KR20230170686A - 부정맥유발 우심실 심근병증에 대한 유전자 치료법 - Google Patents

부정맥유발 우심실 심근병증에 대한 유전자 치료법 Download PDF

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파라 셰이크
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

심부정맥을 예방하고 치료하기 위한 조성물 및 방법. 플라코필린-2(PKP2) 유전자를 포함하는 조성물의 예방 또는 치료 유효량을 이를 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)을 예방 또는 치료하는 방법. 조성물은 PKP-2 유전자를 전달하기 위한 아데노바이러스 연관 벡터(AAV)를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 본 발명은 AAV가 심근친화성 AAV 혈청형이고 심장-특이적 프로모터를 함유한다는 것을 제공한다. 플라코필린-2(PKP2) 유전자를 포함하는 조성물의 예방 또는 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비정상적인 심장 세포-세포 접합 복합체를 특징으로 하는 심혈관 질환을 치료하는 방법.

Description

부정맥유발 우심실 심근병증에 대한 유전자 치료법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 4월 12일에 출원된 미국 가출원 제63/173,527호에 대한 우선권 및 이익을 주장한다. 본 출원의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록의 참고 포함
2022년 4월 12일에 생성되고 크기가 89KB인 "24978-0711_SeqList_ST25"라는 이름의 텍스트 파일의 내용은 본 명세서에 그 전체가 참조에 의해 원용된다.
정부 후원
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인 번호 HL142251 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
서열 목록의 참고 포함
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기술 분야
본 발명은 부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)에 대한 유전자 치료법에 관한 것이다.
현재까지 부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)에 대한 효과적인 치료 또는 치유법은 없으며, 뿐만 아니라 ARVC에 특이적인 요법 또는 약제를 선별하는 치료 양식에 대한 무작위 임상 시험도 없다(1). 현재의 접근법은 증상 완화를 목표로 하며 생활방식 변화(심장 돌연사를 촉발할 수 있는 경쟁적인 스포츠 피하기) 및 약리학적 개입(항부정맥제, 베타 차단제)에 중점을 두고 있다(2,3). 이러한 접근법은 이식형 심장율동전환기-제세동기(ICD), 심장 카테터 절제, 또는 환자가 약물치료에 반응이 없거나 내약성이 되는 경우 심장 이식을 포함하는 보다 침습적인 조치로 전환될 수 있다(2,3). ICD는 디바이스/리드(lead) 관련 합병증이 빈번하고, 카테터 절제술은 새로운 부정맥유발 병소의 생성으로 인해 재발할 수 있으며, 심장 이식은 시술 후 10년째 사망률이 23%이다(3). 이러한 인자들은 질환 진행을 예방하거나 중단하기 위한 수단으로서 ARVC의 분자 촉발인자(세포-세포 접합 파괴)를 표적으로 할 수 있는 새로운 예방 및 치료 전략을 식별하는 데 중대한 필요성을 부각시킨다.
본 개시내용은, 5'에서 3' 방향으로, a) 제1 AAV ITR 서열; b) 프로모터 서열; c) 전이유전자 핵산 분자로서, 플라코필린(plakophilin)-2(PKP2) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이유전자 핵산 분자; d) 전사후 조절 요소; e) 폴리A 서열; 및 f) 제2 AAV ITR 서열을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 9, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 29, 또는 서열번호 30에 제시된 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 14에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 25에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 25에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 프로모터 서열은 심장-특이적 프로모터 서열이다.
일부 양상에서, 프로모터 서열은 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, CAG 프로모터, 혼성체 닭 β-액틴 프로모터, MeCP2 프로모터, EF1 프로모터, 편재성 닭 β-액틴 혼성체(CBh) 프로모터, U1a 프로모터, U1b 프로모터, MeCP2 프로모터, MeP418 프로모터, MeP426 프로모터, 최소 MeCP2 프로모터, VMD2 프로모터, mRho 프로모터, EFla 프로모터, Ubc 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, TRE 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린(Polyhedrin) 프로모터, CaMKIIa 프로모터, Gal1 프로모터, TEF1 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, Ubi 프로모터 또는 α-1-항트립신(hAAT) 프로모터를 포함한다. 일부 양상에서, 프로모터 서열은 심장 트로포닌 T(cTnT) 프로모터 서열을 포함한다. 일부 양상에서, cTnT 프로모터 서열은 서열번호 2에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 폴리A 서열은 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열은 서열번호 6에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 전사후 조절 요소는 oPRE 전사후 조절 요소이다. 일부 양상에서, oPRE 전사후 조절 요소는 서열번호 5, 서열번호 27, 또는 서열번호 28에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용은, 5'에서 3' 방향으로, a) 서열번호 7에 제시된 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV ITR 서열; b) 서열번호 2에 제시된 핵산 서열을 포함하는 프로모터 서열; c) 전이유전자 핵산 분자가 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호 4에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 전이유전자 핵산 분자; d) 서열번호 5에 제시된 핵산 서열을 포함하는 전사후 조절 요소; e) 서열번호 6에 제시된 핵산 서열을 포함하는 폴리A 서열; 및 f) 서열번호 8에 제시된 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV ITR 서열을 포함하는, 전술한 청구항 중 어느 하나의 rAAV 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 (i) AAV 캡시드 단백질; 및 (ii) 전술한 청구항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 바이러스 벡터를 제공한다.
일부 양상에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1 캡시드 단백질, AAV2 캡시드 단백질, AAV4 캡시드 단백질, AAV5 캡시드 단백질, AAV6 캡시드 단백질, AAV7 캡시드 단백질, AAV8 캡시드 단백질, AAV9 캡시드 단백질, AAV10 캡시드 단백질, AAV11 캡시드 단백질, AAV12 캡시드 단백질, AAV13 캡시드 단백질, AAVPHP.B 캡시드 단백질, AAVrh74 캡시드 단백질 또는 AAVrh10 캡시드 단백질이다. 일부 양상에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 또는 AAVrh10 캡시드 단백질이다.
본 개시내용은 a) 본 개시내용의 임의의 실시형태의 rAAV 바이러스 벡터; 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 PKP2 유전자를 수반하는 질환 및/또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시내용의 임의의 실시형태의 rAAV 바이러스 벡터 또는 본 개시내용의 임의의 실시형태의 약제학적 조성물의 적어도 하나의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, PKP2 유전자를 수반하는 질환 및/또는 장애는 비정상적인 심장 세포-세포 접합 복합체를 특징으로 하는 심혈관 질환이다.
일부 양상에서, PKP2 유전자를 수반하는 질환 및/또는 장애는 부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)이다.
일부 양상에서, 유효량은 대상체의 전기적 및 구조적 심장 완전성(integrity)을 개선한다. 일부 양상에서, 유효량은 대상체에서 세포-세포 접합 단백질을 구제하고 재조립한다. 일부 양상에서, 유효량은 대상체의 심장 기능을 개선한다. 일부 양상에서, 유효량은 대상체의 ARVC를 방지하기 위해 전기적 및 구조적 완전성을 보존한다.
일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 2.5×1014 vg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 5.0×1013 vg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다.
일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 척추강내, 뇌내, 심실내, 비강내, 기관내, 귀내, 안구내, 또는 안구주위, 경구, 직장, 경점막, 흡입, 경피, 비경구, 피하, 피내, 근육내, 수조내, 신경내, 흉막내, 국소, 림프내, 수조내 또는 신경내로 대상체에게 투여된다.
일부 양상에서, 치료가 필요한 대상체에서 PKP2 유전자를 수반하는 질환 및/또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 본 개시내용의 실시형태 중 어느 하나의 rAAV 바이러스 벡터 또는 본 개시내용의 임의의 실시양태의 약제학적 조성물.
일부 양상에서, PKP2 유전자를 수반하는 질환 및/또는 장애는 ARVC이다.
일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 2.5×1014 vg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 5.0×1013 vg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 척수강내, 뇌내, 심실내, 비강내, 기관내, 귀내, 안구내, 또는 안구주위, 경구, 직장, 경점막, 흡입, 경피, 비경구, 피하, 피내, 근육내, 수조내, 신경내, 흉막내, 국소, 림프내, 수조내 또는 신경내로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위한 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 아데노(-연관) 바이러스 기술이 PKP2 단백질을 안정적으로 발현할 수 있음을 보여준다. 도 1a는 표시된 감염 다중도(MOI)에서 신생아 심근세포의 아데노바이러스 형질도입 후 돌연변이(MUT) 및 야생형(WT) PKP2 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. FLAG 항체는 PKP2를 인식하고 GAPDH는 로딩 대조군의 역할을 한다. 도 1b는 야생형(WT) 마우스에서 출생 후 2일차(P2)에 AAV9 PKP2의 초기 복강내 주사 및 4주 후 심장 분석에 대한 도식을 보여준다. 도 1c는 출생 후 2일차(P2)에 AAV9 PKP2 주사 후 PKP2 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. PKP2 항체는 내인성 및 형질도입된 PKP2를 인식하고, FLAG 항체는 형질도입된 PKP2만 인식하며, GAPDH는 로딩 대조군의 역할을 한다.
도 2는 시험관내에서 PKP2 단백질 용량의 상승이 심장 세포-세포 접합을 재조립한다는 것을 보여준다. 야생형(WT) 또는 돌연변이(MUT) PKP2 아데노바이러스를 사용한 PKP2 동형접합성 돌연변이 신생아 심근세포(Hom CM)의 형질도입 후, 데스모솜(PKP2, DSP, DSG2, JUP), 접착역(fascia-adheren)(N-Cad), 및 갭 접합(CX43) 단백질의 웨스턴 블롯 분석. GAPDH는 로딩 대조군의 역할을 한다.
도 3a 내지 도 3c는 초기 AAV9 PKP2 투여가 심장 세포-세포 접합을 복원하고 심장 형태를 개선한다는 것을 보여준다. 도 3a는 PKP2 동형접합성 돌연변이(PKP2 Hom) 마우스에서 출생 후 2일차(P2)에 AAV9 PKP2의 초기 복강내 주사 및 4주 후 심장 분석에 대한 도식을 보여준다. 도 3b는 데스모솜 단백질(PKP2, DSP, DSG2, JUP), 접착역 단백질(N-CAD), 및 갭 접합 단백질(CX43)에 대한, 대조군(Ctrl), AAV9-PKP2로 처리된 PKP2 Hom 심장, 및 바이러스 처리되지 않은 PKP2 Hom 심장의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. GAPDH는 로딩 대조군의 역할을 한다. 도 3c는 대조군(Ctrl), 미처리 PKP2 동형접합성 돌연변이체(Hom) 심장, 및 AAV9-PKP2로 처리된 PKP2 Hom 심장의 체중(BW)에 대한 심장 중량(HW)의 비 분석을 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=5 Ctrl, n=5 Hom, n=3 Hom-AAV9 PKP2. Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 ANOVA. **, p<0.01.
도 4a 내지 도 4e는 초기 AAV9 PKP2 투여가 심장의 기계적 및 전기적 기능 장애를 방지한다는 것을 보여준다. 도 4a는 대조군(Ctrl), AAV9 GFP로 처리된 PKP2 동형접합성 돌연변이체(Hom), 및 AAV9 PKP2 심장으로 처리된 PKP2 Hom의 대표적인 단축 심장 자기 공명 영상을 보여준다. 도 4b는 심박수, 뿐만 아니라 좌심실(LV) 및 우심실(RV)의 박출률(EF), 확장기말 부피(EDV) 및 수축기말 부피(ESV)의 정량화를 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=5 Ctrl, n=5 Hom-AAV9 GFP, n=6 Hom-AAV9 PKP2. Tukey 사후 테스트를 사용한 이원 ANOVA. ****, p<0.0001. **, p<0.01. *, p<0.05. 도 4c는 대조군(Ctrl), AAV9 GFP로 처리된 PKP2 동형접합성 돌연변이체(Hom), 및 AAV9 PKP2 심장으로 처리된 PKP2 Hom의 대표적인 복합 표면 심전도를 보여준다. 스케일 바 = 20ms. 도 4d는 심박수, PR 간격 및 QRS 간격의 정량화를 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=5 Ctrl, n=5 Hom-AAV9 GFP, n=4 Hom-AAV9 PKP2. Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 ANOVA. *, p<0.05. 도 4e는 시간에 따른 전기 활동을 묘사하는 대표적인 표면 심전도를 보여준다. 조기 심실 수축(PVC)은 화살표로 표시된다. 각 조건에 대해 PVC가 있는 마우스의 백분율 정량화.
도 5a 내지 도 5c는 초기 AAV9 PKP2 투여가 심장 형태를 보존하고 병원성 조직 재형성을 방지한다는 것을 보여준다. 도 5a는 대조군(Ctrl), AAV9 GFP로 처리된 PKP2 동형접합성 돌연변이체(Hom), 및 AAV9 PKP2 심장으로 처리된 PKP2 Hom으로부터의 대표적인 심장 조직학적 절편을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 보여준다. 스케일 바 = 1mm. 도 5b는 Ctrl, 좌심실(LV) 및 우심실(RV) 내 Hom-AAV9 GFP 및 Hom-AAV9 PKP2의 섬유증에 대한 대표적인 심장 조직학적 절편을 Masson 3색 염색으로 보여준다. 스케일 바 =100μM. 도 5c는 Ctrl, Hom-AAV9 GFP 및 Hom-AAV9 PKP2 심장 유래의 RNA를 사용한 전섬유화 유전자 콜라겐 I형 알파 1(Col1a1)의 역전사 정량적 PCR 분석을 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=4 Ctrl, n=4 Hom-AAV9 GFP, n=6 Hom-AAV9 PKP2. Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 ANOVA. *, p<0.05.
도 6a 내지 도 6g는 초기 AAV9 PKP2 투여가 생존율을 개선시키고 지속적인 심장 보호를 제공한다는 것을 보여준다. 도 6a는 Ctrl, PKP2 동형접합성 돌연변이체(Hom) 및 PKP2 Hom-AAV9 PKP2 마우스의 생존 분석을 보여준다. 도 6b는 6개월령의 Ctrl 및 PKP2 Hom-AAV9 PKP2 심장의 대표적인 단축 심장 자기 공명 영상을 보여준다. 도 6c는 6개월령에 좌심실(LV) 및 우심실(RV)의 박출률(EF) 정량화를 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=2 Ctrl, n=4 Hom-AAV9 PKP2. Tukey 사후 테스트를 사용한 이원 ANOVA. 도 6d는 6개월차에 Ctrl 및 PKP2 Hom-AAV9 PKP2 심장의 대표적인 복합 표면 심전도를 보여준다. 스케일 바 = 10ms. 도 6e는 심박수, PR 간격, QRS 간격의 정량화를 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=2 Ctrl, n=4 Hom-AAV9 PKP2. 독립표본 t-테스트. 도 6f는 데스모솜 단백질(PKP2, DSP, DSG2, JUP), 접착역 단백질(N-CAD), 및 갭 접합 단백질(CX43)에 대한 Ctrl 및 PKP2 Hom-AAV9 PKP2 심장의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. GAPDH는 로딩 대조군의 역할을 한다. 도 6g는 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 간 효소 수준에 대한 혈액 혈청 분석을 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=5 Ctrl, n=6 Hom-AAV9 PKP2. 독립표본 t-테스트.
도 7a 내지 도 7d는 후기 AAV9 PKP2 투여가 세포-세포 접합 단백질 수준 및 기계적 기능을 개선한다는 것을 보여준다. 도 7a는 PKP2 동형접합성 돌연변이체(PKP2 Hom) 마우스에서 4주차(질환 특징이 존재함)에 AAV9 PKP2의 안와후 주사 및 2주 후 심장 분석에 대한 도식을 보여준다. 도 7b는 데스모솜 단백질(PKP2, DSP, DSG2, JUP), 접착역 단백질(N-CAD) 및 갭 접합 단백질(CX43)에 대한 Ctrl, PKP2 Hom-AAV9 GFP, 및 PKP2 Hom-AAV9 PKP2 심장의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. GAPDH는 로딩 대조군의 역할을 한다. 도 7c는 주사 후 2주차에 확장기말 및 수축기말 모두에서 PKP2 Hom-AAV9 GFP 및 PKP2 Hom-AAV9 PKP2 심장의 대표적인 단축 심장 자기 공명 영상을 보여준다. 도 7d는 주사 2주 후에 좌심실(LV) 및 우심실(RV)의 박출률(EF) 정량화를 보여준다. 표준편차와 함께 평균값. n=6 Hom-AAV9 GFP, n=6 Hom-AAV9 PKP2. Tukey 사후 테스트를 사용한 이원 ANOVA. **, p<0.01. *, p<0.05. 도 7e는 Ctrl, PKP2 Hom-AAV9 GFP 및 PKP2 Hom-AAV9 PKP2 마우스의 생존 분석을 보여준다. 로그 순위 테스트. ***, p<0.001.
도 8a 내지 도 8e는 아데노(연관) 바이러스 기술이 성체 마우스 심장에서 인간 PKP2 단백질을 안정적으로 발현할 수 있고 PKP2 Hom 마우스에서 ARVC 질환 결과를 회피할 수 있음을 보여준다.
도 8a는 성체 야생형 대조 마우스의 심장에 전달된 AAV9-hPKP2 또는 AAVrh10-PKP2의 웨스턴 블롯 분석이다. AAV9-hPKP2를 사용한 연구 1에서는 마우스 심장에서의 발현을 평가하기 전 10일의 기간을 두었다. AAVrh10-hPKP2를 이용한 연구 2에서는 마우스의 심장과 간에서의 발현을 평가하기 전 21일의 기간을 두었다. PKP2 및 DSP 발현은 로딩 대조군의 역할을 하는 GAPDH 및 베타-액틴과 함께 평가되었다.
도 8b는 PKP2 Hom 마우스에서 제형과 hPKP2(AAV9 및 AAVrh10을 통해)의 초기 투여(출생 후 2일(P2)) 이후 4주 생존 곡선을 도시한다.
도 8c는 표면 ECG 분석 및 제형과 hPKP2(AAV9 및 AAVrh10을 통해)의 초기 투여(P2) 후 PKP2 Hom 마우스에서 이소성 박동/조기 심실 수축(PVC)의 막대 그래프 분석을 보여준다.
도 8d는 야생형 대조군 미처리 마우스, 제형으로 처리된 PKP2 Hom, AAV9-hPKP2로 처리된 PKP2 Hom 및 AAVrh10-hPKP2로 처리된 PKP2 Hom으로부터의 확장기말의 자기 공명 영상의 대표적인 심장 단축 외관을 보여준다. 우심실(RV) 및 좌심실(LV) 치수는 확장기말에 각 그룹에서 개략되어 있다.
도 8e는 야생형 대조군 미처리 마우스, 제형으로 처리된 PKP2 Hom, AAV9-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom 및 AAVrh10-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom으로부터의 심장의 PKP2 및 세포-세포 접합 단백질(데스모플라킨(DSP), 데스모글레인-2(DSG2), 코넥신43(Cx43), N-카드헤린(NCAD), 플라코글로빈(JUP))에 대한 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적, 과학적 용어 및 두문자어는 본 발명의 기술분야에서 관련 기술의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법, 디바이스 및 물질은 본 명세서에 기술된다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은, 예컨대, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 및 주기적 갱신판); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., (Lippincott, Williams & Wilkins 2003), 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22th ed., (Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy at University of the Sciences 2012)]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
본 발명은 심부정맥을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 본 발명은 플라코필린-2(PKP2) 유전자를 포함하는 조성물의 예방 또는 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 발명은 PKP2 유전자를 전달하기 위한 아데노바이러스 연관 벡터(AAV)를 추가로 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 본 발명은 AAV가 심장친화성(cardiotropic) AAV 혈청형이고 심장 특이적 프로모터를 함유하는 것을 제공한다.
본 개시내용은 특히, 플라코필린-2(PKP2) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이유전자 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터, 및 rAAV 바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 또한 이들 단리된 폴리뉴클레오타이드, rAAV 벡터 및 rAAV 바이러스 벡터를 제조하는 방법, 뿐만 아니라 PKP2 유전자의 상실 및/또는 오작용과 연관된 질환을 포함하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 전이유전자를 전달하는 데 사용되는 이들의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 심장 세포-세포 접합 복합체를 스캐폴드 및 재조립하고 ARVC의 전기적 및 구조적 이상 둘 모두를 경감시키기 위한 플라코필린-2(PKP2)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터를 제공한다. 발표된 연구에서 단일 유전자(데스모솜 또는 기타)가 심장 세포-세포 접합 복합체를 재조립하고 ARVC 질환 발병을 예방하는 데 충분하다는 사실을 보여준 적은 없다. 많은 것 중에서, 본 개시내용은 널리 퍼진 인간 PKP2 돌연변이를 보유하는 신생아 심근세포에서 PKP2의 AAV 매개 전달이 이 모델에서 심장의 전기적 및 구조적 이상을 유발하는 심장 세포-세포 접합 단백질의 손실을 구제할 수 있음을 입증한다. 추가로, 본 개시내용은 이러한 널리 퍼진 인간 PKP2 돌연변이를 보유하는 PKP2 돌연변이체 신생아 심근세포에서 PKP2의 AAV 매개 전달이 심장 세포-세포 접합 단백질의 손실을 유사하게 구제할 수 있음을 보여주며, 이는 PKP2 단백질 투여량의 손실이 이 모델의 심장 구조적 및 전기적 결함의 핵심 동인임을 시사한다. 본 개시내용은 이러한 널리 퍼진 인간 PKP2 돌연변이를 보유하는 신생아 마우스에서 AAV-매개 PKP2 유전자 치료법의 초기 단계 투여가 심장 세포-세포 접합 복합체의 출생 후 파괴를 예방하고 성체 ARVC 질환 발병을 예방하며(심장 전기적 및 기계적 기능의 보존), 뿐만 아니라 마우스의 수명을 유의미하게 개선시키는 데 충분했음을 추가로 입증한다. 본 개시내용은 또한 이러한 널리 퍼진 인간 PKP2 돌연변이를 보유하는 성체 마우스에서 아데노-연관 바이러스 매개 PKP2 유전자 치료법의 후기 단계 투여가 세포-세포 접합 단백질을 구제 및 재조립하고 심장 기능을 개선할 뿐만 아니라 사망을 예방하는데 충분했음을 보여준다. 이 데이터는 종합적으로 PKP2가 심장 세포-세포 접합을 재조립할 수 있는 효율적인 분자 스캐폴드로 기능하고 PKP2 유전자 치료법이 예방적으로 또는 질환 진행 후반에 투여될 때 ARVC 환자에게 귀중한 치료 옵션의 역할을 할 수 있음을 강조한다.
본 명세서에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 이 이름과 연관되고 파르보바이러스과, 디펜포파르보바이러스 속에 속하는 바이러스 클래스의 구성원을 지칭한다. 아데노-연관 바이러스는 공동-감염성 헬퍼 바이러스에 의해 특정 기능이 제공되는 세포에서 성장하는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. AAV의 일반적인 정보 및 리뷰는 예를 들어 문헌[Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228 및 Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)]에서 찾을 수 있다. 다양한 혈청형이 심지어 유전자 수준에서, 구조적 및 기능적으로 매우 밀접한 관련이 있다는 것은 잘 알려져 있기 때문에 이러한 리뷰에 기술된 동일한 원칙이 리뷰의 공개일 이후에 특성화된 추가 AAV 혈청형에 적용될 수 있을 것임은 충분히 예상된다. (예를 들어, 문헌[Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; 및 Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)] 참조). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 특성을 분명하게 나타내고; 모두 AAV2에서 발현되는 것과 같은 3가지 관련 캡시드 단백질을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈 길이를 따라 혈청형 간의 광범위한 교차-혼성화를 나타내는 이종이중체(heteroduplex) 분석; 및 "역위 말단 반복 서열"(ITR)에 상응하는 말단에 유사한 자가-어닐링 분절의 존재에 의해 추가로 시사된다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 조절 제어하에 있음을 시사한다. 이 바이러스의 다양한 혈청형은 유전자 전달에 적합한 것으로 알려져 있고; 알려진 모든 혈청형은 다양한 조직 유형의 세포를 감염시킬 수 있다. 적어도 11개의 순차적으로 번호가 매겨진 AAV 혈청형이 관련 기술 분야에 알려져 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 비제한적인 예시적인 혈청형으로는 11개 혈청형 중 임의의 것, 예를 들어, AAV2, AAV8, AAV9, 또는 변이체 혈청형, 예를 들어, AAV-DJ 및 AAV PHP.B를 포함한다. AAV 입자는 3가지 주요 바이러스 단백질인 VP1, VP2 및 VP3을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, AAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVPHP.B, AAVrh74 또는 AAVrh10을 지칭한다.
예시적인 아데노-연관 바이러스 및 재조합 아데노-연관 바이러스로는 모든 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVPHP.B, AAVrh74 및 AAVrh10)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 아데노-연관 바이러스 및 재조합 아데노-연관 바이러스로는 자가-상보성 AAV(scAAV) 및 하나의 혈청형의 게놈과 다른 혈청형의 캡시드를 함유하는 AAV 혼성체(예를 들어, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 아데노-연관 바이러스 및 재조합 아데노-연관 바이러스로는 rAAV-LK03, AAV-KP-1(문헌[Kerun et al. JCI Insight, 2019; 4(22):e131610]에 자세히 기술됨) 및 AAV-NP59(문헌[Paulk et al. Molecular Therapy, 2018; 26(1): 289-303]에 자세히 기술됨)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
AAV 구조 및 기능
AAV는 복제-결손 파르보바이러스이며, 이의 단일 가닥 DNA 게놈은 길이가 약 4.7 kb이고, 2개의 145개 뉴클레오타이드 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. AAV에는 다수의 혈청형이 있다. AAV 혈청형 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 알려져 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077에 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001401 및 문헌[Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에 제공되어 있고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829에 제공되어 있으며; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829에 제공되어 있고; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716에 제공되어 있고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001862에 제공되어 있고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에 제공되어 있고; AAV-9 게놈은 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 제공되어 있고; AAV-10 게놈은 문헌[Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)]에 제공되어 있고; AAV-11 게놈은 문헌[Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에 제공되어 있다. AAV rh.74 게놈의 서열은 미국 특허 제9,434,928호에 제공되어 있다. 미국 특허 제9,434,928호는 또한 캡시드 단백질 및 자가-상보적 게놈의 서열을 제공한다. 일 양상에서, AAV 게놈은 자가-상보적 게놈이다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/패키징, 및 숙주 세포 염색체 통합을 유도하는 시스-작용성 서열은 AAV ITR 내에 함유되어 있다. 3개의 AAV 프로모터(이들의 상대적인 지도 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 유도한다. 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱(뉴클레오타이드 2107 및 2227에서)과 커플링된 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생성을 초래한다. rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈의 복제를 담당하는 다수의 효소 특성을 보유한다.
cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고 3개의 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 대체 스플라이싱 및 비-콘센서스 해독 시작 부위는 3가지 관련된 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 보다 구체적으로, VP1, VP2 및 VP3 단백질 각각이 해독되는 단일 mRNA가 전사된 후, 2가지 다른 방식으로 스플라이싱될 수 있다: 즉 더 길거나 더 짧은 인트론을 절제하여 2가지 mRNA 풀(pool)인 2.3kb 및 2.6kb 길이의 mRNA 풀의 형성을 초래할 수 있다. 더 긴 인트론이 선호되는 경우가 많으므로 2.3kb 길이의 mRNA를 주요 스플라이스 변이체라고 부를 수 있다. 이 형태에는 VP1 단백질의 합성이 시작되는 제1 AUG 코돈이 결여되어 있어, VP1 단백질 합성의 전체 수준의 감소를 초래한다. 주요 스플라이스 변이체에 남아 있는 제1 AUG 코돈은 VP3 단백질의 개시 코돈이다. 그러나, 동일 개방 판독 프레임에서 해당 코돈의 상류에는 최적의 Kozak(해독 개시) 서열로 둘러싸인 ACG 서열(트레오닌을 암호화함)이 있다. 일부 양상에서, Kozak 서열은 서열번호 3에 기재되어 있다. 이는 VP1과 마찬가지로, 문헌[Becerra SP et al., (December 1985). "Direct mapping of adeno-associated virus capsid proteins B and C: a possible ACG initiation codon". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (23): 7919-23, Cassinotti P et al., (November 1988). "Organization of the adeno-associated virus (AAV) capsid gene: mapping of a minor spliced mRNA coding for virus capsid protein 1". Virology. 167 (1): 176-84, Muralidhar S et al., (January 1994). "Site-directed mutagenesis of adeno-associated virus type 2 structural protein initiation codons: effects on regulation of synthesis and biological activity". Journal of Virology. 68 (1): 170-6, 및 Trempe JP, Carter BJ (September 1988). "Alternate mRNA splicing is required for synthesis of adeno-associated virus VP1 capsid protein". Journal of Virology. 62 (9): 3356-63]에 기술된 바와 같이 실제로 추가 N 말단 잔기를 갖는 VP3 단백질인 VP2 단백질의 낮은 합성 수준에 기여하며, 이들 문헌 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 단일 콘센서스 폴리A 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 생활사 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에 리뷰되어 있다.
각각의 VP1 단백질은 VP1 부분, VP2 부분 및 VP3 부분을 함유한다. VP1 부분은 VP1 단백질에 고유한 VP1 단백질의 N-말단 부분이다. VP2 부분은 VP2 단백질의 N-말단 부분에서도 발견되는 VP1 단백질 내에 존재하는 아미노산 서열이다. VP3 부분 및 VP3 단백질은 동일한 서열을 가지고 있다. VP3 부분은 VP1 및 VP2 단백질과 공유하는 VP1 단백질의 C 말단 부분이다.
VP3 단백질은 별개의 가변 표면 영역 I-IX(VR-I-IX)로 추가로 분류될 수 있다. 각각의 가변 표면 영역(VR)은 단독으로 또는 각각의 다른 VR의 특정 아미노산 서열과 조합으로, 고유의 감염 표현형(예를 들어, 다른 AAV 혈청형에 비해 감소된 항원성, 개선된 형질도입 및/또는 조직 특이적 친화성)을 본 명세서에 내용이 참조에 의해 원용되는 문헌[DiMatta et al., "Structural Insight into the Unique Properties of Adeno-Associated Virus Serotype 9" J. Virol., Vol. 86 (12): 6947-6958, June 2012]에 기술된 바와 같이 특정 혈청형에 부여할 수 있는 특정 아미노산 서열을 포함하거나 함유할 수 있다.
AAV는 예를 들어 유전자 치료법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적이게 만드는 고유한 특징을 보유한다. 배양물 중 세포의 AAV 감염은 세포병변성이 아니며, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 침묵성 및 무증상성이다. 또한, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜 생체 내에서 많은 여러 조직을 표적으로 할 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 느린 분열성 세포 및 비분열성 세포를 형질도입시키고 이들 세포의 수명 동안 전사적으로 활성인 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 본질적으로 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드에 클로닝된 DNA로서 삽입되어 재조합 게놈의 작제를 실현 가능하게 한다. 또한, AAV 복제 및 게놈 캡시드화를 지시하는 신호는 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되어 있기 때문에, 게놈의 내부 대략 4.3kb 중 일부 또는 전부(복제 및 구조적 캡시드 단백질을 암호화함, rep-cap)가 외래 DNA로 대체되어 AAV 벡터를 생성할 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 유의미한 특징은 매우 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 비활성화하는 데 사용되는 조건(수 시간 동안 56°내지 65℃)을 쉽게 견디므로, AAV의 저온 보존이 중대하지 않게 한다. AAV는 심지어 동결건조될 수도 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복감염에 저항성이 아니다.
다수의 연구에서는 근육에서 장기간(1.5년 초과) 재조합 AAV-매개 단백질 발현을 입증했다. 문헌[Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); 및 Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996)]을 참조한다. 또한, 문헌[Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) 및 Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001)]을 참조한다. 더욱이, 근육은 고도로 혈관화되어 있기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 문헌[Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) 및 Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997)]에 기술된 바와 같이, 근육내 주사 후 전신 순환에서 전이유전자 생성물의 출현을 초래했다. 더욱이, 문헌[Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)]은 골격 근섬유가 올바른 항체 글리코실화, 접힘 및 분비에 필수적인 세포 인자를 보유함을 입증했으며, 이는 근육이 분비된 단백질 치료제를 안정적으로 발현할 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 재조합 AAV(rAAV) 게놈은 치료 단백질(예를 들어, PKP2)을 암호화하는 핵산 분자 및 이 핵산 분자의 측면에 있는 하나 이상의 AAV ITR을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 위형(pseudotyped) rAAV의 생성은 예를 들어 WO2001083692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어, 캡시드 돌연변이가 있는 rAAV도 고찰된다. 예를 들어, 문헌[Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)]를 참조한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
전이유전자 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드
본 개시내용은 적어도 하나의 전이유전자 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일부 양상에서, 전이유전자 핵산 분자는 PKP2 폴리펩타이드 또는 이의 적어도 하나의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 기술자가 이해하는 바와 같이, PKP2는 인간 게놈에서 PKP2 유전자에 의해 암호화된다. 따라서, 전이유전자 핵산 분자는 PKP2 서열 또는 이의 임의의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 전이유전자 핵산 분자는 PKP2 폴리펩타이드의 생물학적 등가물을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 관련 기술분야에 공지된 PKP2의 임의의 동형(isoform)일 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 동형은 PKP2 2a 동형일 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 동형은 PKP2 2b 동형일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 기술된 플라코필린-2(PKP2) 유전자는 기능성 PKP2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 유전자 또는 암호화된 단백질은 자연 발생이거나 또는 변형되지만 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료 활성을 보유할 수 있다. 유전자 또는 암호화된 단백질은 공개 문헌에 잘 알려져 있는 바와 같이 인간 기원을 포함하는 포유동물에서 단리된 자연 발생 PKP2 유전자 또는 단백질의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
용어 "PKP2"는 100% 서열 동일성을 갖는 전체 길이 도메인의 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 및 가장 바람직하게는 99%의 분절을 포함하는 아미노산 서열 및 이의 변이를 포함하는 플라코필린-2 전체 길이의 단백질, 및 이의 기능성 단편을 지칭한다. 아미노산 서열의 변이는 이러한 아미노산 서열의 변이가 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 및 가장 바람직하게는 99%를 유지하는 한, 본 개시내용에 의해 포괄되는 것으로 고려된다. 사이의 특정 백분율, 예컨대, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성이 포함된다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보존적 대체는 측쇄와 관련된 아미노산 계열 내에서 발생하는 것이다. 유전자적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 다음과 같은 계열로 분류된다: (1) 산성 아미노산은 아스파테이트, 글루타메이트이다; (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이다; (3) 비극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, (4) 비하전성 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산으로는 아르기닌, 아스파라긴, 아스파테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산으로는 알라닌, 시스테인, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 다른 아미노산 계열로는 (i) 지방족-하이드록시 계열인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 계열인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 계열인 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 및 (iv) 방향족 계열인 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 예를 들어, 류신을 아이소류신이나 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 교체하는 단리 대체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산을 교체하는 유사 대체는 특히 대체가 프레임워크 부위 내의 아미노산을 수반하지 않는다면, 최종 생성된 분자의 결합 또는 특성에 주요 영향을 미치지 않을 것이라고 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능성 PKP2 단백질을 초래하는지 여부는 단백질 유도체의 특정 활성을 검정하여 쉽게 결정할 수 있다. PKP2 단백질의 단편 또는 유사체는 관련 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카복시-말단은 기능성 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 서열은 개선된 치료 활성을 위해 변형될 수 있다.
용어 "PKP2 유전자"는 플라코필린-2 단백질을 암호화하는 전체 길이의 뉴클레오타이드 서열, DNA 또는 RNA, 또는 이의 기능성 단편, 예를 들어, 100% 서열 동일성을 갖는 전체 길이의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 및 가장 바람직하게는 99%의 분절을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 및 이의 변이를 지칭한다. 단편은 100% 서열 동일성을 갖는 전체 길이 유전자의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 및 가장 바람직하게는 99%의 분절을 포함하는 핵산 서열, DNA 또는 RNA, 및 이의 변이를 포함한다. 유전자 서열의 변이는 핵산 서열의 변이가 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 유지하는 한, 본 개시내용에 의해 포괄되는 것으로서 고려된다. 사이의 특정 백분율, 예컨대, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성이 포함된다. 서열은 개선된 치료 활성을 위해 변형될 수 있고, 아데노-연관 바이러스(AAV) 또는 기타 잘 알려진 유전자 전달 벡터 시스템 등을 사용하여 전달을 위해 최적화될 수 있다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열의 적어도 일부와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 적어도 일부와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열의 적어도 일부와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 14에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 14에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 PKP2 서열이라고 지칭될 수 있다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 14에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 14에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
코돈 최적화
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열일 수 있다. PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 야생형 인간 핵산 서열과 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 이하로 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 공여자 스플라이스 부위를 포함하지 않는다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개 또는 약 8개, 또는 약 9개, 또는 약 10개 이하의 공여자 스플라이스 부위를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 야생형 인간 핵산 서열과 비교할 때, 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개 더 적은 공여자 스플라이스 부위를 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 코돈 최적화된 핵산 서열에서 공여자 스플라이스 부위의 제거는 은밀한 스플라이싱이 방지되기 때문에 생체내에서 PKP2 폴리펩타이드의 발현을 예기치 않게 예측 불가능할 정도로 증가시킬 수 있다. 더욱이, 은밀한 스플라이싱은 서로 다른 대상체들 사이에서 예측 불가능할 정도로 변동될 수 있고, 이는 공여자 스플라이스 부위를 포함하는 PKP2 폴리펩타이드의 발현 수준이 서로 다른 대상체들 사이에서 예측 불가능할 정도로 변동될 수 있음을 의미한다. 이러한 예측 불가능성은 인간 치료법의 정황에서는 허용될 수 없다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 야생형 인간 핵산 서열의 GC 함량과 다른 GC 함량을 가질 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열의 GC 함량은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 야생형 인간 핵산 서열과 비교할 때, 전체 핵산 서열에 걸쳐 더욱 균일하게 분포된다. 이론에 구애됨이 없이, 전체 핵산 서열에 걸쳐 GC 함량을 더욱 균일하게 분포시킴으로써, 코돈 최적화된 핵산 서열은 전사체의 길이에 걸쳐 더욱 균일한 용융 온도("Tm")를 나타낸다. 용융 온도의 균일성은 폴리머라제 및/또는 리보솜의 정지를 줄임으로써 핵산 서열의 전사 및/또는 해독이 일어나기 때문에 인간 대상체에서 예기치 않게 코돈 최적화된 핵산의 발현 증가를 초래한다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 야생형 인간 핵산 서열에 비해 더 적은 억제성 마이크로RNA 표적 결합 부위를 가질 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 야생형 인간 핵산 서열과 비교하여 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 10개 더 적은 억제성 마이크로RNA 표적 결합 부위를 가질 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 더 적은 억제성 마이크로RNA 표적 결합 부위를 가짐으로써, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 인간 대상체에서 예기치 않게 증가된 발현을 나타낸다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열은 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 야생형 또는 비-코돈 최적화된 핵산 서열에 비해 인간 대상체에서 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% 증가된 발현을 나타낸다.
AAV 벡터
일부 양상에서, 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 전이유전자 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV(rAAV) 벡터일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 벡터가 예를 들어 형질감염, 감염, 또는 형질전환 과정에 의해 세포 내에 배치될 때 복제될 수 있도록 온전한 레플리콘을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 핵산을 지칭한다. 벡터는 일단 세포 내부에 있으면 염색체외(에피솜) 요소로서 복제될 수 있거나 숙주 세포 염색체에 통합될 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 이해된다. 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 바큘로바이러스, 변형된 바큘로바이러스, 파포바바이러스 또는 달리 변형된 자연 발생 바이러스로부터 유래된 핵산을 포함할 수 있다. 핵산을 전달하기 위한 예시적인 비-바이러스 벡터로는 네이키드 DNA; 양이온성 지질 단독과 또는 양이온성 중합체와 조합으로 복합체화된 DNA; 음이온성 및 양이온성 리포솜; 일부 경우에 리포솜에 함유된, 이종 폴리라이신, 정의된 길이의 올리고펩타이드 및 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 중합체와 축합된 DNA를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 DNA-단백질 복합체 및 입자를 포함하고; 및 바이러스 및 폴리라이신-DNA를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 3원 복합체의 사용을 포함한다.
일반적인 재조합 기술과 관련하여, 프로모터 및 폴리뉴클레오타이드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위 둘 모두를 함유하는 벡터는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사시킬 수 있으며, Agilent Technologies(캘리포니아주 산타클라라 소재) 및 Promega Biotech(위스콘신주 매디슨 소재)와 같은 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해, 전사 또는 해독 수준에서 발현을 간섭하거나 또는 감소시킬 수 있는 초과의 잠재적으로 부적절한 대체 해독 개시 코돈 또는 기타 서열을 없애기 위해, 클로닝된 전이유전자의 5' 및/또는 3' 비해독 부분을 제거, 추가 또는 변경하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 발현을 향상시키기 위해 콘센서스 리보솜 결합 부위가 시작 코돈의 5'에 바로 삽입될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "rAAV 벡터"는 하나 이상의 전이유전자 서열 및 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는, 예를 들어, 숙주 세포의 형질감염에 의해, rep 및 cap 유전자 생성물의 기능성을 제공하는 숙주 세포에 존재할 때 복제되어 감염성 바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 일부 양상에서, AAV 벡터는 프로모터, 적어도 하나의 단백질 또는 RNA를 암호화할 수 있는 적어도 하나의 핵산, 및/또는 감염성 AAV 입자에 패키징되는, 측면 ITR 내에 인핸서 및/또는 터미네이터를 함유한다. 캡시드화된 핵산 부분은 AAV 벡터 게놈으로서 지칭될 수 있다. rAAV 벡터를 함유하는 플라스미드는 또한 제조 목적을 위한 요소, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 복제 기점 서열 등을 함유할 수도 있지만, 이러한 요소는 캡시드화되지 않으므로 AAV 입자의 일부를 형성하지 않는다.
일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 전이유전자 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 AAV 역위 말단(ITR) 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 전사후 조절 요소를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 폴리A 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 리포터 단백질을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 제1 AAV ITR 서열, 프로모터 서열, 전이유전자 핵산 분자, 폴리A 서열, 및 제2 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 5'에서 3' 방향으로 제1 AAV ITR 서열, 프로모터 서열, 전이유전자 핵산 분자, 폴리A 서열, 및 제2 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, rAAV 벡터는 제1 AAV ITR 서열, 프로모터 서열, 전이유전자 핵산 분자, 전사후 조절 요소, 폴리A 서열, 및 제2 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 5'에서 3' 방향으로 제1 AAV ITR 서열, 프로모터 서열, 전이유전자 핵산 분자, 전사후 조절 요소, 폴리A 서열, 및 제2 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, rAAV 벡터는 1개 초과의 전이유전자 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 2개의 전이유전자 핵산 분자를 포함할 수 있어, rAAV 벡터는 제1 전이유전자 핵산 분자 및 적어도 제2 전이유전자 핵산 분자를 포함한다. 일부 양상에서, 제1 및 적어도 제2 전이유전자 핵산 분자는 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 및 적어도 제2 전이유전자 핵산 분자는 상이한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 및 적어도 제2 전이유전자 핵산 서열은 서로 인접할 수 있다.
일부 양상에서, rAAV 벡터는 1개 초과의 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 2개의 프로모터 서열을 포함할 수 있어, rAAV 벡터는 제1 프로모터 서열 및 적어도 제2 프로모터 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 제1 및 적어도 제2 프로모터 서열은 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 및 적어도 제2 프로모터 서열은 상이한 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 및 적어도 제2 프로모터 서열은 서로 인접할 수 있다. rAAV 벡터가 또한 제1 전이유전자 핵산 분자 및 적어도 제2 전이유전자 핵산 분자를 포함하는 일부 양상에서, 제1 프로모터는 제1 전이유전자 핵산 분자의 상류(5')에 위치할 수 있고 적어도 제2 프로모터는 제1 전이유전자 핵산 분자와 적어도 제2 전이유전자 핵산 분자 사이에 위치할 수 있어, 적어도 제2 프로모터는 제1 전이유전자 핵산 분자의 하류(3')와 적어도 제2 전이유전자 핵산 분자의 상류(5')에 존재한다.
선행하는 rAAV 벡터 중 임의의 것은 적어도 하나의 인핸서를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 인핸서는 rAAV 벡터의 어느 곳에나 위치할 수 있다. 일부 양상에서, 적어도 하나의 인핸서는 프로모터의 바로 상류(5')에 위치할 수 있다. 따라서, rAAV 벡터는 5'에서 3' 방향으로 제1 AAV ITR 서열, 인핸서, 프로모터 서열, 전이유전자 핵산 분자, 폴리A 서열, 및 제2 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 적어도 하나의 인핸서는 프로모터의 바로 하류(3')에 위치할 수 있다. 따라서, rAAV 벡터는 5'에서 3' 방향으로 제1 AAV ITR 서열, 프로모터 서열, 인핸서, 전이유전자 핵산 분자, 폴리A 서열, 및 제2 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 적어도 하나의 인핸서는 전이유전자 핵산 분자의 바로 하류에 위치할 수 있다. 따라서, rAAV 벡터는 5'에서 3' 방향으로 제1 AAV ITR 서열, 프로모터 서열, 전이유전자 핵산 분자, 인핸서, 폴리A 서열, 및 제2 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 9에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 18에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 21에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 22에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 23에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 24에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 26에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 29에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 서열번호 30에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
AAV ITR 서열
일부 양상에서, AAV ITR 서열은 관련 기술분야에 공지된 임의의 AAV ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, AAV ITR 서열은 AAV1 ITR 서열, AAV2 ITR 서열, AAV4 ITR 서열, AAV5 ITR 서열, AAV6 ITR 서열, AAV7 ITR 서열, AAV8 ITR 서열, AAV9 ITR 서열, AAV10 ITR 서열, AAV11 ITR 서열, AAV12 ITR 서열, AAV13 ITR 서열, AAVrh74 ITR 서열 또는 AAVrh10 ITR 서열일 수 있다.
따라서, 일부 양상에서, AAV ITR 서열은 AAV1 ITR 서열, AAV2 ITR 서열, AAV4 ITR 서열, AAV5 ITR 서열, AAV6 ITR 서열, AAV7 ITR 서열, AAV8 ITR 서열, AAV9 ITR 서열, AAV10 ITR 서열, AAV11 ITR 서열, AAV12 ITR 서열, AAV13 ITR 서열, AAVrh74 ITR 서열, 또는 AAVrh10 ITR 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 AAV2 ITR 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 AAV2 ITR 서열 또는 변형된 AAV2 ITR 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, AAV2 ITR 서열은 서열번호 7과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, AAV2 ITR 서열은 서열번호 8과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, AAV2 ITR 서열은 서열번호 15와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, AAV2 ITR 서열은 서열번호 16과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, AAV2 ITR 서열은 서열번호 19와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, AAV2 ITR 서열은 서열번호 20과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, AAV2 ITR 서열은 서열번호 25와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 7과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 8과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 8과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 7과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 25와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 8과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 8과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 25와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 15와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 16과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 16과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 15와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 19와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 20과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 20과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 19와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 ITR 서열는 정배향 또는 역배향으로 뒤집힌 것과 같은 임의의 순서일 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 ITR 서열은 ITR 서열을 암호화하는 핵산 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌연변이, 결실, 삽입 또는 재배열을 포함할 수 있다.
프로모터 서열 및 인핸서
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터" 및 "프로모터 서열"은 유전자 또는 전이유전자와 같은 암호 서열의 전사 개시 및 속도가 제어되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역인 제어 서열을 의미한다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적, 유도성, 억제성 또는 조직 특이적일 수 있다. 프로모터는 조절 단백질 및 분자, 예컨대, RNA 폴리머라제 및 전사 인자가 결합할 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. 비제한적인 예시적 프로모터에는 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, 편재적인 닭 β-액틴 혼성체(CBh) 프로모터, 소형 핵 RNA(U1a 또는 U1b) 프로모터, MeCP2 프로모터, MeP418 프로모터, MeP426 프로모터, 최소 MeCP2 프로모터, VMD2 프로모터, mRho 프로모터, 또는 EF1 프로모터가 포함된다.
본 명세서에 제공된 추가의 비제한적인 예시적 프로모터에는 EFla, Ubc, 인간 β-액틴, CAG, TRE, Ac5, 폴리헤드린(Polyhedrin), CaMKIIa, Gal1, TEF1, GDS, ADH1, Ubi 및 α-1-항트립신(hAAT)이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. mRNA 전사 효율을 증가시키거나 감소시키기 위해 이러한 프로모터의 뉴클레오타이드 서열이 변형될 수 있다는 것은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gao et al. (2018) Mol. Ther.: Nucleic Acids 12:135-145(RNA 폴리머라제 III 전사를 폐지하고 RNA 폴리머라제 II-의존성 mRNA 전사를 자극하기 위해 7SK, U6 및 H1 프로모터의 TATA 박스를 변형시킴)]을 참조한다. 합성적으로 유도된 프로모터는 편재적 또는 조직 특이적 발현을 위해 사용될 수 있다. 또한, 일부가 위에 언급되어 있는, 바이러스-유래 프로모터, 예를 들어, CMV, HIV, 아데노바이러스 및 AAV 프로모터는 본 명세서에 개시된 방법에 유용할 수 있다. 일부 양상에서, 프로모터는 전사 효율을 증가시키기 위해 적어도 하나의 인핸서와 함께 사용된다. 인핸서의 비제한적인 예에는 간질성 레티노이드-결합 단백질(IRBP) 인핸서, RSV 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포함된다.
일부 양상에서, 프로모터 서열은 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터 서열(선택적으로, RSV 인핸서와 함께), 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 서열, SV40 프로모터 서열, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터 서열, β-액틴 프로모터 서열, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 서열, U6 프로모터 서열, H1 프로모터 서열, 편재성 닭 β-액틴 혼성체(CBh) 프로모터 서열, 소형 핵 RNA (U1a 또는 U1b) 프로모터 서열, MeCP2 프로모터 서열, MeP418 프로모터 서열, MeP426 프로모터 서열, 최소 MeCP2 프로모터 서열, VMD2 프로모터 서열, mRho 프로모터 서열, EFI 프로모터 서열, EFla 프로모터 서열, Ubc 프로모터 서열, 인간 β-액틴 프로모터 서열, CAG 프로모터 서열, TRE 프로모터 서열, Ac5 프로모터 서열, 폴리헤드린 프로모터 서열, CaMKIIa 프로모터 서열, Gal1 프로모터 서열, TEF1 프로모터 서열, GDS 프로모터 서열, ADH1 프로모터 서열, Ubi 프로모터 서열 또는 α-1-항트립신(hAAT) 프로모터 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 프로모터 서열은 심장 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 양상에서, 심장 특이적 프로모터는 TNNI2 프로모터이다. 일부 양상에서, 심장 특이적 프로모터는 NKX2.5 프로모터이다. 일부 양상에서, 심장 특이적 프로모터는 심장 트로포닌 T(cTnT) 프로모터이다. 일부 양상에서, 심장 트로포닌 T 프로모터는 심장 특이적 발현을 유도한다. 일부 양상에서, 심장 트로포닌 T 프로모터는 심근세포 특이적 발현을 유도한다.
인핸서는 표적 서열의 발현을 증가시키는 조절 요소이다. "프로모터/인핸서"는 프로모터 기능과 인핸서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복체는 프로모터 기능 및 인핸서 기능을 모두 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성", "외인성" 또는 "이종성"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈 내에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결되어 있는 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/또는 프로모터에 의해 지시되도록 하는 합성 기술 또는 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자에 병치되어 배치된 것이다. 본 명세서에 제공된 방법, 조성물 및 작제물에 사용하기 위한 연결된 인핸서/프로모터의 비제한적 예로는 PDE 프로모터 + IRBP 인핸서 또는 CMV 인핸서 + U1a 프로모터를 포함한다. 인핸서는 내인성 또는 이종 프로모터의 위치에 상대적인 이들의 배향에 관계없이, 떨어져서 작동할 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 이해되어 있다. 따라서, 프로모터로부터 떨어져서 작동하는 인핸서는 벡터에서의 위치 또는 프로모터 위치에 상대적인 그의 배향과 관계없이 해당 프로모터에 "작동 가능하게 연결"된 것으로 추가로 이해한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있는 유전자(즉, 전이유전자)의 발현을 지칭한다. 프로모터는 이의 제어 하에 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터는 이의 제어 하에 유전자의 5'(상류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 프로모터가 유래되는 유전자에서 프로모터와 이것이 제어하는 유전자 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리 변동은 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
일부 양상에서, 프로모터 서열은 심장 트로포닌 T(cTnT) 프로모터 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. cTnT 프로모터 서열은 서열번호 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 박테리아 플라스미드는 원핵생물 프로모터를 포함할 수 있다.
전이유전자 핵산 분자
일부 양상에서, 전이유전자 핵산 분자는 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 적어도 하나의 단편을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 전이유전자 핵산 분자는 PKP2 폴리펩타이드의 생물학적 등가물을 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 적어도 하나의 단편을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열의 적어도 일부와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 적어도 일부와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열의 적어도 하나의 일부와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 14에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 14에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 PKP2 서열이라고 지칭될 수 있다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 14에 제시된 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 양상에서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 14에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 전이유전자 핵산 분자는 리포터 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 리포터 단백질은 프로모터의 발현(예를 들어, 조직 특이성 및/또는 강도)을 검정하기 위해 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 검출가능한 단백질이다. 양상에서, 리포터 단백질은 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 양상에서, 리포터 단백질은 DNA 전달 방법, 프로모터 및 인핸서 요소의 기능 식별 및 특성화, 해독 및 전사 조절, mRNA 프로세싱 및 단백질:단백질 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 리포터 단백질의 비제한적인 예는 β-갈락토시다제; 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)과 같은 형광 단백질; 루시페라제; 글루타티온 S-트랜스퍼라제; 및 말토스 결합 단백질이다.
일부 양상에서, 전이유전자 핵산 분자는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 양상에서, rAAV 벡터에 존재하는 전이유전자 핵산 분자는 동일한 rAAV 벡터에도 존재하는 프로모터 서열의 전사 제어 하에 있을 수 있다.
전사후 조절 요소
다양한 전사후 조절 요소는, 예를 들어, 숙주 세포에서 관심 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위해 바이러스 벡터에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 바이러스 전사후 조절 요소일 수 있다. 바이러스 전사후 조절 요소의 비제한적인 예는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE), B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HBVPRE), RNA 수송 요소(RTE) 및 이들의 임의의 변이체를 포함한다. 일부 양상에서, 전사후 조절 요소는 최적화된 전사후 조절 요소(oPRE)일 수 있다. oPRE는 서열번호 5, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 제시된 핵산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
폴리A 서열
일부 양상에서, 폴리아데닐화(polyA) 서열은 관련 기술분야에 공지된 임의의 폴리A 서열을 포함할 수 있다. 폴리A 서열의 비제한적 예에는 MeCP2 폴리A 서열, 레티놀 탈수소효소 1(RDH1) 폴리A 서열, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리A 서열, SV40 폴리A 서열, SPA49 폴리A 서열, sNRP-TK65 폴리A 서열, sNRP 폴리A 서열, 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열 또는 TK65 폴리A 서열이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 폴리A 서열은 MeCP2 폴리A 서열, 레티놀 탈수소효소 1(RDH1) 폴리A 서열, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리A 서열, SV40 폴리A 서열, SPA49 폴리A 서열, sNRP-TK65 폴리A 서열, sNRP 폴리A 서열, 또는 TK65 폴리A 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 폴리A 서열은 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열은 서열번호 6에 제시된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 폴리A 서열은 BGH 폴리A 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, BGH 폴리A 서열은 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
박테리아 플라스미드
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 시험관내 rAAV 벡터의 전파를 허용하기 위해 박테리아 플라스미드 내에 함유될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 박테리아 플라스미드를 제공한다. 박테리아 플라스미드는 복제 기점 서열을 추가로 포함할 수 있다. 박테리아 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 박테리아 플라스미드는 원핵생물 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
비제한적인 예에서, 박테리아 플라스미드 내의 rAAV 벡터는 5'에서 3' 방향으로 5' ITR, cTnT 프로모터 서열, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 전이유전자 핵산 분자, oPRE 서열, BGH 폴리A 서열 및 3' ITR을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 박테리아 플라스미드는 서열번호 10에 제시된 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
복제 기점 서열
일부 양상에서, 복제 기점 서열은 관련 기술분야에 공지된 임의의 복제 기점 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 복제 기점 서열은 박테리아 복제 기점 서열일 수 있으며, 이로써 상기 박테리아 복제 기점 서열을 포함하는 rAAV 벡터가 관련 기술분야의 표준 방법을 사용하여 박테리아에서 생성, 전파 및 유지될 수 있도록 한다.
일부 양상에서, 복제 기점 서열은 pUC 복제 기점 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. pUC19 복제 기점 서열은 서열번호 11과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
항생제 내성 유전자
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터 및/또는 rAAV 바이러스 벡터는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 항생제 내성 유전자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 항생제 내성 유전자를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 항생제 내성 유전자의 예로는 카나마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카르베니실린 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 에리쓰로마이신 내성 유전자, 폴리믹신 B 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 양상에서, 항생제 내성 유전자는 암피실린 항생제 내성 유전자를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 암피실린 항생제 내성 유전자는 서열번호 12와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
AAV 바이러스 벡터
"바이러스 벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 숙주 세포 내로 전달될 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합적으로 생산된 바이러스 또는 바이러스 입자로 정의된다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등을 포함한다. Semliki Forest 바이러스 기반 벡터 및 Sindbis 바이러스 기반 벡터와 같은 알파바이러스 벡터도 유전자 치료법 및 면역요법에 사용하기 위해 개발되었다. 예를 들어, 문헌[ Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827]을 참조한다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 바이러스 벡터" 또는 "rAAV 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 따라서, rAAV 바이러스 벡터의 생산은 이러한 벡터가 rAAV 벡터 내에 함유되어 있기 때문에, rAAV 벡터의 생산을 반드시 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 입자의 단백질성 쉘(shell) 또는 코트(coat)를 지칭한다. 캡시드는 바이러스 게놈을 캡시드화, 보호, 수송 및 숙주 세포 내로 방출하는 기능을 한다. 캡시드는 일반적으로 단백질의 올리고머성 구조 하위단위("캡시드 단백질")로 구성된다. 본 명세서에 사용된 용어 "캡시드화된"은 바이러스 캡시드 내에 둘러싸인 것을 의미한다. AAV의 바이러스 캡시드는 VP1, VP2 및 VP3인 3가지 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물로 구성된다. VP1, VP2 및 VP3의 혼합물은 문헌[Sonntag F et al., (2010년 6월). "A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107(22): 10220-5, 및 Rabinowitz JE, Samulski RJ(2000년 12월). "Building a better vector: the manipulation of AAV virions". Virology. 278(2): 301-8, 각각의 전체 내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨]에 기술된 바와 같이, 1:1:10(VP1:VP2:VP3) 또는 1:1:20(VP1:VP2:VP3)의 비율로 T=1 정이십면체 대칭으로 배열된 60개의 단량체를 함유한다.
본 개시내용은 a) 본 명세서에 기재된 임의의 rAAV 벡터; 및 b) AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 바이러스 벡터를 제공한다.
AAV 캡시드 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 AAV 캡시드 단백질일 수 있다. AAV 캡시드 단백질은 AAV1 캡시드 단백질, AAV2 캡시드 단백질, AAV4 캡시드 단백질, AAV5 캡시드 단백질, AAV6 캡시드 단백질, AAV7 캡시드 단백질, AAV8 캡시드 단백질, AAV9 캡시드 단백질, AAV10 캡시드 단백질, AAV11 캡시드 단백질, AAV12 캡시드 단백질, AAV13 캡시드 단백질, AAVPHP.B 캡시드 단백질, AAVrh74 캡시드 단백질 또는 AAVrh10 캡시드 단백질일 수 있다. 일부 양상에서, 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질일 수 있다. 일부 양상에서, 캡시드 단백질은 AAVrh10 캡시드 단백질일 수 있다.
조성물 및 약제학적 조성물
본 개시내용은 본 명세서에 기술된 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드, rAAV 벡터 및/또는 rAAV 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드, rAAV 벡터 및/또는 rAAV 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 약리학 분야에서 공지되거나 개발된 임의의 방법에 의해 제형화될 수 있으며, 이 방법으로는 활성 성분(예를 들어, 바이러스 입자 또는 재조합 벡터)을 부형제 및/또는 첨가제 및/또는 기타 보조 성분과 접촉시키고, 생성물을 용량 단위로 분할 또는 포장하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 바이러스 입자는 바람직한 특징, 예를 들어, 증가된 안정성, 증가된 세포 형질감염, 지속 또는 지연 방출, 생체분포 또는 향성, 생체내에서 암호화된 단백질의 조절되거나 향상된 해독, 및 생체내에서 암호화된 단백질의 방출 프로파일을 갖는 것으로 제형화될 수 있다.
이와 같이, 약제학적 조성물은 식염수, 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-쉘 나노입자, 펩타이드, 단백질, 바이러스 벡터로 형질감염된 세포(예를 들어, 대상체로의 이식을 위해), 나노입자 모방체 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 약제학적 조성물은 나노입자로서 제형화된다. 일부 양상에서, 나노입자는 자가-조립된 핵산 나노입자이다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로서 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어, 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다. 본 발명의 제형은 하나 이상의 부형제 및/또는 첨가제를 각각 바이러스 벡터의 안정성을 함께 증가시키고, 바이러스 벡터에 의한 세포 형질감염 또는 형질도입을 증가시키고, 바이러스 벡터 암호화 단백질의 발현을 증가시키고, 및/또는 바이러스 벡터 암호화 단백질의 방출 프로파일을 변경시키는 양으로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 약제학적 조성물은 부형제 및/또는 첨가제를 포함한다. 부형제 및/또는 첨가제의 비제한적인 예는 용매, 분산 매질, 희석제 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 동결보호제를 포함한다. "동결보호제"라는 용어는 냉동 중에 물질에 대한 손상을 감소시키거나 없앨 수 있는 작용제를 지칭한다. 동결보호제의 비제한적인 예로는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 글리세롤, 덱스트로스, 라피노스 및/또는 만니톨을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 동물, 더욱 특히 인간 및/또는 인간이 아닌 포유동물에 사용하기에 안전한 다른 제형에 더하여 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 및 에멀젼, 예컨대, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤화제를 포괄한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수도 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 대해서는 문헌[Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)]을 참조한다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 염화마그네슘, 염화나트륨, 폴록사머, 수크로스 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 염화나트륨을 포함할 수 있으며, 여기서 염화나트륨은 약 100mM 내지 약 500mM, 또는 약 200mM 내지 약 400mM, 또는 약 300mM 내지 약 400mM의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 염화나트륨은 약 200mM의 농도로 존재할 수 있다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 트리스를 포함할 수 있으며, 여기서 트리스는 약 10mM 내지 약 100mM, 또는 약 10mM 내지 약 50mM, 또는 약 15mM 내지 약 25mM의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 트리스는 약 20mM의 농도로 존재할 수 있다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 염화마그네슘을 포함할 수 있으며, 여기서 염화마그네슘은 약 0.1mM 내지 약 50mM, 또는 약 0.1mM 내지 약 5mM, 또는 약 0.5mM 내지 약 2.5mM의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 염화마그네슘은 약 1mM의 농도로 존재할 수 있다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 폴록사머 188을 포함할 수 있으며, 여기서 폴록사머 188은 약 0.001% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 폴록사머 188은 약 0.01%의 농도로 존재할 수 있다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 수크로스를 포함할 수 있으며, 여기서 수크로스는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.5% 내지 약 5%의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 수크로스는 약 1%의 농도로 존재할 수 있다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 약 6.5 내지 약 8.5, 또는 약 7.0 내지 약 8.0, 또는 약 7.4 내지 약 7.8의 pH로 제형화될 수 있다. 일부 양상에서, 약제학적 조성물은 약 7.6의 pH로 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 조성물을 사용하는 방법
본 개시내용은 개시된 조성물 및 약제학적 조성물을 사용하여, 예를 들어, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 대상체에게 치료적 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하거나 접촉시켜, 관련 기술분야에 공지되어 있거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 세포, 조직, 기관, 동물 또는 대상체의 질환 또는 장애를 치료하기 위한 개시된 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일 양상에서, 대상체는 포유동물이다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. "대상체" 및 "환자"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, "대상체" 및 "환자"라는 용어는 영장류(예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등을 포함하는 포유동물 대상체를 지칭할 수 있다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물 및/또는 약제학적 조성물 중 어느 하나의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는, 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 심부정맥을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 질환은 PKP2 유전자를 수반하는 유전자 장애일 수 있다. 관련 기술분야의 기술자가 이해하는 바와 같이, ARVC 또는 PKP2-연관 유전자 장애는 심부정맥, 실신, 심장 두근거림, 현기증, 숨가쁨, 흉통, 피로, 지속적인 기침, 조기 심실 수축, 심실 빈맥(VT), 심부전, 심장 섬유증 및/또는 심정지를 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 증상을 대상체에서 유발할 수 있다. 일부 양상에서, ARVC 또는 PKP2-연관 유전자 장애는 심실 부정맥 및 심장 돌연사를 초래하는 좌심실 기능장애 및/또는 심근의 섬유지방 대체와 연관이 있다.
일부 양상에서, ARVC는 심장 데스모솜의 결함을 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "데스모솜"은 세포-세포 접착에 특화된 세포 구조를 지칭한다. 데스모솜은 원형질막의 측면에 무작위로 배열된 국재적 스팟-유사 부착인 일종의 접합 복합체이다. 심장 조직에서 발견되는 데스모솜은 심장 데스모솜이라고 지칭된다.
일부 양상에서, 질환은 대상체의 게놈에서 PKP2 유전자의 적어도 하나의 카피의 기능 상실을 특징으로 하는 질환일 수 있다. 일부 양상에서, 질환은 대상체의 게놈에서 PKP2 유전자의 적어도 하나의 카피의 기능 감소를 특징으로 하는 질환일 수 있다. 일부 양상에서, 질환은 대상체의 게놈 내 PKP2 유전자의 적어도 하나의 카피 내 적어도 하나의 돌연변이 중 적어도 하나의 돌연변이를 특징으로 하는 질환일 수 있다.
PKP2 유전자의 돌연변이는 관련 기술분야에 공지된 임의의 유형의 돌연변이일 수 있다. 돌연변이의 비제한적 예로는 체세포 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드 변이체(SNV), 넌센스 돌연변이, 삽입, 결실, 중복, 프레임이동 돌연변이, 반복 확장, 짧은 삽입 및 결실(INDEL), 긴 INDEL, 대체 스플라이싱, 대체 스플라이싱의 생성물, 변경된 해독 개시, 변경된 해독 개시의 생성물, 단백질체 절단, 단백질체 절단 생성물을 포함한다.
일부 양상에서, 질환은 질환이 있지 않은 대조군 대상체와 비교하여 대상체 중 PKP2 유전자의 발현 감소를 특징으로 하는 질환일 수 있다. 일부 양상에서, 발현의 감소는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%일 수 있다.
일부 양상에서, 질환은 질환이 있지 않은 대조군 대상체와 비교하여 대상체 중 PKP2 양의 감소를 특징으로 하는 질환일 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 양의 감소는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%일 수 있다.
일부 양상에서, 질환은 질환이 있지 않은 대조군 대상체와 비교하여 대상체에서 PKP2 활성의 감소를 특징으로 하는 질환일 수 있다. 일부 양상에서, PKP2 활성의 감소는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%일 수 있다.
일부 양상에서, PKP2를 암호화하는 핵산 시퀀싱을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터는 대상체에서 심장 데스모솜을 안정화시킬 수 있다. 일부 양상에서, PKP2를 암호화하는 핵산 시퀀싱을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터는 대상체에서 심장 세포-세포 접합 단백질의 손실을 구제할 수 있다. 일부 양상에서, PKP2를 암호화하는 핵산 시퀀싱을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터는 대상체에서 세포-세포 접합 단백질을 재조립할 수 있다. 일부 양상에서, 데스모솜 단백질은 PKP2, 데스모플라킨(DSP), 데스모글레인-2(DSG2), 플라코글로빈(JUP)을 포함한다. 일부 양상에서, 세포-세포 접합 단백질은 코넥신 43(CX43)을 포함한다.
일부 양상에서, PKP2를 암호화하는 핵산 시퀀싱을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터는 대상체에서 ARVC와 연관된 전기적 및 구조적 완전성을 개선시킬 수 있다. 일부 양상에서, PKP2를 암호화하는 핵산 시퀀싱을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터는 전기적 및 구조적 완전성을 보존하여 대상체에서 ARVC를 예방할 수 있다.
본 개시내용의 방법, 조성물, 약제학적 조성물, rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터를 사용하여 치료되는 대상체는 본 명세서에 기술된 임의의 질환 및/또는 증상을 가질 수 있다.
일부 양상에서, 대상체는 0.5세 미만, 또는 1세 미만, 또는 1.5세 미만, 또는 2세 미만, 또는 2.5세 미만, 또는 3세 미만, 또는 3.5세 미만, 또는 3.5세 미만, 또는 4세 미만, 또는 4.5세 미만, 또는 5세 미만, 또는 5.5세 미만, 또는 6세 미만, 또는 6.5세 미만, 또는 7세 미만, 또는 7.5세 미만, 또는 8세 미만, 또는 8.5세 미만, 또는 9세 미만, 또는 9.5세 미만, 또는 10세 미만일 수 있다. 일부 양상에서, 대상체는 11세 미만, 12세 미만, 13세 미만, 14세 미만, 15세 미만, 20세 미만, 30세 미만, 40세 미만, 50세 미만, 60세 미만, 70세 미만, 80세 미만, 90세 미만, 100세 미만, 110세 미만, 또는 120세 미만일 수 있다. 일부 양상에서, 대상체는 0.5세 미만일 수 있다. 일부 양상에서, 대상체는 4세 미만일 수 있다. 일부 양상에서, 대상체는 10세 미만일 수 있다. 일부 양상에서, 대상체는 18세 이상일 수 있다.
본 명세서에 개시된 치료 및 예방 방법은 치료법 또는 예방에 대한 환자를 식별 및 선택하기 위한 적절한 진단 기술과 조합될 수 있다.
본 개시내용은 숙주 세포를 본 명세서에 개시된 rAAV 바이러스 벡터 중 어느 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 숙주 세포 내 단백질의 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 바이러스 벡터는 단백질을 암호화하는 전이유전자 핵산 분자를 포함하는 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 중 어느 하나를 포함한다. 일부 양상에서, 단백질은 치료 단백질이다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 시험관내, 생체내 또는 생체외이다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 대상체로부터 유래된다. 일부 양상에서, 대상체는 정상 대상체 내의 단백질 수준 및/또는 기능성과 비교하여 단백질의 감소된 수준 및/또는 기능성을 초래하는 장애를 앓고 있다.
일부 양상에서, PKP2 단백질의 수준은 내인성 PKP2 발현 이상의 수준으로 증가된다. 일부 양상에서, PKP2 단백질의 수준은 치료전 PKP2 발현 수준에 비해 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 105%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 또는 적어도 약 500% 증가된다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 rAAV 바이러스 벡터 중 어느 하나의 유효량과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 대상체의 세포에 관심 유전자를 도입시키는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 바이러스 벡터는 관심 유전자를 포함하는, 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 중 어느 하나를 함유한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양상에서, 대상체에게 본 개시내용의 rAAV 벡터 또는 rAAV 바이러스 벡터를 투여하는 것 외에 예방적 면역억제제 치료 요법을 투여할 수도 있다. 일부 양상에서, 면역억제제 치료 요법은 적어도 하나의 면역억제 치료제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 면역억제 치료제의 비제한적 예로는 시롤리무스(라파마이신), 아세트아미노펜, 디펜하이드라민, IV 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역억제 치료제는 rAAV 벡터 및/또는 rAAV 바이러스 벡터의 투여일 전에, rAAV 벡터 및/또는 rAAV 바이러스 벡터의 투여와 동일한 날에, 또는 rAAV 벡터 및/또는 rAAV 바이러스 벡터의 투여 후 임의의 날에 투여될 수 있다.
진단 또는 치료의 "대상체"는 세포 또는 동물, 예컨대, 포유동물, 또는 인간이다. 대상체는 특정 종에 제한되지 않고 진단 또는 치료 대상이 될 수 있는 비인간 동물, 및 감염될 수 있는 비인간 동물 또는 동물 모델, 예를 들어, 제한 없이 유인원, 뮤린, 래트, 개 또는 토끼 종, 뿐만 아니라 기타 가축, 스포츠 동물 또는 애완동물을 포함한다. 일부 양상에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 대상체에서 질환을 "치료하는 것" 또는 "치료"는 (1) 질환에 취약하거나 아직 증상을 나타내지 않는 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (2) 질환을 억제하거나 발병을 저지하는 것; 또는 (3) 질환 또는 질환의 증상을 호전시키거나 퇴행을 유발하는 것을 지칭한다. 관련 분야에서 이해하는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함한 유익하거나 원하는 결과를 수득하기 위한 접근 방식이다. 본 기술의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 결과는 하나 이상의 증상의 경감 또는 호전, 병태(질환 포함) 정도의 감소, 병태(질환 포함)의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 병태(질환 포함)의 지연 또는 둔화, 병태(질환 포함), 상태 및 관해(부분적 또는 전체적)의 진전, 호전 또는 완화 중 하나 이상을 검출 가능 또는 검출 불가능 여부에 관계 없이 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 특정되지 않는 한, 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 발병, 재발 또는 확산을 예방하는 것을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 이들 용어는 증상의 발병 전에, 특히 본 명세서에서 제공된 질환 또는 장애의 위험이 있는 대상체에게, 하나 이상의 다른 추가 활성제(들)와 함께 또는 없이, 본 명세서에 제공된 화합물 또는 투여 형태를 이용한 치료 또는 그의 투여를 지칭한다. 이들 용어는 특징 질환의 증상의 억제 또는 감소를 포괄한다. 특정 실시형태에서, 질환의 가족력이 있는 대상체는 예방적 요법에 대한 잠재적 후보이다. 특정 실시형태에서, 재발 증상의 이력이 있는 대상체도 예방을 위한 잠재적 후보이다. 이와 관련하여, "예방"이라는 용어는 "예방적 치료"라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 화합물의 "예방적 유효량"은 질환 또는 장애를 예방하거나 그의 재발을 예방하기에 충분한 양이다. 화합물의 예방적 유효량은 질환 예방에 예방적 이점을 제공하는 치료제의 단독적인 또는 하나 이상의 다른 작용제(들)와 조합으로서의 양을 의미한다. "예방적 유효량"이라는 용어는 전반적인 예방을 개선시키거나, 또는 또 다른 예방제의 예방 효능을 향상시키는 양을 포괄할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 원하는 효과를 달성하기에 충분한 양을 의미하고자 한다. 치료적 또는 예방적 적용의 정황에서, 유효량은 문제가 되는 병태의 유형 및 중증도, 및 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약제학적 조성물에 대한 관용성과 같은 개별 대상체의 특성에 따라 달라질 것이다. 유전자 치료법의 정황에서, 유효량은 대상체에서 결핍된 유전자의 일부 또는 전체 기능을 회복시키기에 충분한 양일 수 있다. 일부 양상에서, rAAV 바이러스 벡터의 유효량은 대상체에서 유전자의 발현을 초래하여 PKP2가 생성되도록 하기에 충분한 양이다. 일부 양상에서, 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에서 갈락토스 대사를 증가시키는데 필요한 양이다. 숙련된 기술자는 이들 요인 및 기타 요인에 따라 적절한 양을 결정할 수 있을 것이다.
일부 양상에서, 유효량은 문제가 되는 적용의 크기 및 성격에 따라 달라질 것이다. 또한, 목표 대상체의 성격 및 민감도, 및 사용 방법에 따라서도 달라질 것이다. 숙련된 기술자는 이들 및 기타 고려사항에 기초하여 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 유효량은 실시양태에 따라 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "투여하다" 또는 "투여"는 동물 또는 인간과 같은 대상체에게 물질을 전달하는 것을 의미하고자 한다. 투여는 치료 과정 전반에 걸쳐 지속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 달성될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며 치료법에 사용되는 조성물, 치료법의 목적은 물론 치료되는 대상체의 연령, 건강 또는 성별에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료 의사, 또는 애완동물 및 기타 동물의 경우 치료 수의사가 선택하는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다.
가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며 치료법에 사용되는 조성물, 치료법의 목적 및 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료 의사가 선택한 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 투여량은 투여 경로에 따라 영향을 받을 수 있다는 점에 유의한다. 적합한 투여량 제형 및 작용제를 투여하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 적합한 투여량의 비제한적인 예는 투여당 최소 109개 벡터 게놈 내지 최대 1017개 벡터 게놈일 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법의 일부 양상에서, 대상체에게 투여되는 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 바이러스 벡터)의 수는 약 109 내지 약 1017 범위이다. 일부 양상에서, 약 1010 내지 약 1012, 약 1011 내지 약 1013, 약 1011 내지 약 1012, 약 1011 내지 약 1014, 약 1012 내지 약 1016, 약 1013 내지 약 1016, 약 1014 내지 약 1015, 약 5×1011 내지 약 5×1012, 또는 약 1012 내지 약 1013개의 바이러스 입자가 대상체에게 투여된다.
본 명세서에 기술된 방법의 일부 양상에서, 대상체에게 투여되는 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 바이러스 벡터)의 수는 적어도 약 1010개, 또는 적어도 약 1011개, 또는 적어도 약 1012개, 또는 적어도 약 1013개, 또는 적어도 약 1014개, 또는 적어도 약 1015개, 또는 적어도 약 1016개, 또는 적어도 약 1017개 바이러스 입자이다.
일부 양상에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물 및/또는 약제학적 조성물은 약 1.0×1011 벡터 게놈(vg)/kg 내지 약 1.0×1015 vg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 양상에서, 용량은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 1.0×1014 vg/kg의 범위로 투여된다. 일부 양상에서, 용량은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 1.0×1013 vg/kg의 범위로 투여된다. 일부 양상에서, 용량은 약 1.0×1012 vg/kg, 약 1.5×1012 vg/kg, 약 2.0×1012 vg/kg, 약 2.5×1012 vg/kg, 약 3.0×1012 vg/kg, 약 4.0×1012 vg/kg, 약 4.5×1012 vg/kg, 약 5.0×1012 vg/kg, 약 5.5×1012 vg/kg, 약 6.0×1012 vg/kg, 약 6.5×1012 vg/kg, 약 7.0×1012 vg/kg, 약 7.5×1012 vg/kg, 약 8.0×1012 vg/kg, 약 8.5×1012 vg/kg, 약 9.0×1012 vg/kg, 약 9.5×1012 vg/kg, 약 1.0×1013 vg/kg, 약 1.5×1013 vg/kg, 약 2.0×1013 vg/kg, 약 2.5×1013 vg/kg, 약 3.0×1013 vg/kg, 약 4.0×1013 vg/kg, 약 4.5×1013 vg/kg, 약 5.0×1013 vg/kg, 약 5.5×1013 vg/kg, 약 6.0×1013 vg/kg, 약 6.5×1013 vg/kg, 약 7.0×1013 vg/kg, 약 7.5×1013 vg/kg, 약 8.0×1013 vg/kg, 약 8.5×1013 vg/kg, 약 9.0×1013 vg/kg, 약 9.5×1013 vg/kg, 약 8.0×1012 vg/kg, 약 8.5×1012 vg/kg, 약 9.0×1012 vg/kg, 약 9.5×1012 vg/kg, 약 1.0×1014 vg/kg, 약 1.5×1014 vg/kg, 약 2.0×1014 vg/kg, 약 2.5×1014 vg/kg, 약 3.0×1014 vg/kg, 약 4.0×1014 vg/kg, 약 4.5×1014 vg/kg, 약 5.0×1014 vg/kg, 약 5.5×1014 vg/kg, 약 6.0×1014 vg/kg, 약 6.5×1014 vg/kg, 약 7.0×1014 vg/kg, 약 7.5×1014 vg/kg, 약 8.0×1014 vg/kg, 약 8.5×1014 vg/kg, 약 9.0×1014 vg/kg 또는 약 9.5×1014 vg/kg이다.
일부 양상에서, 조성물, 약제학적 조성물 중 바이러스 입자의 양, 또는 환자에게 투여된 바이러스 입자의 양은 바이러스 게놈을 함유하는 것으로 예측되는 바이러스 입자의 백분율에 기초하여 계산될 수 있다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터는 대상체에게 정맥내, 척수강내, 뇌내, 심실내, 비강내, 기관내, 귀내, 안구내, 또는 안구주위, 경구, 직장, 경점막, 흡입, 경피, 비경구, 피하, 피내, 근육내, 수조내, 신경내, 흉막내, 국소, 림프내, 수조내로 도입될 수 있고; 이러한 도입은 또한 동맥내, 심장내, 뇌실하, 경막외, 뇌내, 뇌실내, 망막하, 유리체내, 관절내, 복강내, 자궁내, 신경내 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상에서, 바이러스 입자는 비제한적인 예로서 원하는 표적 조직, 예를 들어, 심장 조직으로 전달된다. 일부 양상에서, 바이러스 입자의 전달은 전신이다. 수조내 투여 경로는 약물을 뇌실의 뇌척수액에 직접 투여하는 것을 수반한다. 이는 대조(cisterna magna)에 직접 주입하거나 영구적으로 위치한 튜브를 통해 수행될 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터는 비경구로 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터는 복강내 투여를 통해 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터는 정맥내로 투여된다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터는 대상체에서 유전자 결핍을 복구한다. 일부 양상에서, 성공적으로 치료된 세포, 조직, 기관 또는 대상체에서 복구된 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 대 복구되지 않은 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 비는 적어도 약 1.5:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 약 1000:1, 약 10,000:1, 약 100,000:1 또는 약 1,000,000:1이다. 복구된 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 양 또는 비는 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 서던 블롯, PCR, 시퀀싱, 질량 분석법, 유세포 분석법, 면역조직화학, 면역형광법, 형광 동일계내 혼성화, 차세대 시퀀싱, 면역블롯 및 ELISA를 포함하나, 이에 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물 또는 약제학적 조성물의 투여는 치료 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 달성될 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물, 또는 약제학적 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물 또는 약제학적 조성물은 반복적으로 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물 또는 약제학적 조성물은 단일 용량으로 투여된다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터는 심장 조직에 대해 향상된 향성을 나타낸다.
제조 방법
본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터를 생성하는 데에는 다양한 접근법이 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 패키징은 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드 및 세포주를 사용하여 달성된다. 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드는 바이러스 벡터 생성을 촉진하는 요소 및 서열을 함유한다. 다른 양상에서, 헬퍼 플라스미드는 패키징 세포주의 게놈 내로 안정적으로 통합되어, 패키징 세포주는 헬퍼 플라스미드로의 추가 형질감염을 필요로 하지 않는다.
일부 양상에서, 본 개시내용의 rAAV 바이러스 벡터는 곤충 세포의 바큘로바이러스 감염에 따라 제조될 수 있다.
일부 양상에서, 세포는 패키징 또는 헬퍼 세포주이다. 일부 양상에서, 헬퍼 세포주는 진핵 세포이고; 예를 들어 HEK 293 세포 또는 293T 세포이다. 일부 양상에서, 헬퍼 세포는 효모 세포 또는 곤충 세포이다.
일부 양상에서, 세포는 테트라사이클린 활성인자 단백질을 암호화하는 핵산; 및 테트라사이클린 활성인자 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 포함한다. 일부 양상에서, 테트라사이클린 활성인자 단백질의 발현을 조절하는 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 양상에서, 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(PGK) 또는 CMV 프로모터이다.
헬퍼 플라스미드는 예를 들어 복제 불능 AAV를 패키징하는데 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스로 암호화하고, 복제-능력이 있는 AAV의 생산 없이 복제 불능 AAV를 고역가로 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 생성하기 위해, 복제 불능 바이러스 게놈으로부터 유래된 적어도 하나의 바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함할 수 있다.
AAV 패키징을 위한 헬퍼 플라스미드는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 공개 제2004/0235174호 A1을 참고한다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, AAV 헬퍼 플라스미드는 헬퍼 바이러스 DNA 서열로서, 비제한적인 예로 각각의 원래 프로모터 또는 이종 프로모터에 의해 제어되는 Ad5 유전자 E2A, E4 및 VA를 함유할 수 있다. AAV 헬퍼 플라스미드는 원하는 표적 세포의 형질감염을 간단하게 검출할 수 있도록 하기 위해 형광 단백질과 같은 마커 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 추가로 함유할 수 있다.
본 개시내용은 패키징 세포주를 본 명세서에 개시된 AAV 헬퍼 플라스미드 중 어느 하나; 및 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 중 어느 하나로 형질감염시키는 것을 포함하는 rAAV 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, AAV 헬퍼 플라스미드 및 rAAV 벡터는 패키징 세포주 내로 공동-형질감염된다. 일부 양상에서, 세포주는 포유동물 세포주, 예를 들어, 인간 배아 신장(HEK) 293 세포주이다. 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 및/또는 rAAV 바이러스 벡터 중 어느 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 바이러스 또는 플라스미드와 관련하여 용어 "헬퍼"는 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 중 어느 하나의 복제 및 패키징에 필요한 추가 구성요소를 제공하는 데 사용되는 바이러스 또는 플라스미드를 지칭한다. 헬퍼 바이러스에 의해 암호화된 구성요소로는 비리온 조립, 캡시드화, 게놈 복제 및/또는 패키징에 필요한 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 바이러스 또는 플라스미드는 바이러스 게놈 복제를 위한 필수 효소를 암호화할 수 있다. AAV 작제물과 함께 사용하기에 적합한 헬퍼 바이러스 및 플라스미드의 비제한적인 예는 pHELP(플라스미드), 아데노바이러스(바이러스) 또는 헤르페스바이러스(바이러스)를 포함한다. 일부 양상에서, pHELP 플라스미드는 pHELPK 플라스미드일 수 있으며, 여기서 암피실린 발현 카세트는 카나마이신 발현 카세트와 교환된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 패키징 세포(또는 헬퍼 세포)는 바이러스 벡터를 생산하는 데 사용되는 세포이다. 재조합 AAV 바이러스 벡터를 생산하는 것은 트랜스로 제공되는 Rep 및 Cap 단백질, 뿐만 아니라 AAV 복제를 돕는 아데노바이러스 유래의 유전자 서열을 필요로 한다. 일부 양상에서, 패키징/헬퍼 세포는 세포의 게놈에 안정적으로 혼입되는 플라스미드를 함유한다. 다른 양상에서, 패키징 세포는 일시적으로 형질감염될 수 있다. 전형적으로, 패키징 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포와 같은 진핵 세포이다.
키트
본 명세서에 기술된 단리된 폴리뉴클레오타이드, rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물 및/또는 약제학적 조성물은 치료, 진단 또는 연구 적용에서의 사용을 용이하게 하기 위해 약제학적 또는 진단 또는 연구 키트로 조립될 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드, rAAV 벡터, rAAV 바이러스 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 숙주 세포, 단리된 조직 중 어느 하나를 포함한다.
일부 양상에서, 키트는 사용 지침서를 추가로 포함한다. 구체적으로, 이러한 키트는 의도된 적용분야 및 이들 작용제의 적절한 용도를 기술하는 지침서와 함께 본 명세서에 기술된 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 키트는 키트의 하나 이상의 구성 요소를 혼합하고/하거나 샘플을 단리 및 혼합하고 대상체에게 적용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 키트 내의 작용제는 특정 적용분야 및 작용제의 투여 방법에 적합한 약제학적 제형 및 투여량에 존재한다. 연구 목적의 키트는 다양한 실험을 실행하는 데 적절한 농도 또는 양의 구성 요소를 함유할 수 있다.
키트는 본 명세서에 기술된 방법의 사용을 용이하게 하도록 설계될 수 있으며 다양한 형태를 취할 수 있다. 해당되는 경우 키트의 각 조성물은 액체 형태(예를 들어, 용액) 또는 고체 형태(예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에, 조성물 중 일부는 예를 들어 키트에 제공되거나 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종(예를 들어, 물 또는 세포 배양 배지)을 첨가함으로써, 구성 가능하거나 다르게 가공가능할 수 있다(예를 들어, 활성 형태로). 일부 양상에서, 조성물은 보존 용액(예를 들어, 동결보존 용액)에 제공될 수 있다. 보존 용액의 비제한적인 예로는 DMSO, 파라포름알데하이드 및 CryoStor®(Stem Cell Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재)를 포함한다. 일부 양상에서, 보존 용액은 일정량의 메탈로프로테아제 억제제를 함유한다.
일부 양상에서, 키트는 하나 이상의 용기에 본 명세서에 기술된 구성요소 중 임의의 하나 이상을 함유한다. 따라서, 일부 양상에서, 키트는 본 명세서에 기술된 작용제를 담는 용기를 포함할 수 있다. 작용제는 액체, 겔 또는 고체(분말) 형태일 수 있다. 작용제는 멸균 상태로 제조되어 주사기에 포장되고 냉장으로 운송될 수 있다. 대안적으로, 저장을 위해 바이알 또는 다른 용기에 담길 수도 있다. 제2 용기에는 멸균 제조된 다른 작용제가 있을 수 있다. 대안적으로, 키트는 주사기, 바이알, 튜브 또는 기타 용기에서 사전 혼합되어 운송된 활성제를 포함할 수 있다. 키트에는 주사기, 국소 적용 디바이스 또는 IV 바늘 튜브 및 백과 같이, 대상체에게 작용제를 투여하는 데 필요한 구성 요소 중 하나 이상 또는 전부가 있을 수 있다.
추가 정의
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 기술된 본 발명의 다양한 특징은 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 개시내용은 또한 일부 양상에서, 본 명세서에 제시된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 제외되거나 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 예시하기 위해, 명세서에서 복합체가 구성 요소 A, B 및 C를 포함한다고 명시되는 경우, A, B 또는 C 중 임의의 것 또는 이들의 조합이 생략될 수 있고 단독으로 또는 임의의 조합으로 부인될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 모든 명시된 양상, 실시형태, 특징 및 용어는 언급된 양상, 실시형태, 특징 또는 용어 및 이들의 생물학적 등가물을 모두 포함하는 것으로 의도된다.
본 기술의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술 분야의 기술 내에 있는 유기 화학, 약리학, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (RI. Freshney, ed. (1987)]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "본질적으로 이루어지는"(및 문법적 변형)이라는 전환 문구는 언급된 물질 또는 단계 및 언급된 실시형태의 기본적이고 신규한 특징(들)에 중대한 영향을 미치지 않는 것을 포괄하는 것으로서 해석되어야 한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되어서는 안 된다. "이루어지는"은 미량보다 많은 다른 성분 및 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 양상은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 본 명세서에서 각 경우마다, "포함하는", "본질적으로 이루어지는" 및 "이루어지는"이라는 용어 중 임의의 것은 이들의 일상적인 의미를 유지하면서 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다.
본 발명의 요소 또는 이의 바람직한 실시형태(들)를 소개할 때, 영문의 관사 "a", "an", "the" 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 있음을 의미하는 것으로 의도된다. "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "갖는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 의도되며, 나열된 요소 외에 추가 요소가 있을 수 있음을 의미한다.
범위 형식의 기술은 단지 편의와 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 기술은 가능한 모든 하위범위, 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치도 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위에 대한 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등의 하위 범위, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 값 또는 범위는 또한 본 명세서에서 "약"으로서, "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지로 표현될 수도 있다. 이러한 값 또는 범위가 표현될 때, 개시된 다른 실시형태는 언급된 특정 값, 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 선행사 "약"을 사용하여 값이 근사치로서 표현되는 경우, 특정 값은 또 다른 실시형태를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에 개시된 다수의 값이 있으며, 각각의 값은 또한 값 자체에 더하여 "약" 해당 특정 값으로서 본 명세서에 개시되기도 한다는 것이 추가로 이해될 것이다. 실시형태에서, "약"은 언급된 값의 10% 이내, 언급된 값의 5% 이내, 또는 언급된 값의 2% 이내를 의미하는 데 사용될 수 있다.
범위를 포함하여, 모든 수치 지정, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 적절하게 1.0 또는 0.1의 증분씩 (+) 또는 (-)로 변동되거나, 또는 대안적으로 +/- 15%, 10%, 5%, 2%의 변동만큼 변동되는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되지는 않지만, 모든 수치 지정 앞에는 "약"이라는 용어가 선행되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 항상 명시적으로 언급되지는 않지만, 본 명세서에 기술된 시약은 단지 예시일 뿐이며 이와 등가물이 관련 기술 분야에 공지되어 있다는 것도 이해되어야 한다. 양 또는 농도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 지정된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 개시된 임의의 구성 요소, 범위, 용량 형태 등의 선택을 기술하기 위해 사용된 경우, 용어 "허용되는", "유효한" 또는 "충분한"은 상기 구성 요소, 범위, 용량 형태 등이 개시된 목적에 적합하다는 것을 의도한다.
또한, 본 명세서에 사용된 "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 가능한 임의의 및 모든 조합, 뿐만 아니라 대안적("또는")으로 해석되는 경우, 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
"조합"이라는 용어는 하나 이상의 활성 화합물 및 조합 파트너(예를 들어, 이하에 설명되는 또 다른 약물, "치료제" 또는 "공동작용제"라고도 지칭됨)가 동시에 독립적으로 또는 시간 간격 내에서 별도로 투여될 수 있는 조합 투여를 위해, 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합 또는 부품의 키트를 지칭한다. 일부 상황에서, 조합 파트너는 협력적인, 예를 들어, 상승작용적 효과를 보여준다. 본 명세서에서 활용된 용어 "공동 투여" 또는 "조합 투여" 등은 이를 필요로 하는 단일 대상체(예를 들어, 환자)에게 선택된 조합 파트너의 투여를 포괄하는 것으로 의미하며, 작용제가 반드시 동일한 투여 경로로 또는 동시에 반드시 투여되는 것은 아닌 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적 조합"은 하나보다 많은 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 초래되는 생성물을 의미하며 활성 성분의 고정 및 비고정 조합을 모두 포함한다. "고정 조합"이라는 용어는 활성 성분, 예를 들어, 화합물 및 조합 파트너가 모두 단일 실체 또는 투여량의 형태로 환자에게 동시에 투여된다는 것을 의미한다. 용어 "비고정 조합"은 활성 성분, 예를 들어, 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 별도의 실체로서 동시에, 병발적으로 또는 특정 시간 제한 없이 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 이러한 투여는 환자의 체내에서 두 화합물의 치료적으로 효과적인 수준을 제공한다. 후자는 칵테일 요법, 예를 들어, 3가지 이상의 활성 성분 투여에도 적용된다.
구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "숙주 세포"는 예를 들어 진균 세포, 효모 세포, 고등 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 숙주 세포를 포함한다. 진핵 숙주 세포의 비제한적 예로는 유인원, 소, 돼지, 뮤린, 래트, 조류, 파충류 및 인간, 예를 들어, HEK293 세포 및 293T 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자, 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다.
핵산의 "서열"은 핵산 내 뉴클레오타이드의 순서 및 정체를 지칭한다. 서열은 전형적으로 5'에서 3' 방향으로 판독된다. 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 정황에서 "동일한" 또는 "동일성" 백분율이라는 용어는 최대 상응도로 비교 및 정렬된 경우, 예를 들어, 관련 기술분야의 기술자에게 이용 가능한 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나, 또는 육안 조사로 측정했을 때 동일하거나 특정 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는 데 적합한 예시적인 알고리즘은 BLAST 프로그램이며, 이는 예를 들어 문헌[Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search" Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul et al. (1997) ""Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 및 Zhang et al. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation" Genome Res. 7:649-656]에 기술되어 있고, 각 문헌은 참조에 의해 원용된다. 많은 다른 최적의 정렬 알고리즘도 관련 기술분야에 공지되어 있으며 선택적으로 서열 동일성 백분율을 결정하는 데 활용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이 용어는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체 또는 중합체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"핵산" 또는 "핵산 분자"는 질소성 복소환 염기, 또는 염기 유사체를 갖는 2개 이상의 공유 결합된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하며, 여기서 뉴클레오사이드는 포스포다이에스테르 결합 또는 다른 결합에 의해 함께 연결되어 폴리뉴클레오타이드를 형성한다. 핵산은 RNA, DNA 또는 키메라 DNA-RNA 중합체 또는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들의 유사체를 포함한다. 핵산 백본은 당-포스포다이에스테르 연결, 펩타이드-핵산 결합, 포스포로티오에이트 연결, 메틸포스포네이트 연결 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 다양한 연결로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 공지된 치환(예를 들어, 2'-메톡시 치환 및 2'-할라이드 치환)을 갖는 리보스, 데옥시리보스 또는 유사 화합물일 수 있다. 질소성 염기는 통상적인 염기(A, G, C, T, U) 또는 이의 유사체(예를 들어, 이노신, 5-메틸아이소시토신, 아이소구아닌)일 수 있다. 핵산은 RNA 및 DNA에서 발견되는 통상적인 당, 염기 및 연결만을 포함할 수 있거나, 통상적인 성분 및 치환(예를 들어, 2'-메톡시 백본에 의해 연결된 통상적인 염기, 또는 통상적인 염기와 하나 이상의 염기 유사체의 혼합물을 포함하는 핵산)을 포함할 수 있다. 핵산에는 "잠긴 핵산"(LNA)이 포함될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 뉴클레오타이드 단량체는 RNA 모방 당 입체형태로 잠긴 이환식 푸라노스 단위를 가지며, 이는 단일 가닥 RNA(ssRNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 중 상보적 서열쪽으로 혼성화 친화성을 향상시킨다. 핵산은 핵산의 기능 또는 거동을 변경시키기 위해 변형된 염기를 포함할 수 있다(추가 뉴클레오타이드가 핵산에 첨가되지 못하도록 차단하는 3'-말단 다이데옥시뉴클레오타이드의 첨가). 핵산은 천연의 공급원으로부터 통상의 기술을 사용하여 정제할 수 있지만, 시험관내에서 핵산을 제조하는 합성 방법도 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
"유전자"는 특정 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 개방 판독 프레임(ORF)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. "유전자 생성물" 또는 대안적으로 "유전자 발현 생성물"은 유전자가 전사 및 해독될 때 생성되는 아미노산 서열(예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)을 지칭한다.
핵산은 전형적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥이며 일반적으로 포스포다이에스테르 결합을 함유할 것이지만, 일부 경우에는 본 명세서에서 개략된 바와 같이, 대체 백본을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함되며, 그 예로는 제한 없이, 포스포아미드[Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925 및 이 문헌의 참고문헌; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; 및 Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419; 각각 참조에 의해 원용됨], 포스포로티오에이트(Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; 및 미국 특허 제5,644,048호; 둘 모두 참조에 의해 원용됨), 포스포로다이티오에이트(Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 참조에 의해 원용됨), O-메틸포스포로아미다이트 연결(문헌[Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)] 참조; 참조에 의해 원용됨), 및 펩타이드 핵산 백본 및 연결(문헌[Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008; Nielsen (1993) Nature 365:566; 및 Carlsson et al. (1996) Nature 380:207] 참조; 각각 참조에 의해 원용됨)을 포함한다. 다른 유사체 핵산으로는 양하전된 백본(Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097, 참조에 의해 원용됨); 비이온성 백본(미국 특허 제5,386,023호, 제5,637,684호, 제5,602,240호, 제5,216,141호 및 제4,469,863호; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994) Bioorganic & Medicinal Chem: Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; 및 Tetrahedron Lett. 37:743 (1996), 각각 참조에 의해 원용됨) 및 비-리보스 백본, 예를 들어, 미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호, 및 문헌[Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook]에 기술된 것을 갖는 것을 포함하며, 문헌은 각각 참조에 의해 원용된다. 하나 이상의 탄소환식 당을 함유하는 핵산도 핵산의 정의에 포함된다(문헌[Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp 169-176] 참조, 참조에 의해 원용됨). 여러 핵산 유사체는 예를 들어 참조에 의해 원용되는 문헌[Rawls, C & E News Jun.2, 1997 page 35]에도 기술되어 있다. 리보스-인산 백본의 이러한 변형은 표지와 같은 추가 모이어티의 추가를 용이하게 하거나, 또는 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 변경하기 위해 수행될 수 있다.
핵산(예를 들어, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실)에서 전형적으로 발견되는 이러한 자연 발생의 복소환 염기에 더하여, 핵산 유사체는 또한 비-자연 발생의 복소환 또는 변형 염기를 갖는 것도 포함하며, 그 중 많은 것이 본 명세서에 기술되거나 달리 지칭되고 있다. 특히, 많은 비-자연 발생의 염기는, 예를 들어, 문헌[Seela et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, 및 Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640]에 상세히 기술되어 있고, 각 문헌은 참조에 의해 원용된다. 추가로 예시하기 위해, 용융 온도로서 작용하는 뉴클레오타이드에 사용되는 특정 염기(TO 개질제)가 선택적으로 포함된다. 예를 들어, 이들 중 일부는 7-데아자퓨린(예를 들어, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌 등), 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 프로피닐-dN(예를 들어, 프로피닐-dU, 프로피닐-dC 등) 등을 포함한다. 예를 들어, 1999년 11월 23일에 Seela에게 특허 허여된 "SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2'-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES"라는 명칭의 미국 특허 제5,990,303호를 참조하고, 이는 참조에 의해 원용된다. 기타 대표적인 복소환 염기로는 예를 들어 하이포잔틴, 이노신, 잔틴; 2-아미노퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 하이포잔틴, 이노신 및 잔틴의 8-아자 유도체; 아데닌, 구아닌, 2-아미노퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 하이포잔틴, 이노신 및 잔틴의 7-데아자-8-아자 유도체; 6-아자시토신; 5-플루오로시토신; 5-클로로시토신; 5-요오도시토신; 5-브로모시토신; 5-메틸시토신; 5-프로피닐시토신; 5-브로모비닐우라실, 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실; 5-브로모우라실; 5-트리플루오로메틸우라실; 5-메톡시메틸우라실; 5-에티닐우라실; 5-프로피닐우라실 등을 포함한다.
변형된 염기 및 뉴클레오타이드의 예는 또한 예를 들어 1996년 1월 16일자로 Froehler 등에게 특허 허여된 "OLIGONUCLEOTIDES CONTAINING 5-PROPYNYLPYRIMIDINES"라는 명칭의 미국 특허 제5,484,908호, 1997년 7월 8일자로 Froehler 등에게 특허 허여된 "ENHANCED TRIPLE-HELIX AND DOUBLE-HELIX FORMATION WITH OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED PYRIMIDINES"라는 명칭의 미국 특허 제5,645,985호, 1998년 11월 3일자로 Froehler 등에게 특허 허여된 "METHODS OF USING OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED PYRIMIDINES"이라는 명칭의 미국 특허 제5,830,653호, 2003년 10월 28일자로 Kochkine 등에게 특허 허여된 "SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES"라는 명칭의 미국 특허 제6,639,059호, 2001년 10월 16일자로 Skouv에게 특허 허여된 "ONE STEP SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES"이라는 명칭의 미국 특허 제6,303,315호, 및 2003년 5월 15일자로 공개된 Kochkine 등에 의한 "SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES"라는 명칭의 미국 특허 출원 공개 제2003/0092905호에도 기술되어 있고, 각각 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 2단계 공정, 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 해독되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"전사 제어 하에"는 관련 기술분야에서 잘 이해되어 있는 용어이며, 폴리뉴클레오타이드 서열, 일반적으로 DNA 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 전사를 촉진하는 요소에 작동 가능하게 연결되는 것에 달려 있음을 나타낸다. "작동적으로 연결된"은 폴리뉴클레오타이드가 세포 내에서 기능할 수 있도록 하는 방식으로 배열되는 것을 의도한다. 일 양상에서, 프로모터는 하류 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 및/또는 핵산 서열에 적용되는 경우, 용어 "암호화"는 자연 상태에 있거나 또는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 조작될 때 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편에 대한 mRNA를 생산하도록 전사될 수 있다면, 폴리펩타이드를 "암호화"한다고 하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 핵산 서열을 지칭한다. 안티센스 가닥을 이러한 핵산의 보체이며, 암호화 서열은 이로부터 추론될 수 있다.
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되며 가장 넓은 의미에서 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩타이드모방체의 2개 이상의 하위단위로 이루어진 화합물을 지칭한다. 하위단위는 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 양상에서, 하위단위는 다른 결합, 예를 들어, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 본 명세서에 사용된 용어 "아미노산"은 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭하며, 예를 들어, 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체 모두, 아미노산 유사체 및 펩타이드모방체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "신호 펩타이드" 또는 "신호 폴리펩타이드"는 새로 합성된 분비 또는 막 폴리펩타이드 또는 단백질의 N-말단 끝에 일반적으로 존재하는 아미노산 서열을 의도한다. 이는 폴리펩타이드를 특정 세포 위치, 예를 들어, 세포막을 거쳐 세포막 내로, 또는 핵 내로 유도하는 작용을 한다. 일부 양상에서, 신호 펩타이드는 국재화 후에 제거된다. 신호 펩타이드의 예는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 비제한적인 예는 미국 특허 제8,853,381호, 제5,958,736호 및 제8,795,965호에 기술된 것이다. 일부 양상에서, 신호 펩타이드는 IDUA 신호 펩타이드일 수 있다.
"등가물" 또는 "생물학적 등가물"이라는 용어는 특정 분자, 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭할 때 상호교환적으로 사용되며, 원하는 구조 또는 기능성을 유지하면서 최소 상동성을 갖는 물질을 의도한다. 등가의 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 기준 폴리펩타이드(예를 들어, 야생형 폴리펩타이드)에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 동일성 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는 기준 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 야생형 폴리뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 포함한다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩타이드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 동일성 백분율은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교하여 결정할 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산이 차지하고 있는 경우, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 서열 간의 동일성 정도는 서열에 의해 공유된 일치하는 위치 수의 함수이다. "비관련" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시내용의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 25% 미만의 동일성을 공유한다. 본 명세서에 제공된 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 정렬 및 서열 동일성 백분율은 상기 핵산 또는 아미노산 서열을 ClustalW(https://genome.jp/tools-bin/clustalw/에서 이용 가능)로 가져오고 이를 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 발견된 단백질 서열 정렬을 수행하는 데 사용된 ClustalW 매개변수는 Gonnet(단백질의 경우) 가중 행렬을 사용하여 생성했다. 일부 양상에서, 본 명세서에서 발견된 핵산 서열을 사용한 핵산 서열 정렬을 수행하는 데 사용된 ClustalW 매개변수는 ClustalW(DNA의 경우) 가중 행렬을 사용하여 생성한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 아미노산 변형은 아미노산 치환, 아미노산 결실 또는 아미노산 삽입일 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 대체(보존적 돌연변이, 보존적 치환 또는 보존적 변이라고도 함)는 주어진 아미노산을 생화학적 특성(예를 들어, 전하, 소수성 또는 크기)이 유사한 다른 아미노산으로 변화시킨 단백질의 아미노산 대체이다. 본 명세서에 사용된 "보존적 변이"는 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 또 다른 잔기로 대체한 것을 지칭한다. 보존적 변이의 예로는 아이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기가 다른 것 대신 치환된 것; 또는 하나의 하전된 또는 극성 잔기가 다른 것 대신 치환된 것, 예컨대, 라이신 대신 아르기닌의 치환, 아스파르트산 대신 글루탐산의 치환, 아스파라긴 대신 글루타민의 치환 등을 포함한다. 다른 예시적인 보존적 치환의 예로는 알라닌이 세린으로; 아스파라긴이 글루타민 또는 히스타딘으로; 아스파테이트가 글루타메이트로; 시스테인이 세린으로; 글리신이 프롤린으로; 히스티딘이 아스파라긴 또는 글루타민으로; 라이신이 아르기닌, 글루타민, 또는 글루타메이트로; 페닐알라닌이 티로신으로, 세린이 트레오닌으로; 트레오닌이 세린으로; 트립토판이 티로신으로; 티로신이 트립토판 또는 페닐알라닌으로 등과 같은 변화를 포함한다.
본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 세포 또는 조직으로 전달될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "유전자 전달", "유전자 전이", "형질도입" 등은 도입에 사용되는 방법에 관계없이 숙주 세포 내로 외인성 폴리뉴클레오타이드(때때로 "전이유전자"이라고도 함)의 도입을 지칭하는 용어이다. 이러한 방법으로는 벡터 매개 유전자 전이(예를 들어, 바이러스 감염/형질감염, 또는 다양한 기타 단백질 기반 또는 지질 기반 유전자 전달 복합체에 의함)와 같은 잘 알려진 다양한 기술, 뿐만 아니라 "네이키드(naked)" 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는 기술(예를 들어, 전기천공법, "유전자총" 전달 및 폴리뉴클레오타이드 도입에 사용되는 다양한 기타 기술)을 포함한다. 도입된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정적인 유지는 전형적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포와 화합성인 복제 기점을 함유하거나 염색체외 레플리콘(예를 들어, 플라스미드)과 같은 숙주 세포의 레플리콘 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체 내로 통합되는 것을 필요로 한다. 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 명세서에 기술된 바와 같이, 포유동물 세포로 유전자 전이를 매개할 수 있는 벡터로는 다수가 알려져 있다.
"플라스미드"는 전형적으로 염색체 DNA와 분리되어 있고 독립적으로 복제할 수 있는 DNA 분자이다. 많은 경우 원형이며 이중 가닥이다. 플라스미드는 미생물 집단 내에서 수평적 유전자 전이를 위한 메커니즘을 제공하며 전형적으로 주어진 환경 상태 하에서 선택적인 이점을 제공한다. 플라스미드는 경쟁적인 환경 틈새에서 자연 발생의 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자를 운반할 수 있거나, 대안적으로 생산된 단백질은 유사한 상황에서 독소로 작용할 수 있다. 플라스미드 벡터는 염색체외 원형 DNA 분자로서 종종 존재하는 반면, 플라스미드 벡터는 또한 무작위로 또는 표적화된 방식으로 숙주 염색체에 안정적으로 통합되도록 설계될 수 있으며, 이러한 통합은 원형 플라스미드 또는 숙주 세포 내로 도입 전에 선형화된 플라스미드를 사용하여 달성될 수 있다.
유전자 공학에 사용되는 "플라스미드"는 "플라스미드 벡터"로 불린다. 이러한 용도에 많은 플라스미드가 상업적으로 이용 가능하다. 복제되는 유전자는 특정 항생제에 대해 세포가 내성적이게 만드는 유전자 및 여러 일반적으로 사용되는 제한 부위를 함유하여 이 위치에서 DNA 단편의 용이한 삽입을 허용하는 짧은 영역인 다중 클로닝 부위(MCS, 또는 폴리링커)를 함유하는 플라스미드의 카피 내로 삽입된다. 플라스미드의 또 다른 주요 용도는 다량의 단백질을 만드는 것이다. 이 경우, 연구자들은 관심 유전자를 수용한 플라스미드를 함유하는 박테리아 또는 진핵 세포를 성장시키며, 이는 삽입된 유전자로부터 다량의 단백질이 생산되도록 유도될 수 있다.
유전자 전이가 아데노바이러스(Ad) 또는 아데노-연관 바이러스(AAV)와 같은 DNA 바이러스 벡터에 의해 매개되는 양상에서, 벡터 작제물은 바이러스 게놈 또는 이의 일부, 및 전이유전자를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
용어 "조직"은 살아 있거나 죽은 유기체의 조직, 또는 살아 있거나 죽은 유기체로부터 유래되거나 이를 모방하도록 설계된 임의의 조직을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 조직은 건강할 수도 있고 질환에 걸릴 수도 있으며/또는 유전자 돌연변이를 가질 수도 있다. 생물학적 조직은 임의의 단일 조직(예를 들어, 상호연결될 수 있는 세포의 집합), 또는 유기체 신체 중 기관, 또는 부분 또는 영역을 구성하는 조직 그룹을 포함할 수 있다. 조직은 균질한 세포 물질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있거나, 예를 들어, 폐 조직, 골격 조직 및/또는 근육 조직을 포함할 수 있는 흉부를 포함하는 신체 영역에서 발견되는 것과 같은 복합 구조일 수 있다. 예시적인 조직으로는 간, 폐, 갑상선, 피부, 췌장, 혈관, 방광, 신장, 뇌, 담도계, 십이지장, 복부 대동맥, 장골 정맥, 심장 및 장으로부터 유래되는 조직, 예를 들어, 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)은 우심실 기능 장애, 뿐만 아니라 최근 좌심실 기능 장애, 심실 부정맥을 초래하는 심근의 섬유지방 대체 및 젊은 사람과 운동선수의 심장 돌연사를 특징으로 하는 주로 유전자 기반 심장 질환이다(1). ARVC는 65세 이하 사람의 심장 돌연사의 10%, 30세 이하 사람의 24%를 담당한다(2, 3). ARVC는 1000 내지 5000명 중 1명꼴로 발생하는 것으로 생각되지만, 일부 환자는 진단 지표가 좋지 않아 진단되지 않거나 오진되기 때문에 유병률이 더 높을 수 있다(4, 5). 또한, 유아부터 십대 어린이에 이르는 소아 집단이 ARVC에 특히 취약하기 때문에 발병이 더 일찍 시작된다는 증거가 늘어나고 있으며(6 내지 10), 이는 질환의 초기 단계에서 환자를 식별하고 치료해야 하는 중대한 필요성을 강조한다.
지난 10년 동안 ARVC는 40 내지 50% 사례가 데스모솜(데스모글레인-2, 데스모콜린-2, 플라코글로빈, 플라코글로빈-2, 데스모플라킨)과 연관된 다수의 유전자의 돌연변이/결핍과 연계되어 있기 때문에 심장 데스모솜(특정 세포-세포 접합)의 질환으로서 인식되었고, 따라서 단일 유전자 질환으로 간주되지 않았다(11). 이 질환에 중대한 것은 데스모솜 복합체의 한 구성 요소의 돌연변이/결핍이 데스모솜 복합체의 다른 구성원뿐만 아니라 심장 세포-세포 접합의 다른 부분(수축 기구에 연결된 접합막 접합 및 전기적 커플링에 연계된 갭 접합)에 파괴적인 계단식 영향을 미친다는 것이고, 이는 ARVC의 기본이 되는 심장의 구조적 및 전기적 결함을 유도한다. 기능적으로 중요한 이웃 세포 접합 구성 요소와 함께 데스모솜 복합체의 계층적 용해는 단지 데스모솜 자체만이 아니라 전체 심장 세포-세포 접합 복합체에 대한 회복 효과를 표적으로 하는 전략에 대한 필요성을 강조한다. 본 개시내용은 심장 세포-세포 접합 복합체를 재조립하고 ARVC 질환 발병을 예방하기 위한 단일 유전자 전략(플라코필린-2)을 입증하는 연구를 제공한다.
본 발명은 PKP2 cDNA를 전달하고 궁극적으로 심장의 PKP2 단백질 수준을 증가시키는 표적 유전자 치료법이다(도 1a 내지 도 1c). 이 유전자 치료법은 심근세포-특이적 발현을 유도하기 위해 심근친화성 AAV 혈청형 9(AAV9) 또는 AAVrh10, 뿐만 아니라 심장-특이적 프로모터 심장 트로포닌 T를 활용한다(도 1b 내지 도 1c; 도 8a). PKP2 발현은 심장 데스모솜을 효과적으로 재조립할 수 있고(도 2; 도 3a 내지 도 3b; 도 6f; 도 7b; 도 8a, 도 8e), 이는 ARVC의 기본이 되는 심장 세포-세포 접합 결함을 회피하기 위한 분자 스캐폴드 역할을 한다. PKP2는 데스모솜 뿐만 아니라 기타 세포-세포 접합 복합체(gap 접합 및 접착역 접합)를 안정화시키고, 이는 질환 진행의 기본이 되는 하류 캐스캐이딩 결함이다(도 2; 도 3a 내지 도 b; 도 6f; 도 7b; 도 8a, 도 8e). AAV9 PKP2 유전자 치료법은 질환 발병 전 초기 전달을 통한 예방법으로서 기능할 수 있거나, 또는 기존 질환이 있는 환자의 질환 진행을 중단시키는 기능을 할 수 있다(도 3c; 도 4; 도 5; 도 6a 내지 도 6f; 도 7d, 도 7e; 도 8b 내지 도 8d).
본 개시내용은 PKP2 돌연변이 신생아 심근세포에 대한 PKP2를 포함하는 AAV 벡터를 사용한 치료가 세포-세포 접합 단백질 수준(PKP2, DSP, DSG2, JUP, CX43)을 개선시켰음을 보여주는 연구를 제공한다(도 1a, 도 2). 본 개시내용은 생체내 심장에서 심장 트로포닌 T 프로모터의 제어 하에 PKP2를 성공적으로 발현할 수 있는 PKP2를 암호화하는 서열을 포함하는 AAV9 또는 AAVrh10 벡터를 제공한다(도 1b 내지 도 c; 도 8a). PKP2 돌연변이 마우스의 출생 후 2일차에 AAV9 PKP2의 5×1011개 바이러스 입자를 1회 복강내 주사를 수행했다(도 3). 주사 후 4주째에 심장 용해물을 웨스턴 블롯을 통해 분석했고, AAV9 PKP2 투여가 세포-세포 접합 단백질(PKP2, DSP, DSG2, JUP, CX43)의 수준을 개선시킬 수 있음을 발견했다(도 3b). 초기 AAV9 PKP2 주사는 또한 4주령에 ARVC 질환 발병을 예방할 수 있었고(도 3c), 이는 심장의 기계적 및 전기적 기능이 보존되고 심근의 유의미하게 적은 섬유증, 및 연장된 생존이 있었기 때문이다(도 4; 도 5; 도 6a). 세포-세포 접합 단백질 수준, 심장의 기계적 기능 및 심장의 전기적 기능은 AAV9 PKP2 주사 후 6개월째에도 여전히 보존되었고(도 6b 내지 도 6f), 이는 ARVC 질환 발병에 대한 PKP2 유전자 치료법의 지속적인 영향을 강조한다. PKP2 돌연변이 마우스도 모든 질환 특징이 존재하는 시점(4주령)에 AAV9 PKP2로 치료되었고, AAV9 GFP를 투여받은 PKP2 돌연변이 마우스와 비교하여 PKP2 돌연변이 마우스에서 AAV9 PKP2 주사 후 2주째에 심장의 세포-세포 접합 단백질(PKP2, DSP, DSG2, JUP, N-Cad) 및 심장의 기계적 기능의 개선(LV/RV 박출률의 약 15% 개선)을 보여주었다(도 7).
AAVrh10 캡시드화된 PKP2 rAAV 벡터를 사용한 연구도 수행했다. 이들 연구는 AAV9 및 AAVrh10 벡터 혈청형을 포함하는 본 개시내용의 AAV 벡터가 성체 마우스 심장에서 인간 PKP2 단백질을 안정적으로 발현할 수 있고 PKP2 Hom 마우스에서 ARVC 질환 결과를 회피할 수 있음을 입증한다. 도 8a는 주사되지 않은 야생형 대조군과 비교했을 때 5e13 vg/kg 용량의 AAV9를 사용하여 성체 야생형 대조군 마우스의 심장에서 hPKP2가 빠르게는 10일에 발현될 수 있다는 웨스턴 블롯 분석을 보여준다(마우스 PKP2에 상응하는 내인성의 더 느린 이동성 밴드에 대비하여 hPKP2에 상응하는 더 빠른 이동성 크기의 밴드를 주목한다). 웨스턴 블롯 분석은 5e13 vg/kg의 용량에서 AAVrh10을 사용하여 성체 PKP2 이종접합성(HET) 돌연변이체 마우스의 심장에서 감염후 21일차에 hPKP2 발현이 더욱 강력해진다는 것을 추가로 보여준다. 비록 낮은 수준이기는 하지만 간에서도 hPKP2의 발현이 검출될 수 있다. 또한, AAVrh10-hPKP2는 성체 PKP2 Het 심장에서 PKP2에 대한 즉각적인 결합 파트너인 데스모플라킨(DSP) 수준을 안정화시키기 때문에 "표적" 효과를 갖는다. 야생형 대조군 비주사 마우스와 비교했을 때 DSP 수준은 대조군 수준으로 회복된다. GAPDH와 베타-액틴은 로딩 대조군으로 역할을 했다. 이러한 데이터는 AAV9 및 AAVrh10-PKp2 작제물이 성체 마우스 심장에서 발현되고 AAVrh10-PKP2가 성체 PKP2 Het 마우스 심장의 심장 데스모솜에서 결손을 기능적으로 구제한다는 것을 보여준다.
도 8b는 PKP2 Hom 마우스에서 제형 및 hPKP2(AAV9 및 AAVrh10을 통해)의 초기 투여(출생 후 2일(P2)) 이후 4주 생존 곡선을 보여준다. AAV9-hPKP2 및 AAVrh10-hPKP2는 제형 처리된 PKP2 Hom 마우스에서 관찰되는 PKP Hom 마우스의 조기 사망을 예방하는데 충분함을 유의한다. n=5 AAVrh10hPKP2, n=5 Hom-AAV9 PKP2, n=5 제형.
도 8c는 표면 ECG 분석과 제형 및 hPKP2(AAV9 및 AAVrh10을 통해)의 초기 투여(P2) 후 PKP2 Hom 마우스에서 이소성 박동/조기 심실 수축(PVC)의 막대 그래프 분석을 보여준다. AAV9-hPKP2(n=2) 및 AAVrh10-hPKP2(n=4)는 PKP Hom 마우스에서 조기 심실 수축을 예방하기에 충분한데, 그 이유는 4주령까지 이들 그룹에서 PVC가 전혀 관찰되지 않았기 때문임을 유의한다. 이와 대조적으로, 4주령째에 3마리의 제형 처리된 PKP2 Hom 마우스 중 2마리에서는 조기 사망이 관찰되었다. n=4 AAVrh10 hPKP2, n=2 Hom-AAV9 PKP2, n=3 제형.
도 8d는 야생형 대조군 미처리된 마우스, 제형으로 처리된 PKP2 Hom, AAV9-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom 및 AAVrh10-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom으로부터의 확장기말에 자기 공명 영상의 대표적인 심장 단축 외관을 보여준다. 우심실(RV) 및 좌심실(LV) 치수는 확장기말에 각 그룹에서 색상으로 윤곽이 표시된다. 제형 처리된 마우스와 비교할 때 AAVrh10-hPKP2로 처리된 PKP2 Hom에서 RV 및 LV 치수가 크게 감소한 것을 유의한다. 제형 처리된 마우스와 비교할 때 AAVrh10-hPKP2로 처리된 PKP2 Hom에서 LV 치수가 크게 감소한 것을 유의한다.
도 8e는 야생형 대조군 미처리 마우스, 제형으로 처리된 PKP2 Hom, AAV9-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom 및 AAVrh10-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom으로부터의 심장에서 PKP2 및 세포-세포 접합 단백질(데스모플라킨(DSP), 데스모글레인-2(DSG2), 코넥신43(Cx43), N-카드헤린(NCAD), 플라코글로빈(JUP))의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. AAV9-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom 및 AAVrh10-hPKP2를 처리한 PKP2 Hom에서 DSP, DSG2, Cx43(제형 처리된 마우스에서 발견되는 이의 분해 형태와 비교하여), JUP의 심장 단백질 발현에 대한 유의미한 상승조절은 hPKP2 처리된 PKP2 Hom 심장에서 심장 세포-세포 접합 용해의 예방을 강조한다는 점에 유의한다. GAPDH는 로딩 대조군으로서 사용된다. 사망한 제형 처리된 마우스는 별표로 표시됨을 유의한다.
ARVC용 치료제:
1) PKP2는 ARVC 환자의 PKP2 수준을 회복시키는 수단으로서 PKP2 cDNA를 함유하는 아데노-연관 바이러스 벡터를 생성함으로써 ARVC 치료법의 표적이 될 수 있다.
2) PKP2는 ARVC 환자에서 PKP2 기능을 회복시키는 수단으로서 PKP2의 새로운 직접적인 약리학적 활성인자를 개발함으로써 ARVC 치료법의 표적이 될 수 있다.
3) PKP2는 ARVC 환자에서 세포-세포 접합 복합체 재조립을 회복하기 위해 PKP2 기능의 하류 경로를 표적으로 하는 약물을 개발하거나 활용함으로써 ARVC 치료법의 표적이 될 수 있다.
참고문헌
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gagatatgct 1200 cgttccgaga tcgtgggggt cagccgtgct ggcaccacaa gcaggcagcg ccactttgac 1260 acataccaca gacagtacca gcatggctct gttagcgaca ccgtttttga cagcatccct 1320 gccaacccgg ccctgctcac gtaccccagg ccagggacca gccgcagcat gggcaacctc 1380 ttggagaagg agaactacct gacggcaggg ctcactgtcg ggcaggtcag gccgctggtg 1440 cccctgcagc ccgtcactca gaacagggct tccaggtcct cctggcatca gagctccttc 1500 cacagcaccc gcacgctgag ggaagctggg cccagtgtcg ccgtggattc cagcgggagg 1560 agagcgcact tgactgtcgg ccaggcggcc gcagggggaa gtgggaatct gctcactgag 1620 agaagcactt tcactgactc ccagctgggg aatgcagaca tggagatgac tctggagcga 1680 gcagtgagta tgctcgaggc agaccacatg ctgccatcca ggatttctgc tgcagctact 1740 ttcatacagc acgagtgctt ccagaaatct gaagctcgga agagggttaa ccagcttcgt 1800 ggcatcctca agcttctgca gctcctaaaa gttcagaatg aagacgttca gcgagctgtg 1860 tgtggggcct tgagaaactt agtatttgaa gacaatgaca acaaattgga ggtggctgaa 1920 ctaaatgggg tacctcggct gctccaggtg ctgaagcaaa ccagagactt ggagactaaa 1980 aaacaaataa caggtttgct gtggaatttg tcatctaatg acaaactcaa 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Claims (35)

  1. 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터로서, 5'에서 3' 방향으로,
    a) 제1 AAV ITR 서열;
    b) 프로모터 서열;
    c) 플라코필린-2(PKP2) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이유전자 핵산 분자;
    d) 전사후 조절 요소;
    e) 폴리A 서열; 및
    f) 제2 AAV ITR 서열
    을 포함하는, rAAV 벡터.
  2. 서열번호 9, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 29, 또는 서열번호 30에 제시된 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PKP2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 14에 제시된 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 AAV ITR 서열은 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 25에 제시된 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 AAV ITR 서열은 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 25에 제시된 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 심장 특이적 프로모터 서열인, rAAV 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로, RSV 인핸서와 함께), 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, CAG 프로모터, 혼성체 닭 β-액틴 프로모터, MeCP2 프로모터, EF1 프로모터, 편재적인 닭 β-액틴 혼성체 (CBh) 프로모터, U1a 프로모터, U1b 프로모터, MeCP2 프로모터, MeP418 프로모터, MeP426 프로모터, 최소 MeCP2 프로모터, VMD2 프로모터, mRho 프로모터, EFla 프로모터, Ubc 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, TRE 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, Gal1 프로모터, TEF1 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, Ubi 프로모터 또는 α-1-항트립신(hAAT) 프로모터를 포함하는, rAAV 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 심장 트로포닌 T(cTnT) 프로모터 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 cTnT 프로모터 서열은 서열번호 2에 제시된 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리A 서열은 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열이 서열번호 6에 제시된 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사후 조절 요소는 oPRE 전사후 조절 요소인, rAAV 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 oPRE 전사후 조절 요소는 서열번호 5, 서열번호 27, 또는 서열번호 28에 제시된 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 5'에서 3' 방향으로,
    a) 서열번호 7에 제시된 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV ITR 서열;
    b) 서열번호 2에 제시된 핵산 서열을 포함하는 프로모터 서열;
    c) 전이유전자 핵산 분자로서, 상기 전이유전자 핵산 분자는 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 PKP2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 4에 제시된 핵산 서열을 포함하는 것인, 전이유전자 핵산 분자;
    d) 서열번호 5에 제시된 핵산 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
    e) 서열번호 6에 제시된 핵산 서열을 포함하는 폴리A 서열; 및
    f) 서열번호 8에 제시된 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV ITR 서열
    을 포함하는, rAAV 벡터.
  16. rAAV 바이러스 벡터로서,
    (i) AAV 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터
    를 포함하는, rAAV 바이러스 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 AAV 캡시드 단백질은 AAV1 캡시드 단백질, AAV2 캡시드 단백질, AAV4 캡시드 단백질, AAV5 캡시드 단백질, AAV6 캡시드 단백질, AAV7 캡시드 단백질, AAV8 캡시드 단백질, AAV9 캡시드 단백질, AAV10 캡시드 단백질, AAV11 캡시드 단백질, AAV12 캡시드 단백질, AAV13 캡시드 단백질, AAVPHP.B 캡시드 단백질, AAVrh74 캡시드 단백질 또는 AAVrh10 캡시드 단백질인, rAAV 바이러스 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 또는 AAVrh10 캡시드 단백질인, rAAV 바이러스 벡터.
  19. 약제학적 조성물로서,
    a) 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV 바이러스 벡터; 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 첨가제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. PKP2 유전자를 수반하는 질환 및/또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 치료 유효량의 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV 바이러스 벡터 또는 제19항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, PKP2 유전자를 수반하는 상기 질환 및/또는 장애는 비정상적인 심장 세포-세포 접합 복합체를 특징으로 하는 심혈관 질환인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, PKP2 유전자를 수반하는 상기 질환 및/또는 장애는 부정맥유발 우심실 심근병증(ARVC)인, 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 유효량은 상기 대상체의 전기적 및 구조적 심장 완전성을 개선시키는, 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 유효량은 상기 대상체에서 세포-세포 접합 단백질을 구제하고 재조립하는, 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 유효량은 상기 대상체의 심장 기능을 개선시키는, 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 유효량은 상기 대상체에서 ARVC를 예방하기 위해 전기적 및 구조적 완전성을 보존하는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 벡터 또는 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체에게 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 2.5×1014 vg/kg 범위의 용량으로 투여되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 벡터 또는 상기 약제학적 조성물은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 5.0×1013 vg/kg 범위의 용량으로 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 벡터 또는 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체에게 정맥내, 척수강내, 뇌내, 심실내, 비강내, 기관내, 귀내, 안구내 또는 안구주위, 경구, 직장, 경점막, 흡입, 경피, 비경구, 피하, 피내, 근육내, 수조내, 신경내, 흉막내, 국소, 림프내, 수조내 또는 신경내로 투여되는, 방법.
  30. 치료를 필요로 하는 대상체에서 PKP2 유전자를 수반하는 질환 및/또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 바이러스 벡터 또는 제18항에 따른 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, PKP2 유전자를 수반하는 상기 질환 및/또는 장애는 ARVC인, 용도.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 벡터 또는 상기 약제학적 조성물은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 2.5×1014 vg/kg 범위의 용량으로 상기 대상체에게 투여하기 위한 것인, 용도.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 벡터 또는 상기 약제학적 조성물은 약 1.0×1012 vg/kg 내지 약 5.0×1013 vg/kg 범위의 용량으로 상기 대상체에게 투여하기 위한 것인, 용도.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 벡터 또는 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체에게 정맥내, 척추강내, 뇌내, 심실내, 비강내, 기관내, 귀내, 안구내 또는 안구주위, 경구, 직장, 경점막, 흡입, 경피, 비경구, 피하, 피내, 근육내, 수조내, 신경내, 흉막내, 국소, 림프내, 수조내 또는 신경내로 투여하기 위한 것인, 용도.
  35. 제34항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 벡터 또는 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여용인, 용도.
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