E. coli)으로부터 발현되고 정제된 MSA1의 C말단) 항체에 대해 효소결합면역흡착검사(ELISA) 분석을 했다. 혈청이 복제되었다: (∫) rV-MSA1C-(Si,A); (○) rV-MSA1C-(Si,nA); (X) rV-MSA1C-(nSi,A); (◇) rV-MSA1C-(nSi,nA); (+) WR.
도 11은 백시니아 비루스 유도 마우스 항체(vaccinia virus induced mouse antibodies)에 의한 190kD 열대열원충(P. falciparum)의 인식에 대해 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)으로부터 얻은 결과도이다. 스키존트(schizont) 단계 기생충을 완충액에서 끓여서 용해시켰고 4-20% Tris-글리신(glycine) 편차 겔(gradient gel) 위에 놓았고, 그 단백질은 전기 영동에 의해서 PVDF 막으로 이동되었다. 그리고 나서 이 블랏들(blots)을 항(anti)-MSA1C-(Si,A), 항(anti)-MSA1C-A 또는 항(anti)-WR 항체로 면밀히 조사하고 탈인산 가수분해 효소가 결합된 염소 항마우스(goat anti-mouse) IgG로 레이블(label)했다. A. 항(anti)-MSA1C-(Si,A); B. 항(anti)-MSA1C-A; C. 항(anti)-WR.
본 발명은 발현 벡터, 바람직하게는, 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 주요한 분열소체 표면 항원(merozoite surface antigen) 1 (MSA1)의 특정 영역에 실질적으로 대응하는 단백질을 발현시키는 백시니아 비루스 (vaccinia virus)계 또는 그것의 면역원성 펩타이드 부분에 관한 것이다.
이 바람직한 백시니아 비루스(vaccinia virus)계에서, MSA1 단백질 영역에 대한 DNA 암호화는 페이션트(patient)에게 투여 후에 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 의해 발현된다. 그때 페이션트(patient)에서 발현된 MSA1 단백질 또는 부조각(sub-fragment)이 분열소체(merozoite) 말라리아 항원에 대한 체액 및/또는 세포 중개(cell-mediated) 반응을 일으키는데, 그 반응은 일련의 말라리아 감염으로부터 예방 접종을 한 페이션트(patient)를 보호한다. 본 발명에 의한 바람직한 실시예에서, 백시니아 비루스(vaccinia virus)계는 페이션트(patient)에서 항원을 며칠, 몇 달 심지어는 몇 년 동안 계속 발현시켜서, 발현된 항원에 대한 페이션트(patient)의 면역원성 반응을 강화시킨다.
발현 벡터 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 의해 발현되는 MSA1 펩타이드 항원 또는 그것의 면역원성 펩타이드 부분은 또한 시그날 펩타이드(signal peptide) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide) 서열로 구성된다. 본 발명에 의한 백신에서 발현된 MSA1 항원에 시그날(signal) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide)를 첨가하면 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 MSA1 단백질의 페이션트(patient)에게 면역원성을 예기치않게 높이는 것으로 밝혀졌다. MSA1과 시그날(signal) 및/또는 앵커(anchor) 단백질의 함유물은 본 발명에 의한 백시니아 비루스(vaccinia virus)계에 의해 발현될 수 있고 발현된 펩타이드는 MSA1 펩타이드 단독 또는 보조와 결합해서 보다 의미심장하게 더 큰 면역원성 반응을 일으킨다는 것은 예기치않은 결과이다. 또한 MSA1 펩타이드 서열에 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 의한 시그날(signal) 및 앵커 서열(anchor sequence)의 함유물은 시그날(signal) 또는 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)을 포함하지 않는 MSA1 펩타이드에 의해 일으켜지는 면역원성 반응보다 100배 더 큰 면역원성 반응을 일으킬 것이라는 것은 예기치않은 결과이다.
페이션트(patient)에게서 면역원성 반응을 일으키는 방법이 또한 본 발명에 의해서 연구된다. 이 방법에서, 페이션트(patient)는 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 MSA1 펩타이드를 발현시킬 수 있는 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 양을 투여받아서 발현된 펩타이드에 대해서 면역원성 반응을 나타낸다. 바람직하게 일으켜진 면역원성 반응은 "실질적으로 보호"할 것인데, 즉, 말라리아로 인한 페이션트(patient)의 사망을 포함해서, 더 심한 말라리아의 증상과 생리적인 상태로부터 페이션트(patient)를 보호할 것이다.
본 발명은 또한 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 생활환에서 분열소체(merozoite) 단계에 대한 면역원성 반응을 유도하기 위한, 백신과 같은 면역원성 투약 형태에 관한 것이다. 말라리아 감염에 대해 페이션트(patient)를 예방 접종하는 방법도 본 발명에 의해 연구된다. 이 방법에서, 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 MSA1 펩타이드를 발현시킬 수 있는 백시니아 비루스(vaccinia virus) 또는 그것의 면역원성 펩타이드 부분의 효과적인 양을 생산하는 면역원성 반응을 함으로써 페이션트(patient)는 열대열원충(Plasmodium falciparum) 감염에 대해 예방 접종을 받는다.
본 발명은 또한 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 주요한 분열소체 표면 항원(merozoite surface antigen) 1 (MSA1) 또는 시그날(signal) 및/또는 앵커 서열(anchor sequence), 더 바람직하게는 시그날 서열(signal sequence)과 앵커 서열(anchor sequence) 모두를 결합한 열대열원충(Plasmodium falciparum)에 대한 면역원성 펩타이드 부분에 대응하는 펩타이드 서열로 구성되는 키메릭 단백질(chimeric proteins) 또는 펩타이드(peptides)에 관한 것이다.
다음 용어들은 본 발명을 설명하기 위하여 명세서 전체에서 사용될 것이다.
"키메릭 단백질(chimeric protein)", "키메릭 펩타이드(chimeric peptide)" 또는 "키메릭 펩타이드 서열(chimeric peptide sequence)"이라는 용어는 발현된 단백질이나 펩타이드와 앵커 펩타이드(anchor peptide) 및/또는 시그날 펩타이드(signal peptide)로 구성되는 본 발명에 의한 비자연적인 펩타이드 서열을 설명하기 위해 사용된다. 이 용어가 의미하는 것처럼, 키메릭 펩타이드(chimeric peptide)는 일반적으로 또 다른 펩타이드 서열 (앵커(anchor) 또는 시그날 펩타이드 서열)과 결합한 바람직한 대상 단백질 또는 펩타이드 (MSA1 또는 그것의 면역원성 펩타이드 부분)를 포함하는 발현 벡터에 의해 생산되는 합성 펩타이드이다.
"페이션트(patient)"는 본 발명에 의한 발현 벡터 또는 키메릭(chimeric) 단백질의 투약 형태를 투여받은 포유동물과 특히 인간을 포함한 동물을 설명하기 위해서 사용된다. 본 발명에서, 발현 벡터는 MSA1 또는 그것의 면역원성 펩타이드 부분을 암호화하고 페이션트(patient)에서 암호화된 단백질이나 펩타이드를 발현시킨다.
"발현 벡터(expression vector)"는 특정한 펩타이드나 단백질을 암호화하는 DNA, CDNA, RNA 또는 그것들의 변형, 더 바람직하게는 DNA 조각들을 포함해서 핵산이 요구되는 단백질을 발현 또는 생산하기 위해서 페이션트(patient)나 페이션트(patient)의 조직 속에 도입될 수 있는 수단을 설명하기 위해 사용된다. 그런 벡터들은 요구되는 MSA1 단백질 또는 그것의 면역원성 펩타이드 조각, 앵커(anchor) 펩타이드 서열 및/또는, 시그날 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열이 숙주에 삽입되고 복제될 수 있는 벡터를 포함한다. 발현 벡터(expression vector)는 분리 배양해서 키메릭(chimeric) 펩타이드를 생산하는데도 사용될 수 있다. 바람직한 벡터는 포유류의 세포에서 펩타이드 또는 단백질 서열을 발현시킬 수 있고 제한 부위가 잘 알려져 있고 요구되는 단백질 또는 펩타이드 서열의 발현을 위해 필수적인 작동 요소를 포함하는 것이다. 본 발명에서, 벡터는 포유류의 세포를 감염시킬 수 있고 숙주의 생합성 메커니즘을 이용해 단백질을 발현시키거나 합성할 수 있는 백시니아 비루스(vaccinia virus) 벡터, 아데노비루스(adenovirus) 벡터 또는 허피스 비루스(herpes virus) 벡터가 바람직하다. 그런 경우에, 전달을 위해 사용되는 바이러스 벡터는 세포를 감염시키지만 복제에 기인한 세포 용해를 일으키지 않는 것이 가장 바람직하다 (즉, 아데노비루스(adenovirus), 백시니아 비루스(vaccinia virus) 및 허피스 비루스(herpes viruses), 비슷한 종류로부터 선택된 약화되거나 부분적으로 무력하게 된 비루스).
본 발명에서 벡터 연구법에 따르면, 벡터는 숙주 세포를 감염시키고, 숙주 세포의 생합성 경로를 사용해, 암호화된 단백질 또는 펩타이드 조각을 합성할 것이다. 상세한 발생과 인간 이용 역사를 가진 면역이 된 매개물이 본 발명에서 발현 벡터(expression vector)로 사용될 수 있다. 바람직한 발현 벡터(expression vector)는 바이러스 벡터이고 더 바람직하게는, 예를 들면, Earl and Moss, Current Protocols in Molecular Biology, 1993, 16. 17. 1-16. 17. 16과 Smith and Moss, Gene, 1983, 25, 21-28에서 설명하는 것처럼, 백시니아 비루스 벡터(vaccinia virus vector)이다. 그러나, 위에서 설명한 대로 사용될 수 있는 백시니아(vaccinia) 또는 다른 바이러스 벡터가 본 발명에 사용되는데 적당할 수 있다.
요구되는 단백질 또는 펩타이드 서열을 발현시키기 위해서, 발현 벡터(expression vector)는 적어도 한 개의 촉진 유전자(promoter), 작동 유전자(operator), 종결(terminator) 코돈과 그 벡터로부터 핵산의 효과적인 전사와 해독에 필요한 서열을 포함해야 한다. 이러한 작동 요소들은 그 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 의한 바람직한 실시예에서는, 발현 벡터(expression vector)는 적어도 한 개의 선택가능한 표지(selectable marker)를 가진 숙주에 의해 인식되는 복제 기점과 핵산 (바람직하게는, DNA) 서열의 전사를 일으킬 수 있는 촉진 유전자 서열로 유리하게 구성될 것이다.
"백신(vaccine)"은 활발한 면역 예방을 위한 조제품을 설명하기 위해 명세서 전체에서 사용된다. 본 발명에서, 백신(vaccine)은 발현 벡터(expression vector), 바람직하게는 백시니아 비루스(vaccinia virus)계를 포유류와 같은 동물에 투여한 후에 항원 단백질을 발현시키는 백시니아 비루스(vaccinia virus)계로 구성된다. 백신(vaccine)은 MSA1 또는 시그날 펩타이드 서열 및/또는 앵커(anchor) 펩타이드 서열과 결합한 면역원성 펩타이드 부분으로 구성된 키메릭(chimeric) 펩타이드로 구성될 수도 있다. 본 발명에 의한 백신(vaccine(s))을 투여하는 방법은 다양하여 정맥 내, 입, 경구, 피부와 코를 포함하지만, 근육 또는 피하 투여가 가장 흔한 투여 방법이다.
"MSA1 단백질(protein)" 또는 "MSA1 펩타이드(peptide)"는 열대열원충(Plasmodium falciparum) 또는 그것에 대한 면역원성 펩타이드 부분의 분열소체(merozoite) 단계의 주요한 분열소체 표면 항원(merozoite surface antigen) 1을 설명하기 위해 사용된다. MSA1은 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 분열소체(merozoite) 단계의 주요한 표면 단백질이다. 다발성분열(schizogony) 생활환 단계 동안 합성되는 것은 190kD 당단백질이다. 고분자량 전구체(precursor)는 분열소체(merozoite) 표면에 복합체로 남아 있는 88kD, 30kD, 38kD 및 42kD 조각으로 처리 가공된다. 그 복합체는 42kD 앵커 조각(anchor fragment)의 분열에 의해 분열소체(merozoite) 막으로부터 방출되고 19kD 카르복실 말단 조각은 분열소체(merozoite) 막에 남아 있고 침입된 적혈구 속으로 운반된다. 완성된 MSA1 유전자 서열은 UNDP/WORLDBANK/WHO/TDR 말라리아 서열 데이터 베이스에서 입수할 수 있다. 본 발명에 의한 백시니아 비루스(vaccinia virus)계에서 발현에 바람직한 MSA1 부분은 MSA1의 카르복실 말단 부분 (아미노산 1047-1640에 대응)이다. 본 발명에서, 발현된 단백질은 바람직하게는 MSA1 부분이 적어도 MSA1의 카르복실 말단 부분을 포함하는 MSA1 또는 그것의 어느 부분일 수 있다.
"MSA1의 카르복시말단 부분(carboxy-terminal region of MSA1)"과 "카르복시말단의 MSA1 펩타이드(carboxy-terminal MSA1 peptide)"는 본 백신(vaccines)에서 바람직한 발현된 항원 펩타이드 서열인 아미노산 1047-1640에 대응하는 MSA1 단백질의 부분을 설명하기 위해 사용된다. 그것은 단백질 부분에 대해 유도될 수 있는 면역 반응의 특이성 때문에 체액 및/또는 세포 중개(cell-mediated) 반응의 발달에 바람직한 대상을 나타낸다. 본 발명에서, 본 발명에 의한 C말단 MSA1 펩타이드는 많은 MSA1 단백질이 백시니아 비루스(vaccinia virus)계에 합체되는 것보다 덜 특이한 면역 반응을 일으킨다. 본 발명에서, C말단 MSA1 펩타이드를 설명하는 위 용어들은 위에 언급한 593 아미노산 펩타이드 뿐만 아니라 실질적으로 593 아미노산 펩타이드에 상당하는 펩타이드도 포함한다.
C말단에 대응하는 다음의 DNA 서열은 본 발명에서 바람직하게 사용된다:
TTGAATTC ACTTAATAAC CCAAAGCATG TATTACAAAA CTTTTCTGTT
TTCTTTAACA AAAAAAAAGA AGCTGAAATA GCAGAAACTG AAAACACATT
AGAAAACACA AAAATATTAT TGAAACATTA TAAAGGACTT GTTAAATATT
ATAATGGTGA ATCATCTCCA TTAAAAACTT TAAGTGAAGA ATCAATTCAA
ACAGAAGATA ATTATGCCAG TTTAGAAAAC TTTAAAGTAT TAAGTAAATT
AGAAGGAAAA TTAAAGGATA ATTTAAATTT AGAAAAGAAA AAATTATCAT
ACTTATCAAG TGGATTACAT CATTTAATTG CTGAATTAAA AGAAGTAATA
AAAAATAAAA ATTATACAGG TAATTCTCCA AGTGAAAATA ATACGGATGT
TAACAATGCA TTAGAATCTT ACAAAAAATT TCTCCCAGAA GGAACAGATG
TTGCAACAGT TGTAAGTGAA AGTGGATCCG ACACATTAGA ACAAAGTCAA
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TTGTCAAAGA TCCATATAAA TTTCTTAATA AAGAAAAAAG AGATAAATTC
TTAAGCAGTT ATAATTATAT TAAGGATTCA ATAGATACGC ATATAAATTT
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CAGATTTAGA TTCAATTAAA AAATATATCA ACGACAAACA AGGTGAAAAT
GAGAAATACC TTCCCTTTTT AAACAATATT GAGACCTTAT ATAAAACAGT
TAATGATAAA ATTGATTTAT TTGTAATTCA TTTAGAAGCA AAAGTTCTAA
ATTATACATA TGAGAAATCA AACGTAGAAG TTAAAATAAA AGAACTTAAT
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GAAGGTGATA AATGTGTTGA AAATCCAAAT CCTACTTGTA ACGAAAATAA
TGGTGGATGT GATGCAGATG CCAAATGTAC CGAAGAAGAT TCAGGTAGCA
ACGGAAAGAA AATCACATGT GAATGTACTA AACCTGATTC TTATCCACTT
TTCGATGGTA TTTTCTGCAT TTCCTCTAAC TTCTTAGGAA TATCATTCTT
ATTAATACTC ATGTTAATAT TATACAGTTT CATTTAA
상기한 MSA1의 C말단에 대응하는 아미노산 서열은:
KLNSLNNPKHVLQNFSVFFNKKKEAEIAETENTLENTKILLKHYKGLVKYYNGESSPLKTLSEESIQTEDNYASLENFKVLSKLEGKLKDNLNLEKKKLSYLSSGLHHLIAELKEVIKNKNYTGNSPSENNTDVNNALESYKKFLPEGTDVATVVSESGSDTLEQSQPKKPASTHVGAESNTITTSQNVDDEVDDVIIVPIFGESEEDYDDLGQVVTGEAVTPSVIDNILSKIENEYEVLYLKPLAGVYRSLKKQLENNVMTFNVNVKDILNSRFNKRENFKNVLESDLIPYKDLTSSNYVVKDPYKFLNKEKRDKFLSSYNYIKDSIDTDINFANDVLGYYKILSEKYKSDLDSIKKYINDKQGENEKYLPFLNNIETLYKTVNDKIDLFVIHLEAKVLNYTYEKSNVEVKIKELNYLKTIQDKLADFKKNNNFVGIADLSTDYNHNNLLTKFLSTGMVFENLAKTVLSNLLDGNLQGMLNISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSSSNFLGISFLLILMLILYSFI이다.
MSA1 단백질 또는 MSA1 단백질의 면역원성 펩타이드 부분에 실질적으로 대응하는, 바람직하게는, 적어도 C말단의 MSA1 펩타이드의 면역원성 부분에 대응하는 펩타이드를 포함하는 발현된 펩타이드가 본 백신(vaccine)에 사용될 수 있다. 물론, MSA1 단백질 및/또는 시그날 서열(signal sequence) 또는 앵커 서열(anchor sequence)과 결합한 면역원성 펩타이드 부분에 대응하는 발현된 펩타이드도 본 발명에 사용될 수 있다.
"시그날 펩타이드(signal peptide)" "시그날 서열(signal sequence)" 또는 "시그날 단백질(signal protein)"은 본 발명에 의한 페이션트(patient)에서 발현된 단백질이나 펩타이드의 생물학적 활성을 실질적으로 높이기 위해 본 발명에서 사용되는 발현된 단백질이나 펩타이드의 N말단이나 그 근처에서 일반적으로 발견되는 7-30 단위 아미노산 펩타이드 서열, 바람직하게는 약 15-26 단위 아미노산 펩타이드 서열을 설명하기 위해 사용된다. 약 7과 30 사이의 아미노산 단위, 더 바람직하게는, 약 15-26 아미노산 단위, 훨씬 더 바람직하게는 약 16-24 아미노산 단위와 가장 바람직하게는 약 18-20 아미노산 단위의 공수성(hydrophobic) 펩타이드 서열을 일반적으로 포함하는 시그날 서열(signal sequence)은 세포 내 막에 대한 단백질 사슬 ( 일반적으로, 분비 단백질)을 찾는데 필수적인 것 같다. 이러한 공수성 서열은 세포막의 지질 이중층을 통과하는데 충분한 길이이다. 시그날 서열(signal sequence)은 거대분자들의 세포 이동을 위한 조직자로서 기능한다. 이 단백질들은 막을 가로질러 폴리펩타이드 사슬의 이동에 중심 역할을 한다고 생각된다. 본 발명에서, 예방 접종을 받은 페이션트(vaccinated patient)에 의해 발현된 단백질이나 펩타이드 서열의 아미노 말단에 시그날 단백질 서열(signal protein sequence)을 합체하는 것은 발현된 단백질이나 펩타이드와 관련된 생물학적 활성 (면역원성의 치료 효과 포함)의 실질적인 강화와 연관된다. 본 발명에서는, 주지된 시그날 서열(signal sequence)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효모 또는 더 하등한 영양 동물 시그날 서열(signal sequences)을 이용할 수 있지만, 포유류의 시그날 서열(signal sequences)이 포유동물에 사용되는데 분명하게 바람직하고 특정한 종의 시그날 서열(signal sequences)이 요구되는 포유류에서 사용되는데 가장 바람직하다. 따라서, 발현된 단백질이나 폴리펩타이드를 인간에 제공할 때, 인간 시그날 서열(signal sequence)이 가장 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 시그날 서열(signal sequences)은 3부분, 매우 극성이지만 전하를 띠지 않는 경향이 있는 약 5-7 아미노산 잔기들로 구성된 펩타이드의 카르복시 말단에 첫 번째 또는 c 부분 (시그날 펩티다제(signal peptidase) 효소에 대한 분열 위치로 기능); 일반적으로 길이가 약 7-13 아미노산 잔기이고 매우 공수성인, c 부분에 대한 N 말단인 두 번째 또는 h 부분 (주로 Leu, Ala, Met, Val, Ile, Phe 및 Trp 아미노산으로 구성되지만, 종종 Pro, Gly, Ser 또는 Thr 아미노산 잔기를 포함); 그리고 길이와 성분이 매우 다양하지만, N 말단에 의한 양전하 (산성 잔기가 원인이 되는 음전하도 알려져 있음)와 어떤 대전된(charged) 잔기라도 일반적으로 나르는 세 번째 부분 또는 n 부분. 작고 대전되지 않는(uncharged) (Ala, Gly, Ser 등) 경향이 있는 1-3 아미노산 잔기들은 c 부분과 h 부분 사이에 있다. 루신(leucine), 아이소루신(isoleucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 발린(valine), 알라닌(alanine) 및 트립토판(tryptophan), 바람직하게는 루신(leucine), 아이소루신(isoleucine) 및 페닐알라닌(phenylalanine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 구성된 합성 호모폴리메릭(syntheric homopolymeric) h 부분이 본 발명에 의한 시그날 단백질(signal protein)에 사용될 수 있다. von Heijne, European Journal of Biochemistry, (1983), 133, pp. 17-21 참조.
본 발명에 사용되는 시그날 서열(signal sequences)은 진핵생물의 시그날 서열(eukaryotic signal sequences), 바람직하게는 7-30 아미노산 단위, 15-26 단위, 더 바람직하게는 16-26 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는, 18-20 아미노산 단위를 포함한다. 본 발명에서, 시그날 펩타이드(signal peptide)의 c 부분은 더 극성이고 잔기 -5와 -6 또는 -7 또는 -8 사이에 h와 c 부분 사이에 경계 (시그날 서열(signal sequence)의 분열 위치로부터 셀 때 즉, 성숙하거나 발현된 단백질 또는 펩타이드의 첫 번째 아미노산은 +1이다)는 작고 대전되지 않은 경향이 있는 1-3 아미노산 잔기이다 (Ala, Gly, Ser 등). 아미노산에 대한 h/c에서 위치 선호는 다음과 같다:
-10 가장 바람직하게는 루신(leucine) 또는 대체적으로는 아이소루신(isoleucine), 발린(valine), 알라닌(alanine) 또는 페닐알라닌(phenylalanine);
-9 가장 바람직하게는 루신(leucine), 대체적으로는 아이소루신(isoleucine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 페닐알라닌(phenylalanine);
-8 가장 바람직하게는 루신(leucine), 대체적으로는 아이소루신(isoleucine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 글리신(glycine), 페닐알라닌(phenylalanine);
-7 가장 바람직하게는 알라닌(alanine), 대체적으로는 루신(leucine), 아이소루신(isoleucine), 발린(valine), 페닐알라닌(phenylalanine);
-6 가장 바람직하게는 발린(valine), 대체적으로는 루신(leucine), 발린(valine), 아이소루신(isoleucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 알라닌(alanine);
-5 가장 바람직하게는 프롤린(proline), 대체적으로는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 루신(leucine), 발린(valine);
-4 가장 바람직하게는 글리신(glycine), 대체적으로는 프롤린(proline), 루신(leucine), 알라닌(alanine), 발린(valine);
-3 가장 바람직하게는 알라닌(alanine), 대체적으로는 발린(valine);
-2 가장 바람직하게는 루신(leucine), 대체적으로는 페닐알라닌(phenylalanine);
-1 가장 바람직하게는 알라닌(alanine), 대체적으로는 글리신(glycine).
본 발명에 사용되는 시그날 서열(signal sequence)에서, h 부분은 길이가 다양할 수도 있다. n 부분은 극성이고, 양으로 대전된 아미노산 (주로 리신(lysine)과 아르기닌(arginine))을 포함하고 상기한 바와 같이 시그날 펩타이드(signal peptide)의 전체 길이가 다양하다. c 부분은 시그날 펩타이드(signal peptide)/발현되거나 성숙한 단백질의 잔기 -1부터 -5까지 확장된다. c, h 및 n 부분의 위치를 보면, c 부분은 발현되거나 성숙한 단백질의 N 말단이고, h 부분은 c 부분에 대해 N 말단이며 (c와 h 부분 사이의 1-3 아미노산 경계와 더불어) n 부분은 h 부분의 양으로 대전된 N 말단이다. 요컨대, n 부분은 길이가 다양하고 일반적으로 양으로 대전되어 있고 (+2가 선호됨), h 부분은 공수성이고 길이가 다양하며 c 부분은 약 5 (5-7)개의 일반적으로 극성인 아미노산을 포함한다.
공수성 부분의 말단 (즉, 위에 열거한 공수성 잔기 사이의 경계)은 바람직하게는 -6/-5 위치에 있어야 한다. 전반적으로, 시그날 서열(signal sequence)은 5-10 단위 잔기 초기 서열 (메티오닌(methionine)으로 시작) 뒤에 적어도 7개의 잔기 서열 (상기한 것과 같음)과 그 외의 1-10 잔기 아미노산으로 구성되어야 한다. 그 부분의 전형적인 서열은:
ILLLLAV이다.
사용되는 시그날 서열(signal sequence)은 단백질의 발현에 사용되는 세포 형태의 특징을 나타낸다. 따라서, 수의학적 사용에서, 가장 바람직하게 사용되는 시그날 서열(signal sequence)은 동물의 것이다. 종종 포유류의 시그날 서열(signal sequence)이 좋다. 대부분의 포유류의 시그날 서열(signal sequence)이 다른 포유류 세포에서 단백질이나 펩타이드를 발현시키는데 의미있는 효율을 가질 것이다. 인간의 시그날 서열(signal sequence)이 인간에 바람직하게 사용된다.
본 발명에서, 다음의 시그날 펩타이드(signal peptide) DNA 서열이 바람직하게 사용된다:
ATG AAGATCATAT TCTTTTTATG TTCATTTCTT TTTTTTATTA
TAAATACACA ATGTG; 및
ATG AAGATCATAT TCTTTTTATG TTCATTTCTT TTTTTTATTA
TAAATACACA ATGTGTAACA CATGAAAGTT ATCAAGAACT TGTCAAAAAA CTAGAAGCTT TAGAAGATGC AGTATTGACA GGTTATAGTT TATTTCAAAA GGAAAAAATG GTATTAAATG AA.
상기한 시그날 펩타이드(signal peptide) DNA 서열에 대응하는 아미노산 서열은:
MKIIFFLCSFLFFIINTQC; 및
MKIIFFLCSFLFFIINTQCVTHESYQELVKKLEALEDAVLTGYSLFQKEKMVLNE이다.
"앵커 단백질(anchor protein)" 또는 "앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)"은 포스파티딜 이노시톨(phosphatidyl inositol)을 함유한 다당류(glycan)에 일반적으로 공유 결합함으로써 원형질막의 외부 표면에 고정된 단백질 또는 펩타이드를 설명하기 위해 사용된다. 앵커 단백질(anchor protein) 또는 펩타이드(peptide)가 결합된 이런 구조를 글라이코실 포스파티딜이노시톨(glycosyl phosphatidylinositols) 또는 GPIs라고 말한다. 모든 세포에서, GPIs에 공유 결합된 앵커 단백질(anchor proteins)은 세포의 원형질막의 외면이나 분비낭(secretory vesicles)의 내강 표면(lumenal surface)에서 발견된다.
본 발명에서 "앵커 단백질(anchor protein)" 또는 "앵커 펩타이드(anchor peptide)"는 바람직하게는 본 발명에 의한 발현(expression vector)에 의해 발현된 단백질이나 펩타이드의 카르복시 말단 (요구되는 단백질이나 펩타이드를 발현시키는 DNA 서열의 3' 말단과 그 발현된 단백질이나 펩타이드의 카르복실 말단)에서 일반적으로 발현되는 길이가 약 15-35 잔기인 펩타이드 서열로 구성된다.
본 발명에서, 페이션트(patient)에서 발현된 수많은 단백질이나 펩타이드와 특히, 페이션트(patient)에서 발현된 본 발명에 의한 백신의 면역원성 단백질이나 펩타이드는 앵커 펩타이드(anchor peptide)가 그 단백질이나 펩타이드의 카르복시 말단에서 합체될 때 실질적으로 강화된 생물학적 또는 면역원성 반응을 페이션트(patient)에서 일으킨다. 발현된 단백질의 카르복시 말단에 앵커 펩타이드(anchor peptide)를 첨가하고, N말단이나 그 근처에 시그날 단백질(signal protein)을 포함시키면, 발현된 단백질의 생물학적 효과에 예기치않은 강화가 일어난다. 이것은 특히 발현된 단백질이 항원성(antigenic)이거나 면역원성인 경우에 틀림없다.
발현된 단백질이나 펩타이드 잔기의 카르복시 말단은 당지질 앵커(glycolipid anchor)의 부착에 의해 변경되는데, 당지질 앵커(glycolipid anchor)는 세포 표면에 변경된(modified) 단백질이나 펩타이드를 고정시킨다. GPI 앵커(anchor)가 첨가되는 펩타이드 잔기는 항상 글리신(glycine), 아스파르트산(aspartic acid), 아스파라긴(asparagine), 알라닌(alanine), 세린(serine) 및 시스테인(cysteine)과 같은 작은 아미노산들 중의 하나이다. 이런 것들은 대상 단백질/펩타이드의 카르복시 말단에서 생기고 대상 단백질/펩타이드를 지정하는 cDNA 서열에 첨가되기 위해 DNA 조각에 적당한 코돈을 포함시킴으로써 지정될 수 있다. 게다가, 앵커(anchor) 첨가 자리의 아래에 있는 두 잔기는 대개 작다.
세 개의 잔기들 중 가운데 것이 강력한 입체 요건을 가지지 않지만, 분열/앵커 첨가 자리(cleavage/anchor addition site)는 3개의 작은 아미노산 잔기 부분에 있다. 대상 단백질/펩타이드의 카르복시 말단이나 그 근처에 있는 기능적 또는 면역학적으로 중요한 아미노산이 조정되지 않는 것을 확실히 하기 위해, 10 잔기까지 만드는 추가적인 아미노산 (바람직하게는, 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine)과 프롤린(proline) 뿐만 아니라 리신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)같은 극성 아미노산)이 작고 극성인 조각이 카르복시 말단에 있도록 삽입된다. 추가적인 시그날 서열(signal sequence)의 나머지는 카르복시 말단에 공수성 부분을 가진 15-35 아미노산을 포함할 것이다. 이 부분은 15-25 아미노산에 미치고 발린(valine), 루신(leucine), 아이소루신(isoleucine), 알라닌(alanine), 페닐알라닌(phenylalanine)과 같은 아미노산을 포함할 것이지만, 트립토판(tryptophan) 뿐만 아니라 프롤린(proline)과 글리신(glycine)도 포함할 것이다. 전형적인 서열은 다음과 같다:
TACDLAPPAGTTD AAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETATAP
작은 서열은 왼쪽 부분에 굵게 그 단백질의 말단과 GPI 첨가 자리인 D 잔기를 나타내고 있다. 오른쪽 부분은 GPI 첨가 동안 분열되는 공수성 말단을 밑줄로 나타내고 있다.
본 발명에서, 앵커 펩타이드(anchor peptide)는 갈라지는 N 말단 서열을 가질 수 있는데, 갈라지는 N 말단 서열은 펩타이드를 GPI 앵커(anchor)가 첨가되는 소포체와 세포의 운반로로 이끈다. 상기한 바와 같이, 앵커 펩타이드(anchor peptide)도 일반적으로 크기가 약 15-35이고 더 바람직하게는 약 15-30, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 약 15-25 아미노산 잔기인 카르복시 말단에 주로 공수성 서열을 가지고, GPI 앵커(anchor)의 첨가를 알리며 GPI 첨가와 동시에 갈라진다. 그것은 앵커(anchor) 첨가에 중요한 서열이라기보다는 오히려 공수성이다. 본질적으로 적어도 약 15-35, 더 바람직하게는 약 15-30 아미노산 잔기의 어떤 공수성 아미노산 서열이라도 GPI 앵커(anchor)의 첨가를 지시할 수 있을 것이다. 앵커(anchor) 첨가는 일반적으로 GPI 전구체(precursor)의 유리된 에탄올아민 아미노기가 대상 아미노산, C 말단 아미노산의 펩타이드 결합을 공격하는 (친핵성 첨가에 의해서) 트랜스아미데이션(transamidation) 반응이다.
일반적으로, 발현된 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)에서, GPI 앵커(anchor)가 첨가되는 공수성 서열의 위쪽은 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 공간(spacer) (대개 약 5-10 잔기)이다. GPI 앵커(anchor)가 첨가되는 잔기는 ("앵커 첨가 자리(anchor addition site)") 글리신(glycine), 아스파르트산(aspartic acid), 아르기닌(arginine), 알라닌(alanine), 세린(serine) 및 시스테인(cysteine)으로부터 선택된 친수성 공간(spacer) 내에 있는 아미노산 잔기이다. 게다가, 앵커 첨가 자리(anchor addition site)로부터 아래쪽에 있는 두 개의 잔기도 대개는 앵커 첨가 자리(anchor addition site)에서 입체장애를 명확히 최소화할 정도의 작은 아미노산 잔기이다.
바람직하게는, GPI 부분은 미리 만들어지고 발현된 단백질이나 펩타이드의 카르복시 말단 근처의 특정 아미노산 잔기에 시그날 단위(single unit)로서 첨가된다. 따라서, 카르복시 말단 부분은 바람직하게는 길이가 10-30 아미노산인 C 말단 시그날 펩타이드(signal peptide)에 의해 특징지워지고 GPI 앵커(anchor)를 첨가하는데 필요한 정보를 제공한다. GPI 구조가 붙는 실제 아미노산 잔기를 오메가 자리(omega site)라고 부르고 이 잔기는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine), 또는 아스파르트산(aspartic acid)이어야 한다. 오메가(omega) +1 자리 (발현되고 처리 가공되지 않은 단백질의 카르복시 말단 쪽으로)는 바람직하게는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamate) 및 트레오닌(threonine)으로부터 선택된다. 오메가(omega) +2 자리는 알라닌(alanine) 또는 글리신(glycine)이다. 오메가(omega) +2 자리 뒤에 바람직하게는 대전된 아미노산들과 프롤린(proline)을 포함하는 이상적으로 5-7 아미노산들의 중심점 또는 공간(spacer)이 있다; 이것 뒤에는 카르복실 시그날 펩타이드(carboxyl signal peptide)를 종결시키는 바람직하게는 공수성 아미노산 서열이 차례로 있다.
앵커 펩타이드(anchor peptide)의 전체 구조는 발현된 단백질이나 펩타이드의 카르복실 말단에 있는 15-35 아미노산 펩타이드로 요약할 수 있다. 이 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence) (아미노 방향 말단으로부터)은 길이가 다양한 공수성 아미노산으로 시작해서, 대전된 잔기들을 포함하는 바람직하게는 5-7 아미노산과, 3개의 아미노산(오메가(omega) +2 자리에 글리신(glycine) 또는 알라닌(alanine)) ; +1 오메가 자리(omega site)에 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamate) 및 트레오닌(threonine) 중 어느 것; 그리고 오메가 자리(omega site)에 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 세린(serine), 시스테인(cysteine), 아스파르트산(aspartic acid) 또는 아스파라긴(asparagine) 중 어느 것이 있다.
본 발명에서, 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence)이 일반적으로 N 말단 (N 말단에 바로 또는 N 말단으로부터 1000 이상의 아미노산이 제거됨)에서 발견되고 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)은 일반적으로 발현된 단백질이나 펩타이드의 카르복시 말단에서 발견되는 반면, 시그날 펩타이드(signal peptide)는 발현된 대상 단백질이나 펩타이드의 카르복시 말단이나 그 근처에서 발견될 수 있다.
본 발명에서는, 주지된 앵커 서열(anchor sequence)을 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 효모 또는 더 하등한 영양 동물 앵커 서열(anchor sequences)을 이용할 수 있지만, 포유류의 앵커 서열(anchor sequences)을 포유동물에 사용하는게 분명하게 바람직하고 특정한 종의 시그날 서열(signal sequences)을 요구되는 포유류에 사용하는게 가장 바람직하다. 발현된 단백질이나 폴리펩타이드를 인간에 제공할 때, 인간 앵커 서열(anchor sequence)이 가장 바람직하다.
본 발명에서, 다음과 같은 앵커 펩타이드(anchor peptide) DNA 서열(sequence)이 바람직하게 사용된다:
TTCTTAGGAA TATCATTCTT ATTAATACTC ATGTTAATAT TATCCAGTTT CATTTAA.
상기한 앵커 펩타이드(anchor peptide) DNA 서열에 대응하는 아미노산 서열은:
FLGISFLLILMLILYSFI이다.
더 넓은 발명의 이용을 입증하는 실험에서, 도 2-5에 나타난 서열이 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 합체되었고 실험 동물에서 발현되었다.
본 발명에서, 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence)이 일반적으로 N 말단 (N 말단에 바로 또는 N 말단으로부터 1000 이상의 아미노산이 제거됨)에서 발견되고 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)은 일반적으로 발현된 단백질이나 펩타이드의 카르복시 말단이나 그 근처에서 발견되는 반면, 시그날 펩타이드(signal peptide)는 카르복시 말단이나 그 근처에서 발견될 수 있고 앵커 펩타이드(anchor peptide)는 발현된 대상 단백질이나 펩타이드의 N 말단이나 그 근처에서 발견될 수 있다.
"효과적인 양(effective amount)"은 말라리아에 대한 보호 면역 또는 치료 반응을 일으키는데 효과적인 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 양이나 농도를 말한다. 일반적으로, 인간에게 투여되는 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 효과적인 양은 페이션트(patient)가 이전에 열대열원충(Plasmodium falciparum)에 노출된 적이 있는지 등 페이션트(patient)와 관련된 많은 요소들에 따라서 다양할 것이다. 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 효과적인 양은 그 산물의 복용량을 다양하게 하고, 투여 전에 세포와 체액의 면역 및/또는 치료 반응을 측정하므로써 결정할 수 있다. 일반적으로, 인간에서, 이 양은 대략 104- 107플라크 형성 단위(plaque forming units), 바람직하게는 약 1 X 106- 5 X 106플라크형성 단위(plaque-forming units)이다 (상기한 바와 같은 분석으로 결정). 상기한 바와 같이 투여된 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 범위는 백신 수혈자(vaccine recipient)에서 말라리아 감염을 일으키지 않으면서 면역원성 반응을 일으키는 가능성을 높이도록 선택된다.
면역원성 반응을 용이하게 하기 위해 발현 벡터(expression vector) 대신에 키메릭 펩타이드(chimeric peptide)를 투여하는 경우에, 투여하는 키메릭 펩타이드(chimeric peptide)의 양은 말라리아에 대한 보호 면역 또는 치료 반응을 일으키기 위한 펩타이드의 양이나 농도일 것이다. 이 양은 선택된 키메릭 펩타이드(chimeric peptide)의 면역원성에 따라 상당하게 넓은 범위에 걸쳐 다양하지만, 일반적으로 투여하는 펩타이드의 양은 약 0.01 마이크로그램(micrograms) (10 나노그램(nanograms))-250 마이크로그램(micrograms), 더 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램(micrograms)-100 마이크로그램(micrograms), 훨씬 더 바람직하게는 약 1 마이크로그램(micrograms)-25 마이크로그램(micrograms) 범위이다.
바람직한 실시예처럼, 본 발명은, MSA1을 가진 시그날 펩타이드(signal peptide)와 앵커 펩타이드(anchor peptide)를 발현된 펩타이드에 합체시키는 것이 MSA1 펩타이드에 대한 면역 반응을 일으키는데 특히 유리하다고 한다. 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence)은 일반적으로 MSA1 펩타이드나 항원성 펩타이드(antigenic peptide)의 아미노 말단이나 그 근처에 면역원성 펩타이드에 합체되고 앵커 펩타이드(anchor peptide)는 일반적으로 MSA1 펩타이드의 카르복시나 그 근처에 합체된다. 따라서 면역원성 펩타이드는 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 의해서 발현되고 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence) 및/또는 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)을 포함할 것이다. 그러므로, 본 발명에서, 시그날(signal) 및 앵커 펩타이드(anchor peptides)는 각각 바람직하게는 발현된 MSA1 펩타이드의 아미노와 카르복시 말단에서 발현된다. 일반적으로, 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence)은 MSA1 펩타이드로부터 위쪽에 위치하고 앵커 펩타이드(anchor peptide)는 MSA1 펩타이드로부터 아래쪽에 위치한다.
백신 수혈자(vaccine recipient)에 의해 MSA1 펩타이드, 바람직하게는 시그날(signal) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide)를 포함한 MSA1 펩타이드의 발현으로 이끄는 백시니아 비루스(vaccinia virus)를 준비하는 방법에서, MSA1 펩타이드와 선택적으로, 시그날 펩타이드(signal peptide) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide)의 발현을 위한 유전 물질을 포함한 DNA 서열을 합체할 수 있는 방법을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 방법은 그 분야에서 주지되어 있다. 따라서, 본 발명에서, 발현될 MSA1 펩타이드를 위한 유전자 코드를 포함한 DNA 서열은 화학 합성이나 MSA1 DNA 서열의 생화학 분리와 같은 다른 수단에 의해 구하고 클로닝 플라스미드(cloning plasmid) 속에 합체된다 (예를 들면 다음과 같은 클로닝 벡터들(cloning vectors): 많은 것들 중에서 상업적으로 입수할 수 있는 pBR322, pGEM3z, pSP70, pSE420, pRSET, lambdaZAP). 예를 들면, 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 사용해서 적당한 DNA 서열을 클론(clone)하고, 분리하고, 증폭 벡터에 합체하고 DNA의 요구량을 얻기에 충분한 사이클 (DNA 요구량에 따라, 약 5-40 사이클 이상)동안 표준 중합효소 사슬 반응 기술(standard polymerase chain reaction technique)에 의해 증폭한다. 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence) 및/또는 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)을 MSA1 펩타이드를 포함한 벡터에 합체하고, PCR과 엔도뉴클레아제 소화(endonuclease digestion)에 의해 양(positive) 클론에서 적당한 DNA 조각을 확인(identification) (선택(selection)과 스크리닝(screening))한 후, 동일한 테크닉을 사용해 증폭할 수 있다.
증폭 후, DNA를 운반 벡터에 합체하고 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)를 생산하기 위해 진핵 세포, 예를 들면, 원숭이 신장 세포 (BSC-1 세포)와 와일드타입 백시니아 비루스(wild-type vaccinia virus) (WR)로 운반한다. 그리고 나서 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)를 정제 후 증폭한다. 증폭 후, 어떤 경우에는 정제 후, 바람직하게는 시그날 펩타이드(signal peptide) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide)와 결합한, MSA1 펩타이드 또는 그것의 면역원성 부분을 발현시키는 면역원성 복용 형태로서 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)를 동물에 투여한다.
대체적으로, 일단 면역원성 키메릭 단백질(immunogenic chimeric protein)을 암호화하는 핵산이 적당한 발현 벡터(expression vector) 안에 존재하면, 발현 벡터(expression vector)는 적당한 진핵 세포계에서 면역원성 키메릭 단백질(immunogenic chimeric protein)을 발현시키기 위해, 예를 들면, 숙주 밖에서 요구하는 펩타이드 서열의 생산을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 그런 진핵 세포계는, 예를 들면, 힐라(HeLa), L929, T2 또는 RMA-2, 바람직하게는 T2 또는 RMA-S이다. 이 방법에서, 발현 벡터(expression vector(s))를 포함하는 세포들을 기르고 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)및/또는 시그날 서열(signal sequence)과 결합한 요구하는 단백질 또는 펩타이드 서열을 포함하는 합성 펩타이드를 분리하기 위해서 용해한다. 그 때 분리한 펩타이드 서열을 치료나 면역원성 복용 형태로 직접 사용할 수 있다. 대체적으로 그리고 바람직하게는, 발현 벡터(expression vector)가 요구하는 단백질이나 펩타이드와 앵커 서열(anchor sequence)을 발현시키는 페이션트(patient)에게 직접 투여할 수 있고 의도한 치료 또는 면역원성 효과를 그 페이션트(patient)에게 끼칠 수 있다.
겔 전기영동, 친화성(affinity)과 면역친화성(immunoaffinity) 크로마토그래피, 미분 침전(differential precipitation), 분자체(molecular sieve) 크로마토그래피, 등전 집중법(isoelectric focusing)과 이온교환 크로마토그래피를 포함한 주지된 표준 단백질 정제 과정에 의해 세포들을 용해한 후에 발현된 단백질을 세포 배양으로부터 얻을 수 있다. 면역친화성 크로마토그래피의 경우, 적어도 단백질이나 펩타이드의 한 부분에 특이한 항체에 결합한 수지(resin)가 들어 있는 관(column)을 통과시켜 단백질이나 펩타이드를 정제할 수 있다.
세포 배양으로부터 얻은 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence) 및/또는 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence)을 포함한 발현된 단백질이나 펩타이드를 세포 배양으로부터 정제하지 않은 라이세이트(lysate)를 정제하므로써 그런 치료를 필요로 하는 페이션트(patient)에게 순수하거나 상당히 순수한 형태로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 수용할 수 있는 첨가제, 운반체 또는 엑시피언트(excipient)와 결합한 앵커 펩타이드 서열(anchor peptide sequence) 및/또는 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence)을 포함한 발현된 단백질의 면역반응을 유발할 정도의 효과적인 양으로 구성된 성분으로서의 복용 형태로 발현된 단백질을 투여한다. 포뮬레이션(formulation)을 주지된 방법에 의해 준비된 단위 복용 형태로 전달할 수 있다. 투여되는 발현된 단백질이나 펩타이드의 양은 파모카이네틱(pharmokinetic) 변수, 질병의 심함 또는 요구되는 면역원성 반응에 따라서 다양할 것이다. 물론, 페이션트(patient)의 연령, 체중과 상태, 면역원성 복용 형태의 경우에, 페이션트(patient)가 이전에 본 발명의 복용 형태로부터 발현된 단백질의 특징 뿐만 아니라 예방 접종을 받은 그 질병에 원인이 되는 미생물에 노출된 적이 있는지를 포함해서 관련된 요소들을 고려한 의사가 복용량을 정할 것이다.
본 발명에 따라 투여되는 발현된 단백질의 양은 의도한 효과를 내는, 즉, 말라리아에 대한 실질적으로 보호 효과를 제공하는 페이션트(patient)에서 면역원성 반응을 얻기에 효과적인 양으로 구성된다.
대체적으로 그리고 바람직하게는, 본 발명에 따라 투여하는 백신은 페이션트(patient)에 면역원성 반응을 주기에 충분한 MSA1 펩타이드를 발현시키기에 효과적인 발현 벡터(expression vector), 바람직하게는, 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 양으로 구성된다. 바람직하게는, MSA1 펩타이드 또는 그것의 면역원성 펩타이드 서열이 시그날(signal) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide)를 포함하지 않는 MSA1 펩타이드와 비교할 때 발현된 펩타이드의 면역원성을 실질적으로 증가시키기 위해서 시그날(signal) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide)와 결합된다. 면역 반응은 말라리아의 분열소체(merozoite) 단계에 대해 보호 효과를 제공한다.
본 백신은, 투여를 편리하게 하기 위해, 또는 제약적으로 수용가능한 운반체에 첨가될 수 있는 것처럼 주입될 수 있다. 적당한 제약적으로 수용가능한 운반체는 그 분야에 당업자에게 명백할 것이고, 비극성 운반체 뿐만 아니라 저분자량의 알칸올, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜 같은 폴리알칸올을 포함해서 물과 다른 극성 물질을 포함할 것이다.
운반체와 함께 투여하는 본 발명에 의한 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus) 또는 키메릭 단백질(chimeric protein)이나 펩타이드는 종종 단독으로 투여하는 양과 같을 것이다 (같이 투여하지 않음). 물론, 페이션트(patient)가 이전에 열대열원충(Plasmodium falciparum)과 본 발명의 복용 형태로부터 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 특징에 노출된 적이 있는지를 포함해서 페이션트(patient)의 연령, 체중과 상태를 포함한 관련 요소들을 고려한 의사가 복용량을 정할 것이다.
본 발명의 말라리아 백신에서, 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 복용량은 투여하는 형태에 의존할 것이다. 예를 들면, 백신은, 발현된 면역 단백질의 요구 정도에 따라, 104-107플라크 형성 단위(plaque forming units), 바람직하게는 약 1 X 106- 5 X 106플라크형성 단위(plaque-forming units) 농도일 것이다. 따라서, 본 백신 내에 있는 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 농도 또는 양은 일반적으로 이 범위 내에 있을 것이다; 그러나, 어떠한 백신 형태로도 사용되는 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 양은 유도된 면역원성 반응의 세기에 의존할 것이다.
주어진 백신 복용량에서 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 양을 결정할 때, 다음과 같은 방법을 사용할 수 있다. 어떤 백신 복용 형태에는, 상기한 바와 같은 운반체를 포함할 수 있다. 백신에 들어 있는 비루스의 비율은 복용량 뿐만 아니라, 비루스의 화학적 성질, 용해도, 안정도에 의존할 것이다. 복막 내, 근육 내, 피하, 유방 내 또는 다른 경로와 같은 비경구적(parenteral) 경로를 통한 비경구적 투여 또는 주입을 위해, 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 살균액을 준비한다. 본 발명에 의한 백신도 정맥 내로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 의한 백신을 피하를 통해 투여한다.
사용되는 백신 복용량과 치료 계획은 일반적인 치료 방법에서 다른 예방 접종 또는 치료 양생법(regimen)에 보통 사용되는 관행을 따를 것이다. 초기에 하나 이상의 백신이 필수적이라고 예상되지는 않지만, 복용량을 증강하는 것이 예상된다. 바람직하게는, 말라리아에 대한 면역을 위한 복용 계획은 적어도 약 1 X 106플라크형성 단위(plaque-forming units)의 백시니아 비루스(vaccinia virus)의 피하 주입이다.
본 발명에 의한 면역원성 방법에서, 인간 페이션트(patient)는 바람직하게는 시그날(signal) 및/또는 앵커 펩타이드(anchor peptide)와 결합한 MSA1 펩타이드 또는 그것의 면역원성 펩타이드를 발현시키는 효과적인 양의 백시니아 비루스(vaccinia virus)를 투여받는다. 대체적으로는, 시그날(signal) 펩타이드 및/또는 앵커(anchor) 펩타이드와 결합한 MSA1 펩타이드 또는 그것의 면역원성 부분으로 구성된 면역학적으로 효과적인 키메릭(chimeric) 펩타이드를 투여할 것이다. 어떤 경우에는, 백시니아(vaccinia) 비루스 또는 펩타이드의 첨가가 면역원성 반응을 촉진시킬 수 있다. 백신을 추가 복용하면 초기 접종을 증진시킬 수 있다.
다음의 실시예를 설명하기 위해 제공하고 발명의 범위의 제한으로서 고려되지는 않는다.
실시예
방법과 재료
비루스와 세포
원숭이 신장 세포 (BSC-1)와 Hu134TK세포의 단분자층(monolayer) 배양이 10% 피틀 보우빈 세럼(fetal bovine serum, FBS)이 보충된 덜베코스 모디파이드 이글스 미디엄(Dulbecco's modified Eagle's medium, D-MEM)에서 성장했다. 힐라(Hela) 세포와 CV세포들의 단분자층 배양은 10% FBS가 보충된 덜베코스 모디파이드 이글스 미디엄(Dulbecco's modified Eagle's medium, D-MEM)에서 성장했다.
와일드 타입 백시니아 비루스 웨스턴 리저브 (wild type vaccinia Western Reserve(WR)는 BSC-1 세포에서 성장했다.
열대열원충(P. falciparum)의 시험관내 배양
열대열원충(P. falciparum) 분리체(isolate) (홀더등, Nature, 1985, 317, 270-273에 의해 시퀀스(sequence)된 웰컴 스트레인(Wellcome strain)과 동일한 스트레인(strain), FCR-3)가 산소 5%, 이산화탄소 5%, 질소 90% 환경에 25mM 헤페스(Hepes), 32mM 중탄산나트륨과 10% 인간 혈청이 보충된 RPMI 1640 배양기에 인간 적혈구 속에 37℃로 유지되었다. 와싱턴, 디씨에 있는 조지타운 대학의 이사벨라 콰키(Isabella Quakyi) 박사가 열대열원충 균종 (P. falciparum strain) FCR-3을 친절하게도 기증했다.
MSA1의 C말단에 대한 항혈청의 준비
pME-2는 발현이 trp 촉진 유전자에 의해 조절되도록, MSA1 유전자 (3555-5917bp, MSA1의 웰컴 알레(Wellcome Allele)의 C말단이 불완전한 trpE 유전자의 3' 말단에 삽입된 pWRL507로부터 유도된 발현 플라스미드이다. 그 단백질은 홀더등, 기생충 면역학(Parasite Immunol.), 1988, 10, 607에서 설명한 방법을 사용해서 발현되었다. 그 발현된 융합 단백질은 불용성이다. 적당한(competent) DH5알파 세포들은 pME-2에 의해 변형되었고, pME-2 양(positive) 클론 1ml 배양이 100ug/ml (마이크로그램스 퍼 밀리리터(micrograms per ml)) Amp를 포함한 100ml M9 배양기에 접종되었고 하룻밤 동안 성장되었다. 하룻밤 동안 성장한 이 배양을 100ug/ml Amp와 10ug/ml 인돌아크릴릭애시드(indoleacrylic acid)를 함유한 400ml M9에 첨가하고, 37℃와 250 rpm에서 5시간 성장 후, 세포들을 거두었다. 그리고 나서 과립(pellet)을 10ml PBS에서 헹구고 -20℃로 냉동시켰다. 그 과립을 25mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA, 0.2% NP-40 및 100 ul 100mM PMSF를 함유한 10ml 용액에서 녹였다.
과립이 충분히 다시 뜰 때, 라이소자임(lysozyme)을 1mg/ml의 농도로 첨가하고, 그 용액을 2시간 동안 얼음 위에 놓았다. 2시간 후에, 20ul 1M MgSO4와 20ul 10mg/ml DNase를 첨가하고, 그 용액을 다시 2시간 동안 얼음 위에 접종시켰다. 10분간 13000rpm에서 원심분리한 후, 그 과립을 10ml의 와싱 버퍼(washing buffer)로 헹구었다 (100ul 100mM pMSF를 함유한 50mM Tris, 5mM EDTA, 5mM EDGA, 1% NP-40). 그 재료를 위와 같이 원심분리해서 과립을 얻었고 이 과립을 0.5M KSCN, 50mM tris, 5mM EDTA 및 5mM EGTA의 10ml 용액에 다시 띄우고 위와 같이 다시 원심분리했다. 마지막으로, 그 과립을 3ml 물에 다시 띄웠다. 그 산물을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분석하고 나서, 105kD 단백질을 함유한 겔을 대략 1-5mm2조각들로 잘랐다. 융합 단백질을 바이오-라드 모델 422 일렉트로-엘루터(Bio-Rad Model 422 Electro-Eluter)로 용리했고, 진공건조된 산물을 PBS에서 용해시켰다. 그 농도를 BCA 단백질 분석 시약 키트(Kit) (PIERCE)로 분석했다. Balb/c 마이스(mice)를 Titre-Max (박쎌 주식회사(Vaxcel, Inc.))가 들어 있는 100 ug 단백질로 21일간 별도로 면역시켜서 융합 단백질에 대한 항혈청을 조제했다. 두 번째 면역 후에 항혈청을 수집했다.
플라스미드 건조(construction)
(1) MSA1 시그날 서열 (Si)의 증폭
pGEX-2T-P190CR1 (1-150bp의 MSA1을 함유한 pGEX-2T)을 PCR에 샘플로 사용했다. 100ul 혼합물은 100pmol 프라이머(primer) 1과 100pmol 프라이머(primer) 2 (아래 표1), 2. 5단위 Ampli Taq DNA 중합효소(polymerase), dNTP와 10ul 10x 반응 완충액(buffer) (PIERCE)를 포함했다. 증발을 방지하기 위해서 그 시료 위에 광유(mineral oil) 몇 방울을 놓았고 30사이클의 증폭을 받았다 (94℃ 용해, 72℃ 확장(extension), 55℃ 담금질). 증폭한 산물을 1. 5% 아가로스(agarose) 겔 위에서 확인했다.
표 1
PF MSA1과 프라이머 서열로부터 증폭된 유전자의 상대적인 위치
| 증폭된 MSA1 프라이머 프라이머 서열유전자 유전자a조각 상대적 위치시그날 서열 418-582 1 GC GTCGAC ATG AAG ATC ATA TTC TTT TTA 함유 조각 SaII 2 GC GAATTCAA TTC ATT TAA TAC CAT TTT TTC EcoRIMSA1C-A 3556-5337 3 GC GAATTC ACT TAA TAA CCC AAA GCA TGT EcoRI 4 GC GGTACC TTA AAT GAA ACT GTA TAA TAT KpnIMSA1C-Si,nA 418-582 3553-5280 1 GC GTCGAC ATG AAG ATC ATA TTC TTT TTA SaII 5 GC GGTACC TTA GTT AGA GGA ACT GAC GAA AAT KpnIMSA1C-nSi,nA 475-582 3553-5280 6 GC GTCGAC ATG GTA ACA CAT GAA AGT TAT CAA SaII 5 GC GGTACC TTA GTT AGA GGA ACT GAC GAA AAT KpnIMSA1C,nSi,A 475-582 6 GC GTCGAC ATG GTA ACA CAT GAA AGT TAT CAA 3553-5337 SaII 4 GC GGTACC TTA AAT GAA ACT GTA TAA TAT KpnI |
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aGCG, 액세션 넘버(Acession no.) X02919, MSA1의 개시 코돈은 418에 있다.
MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,nA), MSA1C-(nSi,A) 조각은 시그날 서열 바로 아래에 있는 108bp 부분과 리딩 프래임(reading frame)을 보존하기 위해 C말단의 5' 말단에 2bp를 포함한다. 더욱이, 개시 코돈을 개시코돈함유 시그날 서열이 없는 두 조각에 첨가하고 종결 코돈을 앵커(anchor) 부분이 없는 두 조각에 첨가했다.
(2) MSA1 C말단의 증폭 (MSA1C-A)
pME-2 플라스미드를 PCR에 주형으로 사용했다. 100ul (마이크로리터) 혼합물은 프라이머 3과 4를 포함하고 (표 1) 30 사이클의 증폭을 받았다 (94℃ 용해, 72℃ 확장(extension), 55℃ 담금질). 증폭한 산물을 0.8% 아가로스(agarose) 겔 위에서 확인했다.
pSPORT1-MSA1C-(Si,A) (도 1)를 PCR에 주형으로 사용했다. MSA1C-(Si,nA) (프라이머 1과 프라이머 5, 표 1), MSA1C-(nSi,A) (프라이머 5와 프라이머 4) 및 MSA1C-(nSi,nA) (프라이머6과 프라이머 5) 조각도 상기돠 같은 과정으로 증폭시켰다.
(3) 유전자의 분리, 정제 및 클로닝
MSA1C-A를 PCR로 증폭하고, 0.8% 아가로스(agarose) 겔에서 전기영동을 한 결과 그 증폭된 조각은 약 1.8kb였다. EcoRI와 KpnI가 이 조각과 pSPORT1을 소화했고 T4 DNA 리가제(ligase)로 혼합 처리했다. 리게이션(ligation) 산물은 적당한 DH5알파 세포로 변형되었다. X-gal과 암피실린(ampicillin)을 양(positive) 클론 (pSPORT1-MSA1C-A, 도 1)을 스크린하는데 사용했다. 양(positive) 백색 콜로니로부터 재조합 플라스미드를 조제하고 SalI와 EcoRI 침지(digestion)로 확인을 했다. 끼워넣은 것(insert)의 완전한 서열을 결정했다.
시그날 서열을 포함한 조각을 PCR로 증폭하고, 1.5% 아가로스(agarose) 겔에서 전기영동을 한 결과 그 증폭된 조각의 크기는 약 180bp였다. 그리고 나서 Si와 pSPORT1-MSA1C-1 조각을 SalI와 EcoRI로 침지(digest)하고, 잡아매고(ligate) 변형시켰으며, 30 콜로니를 프라이머 1과 프라이머 2를 사용해서 PCR에 의해 선택해서 스크린했다. 재조합 플라스미드(pSPORT1-MSA1C-A, 도 1)를 SalI와 EcoRI 침지(digestion)로 확인하고 시퀀스했으며, 정확한 리딩 프래임(reading frame)을 정했다. 그리고 나서 MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A), MSA1C-(nSi,nA)를 증폭시키기 위해 pSPORT1-MSA1C-(Si,A)를 주형으로서 사용했다.
SalI와 EcoRI로 침지(digest)된 MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A), MSA1C-(nSi,nA)와 pSPORT1-MSA1C-(Si,A)로부터 자른 MSA1C-(Si,A)를 pSC65의 SalI와 KpnI 자리에 각각 삽입했다. 양(positive) 클론을 PCR과 SalI와 KpnI 침지에 의해 스크린하고 끼워넣은 것(insert)의 5'와 3' 말단을 시퀀스해서 정확한 리딩 프레임(eading frame)을 정했다.
도 1은 MSA1C-(Si,A), MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A) 및 MSA1C-(nSi,nA)에 대응하는 서열을 가진 재조합 백시니아 비루스의 구조이다. 본질적으로, 앵커(anchor) 부분을 가진 MSA1C말단 조각을 EcoRI와 KpnI 자리를 사용해 pSPORT1 플라스미드 속에 삽입해서 pSPORT1-MSA1C-A 플라스미드를 만들었다. 시그날 부분을 포함한 조각 (FSi)과 아래쪽 108bp를 5'말단에 있는 SALIU 자리로 PCR 증폭하고 나서 pSPORT1-MSA1C-(Si,A) 플라스미드를 만들기 위해 pSPORT1-MSA1C-A 플라스미드 속에 삽입했다. 그리고 나서 MSA1C-(Si,A) 조각 (SalI 자리에서 KpnI 자리까지)을 제거하고 pSC65 벡터를 끼워서 pSC65-MSA1C-(Si,A) 운반 벡터를 만들었다. SalI 또는 KpnI 자리를 PCR 증폭에 의해 첨가하므로써 다른 3개의 재조합 운반 벡터 (pSC65-MSA1C-(nSi,nA), pSC65-MSA1C-(nSi,A), pSC65-MSA1C-(Si,nA))를 생산했다. 그리고 나서 증폭된 조각을 pSC65 플라스미드에 끼웠다. 4가지 경우 모두에서, 삽입 위치는 합성 초기/후기 촉진 유전자 (pS-E/L)에 인접한다. TKL및 TKR은백시니아 비루스 티미딘 카이네이즈 유전자(vaccinia virus thymidine kinase gene)의 오른쪽과 왼쪽 부분; LacZ는 베타갈락코시데이즈 유전자(beta-galacosidase gene).
DNA 시퀀싱
TAQ 버전(version) 2.0 DNA 중합효소(polymerase)로 하는 DNA 시퀀싱(United States Biochem)에 따라 디데옥시(dideoxy) 뉴클레오타이드 사슬 종결 방법을 사용해서 DNA 시퀀싱을 했다. 도 2-5는 MSA1C-(Si,A), MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A) 및 MSA1C-(nSi,nA)에 대한 DNA (유전자) 서열이다.
재조합 백시니아 비루스의 트랜스펙션(transfection)과 분리
BSC-1 세포의 단분자층을 6층 플레이트(six-well plate)에서 90%로 기르고, 배양기를 제거하고, 그 세포를 0.1-1 플라크 형성 단위(plaque forming units, pfu)/세포로 1시간 동안 와일드-타입 백시니아 비루스 (WR)로 감염시켰다. 비루스 접종원(inoculum)을 제거하고, 단분자층을 압티멤 (OptiMEM) (GIBCO BRL) 혈청없는 배지(serum-free medium)로 두 번 세척했다. Opti-MEM 1ml을 감염된 단분자층에 넣고 리포펙틴(lipofectin)-DNA 복합체 50ul와 서서히 혼합했다 (재조합 pSC65 5ug을 살균 증류수로 25ul로 희석하고, 리포펙틴(lipofectin) 시약 15ug을 살균 증류수로 25ul로 희석하고, 그 용액을 폴리스티렌 관에서 서서히 혼합하고 실온에 15분 동안 방치했다). 37℃에서 5시간 배양 후, 배양기를 2% FBS가 보충된 E-MEM 3ml로 대체하고 48시간 더 배양했다. 배양기를 제거한 후, 2% FBS가 보충된 E-MEM 1ml를 따라 내고서 세포를 얻었다. 37℃에서 3 사이클의 냉동-해동에 의해서 비루스를 방출했다. 배양기를 제거한 후, 희석된 냉동-해동 트랜스펙션(transfection) 혼합물 1ml (첨가 전 4℃에서 30초 음파 파쇄)를 6층 플레이트(six-well plate)에 90%로 성장한 Hu 134 TK의 단분자층에 첨가하고, 비루스를 1시간 동안 37℃에 놓았다. 녹는점이 낮은 아가로스 1%와 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine) 25ug/ml를 함유한 2% FBS가 보충된 E-MEM 위에 감염된 세포를 놓았다. 36시간 감염 후, 녹는점이 낮은 아가로스 1%, 뉴트럴 레드(neutral red) 0.02%와 X-gal 300ug/ml를 함유한 2% FBS가 보충된 E-MEM 위에 단분자층을 놓았다. 아가로스가 굳은 후, 플라크를 염색하기 전에 단분자층을 6-8시간 동안 배양하고 희석액 1ml에 넣고 (멸균 유리 파스테르 피펫을 사용해) 3번 냉동-해동시켰다. 재조합 산물을 정제, 증폭한 후 작은 비루스를 만들었다.
백시니아 재조합 플라크의 면역염색법(immunostaining)
BSC-1 세포를 재조합 백시니아 비루스로 감염시키고, 감염 24시간 후 배양기를 감염된 조직-배양 플레이트로부터 제거했다. 1:1 아세톤:메탄올 혼합물로 2분 동안 세포를 고정시키고, 웰(well)을 PBS 1ml로 세척하고 나서, 2% FBS를 함유한 PBS에 1:200으로 희석된 항-MSA1C-A 혈청을 1ml/웰(well)로 웰(well)에 넣었다. 6층 플레이트(six-well plate)를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 살며시 흔든 후, 웰(well)을 PBS 1ml로 두 번 세척했다. 2% FBS가 들어 있는 PBS에 1:1000으로 희석된 항마우스과산화효소를 웰(well)에 넣고, 플레이트를 45분 실온에서 배양했다. PBS로 두 번 세척한 후에, 기질 용액 0.5ml를 넣었다 (무수 에탄올 500ul에 소량의 다이아니시딘(dianisidine)을 용해, 보텍스(vortex), 5-10분 데우고 나서, 30초 원심분리하고, PBS 10ml와 30% H2O210ul에 기질 용액 200ul를 첨가해서 기질 용액을 만들었다. 플레이트를 5-10분 동안 실온에 놓았다.
재조합 백시니아 감염 세포의 간접 면역형광 염색법(indirect immunofluorescence staining)
힐라(HeLa) 세포를 전처리한 커버슬립(coverslip) 위에 48시간 동안 심고, 그 후 10% FBS가 들어 있는 D-MEM 0.25ml에 M. O. I. 5에서 세포를 감염시켰다. 감염 1-2시간 후 10% FBS가 들어 있는 D-MEM 1.5ml 위에 이 세포들을 놓았다. 그리고 나서 PBS로 세척하고 PBS에 3% 파라포름알데히드에 15분 동안 고정시켰다. PBS에서 세척한 후, 커버슬립(coverslip)을 PBS에 50mM 염화암모늄에 실온에서 10분 동안 배양했다. 슬립(slip)을 PBS에서 다시 세척한 후, PBS에 1:800으로 희석한 항MSA1C-A 혈청을 웰(well)에 넣고, 4℃에서 30분 동안 배양했다. 그리고 나서 커버슬립(coverslip)을 PBS에서 3번 세척하고, 그 세포를 4℃에서 30분 동안 FITC 고우트(goat)-항-마우스와 배양했다. PBS에서 세척한 후, 커버슬립(coverslip)을 5% DABCO/Mowiol에 조직 위에 블랏(blot)하고 슬라이드 위에 올려놓았다.
웨스턴 블랏(western blot) 분석
BSC-1 세포의 융합성 6층 플레이트(six-well plate)를 M. O. I. 5에서 배양기 1ml에 재조합 백시니아 비루스와 감염시켰다. 감염 24시간 후 각각의 웰(well)로부터 세포들을 거두었다. 5분 동안 8000 rpm에서 원심분리 후, 상청액을 마이크로콘(microcon) 30(아미콘 주식회사(Amicon, Inc.))과 함께 10-15ul로 농축시키고, 세포 과립(pellet)을 200ul까지 PBS에 다시 띄웠다. 같은 부피의 2x 완충액 (100mMTris, 200mM 다이티오쓰레이톨(dithiothreitol), 4% SDS, 0.2% 브로모페놀 블루 및 20% 글리세롤)을 넣고, 그 용액을 5분 동안 끓이고 8% Tris-글리신-SDS 겔 속에 넣었다. Tris-글리신-SDS 흐르는 완충액에서 전기영동을 하고, 운반 완충액 (25mM Tris-염산, 192mM 글리신, 155 메탄올)에서 100V로 4℃에서 30분 동안 전기영동에 의해 단백질이 PVDF 막으로 운반되었다. 항MSA1C-A 혈청의 1:500 희석액을 넣기 전에 실온에서 2시간 동안 Tris-염산 (200mM, 0.85%)에 5% BSA로 블랏(blot)을 차폐했다. 2시간 배양 후 pH 7.4 Tris-염산에서 블랏을 10분씩 3번 세척했다. 알칼리성 탈인산 가수분해 효소가 결합된 고우트(goat)-항-마우스 IgG (프로메가, Promega)에 1:7500 희석액을 넣고, 블랏을 실온에서 90분 동안 배양한 후 pH 7.4 Tris-염산에서 10분씩 4번 세척했다. 알칼리성 탈인산 가수분해 효소 (프로메가, Promega)에 대한 웨스턴 블루 안정화 기질을 넣고, 5분 후, 블랏을 물로 세척해서 발달을 중지시켰다.
백시니아 비루스의 대량 조제와 플라크 적정
(1) 백시니아 비루스의 정제
2% FBS가 추가된 E-MEM에 5x107-108힐라 S3 세포를 162㎠ 플라스크에서 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 그 세포를 작은 비루스로 37℃에서 48시간 동안 감염시키고 5분 동안 원심분리에 의해 1800g 과립(pellet)으로 했다. 감염된 세포를 pH 9.0 10mM Tris-염산에 다시 띄우고 30-40 스트로크(stroke)로 균질화했다 (얼음 위에서). 혼합물을 5분 동안 300g으로 원심분리해서 핵을 제거하고, 과립 (제거된 상청액은 웰(well)에 유지됨)을 pH 9.0 10mM Tris-염산에 다시 띄우고 다시 원심분리했다 (상청액은 풀(pool) 됨). 음파 파쇄한 상청액을 벡만(Beckman) SW27 원심분리관에 36% 자당(sucrose) 위에 놓고 4℃에서 45분 동안 35000rpm으로 회전시킨 후, 비루스 과립을 pH 9.0 1mM Tris-염산 1ml에 다시 띄웠다. 자당(sucrose) 편차(gradient) 원심분리를 계속해서 와일드타입 비루스를 정제했다.
(2) 백시니아 비루스의 플라크 적정
BSA-1 세포의 단분자층을 6층 플레이트(six-well plate)에 95%로 성장시키고, 비루스를 음파 파쇄하고, 2% FBS가 보충된 E-MEM에 비루스의 순차적인 10배 희석액(10-7-10-9)을 만들었다. BSC-1 세포를 10-7, 10-8및 10-9으로 희석된 비루스 1ml로 감염시켜서 복제했다. 48시간 배양 후, 배양기를 제거하고 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 0.5㎖용액을 넣었다. 실온에서 15분 더 배양한 후, 플레이트를 물로 세척하고, 건조 후 플라크를 세었다.
항체 반응에 대한 효소결합면역흡착검사(ELISA) 측정
(1) MSA1C-A에 대한 항체 반응
96웰(well) 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 (이뮬론(IMMULON) 2, 다이너테크(Dynatech) 실험소 Inc, VA)에 pH 7.4, Tris-염산 (0.02, 0.85%)에 MSA1C-A의 용액 5ul/ml 100ul/웰(well)로 입히고 4℃에 하룻밤 동안 두었다. 그리고 나서 항원을 씌운 플레이트를 Tris-염산으로 세척하고 pH 7.4, Tris-염산에 1% BSA 150ul로 37℃에서 2시간 동안 차폐했다. pH 7.4, Tris-염산으로 세척한 후, 혈청의 순차적인 10배 희석액 (1% BSA와 0.05% Tween 20을 함유한 Tris-염산에서 희석됨) 100ul을 웰(well)에 넣고 복제했다. 37℃에서 2시간 배양 후, 플레이트를 0.05% Tween 20을 함유한 Tris-염산으로 다시 세척하고 탈인산 가수분해 효소로 레이블(label)한 IgG를 넣었다. 37℃에서 2시간 더 배양 후, 플레이트를 0.05% Tween 20을 함유한 Tris-염산으로 세척하고 알칼리성 탈인산 가수분해 효소 기질을 pH 9.8, 디에탄올아민 완충용액에 넣어서 전개시켰다. 플레이트를 다이너테크(Dynatech) 효소결합면역흡착검사(ELISA) 스캐너(scanner)에서 405nm로 스캔(scan)했다.
(2) 백시니아 비루스에 대한 항체 반응
정제된 WR 백시니아 비루스를 pH 7.4, Tris-염산으로 대략 5X106pfu/ml의 농도로 희석하고 100ul을 96-웰(well) 플레이트 (이뮬론(IMMULON) 2, 다이너테크(Dynatech) 실험소 Inc)의 웰(well) 속에 투약하고 37℃에 2시간 동안 방치했다. 완충용액을 제거하고 비루스를 10% 파라포름알데히드 50ul로 4℃에서 10분 동안 불활성화시켰다. 그리고 나서 플레이트를 첫 번째 그룹에서처럼 차폐하고 상기한 과정을 사용해 전개시켰다.
기생충에 대한 간접(indirect) 형광(fluorescent)항체 테스트
열대열원충(P. falciparum) 기생충을 인간의 적혈구에서 스키존트(schizont) 단계에서 8%의 기생충혈증까지 배양했는데, 그 때 PBS (10x 볼륨(volume))에서 5번 세척했다. 작은 샘플을 택해서, 글라스 슬라이드 위에 바르고 차가운 메탄올에서 고정시켰다. PBS에서 세척한 후, 그 샘플을 재조합과 와일드타입 비루스로 면역이 된 쥐에서의 항혈청으로 조사했다. 탐침 후, 샘플을 FITC 고우트(goat)항마우스 항체로 조사하고 5% DABCO/ Mowiol에 놓았다.
시험관내 침입 분석
샘플의 조제: 토끼의 면역전 혈청 또는 항혈청 (6.7ml)을 56℃에서 25분 동안 가열해서 불활성화시키고, 흡수 혈청에 항체들은 암모늄 설페이트(sulfate)와 함께 침전되었다. 원심분리 후, 과립을 최소량의 PBS에 용해시키고 나서, PBS에서 3번 하룻밤 동안 투석했다. 마지막으로, 부피를 1ml로 맞추었다.
열대열원충(P. falciparum) 기생충을 5% 소르비톨(sorbitol) (다이아나(Diana))과 두 번 일치시키고(synchronize), 24시간 후 3% 기생충혈증(parasitemia)과 3% 적혈구용적(hematocrit)에서 영양형(trophozoite)과 스키존트(schizont)의 혼합물을 96웰(well) 배양 플레이트 (170ul/웰(well))로 운반했다. 항혈청, 면역전 혈청 또는 혈청없는 배지를 기생충 30ul에 넣어서 200ul/웰(well)을 만들고, 플레이트를 산소 5%, 이산화탄소 5% 및 질소 90%로 5분 동안 평형이 된 기밀 용기에 37℃에서 배양했다. 22-24시간 후, 스키존트(schizont) 전부가 파열하는 세포 형태학이 입증되었다. 일단 이것이 입증되면, 각 웰(well)로부터 균질화된 감염 적혈구 4ul를 0.01% (w/v) 글루타르알데하이드 2ml에 실온에서 45분 동안 고정시켰다. 고정 후, 세포들을 4℃에서 1500rpm으로 10분 동안 원심분리하고 나서 50ug/ml 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 4℃ 암실에서 하룻밤 동안 염색했다. 형광활성 세포 선별기를 사용해 형광 세포를 셈으로써 기생충혈증(parasitemia) 전부를 측정했다. 각각의 샘플로부터 20000 세포들이 나왔다. 22-24시간 동안 침입의 억제률을 다음과 같은 공식으로 결정했다:
억제률 = (pre - 0hr) - (T - 0hr) x 100%
(pre - 0hr)
여기에서, "T"는 시험 혈청의 기생충혈증(parasitemia), "pre"는 면역전 혈청의 기생충혈증(parasitemia)이고 "0hr"은 출발 기생충혈증(parasitemia)이다.
결과
재조합 백시니아 비루스의 구조
재조합 백시니아 비루스의 구조는 도 1에 있다. 4가지 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus) 운반 플라스미드는 다음과 같이 구성되어 있다: MSA1의 시그날 및 앵커(anchor) 부분을 함유한 MSA1 펩타이드가 SalI와 KpnI 자리에 삽입되어 있는 재조합 pSC65인 pSC65-MSA1C-(Si,A); pSC65-MSA1C-(Si,nA) (MSA1이 앵커 없는 시그날을 가지는 것을 제외하고는 같음); pSC65-MSA1C-(nSi,A) (MSA1이 시그날 없는 앵커를 가지는 것을 제외하고는 같음) 및 pSC65-MSA1C-(nSi,nA) (MSA1이 시그날과 앵커 모두 없는 것을 제외하고는 같음).
백시니아 비루스 운반 벡터인 pSC65는 합성 화합물 초기/후기 촉진 유전자 (pSE/L)가 있어서 촉진 유전자에 의해 조절되는 이질적인 유전자가 비루스 생장 사이클 동안 발현된다. SalI, BglII, StuI, AatI, KpnI, SmaI, XmaI 및 PacI 자리는 이질적인 유전자의 삽입을 위해 pSE/L의 아래쪽에 바로 위치하고, 동종 재조합을 백시니아 비루스 게놈의 TK 자리로 지시하는 pSE/L과 이질적인 유전자 부분 전체의 옆에 위치하는 E. coli 베타갈락토시데이즈 유전자 서열 (초기와 후기의 백시니아 비루스 전사 조절 시그날이 있는 p7.5 백시니아 비루스 촉진 유전자에 의해 조절됨)과 백시니아 TK 유전자 서열이 있다.
BSC-1 세포가 와일드타입 (WR) 백시니아 비루스로 감염되고 나서 재조합 pSC65로 트랜스펙트(transfect)되었다. 그리고 나서 TK재조합 비루스 플라크를 선별하기 위해 BrdU에서 Hu 134 TK세포의 단분자층에 프라지니(progeny) 비루스의 순차적인 희석액을 놓았다. X-gal을 녹는점이 낮은 한천(agar)에 첨가하므로써 자발적인 TK돌연변이체와 구별했다. 베타갈락토시데이즈의 발현 때문에 청색으로 염색된 플라크를 뽑아서 몇 번 정제한 후 비루스를 조제했다. 4가지 재조합 백시니아 비루스(vaccinia virus)는 rV.V-MSA1C(Si,A); rV.V-MSA1C-(Si,nA); rV.V-MSA1C-(nSi,A) 및 rV.V-MSA1C(nSi,nA) (도 6).
MSA1C-(Si,A), MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A) 및 MSA1C(nSi,nA)의 발현
(1) 백시니아 재조합 플라크의 면역염색법(immunostaining)
BSC-1 세포가 rV.V-MSA1C-(Si,A), rV.V-MSA1C-(Si,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,A) 및 rV.V-MSA1C-(nSi,nA)로 감염되었고, 감염 24시간 후 아세톤/메탄올로 고정시킨 후, 발현된 단백질을 항마우스과산화효소로 레이블(label)했다. 재조합 백시니아 비루스에 의해 감염된 세포가 C말단 단백질을 발현시켰다.
(2) 재조합 백시니아 비루스 발현 단백질의 웨스턴 블랏 분석
BSC-1 세포가 rV.V-MSA1C-(Si,A), rV.V-MSA1C-(Si,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,A), rV.V-MSA1C-(nSi,nA) 및 WR 비루스로 감염되었다. 그리고 나서 감염 24시간 후 세포들을 거두고 세포 과립과 50배 농축 상청액이 8% Tris-글리신-SDS 겔 위에서 성장되었다. 그 블랏을 항MSA1C-A 마우스 혈청으로 레이블(label)하고 나서 알칼리성 탈인산 가수분해 효소가 결합된 염소 항마우스 IgG로 조사했다. 감염 세포가 MSA1의 C말단 부분을 발현시키고, MSA1C-(Si,nA), MSA1C-(nSi,A) 및 MSA1C(nSi,nA)의 분자량은 약 70kD이고, MSA1C-(Si,A)는 약 60kD이었다. 더욱이, 발현된 4개의 단백질 중 어느 것도 그 세포에 의해 분비되는 것 같지 않았다. 도 7은 항(anti)-MSA1C-A 마우스 혈청(mouse serum)을 탐침(探針, probe)으로 사용해서, 백시니아 비루스(vaccinia virus)에 감염된 BSC-1 세포로부터 발현된 단백질의 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 나타낸다.
(3) 간접 면역형광법(indirect immunofluorescence)
커버슬립(coverslip) 위의 세포의 면역형광법(immunofluorescence) 현미경 분석을 한 결과 MSA1C-(Si,A)와 MSA1C-(Si,nA)가 감염된 세포의 표면에서 발현되었고, MSA1C-(nSi,A)와 MSA1C-(nSi,nA)는 감염된 세포의 표면에서 발현되지 않았다. 따라서, 시그날 부분이 세포 표면에서 단백질의 발현에 필수적이라고 결론을 내렸다. 도 8은 재조합 백시니아감염 세포의 간접 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)을 나타낸다.
(4) 토끼에서 항체 반응
토끼 5마리가 rV.V-MSA1C-(Si,A); rV.V-MSA1C-(Si,nA); rV.V-MSA1C-(nSi,nA); rV.V-MSA1C-(nSi,A) 및 WR로 0, 21, 47 및 68일에 피부 내 접종되었다. 네 번째 접종 후에 rV.V-MSA1C-(Si,A)와 rV.V-MSA1C-(Si,nA)의 효소결합면역흡착검사 적정값이 rV.V-MSA1C-(nSi,nA)와 rV.V-MSA1C-(nSi,A)의 적정값보다 5-10배 더 컷다. 토끼 한 마리가 0일에 rV.V-MSA1C-(Si,A)로 정맥 내 접종되었고 47일과 68일에 재접종받았는데, 정맥 내 rV.V-MSA1C-(Si,A)의 효소결합면역흡착검사 적정값이 피부 내 rV.V-MSA1C-(Si,A)의 효소결합면역흡착검사 적정값의 5배였다. 또한, 아마도 항체가 비루스를 중성화시켰기 때문에 정맥 내 rV.V-MSA1C-(Si,A)의 효소결합면역흡착검사 적정값이 갑자기 감소했다. rV.V-MSA1C-(Si,A)와 rV.V-MSA1C-(Si,nA)가 rV.V-MSA1C-(nSi,nA)와 rV.V-MSA1C-(nSi,A)보다 토끼에서 MSA1C-A에 대해 의미심장하게 더 강한 항체 반응을 유도할 수 있고, rV.V-MSA1C-(Si,A)가 피부 내로 도입될 때보다 정맥 내로 도입될 때 두 번째 접종 후에 더 빠른 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 9).
(5) 쥐에서의 항체 반응
Balb/c 다섯 군이 1.0x108rV.V-MSA1C-(Si,A), rV.V-MSA1C-(Si,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,A) 및 WR을 복강내 접종받았다. rV.V-MSA1C-(Si,A)와 rV.V-MSA1C-(Si,nA)가 세 번째 접종 후 rV.V-MSA1C-(nSi,nA)와 rV.V-MSA1C-(nSi,A)에 의해 유도된 수준보다 5-10배 더 큰 C말단 특이 항체를 자극했다. rV.V-MSA1C-(Si,A)의 효소결합면역흡착검사 적정값은 약 1:10000이고 약 3개월 지속되었다 (도 10).
96층 플레이트 위에 씌운 와일드 타입 (WR) 백시니아 비루스를 rV.V-MSA1C-(Si,A), rV.V-MSA1C-(Si,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,A) 및 WR에 대해 재배된 마우스 항체의 순차적인 10배 희석액으로 조사하고 나서, 알칼리성 탈인산 가수분해 효소가 레이블(label)된 염소 항마우스 IgG로 조사했다. 그 결과 재조합 및 WR 비루스의 항WR 비루스 항체 적정값은 두 번째 접종 후에 거의 같았다. 따라서, 재조합 및 WR 비루스에 면역이 된 쥐 전부는 비루스에 의해 성공적으로 감염되었다 (도 10). CBA/J 쥐도 rV.V-MSA1C-(Si,A), rV.V-MSA1C-(Si,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,nA), rV.V-MSA1C-(nSi,A) 및 WR에 면역이 되었다. 항체 적정값은 약간 더 낮기는 하지만 Balb/c 쥐의 항체 적정값과 비슷했다 (데이타는 나타내지 않음).
C말단 부분의 세포표면 발현과 C말단 부분과 MSA1의 시그날 및 앵커(anchor) 펩타이드의 결합은 토끼와 쥐에서의 C말단특이 항체 반응의 자극에 중요하다는 것을 나타내었다.
웨스턴 블랏에서 기생충의 190kD 단백질로 인식된 rV.V-MSA1C-(Si,A)유도 마우스 항체
1x 샘플 완충액에 떠있는 스키존트(schizont) 단계 기생충을 5분 동안 끓이고 4-20% Tris-글리신 편차 겔로 옮기고, 그 단백질을 전기영동에 의해 PVDF 막으로 운반했다. 그리고 나서 블랏을 항MSA1C-(Si,A)와 항MSA1C-A로 조사하고 알칼리성 탈인산 가수분해 효소가 결합된 염소 항마우스 IgG로 레이블했다. 190kD 단백질이 웨스턴 블랏에서 항MSA1C-A에 의해 인식되었다. 그래서 190kD 단백질이 MSA1이라고 결론을 내렸다. 항MSA1C-(Si,A)도 190kD (MSA1) 단백질을 인식했다(도 11). 따라서 재조합 백시니아 비루스가 정확하게 쥐에서 MSA1 조각을 발현시킨다는 것을 증명한다.
기생충에 대한 간접 면역형광법(indirect immunofluorescence)
열대열원충(P. faciparum) 기생충으로 감염된 인간의 적혈구를 4개의 재조합 비루스와 와일드 타입 비루스에 면역이 된 쥐에 의해 생산된 항혈청의 다른 희석액으로 조사했다. rV.V-MSA1C-(Si,nA)와 MSA1C-(Si,A)는 1:16의 희석액에서 모두 양(positive)이었고, MSA1C-(Si,A)는 1:128에서 양으로 유지된 반면, MSA1C-(nSi,nA)와 MSA1C-(nSi,A)는 모두 1:16에서 음이었고, WR도 음이었다 (데이타는 나타내지 않음).
침입 분석
표 2. 인간의 적혈구의 항혈청에 의한 열대열원충(P. falciparum)의 억제 (x ± s.%)
배양에서 항혈청 희석
항혈청희석하지 않음 1:10 1:100 1:1000
MSA1C-(Si,nA) 54. 6±6. 7 46. 2±9. 4 30. 9±10. 8 28. 9±9. 7
MSA1C-(Si,A) 62. 5±10. 2 62. 8±5. 8 60. 4±11. 0 45. 7±11. 9
MSA1C-(nSi,nA) 27. 0±10. 3 23. 7±6. 3 20. 0±4. 6 22. 3±3. 5
MSA1C-(nSi,A) 20. 2±0. 7 12. 3±4. 9 25. 9±6. 0 20. 6±5. 0
WR 11. 8±4. 0 8. 8±8. 1 14. 2±1. 3 3. 8±4. 9
분석을 각각 똑같이 세 번 행했다.
토론
이 항원에 의해 일으켜진 면역 반응을 조사하기 위하여 MSA1 단백질의 C말단 부분을 백시니아 비루스 속에 삽입했다. MSA1 N말단 시그날 서열 원형과 C말단 앵커(anchor) 서열의 어느 것도 포함하지 않는 것, 하나 또는 둘다를 포함하는 구조를 만드는데 4개의 MSA1 조각의 변이를 사용했다. 면역염색법(immunostaining) (데이타는 나타내지 않음)과 웨스턴 블랏 분석 (도 7)으로부터 구한 데이터는 4가지 재조합 백시니아 비루스 구조가 감염된 세포에서 발현되는 것을 나타냈다. 외관상 MSA1C-(Si,A) 구조의 분자량은 예상보다 적은데 엑스포트(export) 동안 단백질의 가수 분해때문일 수 있다. 시그날 서열에다가 앵커(anchor) 부분이 존재할 때만 재조합 단백질에서 크기 차이가 보이고 단백질의 처리 가공에 두 부분 모두가 필요할 수 있다. 웨스턴 블랏도 MSA1C-(Si,nA)와 MSA1C-(Si,A) 단백질로부터 다수의 띠를 나타내는데 이것들이 다른 포도당화 형태일 수 있다. 그런 형태는 시그날 서열을 포함한 두 구조에서만 보이는데, 그 단백질은 골지체에 들어간 후 포도당화된다.
시그날 서열이 있는 두 구조는 세포 표면에서 발현되는데 반해, 시그날 서열이 없는 두 구조는 그렇지 않다. 이것은 시그날 서열이 발현된 재조합 단백질을 세포 표면으로 내보내는데 필요하다는 것을 나타낸다. 더욱이, 시그날 부분만이 세포 표면 발현에 충분하다는 것을 보여 준다. 시그날 서열 때문에, 일단 단백질이 분비로로 들어가면, 세포 표면 발현이 가능하다. 이 세포 표면 발현의 세기와 지속은 단백질이 시그날 부분에다가 앵커(anchor) 부분을 포함할 때보다 더 큰 것 같은데 이것은 공수성 상호작용때문일 수 있다. 이것은 또한 단백질이 외부로 분비되지 않고 아마도 세포 표면에 결합되어 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 시그날 서열만을 가진 구조가 시그날과 앵커(anchor) 부분을 가진 구조보다 더 약한 면역 반응을 유도한다. 앵커(anchor) 부분은 높은 면역 반응에 필요한 적당한 단백질 구조에 필요할 수 있다.
면역형광법(immunofluorescence)는 MSA1C-(Si,nA)와 MSA1C-(Si,A) 구조에 의해 유도된 항체가 시험관내에서 기생충을 인식한다는 것을 설명한다. 이것은 백시니아 비루스에 의해 발현된 재조합 단백질이 기생충 MSA1 C말단과 동일하지는 않지만 매우 유사하다는 것을 나타낸다. 백시니아 비루스를 목표로 삼는 항체는 WR 뿐만 아니라 4가지 재조합 비루스 구조가 대략 같은 정도로 투여된다는 것을 나타낸다. 따라서 4가지 구조의 항체 반응의 차이는 다양한 백시니아 비루스가 아니라 주로 단백질의 서열 때문이다. 시그날과 앵커(anchor) 부분을 포함하는 재조합 단백질은 가장 큰 면역 반응을 유도하는데 이것은 시그날과 앵커(anchor) 서열이 MSA-1 C말단 부분의 최적 발현에 유리하다는 것을 말한다. 더욱이, 시그날과 앵커(anchor) 서열 둘다를 포함하는 단백질에 대한 항체가 기생충에 의한 적혈구의 침입을 가장 효과적으로 억제한다. 침입의 62% 억제가 단지 부분적인 억제처럼 보이지만, 이러한 침입 분석을 3% 출발 기생충혈증(parasitemia)으로 행하는 반면에, 대부분의 다른 연구는 대략 0.3%에서 행해진다. 더 높은 출발 기생충혈증(parasitemia)은 방출된 많은 분열소체(merozoite) 때문에 억제를 감소시킬 수 있다.
이 연구는 MSA1C-(Si,A) 구조가 정확한 세포 표면 발현에 적당한 시그날 서열과 앵커(anchor) 서열을 가진 기능적인 단백질을 발현시키는 것을 보여 준다. 더욱이, 재조합 백시니아 비루스에 면역이 된 쥐와 토끼에 의해 생산된 항체가 시험관내에서 기생충 침입을 막을 수 있다.
기탁
특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약에 따라 다음과 같이 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301에 위치한 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American type Culture Collection)에 기탁했다. 기탁 재료의 입수에 관한 모든 제한은 그것에 대한 특허 발행에 대해 변경할 수 없도록 제거될 것이다.
미생물 ATCC 명명(designation)
재조합 백시니아 비루스 VR-2518
r. v. v-MSA.C (Si,A)
바람직한 실시예에서 설명한 것처럼, 사용된 용어들은 제한이라기보다는 설명어들이고 보다 광범위한 관점에서 본 발명의 참된 범위와 기본 요지로부터 벗어나지 않는 청구범위 내에서 수정이 가능하다고 생각된다.
Claims (34)
- 포유류의 시그날 서열 또는 포유류의 앵커(anchor) 서열과 결합하여 면역원성 MSA1 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드로 구성된 발현 벡터로 구성된 백신.
- 제 1 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 시그날 서열과 앵커(anchor) 서열과 결합한 백신.
- 제 2 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 카르복시말단의 MSA1 펩타이드인 백신.
- 제 3 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 카르복시말단의 MSA1 펩타이드인 백신.
- 제 5 항에 있어서, 상기 카르복시말단의 MSA1 펩타이드가 MSA1의 아미노산 1047부터 1640에 상응하는 593 아미노산 펩타이드인 백신.
- 제 6 항에 있어서, 상기 시그날 서열이 MKIIFFLCSFLFFIINTOC 또는 MKIIFFLCSFLFFIINTOCVTHESYOELVKKLEALEDAVLTGYSLFOKEKMVLNE인 백신.
- 제 6 항에 있어서, 상기 앵커(anchor) 서열이 FLGISFLLILMLILYSFI인 백신.
- 상기 백신을 페이션트(patient)에게 투여한 후 MSA1 펩타이드를 발현시킬 수 있는 재조합 백시니아 비루스의 효과적인 양을 투여하는 것으로 구성된 말라리아에 대해 페이션트(patient)에게 예방 접종을 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 시그날 서열과 앵커(anchor) 서열로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드와 결합된 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 시그날 펩타이드와 앵커(anchor) 펩타이드와 결합된 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 카르복시말단의 MSA1 펩타이드인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 카르복시말단의 MSA1 펩타이드인 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 카르복시말단의 MSA1 펩타이드가 MSA1의 아미노산 1047부터 1640에 상응하는 593 아미노산 펩타이드인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 시그날 서열이 MKIIFFLCSFLFFIINTOC 또는 MKIIFFLCSFLFFIINTOCVTHESYOELVKKLEALEDAVLTGYSLFOKEKMVLNE인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 앵커(anchor) 서열이 FLGISFLLILMLILYSFI인 방법.
- a) 면역원성 MSA1 펩타이드;b) 앵커(anchor) 서열 펩타이드; 및c) 시그날 서열 펩타이드로 구성된 키메릭(chimeric) 펩타이드 서열.
- 제 16 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 카르복시말단의 MSA1 펩타이드인 키메릭(chimeric) 펩타이드.
- 제 17 항에 있어서, 상기 카르복시말단의 MSA1 펩타이드가 MSA1의 아미노산 1047부터 1640에 상응하는 593 아미노산 펩타이드인 키메릭(chimeric) 펩타이드.
- 제 16 항에 있어서, 상기 시그날 서열이 MKIIFFLCSFLFFIINTOC 또는 MKIIFFLCSFLFFIINTOCVTHESYOELVKKLEALEDAVLTGYSLFOKEKMVLNE인 키메릭(chimeric) 펩타이드.
- 제 16 항에 있어서, 상기 앵커(anchor) 서열이 FLGISFLLILMLILYSFI인 키메릭(chimeric) 펩타이드.
- 면역원성 MSA1 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 포유류의 시그날 서열 또는 포유류의 앵커(anchor) 서열로 구성된 발현 벡터.
- 제 21 항에 있어서, 시그날 서열과 앵커(anchor) 서열과 결합한 상기 MSA1 펩타이드를 암호화하는 벡터.
- 제 21 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 카르복시 말단의 MSA1 펩타이드인 벡터.
- 제 22 항에 있어서, 상기 MSA1 펩타이드가 카르복시 말단의 MSA1 펩타이드인 벡터.
- 제 21 항에 있어서, 상기 카르복시말단의 MSA1 펩타이드가 MSA1의 아미노산 1047부터 1640에 상응하는 593 아미노산 펩타이드인 벡터.
- 제 22 항에 있어서, 상기 시그날 서열이 MKIIFFLCSFLFFIINTOC 또는 MKIIFFLCSFLFFIINTOCVTHESYOELVKKLEALEDAVLTGYSLFOKEKMVLNE인 벡터.
- 제 22 항에 있어서, 상기 앵커(anchor) 서열이 FLGISFLLILMLILYSFI인 벡터.
- 제 22 항에 의한 백시니아 비루스 벡터.
- 제 23 항에 의한 백시니아 비루스 벡터.
- 제 24 항에 의한 백시니아 비루스 벡터.
- 제 26 항에 의한 백시니아 비루스 벡터.
- 제약적으로 수용할 수 있는 운반체, 엑시피언트(excipient) 또는 첨가제와 결합해서 투여된 제 17 항에 의한 펩타이드의 면역반응을 유발할 정도의 효과적인 양으로 구성된 백신.
- 도 2, 도 3 또는 도 4에 나타난 서열에 실질적으로 상응하는 DNA 서열.
- 도 2에 나타난 서열에 실질적으로 상응하는 제 33항의 DNA 서열.
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