KR101522341B1 - 신규한 조건부-복제 가능 아데노바이러스 및 그의 제조 방법 - Google Patents

신규한 조건부-복제 가능 아데노바이러스 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 암질환의 예방 또는 치료용 조건부-복제 가능 아데노바이러스에 관한 것으로, 보다 구체적으로 표적-특이적 프로모터 및 E4orf 1에서 E4orf 4 영역이 결손된 아데노바이러스 유전자를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료용 조건부 복제-가능 아데노바이러스, 상기 조건부 복제-가능 아데노바이러스가 도입된 숙주 세포, 상기 조건부 복제-가능 아데노바이러스의 제조 방법 및 상기 조건부 복제-가능 아데노바이러스를 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 조건부-복제 가능 아데노바이러스 및 그의 제조 방법{Novel conditionally-replication-competent-adenovirus and method of producing the same}
본 발명은 신규한 암질환의 예방 또는 치료용 조건부-복제 가능 아데노바이러스에 관한 것으로, 보다 구체적으로 표적-특이적 프로모터 및 E4orf 1에서 E4orf 4 영역이 결손된 아데노바이러스 유전자를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료용 조건부 복제-가능 아데노바이러스, 상기 조건부 복제-가능 아데노바이러스가 도입된 숙주 세포, 상기 조건부 복제-가능 아데노바이러스의 제조 방법 및 상기 조건부 복제-가능 아데노바이러스를 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
지난 20년간 유전자 치료법은 암 질환에 대해서 대안적 또는 보조적 치료 방법으로 각광받아 왔다. 이러한 암질환의 유전자 치료법에 있어서 아데노바이러스는 가장 흔히 사용되는 벡터 중의 하나로 다음과 같은 2가지의 다른 방식으로 작용한다. 하나는 치료용 유전자를 암세포 내부로 전달하는 방식이고 다른 하나는 선택적으로 복제되어 종양 세포를 용해시키는 방식이다.
초기 연구에서는, 복제 가능 바이러스를 사용할 경우 목적하지 않은 조직에서 바이러스가 비특이적으로 복제되는 경우가 있었기 때문에 복제-불가능 아데노바이러스 (replication-incompetent adenovirus)를 암 억제 유전자, 자살 유전자, 항-혈관신생 유전자, 또는 면역 조절 유전자와 같은 치료용 유전자를 종양 부위로 전달하는데 사용했었다. 그러나, 복제-불가능 아데노바이러스에 의해 매개되는 유전자 전달 벡터는 종양 세포 내로의 낮은 감염능, 숙주세포의 면역 방어를 극복할 수 없는 점, 및 불충분한 방관자 효과 (bystander effects) 때문에, 임상에 적용하는 데 있어서 불만족스러운 평가를 받아 왔다. 따라서 아데노바이러스-매개 암 유전자 치료법의 잠재능력을 제한하는 이러한 장애물을 극복하기 위한 전략으로서, 조건부 복제 가능 아데노바이러스 (conditionally replication competent adenovirus; CRAd)가 암 치료 대체 방법으로 새롭게 등장하였다. 조건부-복제 가능 아데노바이러스는 미리 목적한 조직에서만 복제가 되고 주위 세포가 아닌 암세포만을 죽일수 있도록 디자인된 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 바이러스 유전체 내의 유전자 협조 발현을 통해 그들의 생활 주기를 완료할 때, 아데노바이러스 유전체 내 초기 유전자 4개 그룹들 (E1 , 2, 3 및 4)이 세포 안으로 진입 후 일련의 유전자 발현의 조절에 의해 아데노바이러스 용균성 생활환 (lytic cycle)을 조율하는 것으로 알려져 있다. 그 중 E4 부위는 아데노바이러스 생활주기 완료, 바이러스 복제 조절, 세포사멸 유도, 그리고 숙주세포 단백질 합성에 필수적인 역할을 하는 몇 가지 유전자를 코딩한다.
종양- 또는 조직-특이적 아데노바이러스 복제를 수행하기 위해 2가지의 전략이 제안되었다; 한 가지 방법은 아데노바이러스 복제에 필수적인 E1 유전자를 해당 표적 세포에서 활성을 가지는 특이적 프로모터 조절 하에 위치시키는 것이다; 그리고 다른 하나의 방법은 E1a 또는 E1b 유전자를 결손시켜서 기능성 E1a 또는 E1b의 부재하에서 아데노바이러스 복제를 허용하는 암세포의 독특한 능력을 이용하는 것이다. 초기 아데노바이러스 유전자인 E1a 또는 E1b 는 정상세포에서 p53 및 pRb에 각각 결합하여 세포주기를 활성화시킨다. 이러한 방식으로 작용하는 종양에 제한적인 복제-가능 아데노바이러스 (tumor restricted replication-competent adenoviruses; TRRCA)들은 종양 성장을 어느 정도 저해하였지만, 항-종양 효능에 있어서 충분하지 않았다. 따라서, 항-종양 효능을 높이기 위해서 치료용 유전자를 지닌 아데노바이러스의 개발이 요구되어 왔다.
최근까지, 대다수의 연구는 암-특이적 복제를 위해 표적-특이적 프러모터를 포함하는 E1을 사용하여 왔고, TRRCA에 의한 치료용 유전자 발현을 위해 E1b/E3 결손 바이러스를 사용하였으며, 이의 사용에 따라 어느 정도의 증대된 치료 효능을 얻었다 (Wildner O, et al., Cancer Res 1999;59: 410-327-30., Fueyo J, et al., Oncogene 2000;19: 2-12. 29., Motoi F, et al., Hum Gene Ther 2000;11: 223-35., Freytag SO, et al., Hum Gene Ther 1998;9: 1323-33.). 또한 흔치 않지만, 몇 가지 연구가 E4를 SPB (surfactant protein B) 프로모터 (Doronin K, et al., J Virol 2001;75: 3314-24), 또는 합성 카테닌 반응 인자 (synthetic catenin responsive element, Toth K, et al., Cancer Res 2004;64: 3638-44.), hTERT 프로모터 (Kuppuswamy M, et al., Gene Ther 2005;12: 1608-17.)와 같은 조직/종양-특이적 프로모터 조절 하에 위치시킴으로써 엄격한 아데노바이러스 복제 조절을 이루었음을 보고하고 있다. 본 발명자들은 이전 연구에서 아데노바이러스의 E1a 및 E4 유전자를 양방향성의 전립선암-특이 인핸서 서열 (prostate-specific-enhancer sequence, PSES; Li X, et al., Cancer Res 2005;65: 1941-51.)의 조절하에 위치시킴으로써, 전립선암 치료에 잠재적으로 유용한 신규 재조합 아데노바이러스 AdE4PSESE1a 개발을 보고한 바 있다. 이 중 E4 orf (open-reading-frames)들의 어느 부위는 아데노바이러스 복제에 필수적이지 않음에도 불구하고, E4 부위는 치료용 유전자를 발현하는 조건부 복제-가능 아데노바이러스 개발에 사용되지 않아 왔다. 또한 종전의 치료용 유전자를 발현하는 조건부 복제-가능 아데노바이러스는 치료용 유전자와 같은 외래 유전자의 삽입에 있어서 삽입되는 외래 유전자의 크기에 제한이 있는 등 한계점이 있어 왔다.
이에 본 발명자들은 조건부 복제-가능-아데노바이러스에서 외래 유전자인 치료용 유전자의 크기 제한을 완화시킬 수 있는 새로운 유전자의 탑재 위치를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 이식 유전자를 아데노바이러스에 결합하기 위한 새로운 삽입 위치로서의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 동정하는 한편, 상기 위치에 엔도스타틴 및 엔지오스타틴을 삽입하여 암의 성장 억제 및 항-종양 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 표적-특이적 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 E4orf 1에서 E4orf 4 영역이 결손된 아데노바이러스 E4 유전자를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료용 조건부 복제-가능 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조건부-복제 가능 아데노바이러스가 도입된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 E4/E1a 프로모터를 표적-특이적 프로모터로 치환하는 단계; 및 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 결손시키는 단계를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료를 위한 조건부 복제-가능 아데노바이러스의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조건부-복제 가능 아데노바이러스를 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 한 양태로서, 본 발명은 표적-특이적 프로모터 및 E4orf 1에서 E4orf 4 영역이 결손된 아데노바이러스 유전자를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료용 조건부 복제-가능 아데노바이러스에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "표적-특이적 프로모터"란 표적으로 하는 상태나 위치에 따라 특이적으로 프로모터 다운스트림 (downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 업스트림 (upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다. 특이적으로 프로모터 하위 유전자의 전사를 개시하도록 하는 핵산 서열은 표적으로 하는 상태나 위치에 따라 다양한 프로모터 서열이 제한 없이 포함될 수 있으며, 그 예로 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터가 있다. 조직 특이적 프로모터로는 아데노바이러스가 감염된 조직에서 특이적으로 하위 유전자의 전사를 개시할 수 있는 핵산 서열로서, 이에 제한되는 것은 아니나 hTERT (human Telomerase Reverse Transcriptase) 촉매 도메인 (catalytic domain)의 전사 조절체, E2F 전사 조절체, 또는 알려진 여러 조직 특이적 프로모터로 E4/E1a 프로모터를 대체하여 E4/E1a의 발현을 표적하는 부위에서 발현하도록 조절함으로써 바이러스의 증식을 조절할 수 있는 서열일 수 있다. 예를 들면 전립선 조직 특이적 프로모터와 같은 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 E4/E1a 프로모터와 대체될 수 있는 핵산 서열로서 프로모터에 추가로 조직 특이적 인핸서 서열이 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 그 예로 전립선-특이적 인핸서 서열 (prostate specific enhancer element; PSES)이 될 수 있다. 또한 조직 특이적 인핸서 서열과 작동가능하게 연결된 E4/E1a TATA 박스 또는 TATA 박스를 포함하는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 인핸서 서열의 경우 E4/E1a의 기본 프로모터 TATA 박스를 제외한 다른 전사조절 부분을 결손시키고 TATA 박스에 연결하여 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 아데노바이러스의 E4/E1a 프로모터를 PSES로 대체하여 제작한 Ad5E4(mRFP)를 HeLa, LNCaP 및 CWR22rv에 형질감염시킨 결과, 자궁경부암 세포인 HeLa 세포와는 달리 전립선암 세포주인 LNCaP 및 CWR22rv에서 특이적으로 PSES에 조절되는 mRFP에 의해 빨간색 형광 신호를 나타냄을 확인하였다 (도 2c).
본 발명에서 용어, "조건부 복제-가능 아데노바이러스"는 아데노바이러스 게놈의 비-필수영역을 결손시켜 외래 유전자를 삽입시킬 수 있는 기능을 갖는 아데노바이러스로서, 본 발명에서는 암과 같은 특정 질환을 나타내는 세포 또는 특정 조직에서 암 특이적으로 복제가 가능한 아데노바이러스를 의미한다.
본 발명에서 용어, "E4orf (open reading frame)"란 아데노바이러스의 초기 유전자군인 E1, E2, E3 및 E4 영역 중 E4 영역의 단백질을 코딩하는 영역을 의미한다. 아데노바이러스의 E1 영역은 표적세포 감염 후 1차적으로 발현이 일어나는 곳이며, 2개의 전사단위, 즉 E1a와 E1b 유전자로 이루어진다. E1a 단백질은 세포의 주기를 촉진시킴으로써 무한증식의 형질전환을 일으키며 E2, E3 및 E4 유전자의 전사를 활성화시키는 전사 조절 물질이기도 하다. 한편, E2 군의 총 3개의 유전자 생성물은 유전자 생성물 E3 및 E4와 함께 복제에 참여한다. 본 발명의 E4 영역은 아데노바이러스의 생활주기 완료, 바이러스 복제 조절, 세포사멸 유도, 및 숙주세포 단백질 합성에 필수적인 역할을 하는 몇 가지 단백질을 코딩한다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 아데노바이러스 E4orf 영역이 바이러스 복제에 필수적인지를 확인하기 위하여 복제 능력 실험을 수행한 결과, E4 결손체인 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 결손시켜도 복제 능력을 무력화시키지 않는다는 것을 확인하였다 (도 1). 또한 E4orf 영역은 정상세포에서 세포 독성 효과를 나타내고 기본적인 최소발현의 경우에도 정상세포에 손상을 줄 수 있다고 알려져 있으므로, 본 발명의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 결손한 아데노바이러스는 암 질환의 치료 또는 예방용으로 사용하는 경우 아데노바이러스 복제능을 무력화시키지 않을 뿐만 아니라 정상세포에 부작용을 완화시킬 수 있다는 것을 시사한다.
바람직한 일 실시태양으로, 본 발명은 결손된 E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 목적 유전자를 삽입할 수 있으며, 당업자의 선택에 따라 삽입되는 목적 유전자의 종류, 크기 및 서열을 달리할 수 있고, 최적화를 위하여 당업계에 공지된 유전공학적 방법으로 변화시킬 수 있음은 자명하다. 또한 목적 유전자는 치료용 유전자 또는 리포터 유전자가 포함될 수 있다. 치료용 유전자는 본 발명의 조건부 복제-가능 아데노바이러스의 종양 용해 효능뿐만 아니라 항-종양 활성을 증가시켜서 암 질환의 치료 또는 예방 효과를 증대시키기 위한 목적으로 삽입할 수 있다. 치료용 유전자는 본 발명의 아데노바이러스를 암 질환의 예방 또는 치료용으로 사용하기 위하여 암 조직에 전달하기 위하여 설계된 유전자는 제한 없이 사용할 수 있으나, 프로드럭 (prodrug) 유전자, 사이토카인 (cytokine) 유전자, 세포자살 유도 유전자, 종양 억제 유전자, 메탈로프로테이나제 (metalloproteinase) 억제제 유전자 및/또는 혈관 신생 억제제 유전자 및 티로신 키나제 (tyrosine kinase) 억제제 유전자일 수 있다. 사용할 수 있는 프로드럭 유전자의 예로는 바람직하게 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제, 카르복시펩티다제, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제; 또는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 (PNP)이다. 사용할 수 있는 사이토카인은 예컨대 GM-CSF, TNF-알파, IL-12, IL-2, IL-6, CSF 또는 인터페론-감마이다. 사용할 수 있는 세포자살-유도 유전자는 예컨대 데코린, 레티노블라스토마 94, Bax 및 Bad, 아포프틴, ADP, bcl-xs, FasL, Apo-1 및 Trail 또는 Bims이다. 사용할 수 있는 종양 억제 유전자는 예컨대 p53, p16, p21, p27 또는 MDA-7 이다. 사용할 수 있는 혈관신생 억제제는 예컨대 엔도스타틴 (endostatin) 또는 안지오스타틴 (angiostatin) 및 VEGF에 대한 항체이다. 사용할 수 있는 메탈로프로테이나제 억제제는 예컨대 Timp-3, PAI-1 또는 Timp-1이다. 티로신 키나제의 예는 EGFR (표피 생장 인자 수용체)이다. 바람직한 티로신 키나제 억제제는 허셉틴 (Herceptin) 이나 이제 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 치료용 유전자가 삽입될 수 있음을 증명하기 위해 혈관신생 억제를 통해 암 치료 기능이 있다고 알려진 엔도스타틴 및 안지오스타틴 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 삽입한 Ad5E4(Endo/angio)을 제작하고 항-종양 활성을 분석한 결과, 효과적으로 CWR22rv 이종이식 성장을 억제하는 것을 확인하였다 (도 6).
바람직한 일 실시태양으로 상기 조건부-복제 가능 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 추가로 포함하도록 제작할 수 있다. 이와 같은 리포터 유전자는 본 발명의 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있도록 한다.
본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "리포터 유전자"는 본 발명의 조건부-복제 가능 아데노바이러스의 복제 능력 또는 감염 여부를 모니터링하기 위해 사용되는 유전자로서 감염된 세포 또는 조직의 손상이 없이 모니터링할 수 있는 유전자는 제한 없이 사용될 수 있으나, 그 예로 녹색 형광 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광 단백질 (modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광 단백질 (modified red fluorescent protein; mRFP), 증강된 적색 형광 단백질 (ERFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 증강된 청색 형광 단백질 (EBFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP), 남색 형광 단백질 (CFP) 또는 증강된 남색 형광 단백질 (ECFP)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명자는 아데노바이러스의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)은 E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 삽입한 mRFP로 바이러스 복제 능력은 GFP 발현 여부를 확인하였다.
바람직한 일 실시태양으로 본 발명은 조직 특이적 프로모터로서 PSES (Prostate-specific enhancer element), 목적 유전자로서 mRFP (modified red fluorescent protein), 및 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 CMV 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 GFP (green fluorescent protein)를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 조건부-복제 가능 아데노바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 E4/E1a 프로모터를 PSES로 대체하고, 결손된 E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 mRFP를 삽입하고 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된 GFP를 코딩하는 유전자를 포함하는 Ad5E4(mRFP)를 제작하여 복제 능력 (도 3a 및 3b) 및 세포 살해능을 확인하였으며 (도 4a 및 4b), CWR22rv 이종이식 종양 모델에서 항-종양 효능을 확인하였다 (도 5a). 이는 본 발명의 아데노바이러스가 암 질환의 치료 또는 예방을 할 수 있다는 것을 시사한다.
바람직한 일 실시태양으로 본 발명은 표적-특이적 프로모터로서 PSES, 목적 유전자로서 엔도스타틴 및 안지오스타틴 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 및 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 CMV 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 GFP (green fluorescent protein)를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 조건부-복제 가능 아데노바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 Ad5E4(mRFP)의 제작 과정과 동일하지만 E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 mRFP 대신에 엔도스타틴 및 안지오스타틴 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 Ad5E4(Endo/angio)를 제작하여 CWR22rv 이종이식 종양 모델에서 항-종양 효능을 확인하였다 (도 6). 이는 본 발명의 아데노바이러스가 암 질환의 치료 또는 예방을 할 수 있다는 것을 시사한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조건부-복제 가능 아데노바이러스가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "숙주 세포"는 본 발명의 아데노바이러스를 제조할 수 있는 숙주 세포는 제한 없이 포함되나, 포유류 세포 또는 조류 세포일 수 있으며, 예시적 포유류 세포는 돼지류 세포, 인간 세포, 소류 세포 및 조류 세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 HER911E4 세포를 사용하여 아데노바이러스를 제작하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) E4/E1a 프로모터를 표적-특이적 프로모터로 치환하는 단계; 및 (b) E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 결손시키는 단계를 포함하는, 암 질환의 예방 또는 치료를 위한 조건부 복제-가능 아데노바이러스의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프로모터 치환 방법 또는 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 결손시키는 단계는 당업계에 알려진 통상적인 유전자조작 방법을 통하여 달성될 수 있다. 또한 상기 (a) 및 (b) 단계는 당업자의 선택에 따라 동시에 또는 순차적으로 수행할 수 있고, 필요에 따라 (b) 단계 후 (a) 단계를 수행할 수 있음은 자명하다.
또한 본 발명의 방법은 상기 (b) 단계의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 결손시킨 이후에 목적 유전자를 삽입하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 조건부-복제 가능 아데노바이러스의 제작은 좌측 ITR (inverted terminal repeats), 패키징 신호 (1-358 bp) 및 아데노바이러스 유전체 벡터인 pAd288E1bPSESE1a를 포함하는 클로닝 벡터인 pAd1020SfidA를 포함하는 시스템에서, pAd288E1bPSESE1a의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 mRFP로 대체해서, 3,504 bp로부터 E3 부위를 지닌 말미까지의 아데노바이러스 유전체 우측 암 (arm)을 포함하는 pAd288E4(mRFP)E1b. E4PSESE1a를 제조하였다. CMV.EGFP 발현 카세트를 pAd1020SfidA로 클로닝하여 pAd1020SfidA.CMV.EGFP를 제조한 후, 제한효소 SfiI로 절단하여 아데노바이러스 좌측 ITR, 패키징 신호 (1-358 bp) 및 카나마이신 내성 유전자 (Kanr)를 포함하는 CMV.EGFP를 유리 (release)하였다. 그 다음 Kanr.ITR.EGFP.CMV 절편을 SfiI로 절단한 pAd288E4(mRFP)E1b에 클로닝하였다. 라이게이션된 DNA는 대장균으로 형질전환시킨 후, 코스미드 DNA (cosmid DNA)를 정제한 후, PacI으로 절단하여 아데노바이러스 유전체를 유리하였고, HER911E4로 트랜스펙션하여 재조합 아데노바이러스인 Ad5E4(mRFP)를 제조하였다. Ad5E4(mRFP)는 전립선 특이 인핸서 인자인 PSES에 의해 E4 및 E1a 유전자를 조절하여 전립선암에서 특이적으로 복제되도록 디자인되었다. Ad5E4(mRFP)는 아데노바이러스 복제 모니터링을 도와주는 아데노바이러스 유전체 좌측 암(arm)의 GFP 유전자를 또한 포함하고 있다. Ad5E4(Endo/angio) 제조를 위해서, pAd288E1bPSESE1a의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 엔도스타틴-안지오스타틴 (endostatin-angiostatin)으로 대체해서, 3,504 bp로 부터 E3 부위를 지닌 말미까지의 아데노바이러스 유전체 우측 암 (arm)을 포함하는 pAd288E4(Endo/angio)E1b-E4PSESE1a를 제조하였다. Ad5E4(Endo/angio)를 만드는 나머지 절차는 상기의 Ad5E4(mRFP) 제조 방법과 동일하게 수행하였다. 바이러스 유전체 내의 CMV.EGFP 발현 카세트는 바이러스 감염의 마커인 EGFP로 인해, 시험관 내에서의 바이러스 증식 및 생체 내에서 바이러스 분포를 모니터할 수 있게 하였다. 증폭된 아데노바이러스를 CsCl 구배 원심분리로 정제하여 투석을 수행하였고, 정제 및 투석된 바이러스 분획 (aliquot)을 -70℃에서 보관하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조건부-복제 가능 아데노바이러스를 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 암 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
바람직한 일 실시태양으로 본 발명의 치료 또는 예방 가능한 암은 본 발명의 조건부 복제-가능 아데노바이러스를 이용하여 선택적으로 사멸시킬 수 있는 암은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 또는 신경계의 암이 있으며, 구체적으로 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 (central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다. 가장 바람직하게는 전립선암일 수 있다.
본 발명의 암 질환의 치료 또는 예방용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 본 발명의 조건부-증식 가능 아데노바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조건부-증식 가능 아데노바이러스는 E4/E1a의 프로모터를 전립선에서 특이적으로 발현을 증대시키는 PSES로 대체하여 제작하였고, 이에 따라 전립선암 세포주인 CWR22rv 및 LNCaP 세포를 특이적으로 사멸시켰으며 (도 4a 및 4b), CWR22rv 이종이식 종양 모델에서 종양의 성장을 특이적으로 억제하였으며 (도 5a), 조직학적 분석 결과 종양의 괴사를 나타냈고 (도 5c), 신생혈관 억제 단백질인 엔도스타틴 및 안지오스타틴 융합 단백질을 E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 삽입한 조건부-증식 가능 아데노바이러스 (Ad5E4(Endo/angio))의 경우 치료 유전자가 아닌 mRFP를 삽입한 조건부-증식 가능 아데노바이러스 (Ad5E4(mRFP)) 보다 효과적으로 CWR22rv 이종이식 종양의 성장을 억제하였을 뿐만 아니라 (도 6), 광학 현미경으로 관찰한 결과 현저한 치료 효과 및 상당 양의 섬유증을 확인하였다. 이는 본 발명의 조건부-증식 가능 아데노바이러스가 암 질환의 치료 또는 예방용 조성물로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조건부-복제 가능 아데노바이러스를 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 질환의 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 암 조직에 국소 투여한다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암 질환의 치료 또는 예방용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 항암 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 항암 효과를 증대시킬 수 있다.
본 발명의 신규한 조건부-복제 가능 아데노바이러스는 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 새로운 외래 유전자의 삽입 위치로 동정하여 종래의 조건부-복제 가능 아데노바이러스보다 더 큰 외래 유전자를 삽입할 수 있을 뿐만 아니라, E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 치료용 유전자를 삽입하여 급성 복제 후의 조건부-복제 가능 아데노바이러스의 항-종양 활성의 감소를 극복하여 암 질환의 치료 또는 예방용으로 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 야생형 아데노바이러스 및 이의 E4-결손 변이체의 복제 능력을 도시화한 것이다. 세포들 (0.5 x 106)을 6-웰 배양 접시에 시딩하고 24시간 후에 바이러스에 노출시켰다. 감염시킨 24시간 후에 세포들을 PBS로 세척한 후, 바이러스를 제거하였다. 2일 후 상등액 및 세포 펠렛 (pellet)으로부터 아데노바이러스를 수득하여 아데노바이러스 입자를 실시예의 복제 능력 분석 방법에 따라 평가하였다. 데이터는 두 개의 다른 감염 연구의 3개의 별개 시료의 평균 값이다.
도 2a 내지 도 2e는 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 이용한 CRAd의 제작을 나타낸다. 도 2a는 아데노바이러스의 초기 전사체 (E1, E2, E3 및 E4)의 구조를 도식적으로 나타낸 그림이다. GFP는 증대된 녹색 형광 단백질에 대한 cDNA, mRFP는 단량체 빨간색 형광 단백질에 대한 cDNA를 나타낸다. 도 2b는 E4 부위는 분기 서열-poly[py]-MCS (branch sequence-poly[py]-MCS)를 갖도록 재구축되어 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 대체한다. 분기 서열-poly[py]를 삽입하여 선택적 스플라이싱을 용이하게 하였으며 MCS는 본 발명의 mRFP와 같은 외래유전자의 삽입에 사용하였다. 도 2c는 1 moi의 Ad5E4(mRFP)로 세포를 노출시킨 1일 및 2일 후에 녹색 및 빨간색의 세포들을 형광현미경으로 관찰하였다. CWR22rv 및 LNCaP는 PSES-양성 세포이며, HeLa 는 PSES-음성 대조군 세포이다. 도 2d는 각 세포에서 생성된 스플라이싱 생산물을 관찰하였다. 세포들을 1 moi의 Ad5E4(mRFP)로 감염시켰다. 세포로부터 전체 RNA를 분리한 후 상당하는 cDNA를 합성하였다. 바이러스 게놈을 주형으로 (2, 4 및 6 레인) 및 cDNA를 주형으로 (3, 5 및 7 레인) E4orf6 또는 E4orf6/7 또는 mRFP에 대한 프라이머로 PCR을 수행하였다. 도 2e는 Ad5E4(Endo/angio)의 모식도를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 Ad5E4(mRFP)의 복제 능력에 관한 것이다. 도 3a는 CWR22rv 및 LNCaP 세포들을 0.1 moi의 Ad5E4(mRFP)로 감염시키고 바이러스 감염 후 6일째까지 형광현미경하에서 매일 모니터하였다. 도 3b는 복제 능력을 도 1에 개시된 바와 같이 정량화하였다. HeLa 세포는 음성 대조군이다.
도 4a 및 도 4b는 Ad5E4(mRFP)의 살해 능력을 나타낸다. 각각의 세포 (도 4a는 LNCaP 및 도 4b는 CWR22rv)를 도에 지시된 바와 같은 다양한 moi로 감염시켰다. MTT 분석은 바이러스 증폭에 의한 세포 변성 효과를 측정하기 위해 수행하였다. 모든 데이터는 두 개의 다른 감염 실험에서 별개 3개 시료의 평균 값이다.
도 5a 내지 도 5c는 CWR22rv 이종이식에서 Ad5E4(mRFP)의 생체 내 (in vivo) 항-종양 활성을 나타낸다. 도 5a는 CWR22rv 이종이식은 흉선이 없는 누드 마우스 피하에 주사하여 구축하였다. 종양을 종양 내 주사를 통해 Ad5E4(mRFP)(■) 또는 Ad5CMVGFP(▲)를 처리하였다. 종양 부피를 3일 마다 측정하고 초기 크기로부터 변화 배수에 따라 그래프를 그렸다. 도 5b는 바이러스-처리 종양의 녹색 및 빨간색 형광을 공초점 현미경하에서 분석하였다. 종양 동결 절편을 x10로 확대하였다. 각 사진의 삽입 패널은 고배율 (x40)에서 찍었다. 도 5c는 바이러스-처리 종양의 조직학적 분석이다. 종양 동결 절편을 헤마톡실린 및 에오신 염색 (왼쪽 칼럼)을 하였고 현미경 하에서 x4로 확대하였다. 각 사진의 삽입 패널은 고배율 (x20)에서 찍었다.
도 6은 Ad5E4(Endo/angio)에 의해 유도된 생체 내 (in vivo) 항-종양 활성을 나타낸다. CWR22rv 이종이식은 흉선이 없는 누드 마우스에서 확립하였다. 종양을 종양-내 주사를 통해 Ad5E4(mRFP)(■) 또는 Ad5E4(Endo/angio)(▲) 또는 Ad5CMVGFP(▼)를 처리하였다. 종양 부피를 3일 마다 측정하고 초기 크기부터 변화 배수에 따라 그래프를 그렸다. 그림은 종양 동결 절편을 헤마톡실린 및 에오신 염색을 하고 현미경하에서 x4 배율로 관찰한 그림이다. 각 사진의 삽입 패널은 고배율 (x20)에서 찍었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 실험 준비 및 실험 방법
<1-1> 세포 및 세포 배양
아데노바이러스 E1 단백질을 보충하여 E1-결손 재조합 아데노바이러스를 제조하는 데 이용되는 HEK293 세포주를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)이 첨가된 MEM 배지에서 배양하였다. HER911E4 세포주를 10% FBS 및 1% P/S를 첨가한 DMEM 배지에서 배양하였다. HER911E4 세포주는 tetR 조절하에서 아데노바이러스 E4 단백질을 발현하는 HER911 유래의 세포주로서, 100 ng/㎖ 테트라사이클린 (tetracyclin; BD Biosciences, St. Jose )을 첨가한 HER911과 같은 배지인 10% FBS 및 1% P/S를 첨가한 DMEM 배지에서 유지하였다. 인간 전립선암 세포주 (LNCaP 및 CWR22rv) 및 HeLa는 10% FBS 및 1% P/S가 첨가된 RPMI 1640에서 유지하였다. 정상 케라티노사이트 (keratinocyte) 및 전립선은 론자 (Lonza; Switzerland)로부터 구입하였고 제조사의 특별 배지에서 유지하였다.
<1-2> 재조합 아데노바이러스의 제조
본 발명자들이 사용한 재조합 아데노바이러스 제조 전략은 Chinghai Kao 박사가 개발한 시스템을 바탕으로 하였다 (Li X, Zhang YP et al . Cancer Res 2005;65: 1941-51.34). 시스템은 아데노바이러스 좌측 ITR (inverted terminal repeats), 패키징 신호 (1-358 bp) 및 아데노바이러스 유전체 벡터인 pAd288E1bPSESE1a를 포함하는 클로닝 벡터인 pAd1020SfidA를 포함하고 있다. 상기 pAd288E1bPSESE1a의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 mRFP로 대체해서, 3,504 bp로부터 E3 부위를 지닌 말미까지의 아데노바이러스 유전체 우측 암 (arm)을 포함하는 pAd288E4(mRFP)E1b. E4PSESE1a를 제조하였다. CMV.EGFP 발현 카세트를 pAd1020SfidA로 클로닝하여 pAd1020SfidA.CMV.EGFP를 제조한 후, 제한효소 SfiI로 절단하여 아데노바이러스 좌측 ITR, 패키징 신호 (1-358 bp) 및 카나마이신 내성 유전자 (Kanr)를 포함하는 CMV.EGFP를 유리 (release)하였다. 그 다음 Kanr.ITR.EGFP.CMV 절편을 SfiI로 절단한 pAd288E4(mRFP)E1b에 클로닝하였다. 라이게이션된 DNA는 대장균으로 형질전환시킨 후, 암피실린 및 카나마이신을 포함하는 아가(agar) 플레이트에 도말하였다. 코스미드 DNA (cosmid DNA)를 정제한 후, PacI으로 절단하여 아데노바이러스 유전체를 유리하였고, 리포펙타민 2000 트랜스펙션 시약 (Invitrogen, Carlsbad)을 사용하여 HER911E4로 트랜스펙션하여 재조합 아데노바이러스인 Ad5E4(mRFP)를 제조하였다. Ad5E4(mRFP)는 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 종래에 보고된 (Lee SJ, et al., Mol Ther 2004;10: 1051-8) CRAd 백본을 바탕으로, E4 orf 1 내지 4 영역을 mRFP로 대체하며, 강력한 스플라이싱 컨센서스 염기 배열(consensus sequence)을 MCS (multi-cloning-sequence)를 지닌 mRFP 유전자 옆에 삽입하였다. 이러한 재조합 CRAd인 Ad5E4(mRFP)는 전립선 특이 인핸서 인자인 PSES에 의해 E4 및 E1a 유전자를 조절하여 전립선암에서 특이적으로 복제되도록 디자인되었다. Ad5E4(mRFP)는 아데노바이러스 복제 모니터링을 도와주는 아데노바이러스 유전체 좌측 암(arm)의 GFP 유전자를 또한 포함하고 있다. Ad5E4(Endo/angio) (도 2e) 제조를 위해서, pAd288E1bPSESE1a의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 엔도스타틴-안지오스타틴 (endostatin-angiostatin)으로 대체해서, 3,504 bp로 부터 E3 부위를 지닌 말미까지의 아데노바이러스 유전체 우측 암 (arm)을 포함하는 pAd288E4(Endo/angio)E1b-E4PSESE1a를 제조하였다. Ad5E4(Endo/angio)를 만드는 나머지 절차는 상기의 Ad5E4(mRFP) 제조 방법과 동일하게 수행하였다. 바이러스 유전체 내의 CMV.EGFP 발현 카세트는 바이러스 감염의 마커인 EGFP (enhanced green fluorescent protein)로 인해, 시험관 내에서의 바이러스 증식 및 생체 내 (in vivo )에서 바이러스 분포를 모니터할 수 있게 하였다. 증폭된 아데노바이러스를 CsCl 구배 원심분리로 정제하였다. 농도 구배로 정제된 모든 바이러스 스톡(stock)을 4℃에서 24 시간 동안 완충용액을 3번 갈아주면서 투석 완충 용액으로 투석을 수행하였다. 상기 투석 완충용액 1,000 ㎖은 2차 증류수 789 ㎖, 1 mol/L의 MgCl2 1 ㎖, 1 mol/L의 Tris-HCl (pH 7.5) 10 ㎖ 및 50% 글리세롤 200 ㎖을 포함하고 있다. 정제 및 투석된 바이러스 분획 (aliquot)을 -70℃에서 보관하였다. 복제-결손 재조합 아데노바이러스인 Ad5CMV.GFP는 HEK293 세포에서 증폭하였다.
<1-3> 이종 이식 종양 동물 모델의 준비
모든 동물 실험은 한국 국립 암센터 실험 동물 보호 및 사용 지침에 따라 무병원균 시설 및 조건하에서 실시하였다. 한국의 중앙 동물에서 6주 내지 9주령의 수컷 무균 누드 마우스를 구입하였다. CWR22rv 이종 이식 확립을 위해, 106 개의 CWR22rv 세포를 마우스의 양 옆구리에 피하지방 주사하였다. 종양 크기가 직경 4 내지 6 mm에 도달하였을 때 (일반적으로 세포를 주사한 후 2 내지 3주 후 이루어짐), 5 x108 pfu의 아데노바이러스 입자들을 각 종양 부위에 주사하였다. 상기 종양 크기를 일주일에 2 번씩 모니터하였고, 종양의 부피를 식(길이 x 두께2 x 0.5236)를 사용하여 계산하였다. 종양을 해당 시간에 수득하여 면역조직화학 및 다른 분석에 사용하였다.
실시예 2: 바이러스 복제 능력 분석
<2-1> 바이러스 복제 능력 분석 방법
Ad5E4(mRFP), Ad5-wt 또는 Ad5CMV.GFP로 감염시키기 하루 전에 CWR22rv 및 LNCaP 세포들을 6-웰 플레이트에 에 웰 당 1 x 106 세포수 밀도로 시딩 (seeding) 하였다. 배지를 24 시간 후에 갈아 주었고, Ad5E4(mRFP)가 암세포에서 복제할 수 있는지 판별하기 위해서 7일간 형광 현미경으로 세포를 관찰하였다. 바이러스 복제를 정량화하여 감염 3일 후 배지로부터 수거한 상등액에서 바이러스 역가 (titer)를 결정하였다. 7일간 형광 현미경하에서 세포를 관찰하였다. 상등액에 존재하는 바이러스의 역가는 종래에 기술된 방법으로 분석하였다 (Li X, Zhang YP et al . Cancer Res 2005;65: 1941-51.34). 웰 당 1 내지 10-11 ㎕ 범위로 희석한 상등액의 희석물로 감염시키기 하루 전, HER911E4 세포들을 웰 당 5 x 103 세포수 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 5일째에 8개 웰의 한 열(row)을 현미경으로 조사하였다. 생성된 바이러스 양은 LD50 값으로 나타냈으며, LD50 값은 7일째 96-웰 플레이트의 한 열 중 4개 이상의 웰에서 세포 변성 효과 (cytopathic effect)를 유발하는 희석배율 (dilution factor)로 정의된다.
<2-2> E4orf 부위 결손 변이체의 복제 능력 분석
E4 부위의 orf들이 암세포에서 아데노바이러스 복제에 필수적인지를 확인하기 위해, E4 결손 변이체인 ΔE4orf1-4 및 ΔE4orf1-3의 복제능력을 테스트하였다. 2 종류의 정상세포인 케라티노사이트 및 전립선 세포, 그리고 2 종류의 전립선암 세포인 CWR22rv 및 LNCaP 세포 각각을 변이체 아데노바이러스인 Ad5CMV.GFP 또는 아데노바이러스 혈청형 5 야생형 바이러스인 Ad5-wt로 감염시키는 실험을 수행하였다. 감염 3일 후, 배양 배지에서 수득한 아데노바이러스를 사용하여 상기 <2-1>에서 기술한 복제 능력 분석 방법과 동일하게 복제 능력 분석을 수행하였다. 제작된 아데노바이러스는 전립선암 및 전립선암-유래 암세포에서 독점적으로 복제할 수 있게 디자인되었으므로, 상기 2개의 전립선암 세포를 포함하여 복제 능력 분석 실험을 수행하였다.
그 결과,ΔE4orf1-3 및 ΔE4orf1-4 둘 모두 테스트한 모든 세포주에서 야생형 아데노바이러스와 비교해 볼 때, 약 5배 내지 10배 적게 복제되었다 (도 1). 이러한 결과는 E4orf 1에서 E4orf 4 영역 결손이 암 세포에서 아데노바이러스 복제 능력을 무력화시키지 않는다는 것을 암시하는 결과이다. 더욱이, 이러한 결과는 E4 orf 1, 2, 3 및 4 부위가 바이러스 복제에 필수적이지 않으며, 외래 유전자의 잠재적 삽입 위치가 될 수 있음을 암시하는 결과이다. 또한, E4orf는 정상세포에서 세포독성 효과를 나타내며 기본적인 최소발현도 정상세포에 손상을 줄 수 있다고 알려져 있기 때문에 (Ji L, Bouvet M, et al., Gene Ther 1999;6: 393-402), E4orf 1에서 E4orf 4 영역의 결손은 아데노바이러스-매개 유전자 치료법에 있어서 정상세포에 대한 부작용을 완화시켜줄 수 있는 방안이 될 수 있다.
<2-3> Ad5E4(mRFP)의 복제 능력 분석
Ad5E4(mRFP)가 복제 능력을 보유하고 있는지를 확인하기 위해서, 2개의 형광 단백질을 모니터링하여 복제능력을 평가하였다. 우선 먼저, 첫째 날부터 3일째에 간신히 형광을 보일 정도인 작은 양의 Ad5E4(mRFP)로 감염시킨 세포들을 4개의 다른 시간 간격을 두고 형광 현미경하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 0.1 moi의 Ad5E4(mRFP) 아데노바이러스 감염 6일 후, LNCaP 세포에서 그린 형광이 크게 강화되었고, CWR22rv 세포에서는 시간에 의존하여 약하게 형광이 강화되었다. 형광 증가와 동시에, Ad5E4(mRFP)는 2 종류의 세포에 대해서 매우 강한 세포 변성 효과를 유도하였고, CWR22rv 세포에 대한 세포 변성 효과가 더 컸다. 그러나 0.1 moi의 복제-불가능 아데노바이러스인 Ad5CMVGFP로 감염하면 6일 후에도 그린 형광의 증가를 나타내지 않았으며 2 종류의 세포에 대해서도 세포 독성 효과를 나타내지 않았다. 바이러스 복제 능력을 상기 <2-1>의 방법에 의해 정량화하였으며, 야생형 아데노바이러스에 의해 표준화 (normalization) 하였다. 전립선암 세포인 LNCaP 및 CWR22rv에서의 복제능력은 HeLa 세포보다 104 배 이상 높았다 (도 3b). 도 3a의 데이터와 일치하게, Ad5E4(mRFP)의 복제능력은 LNCaP 세포에서 10배 더 높았다.
실시예 3: mRFP 로 치환된 E4orf 1에서 E4orf 4 영역을 지닌 CRAd 제조 및 분 석
<3-1> Ad5E4(mRFP) 아데노바이러스의 mRFP 및 GFP 발현 분석
아데노바이러스 제조를 테스트하기 위해서, 본 발명자들은 Ad5E4(mRFP)가 PSES-특이적 전립선암 세포인 LNCaP 및 CWR22rv에서 mRFP 및 GFP를 발현하는지 여부를 조사하였다. LNCaP 및 CWR22rv 세포들을 Ad5E4(mRFP)로 감염시키고 이틀 후에 GFP/mRFP 발현을 분석하였다. Ad5E4(mRFP)가 표적인 전립선암 세포에서 유전자 발현을 매개하는 것을 증명하기 위해 HeLa 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 재조합 아데노바이러스는 이틀째에 최대의 형광 신호를 나타내었고, 2 종류의 세포에서 빨강 및 녹색 형광 단백질을 발현하였다. 그러나, 전립선-특이적 PSES의 전사 증대 활성 때문에 자궁 경부암인 HeLa에서 상기 바이러스는 mRFP 발현을 매개하지 않았다. PSES 프로모터에 의해 조절되는 mRFP 유전자와 달리, GFP 유전자는 통상적인 CMV 프로모터-조절 EGFP 유전자 발현에서 예상되듯이 HeLa에서 잘 발현되었다 (도 2c).
<3-2> E4 mRNA에 대한 RT-PCR 분석
E4 부위의 E4orf 1에서 E4orf 4 영역이외의 스플라이싱 산물이 Ad5E4(mRFP) 감염 후에 생성되는지를 분석하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. Ad5E4(mRFP) 0.1 moi로 감염된 세포로부터 전체 RNA를 얻었고, RT-PCR을 사용하여 E4orf6/7, E4orf6 및 mRFP에 해당하는 3개의 mRNA 산물을 평가하였다. 구체적으로 CWR22rv 및 LNCaP 세포를 P100 배양기에 배양기 당 5 x 106 세포수의 밀도로 시딩하였고, 시딩 하루 후 Ad5E4(mRFP)로 감염시켰다. 그 후 세포를 냉각 PBS로 한번 세척하였고 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 세포를 용해하였고, 세포 용해물을 수득하여 클로로폼 200 ㎖으로 추출하였다. 전체 RNA를 포함한 수용액 상을 이소프로판올로 침전시켰으며 이후의 RT-PCR 분석을 위해 DEPC (diethyl pyrocarbonate)를 처리한 증류수 50 ㎕에 녹였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 분석하였다.
PCR 산물의 분석에 사용한 프라이머들은 다음과 같다:
E4 34 kDa에 대한 프라이머:
5'-gcc gtc tcg agt ggt gtt ttt-3' (서열번호 1) 및
5'-aga tca ccg tac ctt aat caa ac-3' (서열번호 2),
E4orf6/7에 대한 프라이머:
5'-aga agt cca cgc gtt gtg cat tgt-3'(서열번호 3) 및
5'-cct aaa cca gct ggc caa aac-3' (서열번호 4),
mRFP에 대한 프라이머:
5'-gct aag ctt atg gcc tcc tcc gag gac-3' (서열번호 5) 및
5'-cta gaa tcc aac ggg ccc tct aga gtt-3' (서열번호 6).
PCR 조건은 94℃에서 2분으로 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분으로 30 사이클, 및 68℃에서 15분으로 1 사이클을 수행하고, 4℃에서 2시간 반응시켰다.
그 결과, 주형으로 Ad5E4(mRNA) DNA (2, 4, 6 레인, 도 2d)를 사용하여 얻은 PCR 산물과 비교해 볼 때, Ad5E4(mRFP)로 감염시킨 세포의 전체 RNA로부터 생성된 cDNA를 사용한 PCR 산물은 Ad5E4(mRFP) 유전체로부터 전사된 전체 RNA가 E4orf6/7 및 E4orf6를 코딩하는 스플라이싱된 mRNA를 포함하고 있음을 나타냈다 (3, 5 레인, 도 2d). E4orf6/7 및 E4orf6와는 달리, mRFP 유전자 발현을 위한 mRNA로부터 얻은 PCR 산물은 DNA를 주형으로 사용한 PCR 산물과 동일하였다. 이는 mRFP 코딩 부위가 Ad5E4(mRFP) 유전체로부터 전사된 프라이머리 E4 RNA의 앞 부분에 위치하기 때문이다 (6, 7 레인, 도 2d). PCR 산물을 클로닝하였고, 이들의 서열이 E4orf6 및 E4orf6/7를 코딩하는 스플라이싱 변이체인지 여부를 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 다른 E4 orf들이 mRFP 유전자를 따라 적절하게 스플라이싱되어, 결국 유전자 산물로 전사되고, 이후 바이러스 패키징을 도와줘서, Ad5E4(mRFP)가 바이러스 용균성 생활환을 완료할 수 있게 해주는 것을 증명한다.
실시예 4: 세포 살해능 분석 ( cell killing assay )
LNCaP 또는 CWR22rv 세포를 다양한 양의 Ad5E4(mRFP)로 감염시킨 후 유도된 세포 변성 효과를 관찰하는 실험을 수행하였다. 0 내지 20 moi (multiplicity of infection) 범위의 Ad5E4(mRFP) 및 Ad-wt로 감염시키기 하루 전에, CWR22rv 및 LNCaP 세포들을 96-웰 플레이트에 웰 당 5 x 103 세포수 밀도로 시딩하였다. 배양 3일 후, 제조사 (Dojindo, Rockville, MD)의 지시에 따라, MTT 세포독성 검사를 통하여 세포의 생존능력을 관찰하였다. 비처리된 세포의 생존율을 100%라 가정하고 그래프를 작성하였다.
그 결과, Ad5E4(mRFP)는 감염 3일 후에 2 moi 보다 적은 양으로 LNCaP 및 CWR22rv 세포를 죽였다 (도 4a 및 4b). 이러한 재조합 아데노바이러스의 살해 능력은 야생형 아데노바이러스의 능력과 거의 비교할만하였다. 이와 대조적으로, Ad5CMV.GFP는 높은 양을 감염시켜도 LNCaP 및 CWR22rv 세포에 손상을 주지 않았다. 이러한 결과는 감염 동안 복제의 생활 주기는 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 종양 세포 사멸 촉진에 이용할 수 있음을 가리킨다.
실시예 5: E4orf 1에서 E4orf 4 영역에 이식 유전자를 지닌 CRAd 의 생체 내 항-종양 활성 분석
<5-1> 종양 성장 분석
상기 실시예 <1-3>의 CWR22rv 이종이식 종양 모델에서 Ad5E4(mRFP)의 항종양 효능성을 평가하였다. 누드마우스의 옆구리 뒤쪽에 종양이 감지되었을 때, 1 x 108 pfu의 Ad5E4(mRFP) 또는 Ad5CMV.GFP를 종양 내로 주사 (intra-tumoral injection) 하였다. 종양의 크기 분석은 상기 실시예 <1-3>에서 기술한 방법과 동일하다.
그 결과, Ad5E4(mRFP)는 종양 성장에 영향을 미치지 않는 대조군 아데노바이러스인 Ad5CMV.GFP와 비교하여 현저하게 종양 성장을 억제하였다 (도 5a).
<5-2> 조직학적 분석
상기 실시예 <1-3>에서 수득한 종양을 1시간 동안 4% 파라포름알데하이드에서 고정하였고, 30% 수크로스에서 하룻밤 동안 저온 보존한 후 조직 OCT 용액에 담구어 -20℃에서 보관하였다. 10 ㎛ 동결 절편을 젤라틴으로 코팅된 슬라이드 위에 마운트하였다. GFP/RFP 광학을 갖춘 니콘 형광 현미경으로 종양 내 형광 단백질들(GFP 및 RFP)을 직접 관찰하였다. H&E (hematoxylin and eosin) 염색을 위해 동결 절편을 1분 동안 헤마톡실린으로 염색한 후 에오신으로 30 초간 염색하였다. 수돗물로 충분히 세척한 후, 슬라이드를 알코올 탈수, 자일렌으로 제거 작업, 그리고 현미경 관찰을 위해 폴리마운트 배지로 마운팅하였다. 종양 내의 카스파제-3 (caspase)-3 양을 측정하기 위해 상기에서 기술한 바와 같이 젤라틴으로 코팅된 슬라이드 위에 마운트된 동결 절편을 토끼 항-카스파제-3 항체와 반응시켰다 (Abcam, Cambridge, UK). 비오틴 (biotin)이 부착된 2차 항체를 Vectastain avidin-biotin complex kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 같이 사용하였다. 3,3'-다이아미노벤지딘 크로모젠 (Dako, Carpinteria, CA)을 사용하여 마지막 반응을 시각화하였다. 슬라이드는 헤마톡실린으로 대비 염색 (counterstain)하였다.
그 결과, Ad5E4(mRFP)-처리 마우스들로부터 수득된 종양은, Ad5CMV.GFP-처리 그룹의 종양과는 대조적으로, 그린 및 레드 형광에 대해 양성 신호를 보여주었다. 각 그룹의 종양에 대한 H&E 조직학적 분석은 Ad5E4(mRFP) 그룹의 종양만이 광범위하게 섬(island) 모양의 괴사(necrotic) 부위를 보여주었으며 (도 5c), 이러한 결과는 괴사 절편이 제한된 바이러스 감염 및 종양 내의 증식에 의한 손상되지 않은 건강한 종양 세포에 의해 둘러싸여 있다는 것을 의미한다. 또한, Ad5E4(mRFP)로 처리된 종양은 항-카스파제-3 항체에 강하게 염색되었다 (도 5c).
<5-3> Ad5E4(Endo/angio) 아데노바이러스의 항-종양 활성 분석
Ad5E4(mRFP)의 효능을 강화시키기 위해 E4or1-4에 다른 치료용 유전자가 삽입될 수 있음을 증명하기 위해 제작한 엔도스타틴 및 안지오스타틴 융합 단백질을 아데노바이러스 E4orf 1에서 E4orf 4 영역의 유전자위치에 삽입하여 Ad5E4(Endo/angio)를 사용하여 항-종양 활성을 분석하였다.
상기 실시예 <1-3>의 흉선이 없는 수컷 누드 마우스의 옆구리에 CWR22rv 이종이식을 확립한 후, Ad5E4(mRFP), Ad5E4(Endo/angio), 음성 대조군으로 Ad5CMV.GFP를 주사하여 종양 크기를 도식화하였다.
그 결과, Ad5E4(Endo/angio)는 Ad5E4(mRFP)보다 효과적으로 CWR22rv 이종이식 성장을 억제하였다 (도 6). 또한, Ad5E4(Endo/angio) 및 Ad5E4(mRFP)를 주사한 종양으로부터 얻은 조직 절편을 H&E 염색한 후 광학 현미경으로 관찰한 결과 현저한 치료 효과 및 상당 양의 섬유증(fibrosis)을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 본 발명에서 제조한 조건부 복제-가능 아데노바이러스는 외래 유전자의 삽입 및 치료용 유전자의 전달체로서 효율적으로 이용될 수 있음을 나타내는 결과이다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Novel conditionally-replication-competent-adenovirus and method of producing the same <130> PA090518/KR-DIV-1 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E4 34Kda <400> 1 gccgtctcga gtggtgtttt t 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E4 34kDa <400> 2 agatcaccgt accttaatca aac 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E4orf6/7 <400> 3 agaagtccac gcgttgtgca ttgt 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E4orf6/7 <400> 4 cctaaaccag ctggccaaaa c 21 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mRFP <400> 5 gctaagctta tggcctcctc cgaggac 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mRFP <400> 6 ctagaatcca acgggccctc tagagtt 27

Claims (10)

  1. 아데노바이러스가 표적 세포에서 복제가능하도록 E4/E1a 프로모터가 표적-특이적 프로모터로 대체되고, 아데노바이러스 E1 유전자를 가지며, 아데노바이러스 E4 유전자 중 E4orf 1에서 E4orf 4 영역이 결손되고 상기 결손된 부위에 치료용 유전자가 삽입된 것이 특징인, 암 질환의 예방 또는 치료용 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적-특이적 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것인 아데노바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치료용 유전자는 프로드럭 (prodrug) 유전자, 사이토카인 유전자, 세포자살 유도 유전자, 종양 억제 유전자, 메탈로프로테이나제 (metalloproteinase) 억제제 유전자, 혈관 신생 억제제 유전자 및 티로신 키나제 (tyrosine kinase) 억제제 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자인 재조합 아데노바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 추가로 포함하는, 아데노바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광 단백질 (modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광 단백질 (mRFP), 증강된 적색 형광 단백질 (ERFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 증강된 청색 형광 단백질 (EBFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP), 남색 형광 단백질 (CFP) 및 증강된 남색 형광 단백질 (ECFP)로 이루어지는 군에서 선택된 것인 아데노바이러스.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표적-특이적 프로모터는 PSES (Prostate-specific enhancer element)를 포함하고, 상기 E4orf 1에서 E4orf 4 영역이 결손된 부위에 치료용 유전자로 엔도스타틴 및 안지오스타틴 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 상기 표적-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 삽입되고, 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 CMV 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 GFP (green fluorescent protein)를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 아데노바이러스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 아데노바이러스가 도입된 숙주 세포.
  8. (a) E4/E1a 프로모터를 표적-특이적 프로모터로 치환하는 단계;
    (b) E4orf1에서 E4orf 4 영역을 결손시키는 단계; 및
    (c) 상기 결손시킨 부위에 치료용 유전자를 삽입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스를 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 폐암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 결장암,유방암, 자궁경부암, 식도암, 갑상선암, 연조직 육종, 전립선암, 백혈병, 림프종, 방광암 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
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