CN113181218A - 人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用 - Google Patents

人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用。本发明以大鼠为研究对象，采用子宫全层组织部分切除的方式建立大鼠子宫瘢痕模型，并通过瘢痕原位注射及腹腔注射hAECs进行细胞移植，并收集移植后的子宫瘢痕，进行组织学实验，免疫组织化学染色与蛋白免疫印记(western blot)实验并对移植后子宫瘢痕大鼠进行生育实验。证明了人羊膜上皮细胞对大鼠子宫瘢痕处的受损内膜与肌层具有修复作用，并且可以改善子宫瘢痕部位的生育结局。为今后临床修复子宫瘢痕提供新的有效选择。

Description

人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用
技术领域
本发明涉及细胞制剂技术领域，尤其涉及人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用。
背景技术
子宫是女性的生殖器官之一，具有孕育胎儿的重要作用。子宫组织损伤对女性生育力及生活质量造成严重影响。近年来，剖宫产率在全球范围内呈显著上升的趋势。研究表明，2015年全球剖宫产率约为21.1％，已增加长至2000年(12.1％)的近两倍，而这种增长趋势在中国和巴西两国尤为显著。随着剖宫产率剧增，剖宫产术后的远期并发症如剖宫产术后子宫瘢痕缺损(CSD)也逐渐引起重视。CSD是指子宫下段剖宫产术后因切口局部组织愈合不良所形成的，一端与宫腔内膜相通，另一端指向子宫浆膜层的空腔，故又称憩室。CSD的病理结构特点为子宫切口瘢痕处的胶原纤维沉积而肌纤维显著减少。
CSD临床表现包括严重的妇科症状，不孕与再次生育相关的产科不良结局，严重影响女性生活质量。随着中国二胎政策的全面开放，CSD女性再生育的需求也急剧增加，而CSD所导致的再生育相关问题急待解决。目前，CSD的临床治疗手段包括保守治疗与手术治疗，但仍未建立统一标准治疗方案。手术将无可避免地带来创伤或可能造成子宫穿孔或膀胱损伤等并发症，同时，对术者的要求较高。因此，为了促进CSD患者的生育力修复以及临床症状缓解，需要探索一种操作简便、创伤小、疗效可靠的新型治疗方案。
人羊膜上皮细胞(hAECs)是一种围产期干细胞，具有易于获取，提取率高，无伦理风险，免疫原性低及致瘤的风险低等优点。由于其独特的组织胚胎学来源，hAECs具有多向分化潜能。近来的研究发现hAECs也具备间充质干细胞特有的旁分泌作用，可通过分泌多种细胞因子、生长因子发挥生物学作用。目前已报道hAECs在肺纤维化、肝纤维化、中枢神经系统疾病等疾病治疗中具有应用前景。但在妇产科疾病方面还鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用。
进一步地，所述子宫瘢痕为女性剖宫产术后子宫瘢痕缺损。
进一步地，所述细胞制剂包括活性成分人羊膜上皮细胞和药学可接受的载体。
进一步地，所述药学可接受的载体为磷酸缓冲液、生理盐水、脐带血清或全血清中的一种或几种组合。
进一步地，所述药学可接受的载体还包括人工支架。
进一步地，所述人工支架为聚乳酸、聚乙醇酸、明胶海绵中的一种或几种组合。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明以大鼠为研究对象，采用子宫全层组织部分切除的方式建立大鼠子宫瘢痕模型，并通过瘢痕原位注射及腹腔注射hAECs进行细胞移植，并收集移植后的子宫瘢痕，进行组织学实验，免疫组织化学染色与蛋白免疫印记(western blot)实验并对移植后子宫瘢痕大鼠进行生育实验。证明了人羊膜上皮细胞对大鼠子宫瘢痕处的受损内膜与肌层具有修复作用，并且可以改善子宫瘢痕部位的生育结局。为今后临床修复子宫瘢痕提供新的有效选择。
附图说明
图1为人羊膜上皮细胞表达特异性表面分子并具有低免疫原性与干细胞特性结果图，其中，A为光镜下羊膜上皮细胞具有典型的铺路石样的上皮细胞形态，标尺＝100μm；B为标记CFSE后的hAECs在荧光显微镜下发出绿色荧光，标记成功率约100％，标尺＝100μm；C-F为流式细胞术检测hAECs的细胞表面分子的表达情况；G为免疫荧光染色结果示hAECs的上皮标志分子CK18阳性，而间质标志分子Vimentin阴性，标尺＝200μm；
图2为大鼠子宫瘢痕模型的建立，其中，A为大鼠子宫瘢痕模型的实验设计流程图；B为大鼠子宫瘢痕模型建立与处理模式图，于子宫角作一长1.0cm×宽0.5cm的全层组织切除伤口，同时保留系膜，30天后子宫瘢痕形成，再进行hAECs移植；C为大鼠子宫瘢痕的大体照片；D为损伤30天后的子宫瘢痕模型的横截面HE染色结果，图a为模型组，图b为shamgroup，标尺＝500μm；E为损伤30天后的子宫瘢痕的横截面Masson染色结果，标尺＝200μm；
图3为hAECs促进子宫瘢痕的内膜及肌层的修复，其中，A为细胞移植后30天及60天子宫瘢痕的HE染色结果，标尺＝500μm；B为子宫瘢痕的内膜厚度的统计结果；C为子宫瘢痕的内膜腺体的统计结果；D为移植后30天及60天的子宫瘢痕的α-SMA的免疫组织化学染色结果，图示为假手术组(sham group)，PBS组，及hAECs组的结果，标尺＝500μm；E为α-SMA阳性区域百分比的统计结果，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS；
图4为hAECs移植后再子宫瘢痕中的定位；
图5为体内移植早期hAECs保持上皮表型；
图6为hAECs通过上调MMP-8的表达促进瘢痕处胶原降解，其中，A为Masson染色；B为移植后30天及60天sham组，PBS组及hAECs组的MMP-8免疫组化染色结果；C为MMP-8染色的半定量统计结果；D为Western blot法检测移植5天后子宫瘢痕部分的MMP-8的蛋白表达水平；E为Western blot结果的灰度值统计结果，MMP-8的表达水平通过β-tubulin表达量进行标化，**P<0.01，***P<0.001；
图7为大鼠子宫瘢痕组织的氧化应激损伤上调；其中，A采用免疫组织化学技术检测sham组(a,c)和子宫瘢痕模型组(b,d)中4-HNE的表达水平；B采用免疫组织化学技术检测sham组(a,c)和子宫瘢痕模型组(b,d)中4-HNE的表达水平；C-D通过高倍镜下计数染色呈阳性的细胞百分比对4-NHE和8-OHdG的表达水平进行半定量统计的结果，**P<0.01，***P<0.001；
图8为hAECs经过氧化氢体外刺激后上调表达MMP-8，其中，A为CCK8法检测经不同浓度过氧化氢刺激后的hAECs细胞活力，结果是在25μM H2O2处理12小时后的hAECs细胞活力升高，然而随着过氧化氢浓度增加细胞活力降低；B为25μM过氧化氢处理hAECs 12小时后，收集细胞上清及hAECs细胞，ELISA法检测细胞上清的总MMP-8的表达水平；C为WesternBlot法检测经过氧化氢处理(25μM，12小时)的hAECs细胞中MMP-8的表达水平；D为MMP-8蛋白相对表达量的统计结果；
图9为hAECs促进子宫瘢痕的血管修复；其中，A为移植30天及60天后子宫瘢痕的vWF的免疫组化实验的结果示各组的子宫瘢痕组织的血管密度；B为移植30天及60天后子宫瘢痕组织的VEGFA的IHC结果；C为vWF的免疫组化实验的统计结果；D为子宫瘢痕组织的VEGFA表达水平在高倍镜下的半定量统计结果；E为Western blot法检测移植后5天后子宫瘢痕组织的VEGFA表达水平；F为Western blot结果相对灰度值的统计结果(n＝5)，VEGFA的表达水平通过β-tubulin表达量进行标化；
图10为子宫瘢痕大鼠造模90天后的妊娠试验子宫形态结果图；
图11为子宫瘢痕大鼠造模90天后的妊娠试验胚胎总数统计图；
图12为子宫瘢痕大鼠造模90天后的妊娠试验子宫瘢痕部位胚胎数量统计图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1 hAECs修复大鼠子宫瘢痕模型受损内膜与子宫肌层
来源于人羊膜的hAECs体外培养后在光镜下呈现典型的鹅卵石样排列形态(图1A)。为了鉴定hAECs的细胞特性，对hAECs进行了流式细胞术检测与免疫荧光染色。流式细胞术结果示hAECs的表面干细胞标志SSEA4与上皮标志CD324阳性，然而间质标志CD146与免疫原性指标HLADR为阴性(图1C-F)。免疫荧光染色结果示hAECs表达上皮标志分子细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)，然而不表达间质标志分子波形蛋白(Vimentin)(图1G)。此外，为追踪hAECs移植后在大鼠体内的分布，在细胞移植前用CFSE(carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester)对hAECs进行体外标记，结果示hAECs标记后在荧光显微镜下呈绿色荧光，其标记阳性率达约100％(图1B)。
通过切除子宫全层诱导瘢痕形成的方法建立大鼠子宫瘢痕模型，切除的组织为沿长轴1.0cm，横截面周长的1/2-2/3的全层子宫，并在余四边作黑色线结标记(图2C)。同时，设置了仅开腹未损伤子宫的假手术组(sham组)。损伤后30天收集子宫瘢痕组织并进行HE(Haematoxylin and eosin,HE)染色和Masson染色。结果示与sham组相比，模型组的大鼠子宫肌层呈连续性中断，内膜厚度减少，并且在瘢痕处有大量纤维组织沉积，表明子宫瘢痕大鼠模型已成功建立(图2D-E)。此时，对已形成子宫瘢痕的大鼠进行二次手术，使用显微注射器于子宫瘢痕原位处肌层进行106hAECs子宫肌层注射治疗，且于次日进行hAECs腹腔注射一次。同时，还设置了仅注射PBS的阴性对照组与子宫完整且未行二次手术的sham组(图2A)。
为评估hAECs对大鼠子宫瘢痕的修复作用，分别于移植后30天及60天收集大鼠子宫瘢痕组织样本，石蜡包埋后进行HE染色(图3A)。结果如图3B-C所示，移植30天后，hAECs组的子宫内膜厚度与腺体数量显著高于PBS组。移植60天后，hAECs组的内膜厚度也显著大于PBS组，但均小于sham组。移植60天后，hAECs组的腺体数量与PBS组无统计学差异。子宫肌层是子宫瘢痕修复的另一个重要指标，通过免疫组织化学检测子宫瘢痕组织α-SMA的表达水平并计算阳性面积百分比，进而评估肌层修复情况。结果如图3D-E所示，移植30天及60天后，hAECs组子宫瘢痕处α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达水平均显著高于PBS组。
为验证hAECs成功移植于子宫瘢痕处并观察分布情况，将CFSE标记的hAECs进行子宫瘢痕移植，并于移植后1,2,3天进行子宫瘢痕组织收集，冰冻包埋与荧光显微镜下观察。结果如图4所示，移植后1,2,3天在子宫疤痕组织处均分布有发出绿色荧光的hAECs，并且细胞聚集子宫组织的外层。此外，免疫荧光染色结果示，子宫瘢痕组织处的hAECs表达上皮标志分子CK18，而不表达间质标志分子Vimentin(图5)。
综上，人羊膜上皮细胞对大鼠子宫瘢痕处的受损内膜与肌层具有修复作用。
实施例2 hAECs促进大鼠子宫瘢痕处胶原降解并上调MMP-8的表达
胶原组织沉积是子宫瘢痕的重要特征。为评估hAECs对子宫疤痕组织的胶原降解作用，对瘢痕组织的石蜡切片进行了Masson染色，结果如图6A所示，移植后30天及60天，与PBS组相比，hAECs组的子宫瘢痕处的胶原沉积显著减少，子宫肌层显著增加。
金属基质蛋白酶-8(matrix metalloproteinase-8，MMP-8)是金属基质蛋白酶中胶原酶亚家族成员，可降解间质Ⅰ型，Ⅱ型与Ⅲ型胶原并参与子宫的组织重建过程。应用免疫组织化学技术和westernblot检测体内子宫瘢痕处MMP-8表达情况。免疫组化实验的结果如图6B-C所示，移植后30天及60天，hAECs组的MMP-8表达水平都显著高于PBS组。Westernblot结果如图6D-E所示，移植5天后的子宫瘢痕组织中，hAECs组的MMP-8蛋白表达水平显著高于PBS组。
接下来，通过体外实验进一步探究MMP-8升高的可能机制。免疫组化的结果示在大鼠子宫瘢痕中氧化应激损伤标志分子4羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)和8羟基脱氧鸟苷(8-hydroxyguanosine，8-OHdG)的表达水平显著升高(图7)。
过氧化氢是伤口愈合过程中氧化还原信号通路中重要的氧代谢产物之一。本发明中，采用过氧化氢诱导hAECs模拟子宫瘢痕损伤环境。首先，应用CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测不同浓度过氧化氢诱导后的hAECs细胞活力。结果如图8A所示浓度25μM的过氧化氢刺激12小时的hAECs的细胞活力显著增加，然而细胞活力随过氧化氢浓度升高而降低。收集了浓度25μm过氧化氢刺激12小时后hAECs的细胞上清，并进行细胞换液，24小时后再提取细胞蛋白，并分别用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和western blot法检测MMP-8蛋白水平。同时收集了未加过氧化氢处理的对照组上清和细胞蛋白。两者结果都显示过氧化氢组的MMP-8蛋白水平高于对照组(图8B-D)。
实施例3 hAECs促进大鼠子宫瘢痕组织血管修复并上调VEGFA表达
血管再生在组织修复过程中具有重要作用。为了研究hAECs对子宫瘢痕组织血管修复的作用，采用免疫组化技术检测具有高度特异性的血管内皮标志物血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，通过计数vWF阳性的血管数，进而计算单位面积内血管密度(blood vessel density，BVD)。结果如图9A，C所示，移植30天后，hAECs组的BVD显著大于PBS组，且与sham组相似，无统计学差异。与之相似，移植60天后，hAECs组的BVD也显著大于PBS组，同时也大于sham组。
血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factorA，VEGFA)是一种特异性促血管生长因子，采用免疫组化技术与western blot法检测VEGFA在子宫瘢痕组织中的表达情况，以进一步评估hAECs的促血管修复作用。免疫组化的结果示移植后30天及60天，hAECs组的VEGFA阳性细胞数均显著高于PBS组(图9B，D)。与之相似，western blot结果示移植5天后，hAECs组的VEGFA蛋白表达水平显著高于PBS组。
实施例4 hAECs改善大鼠子宫瘢痕处的生育结局
将移植后60天的子宫瘢痕大鼠与已验证生育能力的雄性SD大鼠进行合笼交配，观察到阴道栓后16天解剖孕鼠，观察子宫形态，胚胎总数及子宫瘢痕部位胚胎数量，以评估子宫瘢痕维持妊娠至晚期的能力。
如图10所示，sham组中胚胎整齐地排列分布于子宫角，大小均匀。PBS组子宫瘢痕处无胚胎着床，而在hAECs组中子宫瘢痕处有胚胎着床并且胚胎成功维持发育至孕晚期，其胚胎大小与正常组织处着床的胚胎无明显差异。sham组中所有大鼠均成功受孕，而hAECs组的受孕率高于PBS组(表1)。如图11所示，hAECs组和PBS组的胚胎数均低于sham组。然而，hAECs组的子宫瘢痕组织处着床的胚胎数量显著大于PBS组(图12)。
表1损伤90天后三组大鼠的生育结局
Figure BDA0002987009630000071
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.人羊膜上皮细胞在制备修复子宫瘢痕细胞制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述子宫瘢痕为女性剖宫产术后子宫瘢痕缺损。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞制剂包括活性成分人羊膜上皮细胞和药学可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药学可接受的载体为磷酸缓冲液、生理盐水、脐带血清或全血清中的一种或几种组合。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药学可接受的载体还包括人工支架。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述人工支架为聚乳酸、聚乙醇酸、明胶海绵中的一种或几种组合。
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