JPWO2020091069A1 - 2分割されたCpf1タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
また、ヌクレアーゼ不活性型変異Cas9(dead Cas9:dCas9)やニッカーゼ型変異Cas9(Cas9 nickase:nCas9)と種々のエフェクターとの融合タンパク質を用いるゲノム編集の種々の改良技術も知られている。
本発明者らは、光依存的にホモ二量体を形成するNeurospora Crassa由来のVividタンパク質を改変し、光の照射により二量体の形成及び解離を精密に制御することができる光スイッチタンパク質のペア「マグネット」を開発した(非特許文献6、特許文献1)。また、ゲノム編集ツールとして、2分割されたCas9タンパク質とマグネットを融合した2つの融合ポリペプチドのセットを開発した(非特許文献7、特許文献2)。
Cpf1においては、標的DNA配列に導くcrRNAが用いられる。crRNAの3'末端の20〜25塩基に相補的で、且つ、その5'末端側にTTTV(VはA、C及びGのいずれかの塩基を表す)で表されるPAM(protospacer-adjacent motif)領域が標的DNA配列となり、Cpf1に切断される。
これらの知見に基づいて、本発明を完成した。
〔1〕
2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセットであって、2つのポリペプチドが、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントである、2つのポリペプチドのセット。
〔2〕
2分割されたCpf1タンパク質の2つの融合ポリペプチドのセットであり、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドのそれぞれに、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントのいずれかが結合する、〔1〕に記載のポリペプチドのセット。
〔3〕
Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが自発会合する、〔1〕又は〔2〕に記載のポリペプチドのセット。
〔4〕
Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ活性型である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のポリペプチドのセット。
〔5〕
Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ不活性型である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のポリペプチドのセット。
〔6〕
Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及び/又はCpf1タンパク質のC末端側フラグメントに機能性ドメインが結合する、〔5〕に記載のポリペプチドのセット。
〔7〕
Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ不活性型であり、
Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが自発会合し、
光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドの一方にCpf1タンパク質のN末端側フラグメント及び/又はCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが結合し、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドの他方に機能性ドメインが結合する、〔1〕に記載のポリペプチドのセット。
〔8〕
Cpf1タンパク質のN末端側フラグメントとCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:2のアミノ酸配列を、69位〜73位、83位〜89位、131位〜138位、244位〜252位、265位〜296位、309位〜312位、371位〜387位、404位〜409位、437位〜445位、549位〜552位、567位〜577位、606位〜609位、619位〜628位、727位〜736位、802位〜811位、1037位〜1042位、1140位〜1148位、1155位〜1161位、1163位〜1178位のいずれかの位置で切断した2つのポリペプチドの組み合わせ、
上記いずれかの組み合わせにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む組み合わせ;並びに
上記いずれかの組み合わせにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列が上記配列と80%以上の配列同一性を有するフラグメントである組み合わせである、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載のポリペプチドのセット。
〔9〕
〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載のポリペプチドのセットをコードする核酸。
〔10〕
〔9〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔11〕
標的二本鎖核酸を切断する方法であって、
前記標的二本鎖核酸と、〔4〕に記載のポリペプチドのセットとを、インキュベートする工程を含む、方法。
〔12〕
標的二本鎖核酸を切断する方法であって、
前記標的二本鎖核酸と、〔4〕に記載のポリペプチドのセットと、前記標的二本鎖核酸のそれぞれの配列に相補的な配列を含むガイドRNAのペアとを、光照射して又は薬物存在下でインキュベートする工程を含む、方法。
〔13〕
標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、〔6〕に記載のポリペプチドのセットとを、インキュベートする工程を含む、方法。
〔14〕
標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、〔6〕に記載のポリペプチドのセットと、前記標的二本鎖核酸のそれぞれの配列に相補的な配列を含むガイドRNAのペアとを、光照射して又は薬物存在下でインキュベートする工程を含む、方法。
〔15〕
標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、〔7〕に記載のポリペプチドのセットとを、光照射して又は薬物存在下でインキュベートする工程を含む、方法。
本発明に係る2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセットは、2つのポリペプチドが、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントである、2つのポリペプチドのセットである。
Cpf1タンパク質を2分割すると、2つのポリペプチドが得られる。2つのポリペプチドのうち、Cpf1タンパク質におけるN末端アミノ酸を含むフラグメントをCpf1タンパク質のN末端側フラグメントといい、Cpf1タンパク質におけるC末端アミノ酸を含むフラグメントをCpf1タンパク質のC末端側フラグメントという。
ここで、本明細書において、Cpf1タンパク質とは、Cpf1及びその変異体を意味し、下記(1)〜(3)を含む意味で用いる。
(1)native Cpf1を含み、ヌクレアーゼ活性型であるCpf1ヌクレアーゼ(単に、「Cpf1」と記載する場合もある。)
(2)ヌクレアーゼ不活性型変異Cpf1(単に、「dead Cpf1(dCpf1))」と記載する場合もある。)
(3)ニッカーゼ型変異Cpf1であるCpf1ニッカーゼ(Cpf1 nickase(nCpf1))
天然に由来するCpf1や、dCpf1及びnCpf1が、本来の機能を損なわずに、機能に関連のない部分が変異を受けている変異体も本明細書におけるCpf1タンパク質に含まれる。
dCpf1とnCpf1は、Cpf1の2つのDNA切断能のうち少なくとも1つのDNA切断能が失活したCpf1の変異体である。
また、本発明における2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセットは、好適には、2分割されたCpf1タンパク質の2つの融合ポリペプチドのセットである。2つの融合ポリペプチドのセットである場合、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドのそれぞれに、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントのいずれかが結合し、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドが、光誘導され、あるいは薬物誘導されて二量体を形成するのに併せて、融合したCpf1タンパク質のN末端側フラグメント及び融合したCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが、誘導会合型として再構成する。なお、2つの融合ポリペプチドのセットである場合においても、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが、自発会合型として再構成してもよい。
2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドが再構成される場合のCPf1タンパク質の特性は、ヌクレアーゼ活性、ヌクレアーゼ不活性又はニッカーゼ活性が挙げられる。
本発明に係る2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセット(split-Cpf1)は、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント(split-Cpf1-N)とC末端側フラグメント(split-Cpf1-C)に分割された2つのポリペプチドのセットであり、2つのポリペプチドのセットが、誘導会合型あるいは自発会合型として再構成してヌクレアーゼ活性を示す。
本明細書においてヌクレアーゼ活性とは、Cpf1の本来の機能である、二本鎖核酸の塩基間のホスホジエステル結合を加水分解して切断する活性を意味する。
本明細書においては、ヌクレアーゼ活性型Cpf1タンパク質をCpf1とも記載する。
本発明に係る2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセット(split-Cpf1)は、好適には、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドのそれぞれに、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント(split-Cpf1-N)とC末端側フラグメント(split-Cpf1-C)のいずれかが結合した2つの融合ポリペプチドのセットであって、光依存的に又は薬物存在下で、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが誘導会合型として再構成して、ヌクレアーゼ活性を示す。
かかる二本鎖核酸の切断方法も本発明に包含される。
本発明に係る2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセット(split-dCpf1)は、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント(split-dCpf1-N)とC末端側フラグメント(split-dCpf1-C)に分割された2つのポリペプチドのセットであり、2つのポリペプチドのセットが、誘導会合型あるいは自発会合型として再構成してヌクレアーゼ不活性型である。
本明細書においては、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1タンパク質をdCpf1とも記載する。
本発明に係る2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセット(split-dCpf1)は、好適には、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドのそれぞれに、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントのいずれかが結合した2つの融合ポリペプチドのセットであって、光依存的に又は薬物存在下で、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが誘導会合型として再構成する。なお、2つの融合ポリペプチドのセットである場合においても、Cpf1タンパク質のN末端側
フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが、自発会合型として再構成してもよい。
したがって、LbCpf1についてはD832A、E925A及びD1180Aのいずれかに変異を有することで、dLbCpf1となるが、他の種由来のCpf1におけるdCpf1としては、LbCpf1におけるD832、E925及びD1180に相当する、他の種由来のCpf1におけるD又はEのアミノ酸において、それぞれ、Aに置換されていればdCpf1とすることができる。
LbCpf1においては、D832A、E925A及びD1180Aのいずれか一つが導入されていることにより、ヌクレアーゼ不活性型dCpf1となるが、Acidaminococcus sp. BV3L6由来のCpf1(AsCpf1)については、D908A及びE993Aのいずれか一つが導入されていることにより、ヌクレアーゼ不活性型dCpf1となり、Francisella tularensis subsp. Novicida U112由来のCpf1(FnCpf1)については、D917A及びE1006Aのいずれか一つが導入されていることにより、ヌクレアーゼ不活性型dFnCph1となる。
本明細書においてヌクレアーゼ不活性型であるポリペプチドのセット(split-dCpf1)の場合、再構成されたdCpf1は、機能性ドメインに基づいた機能を発揮し得、中でも、機能性ドメインとして、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメインを用いることにより、遺伝子発現の活性化や抑制をする。
Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるN末端側フラグメント(split-dCpf1-N)のN末端及びC末端において、及び/又は、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるC末端側フラグメント(split-dCpf1-C)のN末端及びC末端において、機能性ドメインは結合していてもよい。すなわち、4つの機能性ドメインが、ポリペプチドのセット(split-dCpf1)に結合していてもよい。
ポリペプチドのセット(split-dCpf1)は自発会合し、かつ、光依存的に又は薬物存在下で、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドが二量体を形成することで、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドの一方に結合した4つの機能性ドメインが存在し得る。
機能性ドメインが、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドを介さずに、直接、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるN末端側フラグメント(split-dCpf1-N)のN末端及びC末端において、及び/又は、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるC末端側フラグメント(split-dCpf1-C)のN末端及びC末端において結合していてもよい。この場合、機能性ドメインが、ポリペプチドのセット(split-dCpf1)において、機能性ドメインが、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドを介さずに、直接、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるN末端側フラグメント(split-dCpf1-N)のN末端及びC末端において、及び/又は、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるC末端側フラグメント(split-dCpf1-C)のN末端及びC末端において結合し、また、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドの一方に結合し、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドの他方は、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるN末端側フラグメント(split-dCpf1-N)のN末端及びC末端において、及び/又は、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるC末端側フラグメント(split-dCpf1-C)のN末端及びC末端において結合する。
Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるN末端側フラグメント(split-dCpf1-N)のN末端又はC末端において、及び/又は、Cpf1タンパク質の2つのポリペプチドであるC末端側フラグメント(split-dCpf1-C)のN末端又はC末端において、機能性ドメインは結合していてもよい。すなわち、2つの機能性ドメインが、ポリペプチドのセット(split-dCpf1)に結合していてもよい。
当該ポリペプチドのセット(split-dCpf1)は、標的二本鎖核酸配列に基づいて設計したガイドRNAと組合せて用いることにより、標的二本鎖核酸配列において機能性ドメインに基づいた機能を発揮したりする。
かかる二本鎖核酸における機能性ドメインに基づいた機能を発揮する方法も本発明に包含される。
転写活性化ドメインとしては、トランスアクチベーションドメイン、トランスアクチベーターとも呼ばれるドメインであって、標的遺伝子に対する転写活性化ドメインである。転写活性化ドメインとしては、VP16、VP64、p65及びHSF1等が挙げられる。
転写抑制ドメインとしては、KRAB及びSID4X等が挙げられる。
リコンビナーゼとしては、セリンリコンビナーゼ(例えば、Hin、Gin又はTn3リコンビナーゼなど)及びチロシンリコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼなど)等が挙げられる。
デアミナーゼとしては、シチジンデアミナーゼ(例えば、APOBEC1、AID又はACF1/ASEデアミナーゼなど)及びアデノシンデアミナーゼ(例えば、ADATファミリーデアミナーゼなど)等が挙げられる。
エピジェネティック修飾因子として、ヒストン脱メチル化酵素、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
ヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼ(例えば、TREX2、TREX2、Exo1、lambda exonucleaseなど)及びエンドヌクレアーゼ(例えば、FokIなど)等が挙げられる。
リンカーを介して結合する場合のリンカーは、例えば、1又は複数のグリシンとセリンを構成アミノ酸とするフレキシブルなリンカーを用いることができる。
本明細書において「遺伝子の発現」は、DNAをテンプレートとしてRNAが合成される転写と、RNA配列に基づいてポリペプチドが合成される翻訳の双方を含む概念として用いられる。
ヌクレアーゼ不活性型であり、かつ誘導会合型のポリペプチドのセット(split-dCpf1)である場合であって、標的遺伝子の発現を活性化又は抑制する2つのポリペプチドのセットは、標的遺伝子の一部の配列と相補的な配列を有するガイドRNAと組合せることにより、標的遺伝子の発現を活性化又は抑制することができる。この場合、ガイドRNAは、例えば、標的遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のプロモーター配列又はエクソン配列の一部(例えば約20塩基)に相補的な配列とすることができ、これにより、転写の開始又はmRNAの伸長が阻害される。
かかる遺伝子発現の活性化方法又は抑制方法も本発明に包含される。
VP64、MS2、p65及びHSF1に相当する因子として、公知の転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質を用いることもできるが、例えば、Nature (2015) 517, 583-588及びNature protocols (2012) 7(10), 1797-1807に開示されるような転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質を用いることができる。
本発明に係る2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセット(split-nCpf1)は、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント(split-dCpf1-N)とC末端側フラグメント(split-dCpf1-C)に分割された2つのポリペプチドのセットであり、2つのポリペプチドのセットが、誘導会合型あるいは自発会合型として再構成してニッカーゼ活性型である。
本明細書においてニッカーゼ活性とは、二本鎖核酸のうち一本鎖にニックを形成する活性を意味する。
本明細書においては、ニッカーゼ活性型Cpf1タンパク質をnCpf1とも記載する。
ニッカーゼ活性型のポリペプチドのセットにおいても、ヌクレアーゼ活性型のポリペプチドのセットに用いられるCpf1タンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントと同様に設計することができる。
また、ニッカーゼ活性型のポリペプチドのセットにおいて、ヌクレアーゼ不活性型のポリペプチドのセットにおけるのと同様に、転写活性化ドメインやデアミナーゼ等の機能性ドメインを有するポリペプチドのセットとしてもよい。
それぞれのガイドRNAは、ヌクレアーゼ活性型のポリペプチドのセットと同様に設計することができる。また、複数のガイドRNAのペアを用意することにより、同時に複数の標的配列を切断することも可能である。
かかる二本鎖核酸の切断方法も本発明に包含される。
また、本発明に係る「ニッカーゼ活性型を示すCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセット」とNHEJやHDRを組み合わせれば、標的配列に所望のindel変異を導入することもできる。ガイドRNAを複数用いて、多重遺伝子改変を行ってもよい。
ここで、例えば、LbCpf1のR1138Aを例に挙げて説明すると、必ずしもN末端から数えて1138番目のアミノ酸がAに置換されているのではなく、天然由来のアミノ酸配列においてN末端から数えて1138番目のRに対応するアミノ酸がAに置換されていることを意味する。
したがって、LbCpf1についてはR1138Aの変異を有することで、nLbCpf1となるが、他の種由来のCpf1におけるnCpf1としては、LbCpf1におけるR1138に相当する、他の種由来のCpf1におけるアミノ酸において、Aに置換されていればnCpf1とすることができる。
以下、LbCpf1の全長アミノ酸配列である配列番号:2を例にして説明するが、他の種由来のCpf1についても、LbCpf1のアミノ酸配列に対応する各アミノ酸を選択してもよい。
N末端側フラグメントのN末端アミノ酸は、配列番号:2の配列において、C末端側フラグメントのN末端アミノ酸よりもN末端側のアミノ酸である。N末端側フラグメントのC末端アミノ酸は、配列番号:2の配列において、C末端側フラグメントのN末端アミノ酸よりもN末端側のアミノ酸であってもC末端側のアミノ酸であってもよい。
Cpf1のN末端側フラグメント又はC末端側フラグメントと、配列番号:2のアミノ酸配列との重複する領域が、配列番号:2のアミノ酸配列の70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、100%、又は100%以上となるよう設計して得られるN末端側フラグメント又はC末端側フラグメントは、Lachnospiraceae bacterium ND2006由来以外の他種由来のCpf1又はCpf1タンパク質におけるN末端側フラグメント又はC末端側フラグメントとなり得る場合もある。また、Lachnospiraceae bacterium ND2006由来以外の他種由来のCpf1又はCpf1タンパク質におけるN末端側フラグメント又はC末端側フラグメントは、LbCpf1におけるN末端側フラグメントとC末端側フラグメントとする切断部位を参考に、対応する部位で切断された2分割されたCpf1又はCpf1タンパク質であってもよい。
本明細書において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列からなるフラグメント、又は、フラグメントのアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるフラグメントという場合に同様である。
本発明において、Lachnospiraceae bacterium ND2006由来のLbCpf1に代えて用いることのできるCpf1を例示として、表1に示す。
N末端側フラグメントとC末端フラグメントは、例えば、配列番号:2のアミノ酸配列を、69位〜73位、83位〜89位、131位〜138位、244位〜252位、265位〜296位、309位〜312位、371位〜387位、404位〜409位、437位〜445位、549位〜552位、567位〜577位、606位〜609位、619位〜628位、727位〜736位、802位〜811位、1037位〜1042位、1140位〜1148位、1155位〜1161位、1163位〜1178位のいずれかの位置で、切断してできるフラグメントであってもよい。
誘導会合型である場合、N末端側フラグメントとC末端フラグメントは、配列番号:2のアミノ酸配列を、好ましくは、69位〜73位、83位〜89位、131位〜138位、244位〜252位、265位〜296位、309位〜312位、549位〜552位、619位〜628位、727位〜736位、802位〜811位、1037位〜1042位、1140位〜1148位、1155位〜1161位、1163位〜1178位のいずれかの位置で、より好ましくは、309位〜312位、549位〜552位、727位〜736位、1037位〜1042位、1163位〜1178位のいずれかの位置で、さらに好ましくは、309位〜312位、727位〜736位の位置で、切断してできるフラグメントであってもよい。
自発会合型である場合、N末端側フラグメントとC末端フラグメントは、配列番号:2のアミノ酸配列を、好ましくは、83位〜89位、244位〜252位、371位〜387位、404位〜409位、437位〜445位、567位〜577位、606位〜609位のいずれかの位置で、より好ましくは、371位〜387位、404位〜409位、437位〜445位、567位〜577位、606位〜609位のいずれかの位置で、さらに好ましくは、567位〜577位の位置で、切断してできるフラグメントであって
もよい。
こうして得られるフラグメントのアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列からなるフラグメント、又は、こうして得られるフラグメントのアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるフラグメントであってもよい。
かかるフラグメントのアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列からなるフラグメント、又は、かかるフラグメントのアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるフラグメントであってもよい。
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜70位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、71位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜86位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、87位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜134位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、135位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜248位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、249位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜266位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、267位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜310位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、311位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜373位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、374位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜406位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、407位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜443位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、444位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜550位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、551位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜574位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、575位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜607位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、608位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜624位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、625位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜730位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、731位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜808位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、809位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜1039位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、1040位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜1143位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、1144位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜1157位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、1156位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;
配列番号:2のアミノ酸配列における1位〜1170位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、1171位〜1273位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組み合わせ;及び
上記いずれかの組み合わせにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む組み合わせ;並びに
上記いずれかの組み合わせにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列が上記配列と80%以上の配列同一性を有するフラグメントである組み合わせ。
上記するDNA切断に関わるヌクレアーゼドメイン(RuvCあるいはUK)以外のドメインで切断していることが好ましく、また、αへリックスやβシートを接合する領域(例えば、ループ領域)であり、かつCpf1分子の外側に配向されている領域を切断することが好ましいN末端側フラグメントとC末端フラグメントの具体例として、上記の組み合わせから選択してもよい。また、誘導会合型である場合や自発会合型である場合にも同様に、その具体例として上記の組み合わせから選択してもよい。
本明細書においてアミノ酸は、慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。一文字表記又は三文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれの変異体や誘導体を含む場合もある。
本明細書において、「光依存的に二量体を形成する2つのポリペプチドのセット」(以下「光スイッチタンパク質」という。)は、光を照射することによってホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する天然のタンパク質のペア、又はこれを人工的に改変したものをいう。光スイッチタンパク質の非限定的な例として、以下のものが挙げられる。
〔ヘテロ二量体を形成するペア〕
PhyBとPIF(Levskaya, A., et al., Nature, 461, 997-1001 (2009).)
FKF1とGI(Yazawa, M. et al., Nat. Biotechnol.27, 941-5 (2009).)
CRY2とCIB1(Kennedy, M. J., et al., Nat. methods 7, 12-16 (2010).)
UVR8-COP1(Crefcoeur, RP. et al., Nat. Commun. 4:1779 doi: 10.1038/ ncomms2800 (2013).)
VVD-WC1(Malzahn, E. et al., Cell, 142, 762-772 (2010).)
PhyB-CRY1(Hughes, R. M. et al., J. Biol. Chem. 287, 22165-22172 (2012).)
RpBphP1-RpPpsR2(Bellini, D. et al., Structure, 20, 1436-1446 (2012).)
〔ホモ二量体を形成するペア〕
UVR8(Chen, D. A. et al., J. Cell Biol. 201, 631-640 (2013).)
EL222(Motta-Mena, L. B. et al., Nat. Chem. Biol., 10, 196-202 (2014).)
bPac(Stierl, M. et al., Beggiatoa, J. Biol. Chem., 286, 1181-1188 (2001).)
RsLOV(Conrad, K. S. et al., Biochemistry, 52, 378-391 (2013).)
PYP(Fan, H. Y. et al., Biochemistry, 50, 1226-1237 (2011).)
H-NOXA(Zoltowski, B. D. et al., Biochmeistry, 47, 7012-7019 (2008).)
YtvA(Zoltowski, B. D. et al., Biochmeistry, 47, 7012-7019 (2008).)
NifL(Zoltowski, B. D. et al., Biochmeistry, 47, 7012-7019 (2008).)
FixL(Zoltowski, B. D. et al., Biochmeistry, 47, 7012-7019 (2008).)
RpBphP1(Bellini, D. et al., Structure, 20, 1436-1446 (2012).)
CRY2(マルチマー形成)(Zoltowski, B. D. et al., Biochmeistry, 47, 7012-7019 (2008).)
光スイッチタンパク質は、ペアのそれぞれのアミノ酸数が約200以下、約180以下、又は約160以下であってもよい。
ここで、側鎖に正電荷を有するアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよく、天然のアミノ酸の場合には、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが挙げられる。側鎖に負電荷を有するアミノ酸も、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよく、天然のアミノ酸の場合には、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。
pMagとnMag
pMagとnMagHigh1
pMagHigh1とnMag
pMagHigh1とnMagHigh1
ここで、pMagは、配列番号:1のアミノ酸配列又はこれと80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有する配列において、I52R及びM55Rの変異を有するポリペプチドをいい、pMagHigh1は、pMagのアミノ酸配列において、さらにM135I及びM165Iの変異を含むポリペプチドをいう。
また、nMagは、配列番号:1にアミノ酸配列又はこれと80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有する配列において、I52D及びM55Gの変異を有するポリペプチドをいい、nMagHigh1は、nMagのアミノ酸配列において、さらにM135I及びM165Iの変異を含むポリペプチドをいう。
リンカーとしては、例えば、1又は複数のグリシンとセリンを構成アミノ酸とするフレキシブルなリンカーを用いることができる。
本発明に用いられる「薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドのセット」は、公知のものとすることができる。例えば、ラパマイシン存在下でヘテロ二量体を形成するFKBP(FK506-binding protein)とFRB(FKBP12-rapamycin associated protein 1 fragment)のセット、ジベレリンとその結合タンパク質(GAI/GID1)を用いたシステム(Nat. Chem. Biol. 8, 465-470 (2012) doi:10.1038/nchembio.922)、フシコクシンとその結合タンパク質(CT52M1/T14-3-3cΔC-M2)を用いたシステム(PNAS 110, E377-386 (2013) doi: 10.1073/pnas.1212990110)、アブシジン酸とその結合タンパク質(PYL/ABI)を用いたシステム(Science Signaling 4 (164), rs2 (2011) DOI: 10.1126/scisignal.2001449)、rCD1/FK506とその結合タンパク質(FKBP/SNAP)を用いたシステム(Angew. Chem. Int. Ed. 53, 1-5 (2014) DOI: 10.1002/anie.201402294)が挙げられるが、これらに限定されない。
また、薬物存在下で二量体を形成するポリペプチドのそれぞれと、あるいは、光スイッチタンパク質のポリペプチドのそれぞれと、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びC末端フラグメントとの結合において、ポリペプチドのそれぞれは、本明細書において記載するポリペプチドのそれぞれから任意に選択することができ、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びC末端フラグメントも本明細書において記載するフラグメントや組み合わせから任意に選択することができる。すなわち、本明細書において、例示されるポリペプチドのそれぞれと、例示されるフラグメントとを任意に結合させることができ、好ましいもの同士であっても、一方を好ましいものから選択し、他方をより好ましいものから選択するといったことも可能である。当然に、好ましいものと好ましいものとを組み合わせてもよく、好ましいものとさらに好ましいものとを組み合わせてもよく、例示されるものと、好ましいもの、より好ましいもの、更に好ましいものとを組み合わせてもよい。
本発明は、2つのポリペプチドのセットを構成するポリペプチドをコードする核酸も提供する。
本明細書において用語「核酸」は、特に記載されていない限り、DNA、RNA、DNA/RNAのキメラ、及び、locked nucleic acid(LNA)やペプチド核酸(PNA)などの人工核酸を含む。
発現ベクターには、DNA複製開始点(ori)、選択マーカー(抗生物質抵抗性、栄養要求性等)、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ(FLAG、HA、GST、GFPなど)をコードする核酸等を組み込んでもよい。
形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするポリペプチドが発現する。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法(例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS−PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等)で行うことができる。
本発明に係るキットは、標的二本鎖核酸を切断するためのキットであって、本発明に係る「ヌクレアーゼ活性型の2つのポリペプチドのセット」、又は該ポリペプチドのセットをコードする核酸、又は該核酸を含むベクターと、標的二本鎖核酸の一方の配列に相補的な配列を含むガイドRNA又はそれをコードする核酸と、を含む。
例えば、ヌクレアーゼ活性型の2つのポリペプチドのセットのそれぞれをコードする核酸、及びガイドRNAをコードする核酸の合計3種類の核酸を含むキットとすることができ、該キットにおいて3種類の核酸は、1つ、2つ、又は3つのベクターに挿入されていてもよい。ガイドRNAは2種類以上であってもよい。
例えば、ニッカーゼ活性型の2つのポリペプチドのセットのそれぞれをコードする核酸、及びガイドRNAのペアをコードする核酸の合計4種類の核酸を含むキットとすることができ、該キットにおいて、4種類の核酸は、1つ、2つ、3つ又は4つのベクターに挿入されていてもよい。ガイドRNAのペアは、2以上であってもよい。
例えば、標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する2つのポリペプチドのセットをそれぞれコードする核酸、及びガイドRNAをコードする核酸の合計3種類の核酸を含むキットとすることができ、該キットにおいて3種類の核酸は、1つ、2つ、又は3つのベクターに挿入さいれていてもよい。ガイドRNAは2種類以上であってもよい。
例えば、標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する2つのポリペプチドのセットをそれぞれコードする核酸、アプタマー及びガイドRNAをコードする核酸、並びに転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質をコードする核酸の合計4種類の核酸を含むキットとすることができ、該キットにおいて4種類の核酸は、1つ、2つ、3つ、又は4つのベクターに挿入さいれていてもよい。ガイドRNAは2種類以上であってもよい。
本発明においては、転写活性化ドメインとしてVP64がCpf1タンパク質のC末端側フラグメントに結合したポリペプチドを含む標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する2つのポリペプチドのセット、アプタマー結合タンパク質としてMS2とし、転写活性化ドメインとして、p65及びHSF1とし、MS2結合配列が結合したガイドRNAをコードする核酸、並びにp65、HSF1及びMS2をコードする核酸が好適に用いられるが、VP64、MS2、p65及びHSF1に相当する因子として、Nature (2015) 517, 583-588及びnature protocols (2012) 7(10), 1797-1807に開示されるような転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質を用いることもできる。
当該キットには、上述の「ニッカーゼ活性型の2つのポリペプチドのセット」等や上述の「ヌクレアーゼ不活性型の2つのポリペプチドのセット」等を含んでいてもよい。
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
コドンを最適化したLachnospiraceae bacterium ND2006 由来のCpf1(LbCpf1)のN末端側フラグメント並びにC末端側フラグメントをコードするcDNAは、Addgene より入手したplasmid(#69988)を元にして作製した。薬物スイッチタンパク質(FKBP,FRB)をコードするcDNAはヒトcDNAライブラリーを元に作製した。光スイッチタンパク質(pMag,nMagHigh1)をコードするcDNAは参考文献(Kawano, F. et al. Nat. Commun. 6, 6256 (2015))に従って作製した。このような二量体化ドメイン(光スイッチタンパク質,薬物スイッチタンパク質)を標準的なPCRで増幅する過程で、グリシンとセリンからなるリンカーと核局在化配列をそれらの5'末端や3'末端に付加した。このようにCpf1のN末端側フラグメント及びC末端側フラグメントと二量体化ドメインを用いた誘導会合型Cpf1のコンストラクトはpcDNA3.1 V5/His-Aベクター(Invitrogen)に導入した。
分割dCpf1アクチベーターをコードするプラスミドを作製するために、標準的なoverlap PCRを用いて、LbCpf1にE925A変異を導入してヌクレアーゼ活性を欠失させたdLbCpf1を作製した。p65-HSF1をコードするcDNAをAddgene plasmid(#61423)より入手し、その5'末端と3'末端にグリシンとセリンからなるリンカーと核局在化配列をPCRで付加した。dLbCpf1のN末端側フラグメントとC末端側フラグメント及びp65-HSF1からなる分割dLbCpf1アクチベーターのコンストラクトはpcDNA3.1 V5/His-Aベクターに導入した。コントロールとしてのSAMを作製するために、dCas9-VP64とMS2-p65-HSF1をAddgene plasmid(#61422 と61423)から増幅し、pcDNA3.1 V5/His-Aに導入した。
ヒトU6プロモーターを用いた哺乳類細胞でのcrRNAの発現にはpSPgRNAベクター(Addgene plasmid #47108)を改変して用いた。この改変pSPgRNAベクターのBsmBIサイトにオリゴDNAを導入することにより、停止コドンが導入されたFlucレポーター、DNMT1、GRIN2b、FANCF1、GAL4-luciferase レポーター、ASCL1、HBG1、IL1R2、IL1RN、NGN3をそれぞれ標的とするcrRNAを作製した。MS2結合配列を導入したsgRNA(sgRNA 2.0と呼ぶ)はAddgene plasmid(#61424)より増幅し、pSPgRNAベクターに導入して用いた。ASCL1、HBG1、IL1R2、IL1RN、NGN3をそれぞれ標的とするsgRNAは、このsgRNA 2.0ベクターのBbsIサイトにオリゴDNAを導入することにより作製した。
停止コドンが導入されたFlucレポーターは、pGL4.31ベクター(Promega)からのfirefly luciferase(Fluc)をpcDNA 3.1/V5-HisAベクターのHind IIIとXho Iサイトに導入すると共に、停止コドンや PAM配列をMulti Site-Directed Mutagenesis Kitで導入することによって作製した。Luciferase donorベクターはpColdIベクター(Clontech)のXho IとHind IIIサイトにFlucの配列を逆さにして導入することにより作製した。Surrogate EGFPレポーターは、pcDNA 3.1/V5-HisAベクターのHind III and Xho IサイトにmCherryと コドンフレームがずれたEGFP を導入することにより作製した。なお、このmCherryと コドンフレームがずれたEGFP の間には、EcoR IとBamH I サイトにオリゴDNAを用いてDNMT1 標的配列を導入することにより作製した。
HEK293T細胞(ATCC)は10% FBS(HyClone)、100 unit/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin(GIBCO)を添加したDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM,Sigma Aldrich)を用いて37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。HeLa細胞(ATCC)は10% FBS、100 unit/mL penicillin、100 μg/ml streptomycinを添加したMinimum Essential Media(MEM, Sigma Aldrich)を用いて37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。
HEK293T細胞を2.0 × 104 cells/wellの密度で 96-well black-walled plate(Thermo Fisher Scientific)に播種し、37 ℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。HEK293T細胞への遺伝子導入はLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いてマニュアルに従って行った。二量体化ドメインを連結したLbCpf1のN末端側フラグメント、二量体化ドメインを連結したLbCpf1のC末端側フラグメント、crRNA、停止コドンが導入されたFlucレポーター、Luciferase donorベクターをそれぞれコードするプラスミドを2.5:2.5:5:1:4の比でトランスフェクションした。なお、トランスフェクションに用いたプラスミドの総量は0.1 μg/wellである。薬物(ラパマイシン)誘導会合型split-LbCpf1の評価の場合、トランスフェクションから24時間後、10 nM rapamycinを含む100 μLのDMEMで培地を置換した。なお、光誘導会合型split-LbCpf1の評価の場合、rapamycinではなく、青色光照射下でサンプルを培養した。青色光照射には470 nm ± 20 nmのLED光源(CCS Inc.)を用いた。青色光の強度は1 W/m2で光照射を行なった。48時間のインキュベーションの後、培地を500 μM D-luciferin(Wako Pure Chemical Industries)を含む100 μLのphenol red-free DMEM(Sigma Aldrich)で置換した。30分間のインキュベーションの後、プレートリーダー(Centro XS3 LB 960,Berthold Technologies)で発光計測を行なった。(図1,図2,図3)
非相同末端結合(NHEJ)による挿入欠失(indel)変異の評価のために、HEK293T細胞を1.0 × 105 cells/wellの密度で 24-well black-walled plate(Thermo Fisher Scientific)に播種し、37 ℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。HEK293T細胞への遺伝子導入はLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いてマニュアルに従って行った。二量体化ドメインを連結したLbCpf1のN末端側フラグメント、二量体化ドメインを連結したLbCpf1のC末端側フラグメント、crRNAをそれぞれコードするプラスミドを1:1:1の比でトランスフェクションした。ポジティブコントロールとして、全長LbCpf1とcrRNAをそれぞれコードするプラスミドを2:1の比でトランスフェクションした。なお、トランスフェクションに用いたプラスミドの総量は0.5 μg/wellである。HeLa細胞の場合、5.0 × 104 cells/wellの密度で 24-well black plate(Thermo Fisher Scientific)で播種し、37 ℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。HeLa細胞への遺伝子導入はX-tremeGENE 9(Sigma Aldrich)を用いてマニュアルに従って行った。薬物(ラパマイシン)誘導会合型split-LbCpf1の評価の場合、トランスフェクションから24時間後、10 nM rapamycinを含むDMEMで培地を置換した。なお、光誘導会合型split-LbCpf1の評価の場合、rapamycinではなく、青色光照射下でサンプルを培養した。特に記載がない場合は、24時間のインキュベーションの後、Blood Cultured Cell Genomic DNA Extraction Mini Kit (Favorgen)を用いて、マニュアルに従ってゲノムDNAを抽出した。(図4,図5,図6,図7,図8)
split-LbCpf1や全長LbCpf1による切断部位を含むゲノムDNAをPrimeSTAR(登録商標)HS DNA Polymerase(TaKaRa)を用いたPCRにより増幅した。このPCRは次のようなtouchdown PCRの条件で行なった:98 ℃、 3 min; (98 ℃, 10 sec; 72-62 ℃, -1 ℃/cycle, 30 sec; 72 ℃, 60 sec) × 10 cycles; (98 ℃, 10 sec; 62 ℃, 30 sec; 72 ℃, 60 sec) × 25 cycles, 72 ℃, 3 min。PCRで増幅したアンプリコンはFastGene Gel/PCR Extraction Kits(Nippon Genetics)を用いて、マニュアルに従って精製した。精製したアンプリコンは2 μL の制限酵素用NEB buffer 2(New England Biolabs)と超純水と混和して20 μLとし、ヘテロ二重鎖DNAを形成させるためにre-annealingを行なった(95 ℃, 10 min; 90-15℃, -2.5 ℃/ 1 min)。Re-annealingを行なった後、ヘテロ二重鎖DNAをT7 endonuclease I(T7EI,New England Biolabs)で30 min、37 ℃で処理を行い、ゲル電気泳動装置(Agilent 4200 TapeStation,Agilent)での解析を行なった。定量はバンドの強度を元に行った。Split-LbCpf1や全長LbCpf1によるindel変異の効率は次の式に基づいて計算した:100 × (1 - (1 - (b + c)/(a + b + c))1/2)。ただし、aはT7EIによって切断されなかったPCR産物、bとcはT7EIによって切断されたPCR産物を示す。
HEK293T細胞を8.0 × 105 cells/dishの密度で fibronectin(BD Biosciences)で表面を修飾した35 mm dish (Iwaki Glass)に播種し、37 ℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。HEK293T細胞への遺伝子導入はLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いてマニュアルに従って行った。N730-pMag、nMagHigh1-C731、DNMT1を標的とするcrRNA、DNMT1の標的部位を含むsurrogate EGFPレポーターを1:1:2:6の比でトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたプラスミドの総量は0.5 μg/dishとした。トランスフェクションから24時間後、フォトマスクを用いて2 mmのスリット状に青色光を照射した(24時間,37 ℃,5% CO2)。4% paraformaldehydeで15 min処理して細胞を固定化した。実体顕微鏡(M205 FA,Leica)を用いて画像を取得し、ソフトウェア(Metamorph,Molecular Devices)で画像解析を行なった。(図9)
HEK293T細胞を2.0 × 104 cells/wellの密度で 96-well black-walled plate(Greiner Bio-One)に播種し、37 ℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。HEK293T細胞への遺伝子導入はLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いてマニュアルに従って行った。所定のドメインを連結したLbCpf1のN末端側フラグメント、所定のドメインを連結したdLbCpf1のC末端側フラグメント、crRNA、luciferaseレポーターを1:1:1:1の比でトランスフェクションした。ポジティブコントロールとして転写活性化ドメインを連結した全長dLbCpf1を用いる場合には、転写活性化ドメインを連結した全長dLbCpf1、crRNA、luciferaseレポーターを2:1:1の比でトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたプラスミドの総量は0.1 μg/wellとした。トランスフェクションから48時間後、培地を500 μM D-luciferin(Wako Pure Chemical Industries)を含む100 μLのphenol red-free DMEM(Sigma Aldrich)で置換した。生物発光測定はプレートリーダー(Centro XS3 LB 960,Berthold Technologies)を用いて行なった。(図10,図12,図14,図16)
HEK293T細胞を2.0 × 104 cells/wellの密度で 96-well black-walled plate(Thermo Fisher Scientific)に播種し、37 ℃,5% CO2の条件下で24時間培養した。HEK293T細胞への遺伝子導入はLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いてマニュアルに従って行った。LbCpf1のN末端側フラグメント(N574)、LbCpf1のC末端側フラグメント(C575)、crRNA、停止コドンが導入されたFlucレポーター及びLuciferase donorベクターをそれぞれコードするプラスミドを2.5:2.5:5:1:4の比でトランスフェクションした。なお、トランスフェクションに用いたプラスミドの総量は0.1 μg/wellであった。48時間のインキュベーションの後、培地を500 μM D-luciferin(Wako Pure Chemical Industries)を含む100 μLのphenol red-free DMEM(Sigma Aldrich)で置換した。30分間のインキュベーションの後、プレートリーダー(Centro XS3 LB 960,Berthold Technologies)で発光計測を行なった。(図11)
Cells-to-Ct Kit(Thermo Fisher Scientific)もしくはCellAmp Direct RNA Prep Kit(TaKaRa)とPrimeScript RT Master Mix(TaKaRa)、SuperScript IV VILO Master Mix(Thermo Fisher Scientific)を組み合わせて、マニュアルに従ってトータルRNAを抽出した。StepOnePlusシステム(Thermo Fisher Scientific)とTaqMan Gene Expression Master Mix(Thermo Fisher Scientific)を用いてマニュアルに従って定量的リアルタイムPCR分析を行った。それぞれの標的遺伝子と内在性コントロールのGAPDHを検出するためのTaqManプローブ(Life technologies)を用いた。TaqMan Gene Expression Assay IDは以下のとおり:ASCL1: Hs04187546_g1, MYOD1: Hs02330075_g1, IL1RN: Hs00893626_m1, IL1R2: Hs01030384_m1, NGN3: Hs01875204_s1, HBG1: Hs00361131_g1, GAPDH: Hs99999905_m1)。ネガティブコントロール(空のベクターを導入した細胞を暗所で処理したもの)に対するそれぞれのサンプルの相対的なmRNAレベルはstandard ΔΔCt methodで算出した。(図13,図15,図17,図18,図19)
RIKEN Bio Resource CenterよりヒトiPS細胞(#454E2)を入手し、マトリゲル(Corning, #354230)でコートした6-well culture plate(Thermo Fisher Scientific)を用いてmTeSR1培地(Stemcell Technologies)の中で培養した。5.0 × 105 個のiPS細胞にpCAG-BPNLS-p65-HSF1-NLS-dN574-p65-HSF1-BPNLS、pCAG-BPNLS-p65-HSF1-dC575-p65-HSF1-BPNLS、NGN3標的とするcrRNAを導入するために4D-Nucleofector(Lonza,CA-137 programを利用)とP3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S(Lonza)を用いた。トランスフェクションした細胞を2.5 × 105 cells/wellの密度でマトリゲルでコートした8-well chamber slide(Thermo Scientific)に播種し、10 μM ROCK inhibitor(WAKO)を含んだmTeSR1培地で培養した。この10 μM ROCK inhibitorを含んだ新しいmTeSR1培地を毎日添加した。トランスフェクションから24時間後、サンプルを定量的リアルタイムPCRで分析し、トランスフェクションから96時間後、蛍光抗体法での染色を行なった。(図20,図21,図22)
サンプルをPBSで2回洗浄し、4% paraformaldehyde(WAKO)で10分間固定した後、0.2% Triton X-100を含んだPBSで10分間処理した。サンプルをPBSで2回洗浄し、3% BSAと10% FBSで1 時間ブロッキングを行い、anti-beta III tubulin eFluor 660 conjugate(eBioscience, catalog no. 5045-10, clone 2G10-TB3)で3時間染色を行った。なお、anti-beta III tubulin eFluor 660 conjugateはブロッキング溶液で1:500に希釈して用いた。サンプルをPBSで2回洗浄し、DAPI(Thermo Scientific)で10分間染色した。染色したサンプルは20倍の対物レンズを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡(Carl Zeiss,LSM710)で蛍光観察した。
HEK293T細胞を2.0 × 104 cells/wellの密度で 96-well plate(Thermo Scientific)に播種し、37 ℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。HEK293T細胞への遺伝子導入はLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いてマニュアルに従って行った。トランスフェクションに用いたプラスミドの総量は0.1 μg/wellとした。アクチベータードメインを連結したCpf1のN末端断片(BPNLS-p65-HSF1-NLS-dN574-p65-HSF1-BPNLS)をコードするcDNA(この配列は配列番号15に同じ)、アクチベータードメインを連結したdCpf1のC末端断片(BPNLS-p65-HSF1-dC575-p65-HSF1-BPNLS)をコードするcDNA(この配列は配列番号16に同じ)、crRNAを1:1:1の比でトランスフェクションした。dCas9-SAMの場合、dCas9-VP64をコードするcDNA、MCP-p65-HSF1をコードするcDNA、sgRNA2.0を1:1:1の比でトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、定量的リアルタイムPCR(rtPCR)分析を行った。
動物実験は東京大学の「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン」に従って実施した。In vivoでのルシフェラーゼレポーター実験では、6週齢のメスのマウス(BALB/c)に分割dCpf1アクチベーターをコードするcDNA、GAL4-UASルシフェラーゼレポーター、およびレポーターを標的とするcrRNAもしくは無関係なヒトB4GALNT1を標的とするcrRNAを搭載したプラスミドを1:1:1の比でインジェクションした。インジェクションにはTransIT-EE Hydrodynamic Delivery Solution(Mirus Bio LLC)を用いた。1匹のマウスに体重1gあたり0.1 mLのインジェクション溶液と、1匹のマウスあたり総量75 μgのDNAを用いてインジェクションを行なった。インジェクションから20時間後、除毛クリームを使ってマウスの腹部の皮膚を除毛した。インジェクションから24時間後に、Lumazone 生物発光イメージャー(日本ローパー)とEvolve 512 EMCCDカメラ(Photometrics)を使って生物発光イメージングを行った。生物発光イメージングの直前に、100 mM D-luciferinを含む200 μLのHank’s balanced salt solutionをマウスの腹腔にインジェクションし、インジェクションから5分以内に生物発光画像を取得した。In vivoで内在性遺伝子(ASCL1)を活性化する場合には、分割dCpf1アクチベーターをコードするcDNAとASCL1を標的とするcrRNAもしくはネガティブコントロールのcrRNAを1:1の比で、TransIT-EE Hydrodynamic Delivery Solutionを使って、マウスにインジェクションした。このとき、1匹のマウスあたり総量100 μgのDNAを用いた。インジェクションから24時間後に、肝臓を取り出してRNAlater solution(Invitrogen)の中に入れた。これはRNAの分解を防ぐためである。Cryolys Evolution cooling systemを搭載したPrecellys Evolution tissue homogenizer(Bertin Instruments)、Precellys Lysing Kit CK28、Nucleospin RNAを使って、肝臓からTotal RNAを抽出し、Superscript IV VILO Master Mixを使ってcDNAを合成した。Luna Universal Probe qPCR Master Mix(New England Biolabs)を使ってrtPCRを行い、StepOne Real-Time PCR Systemで解析を行った。ASCL1遺伝子と内在性コントロールのGAPDH遺伝子を検出するためにTaqManプライマー(Life technologies)を用いた。TaqMan Gene Expression Assay IDは以下のとおり: ASCL1: Mm03058063_m1、 GAPDH: Mm99999915_g1。トランスフェクションしていないネガティブコントロールに対するそれぞれのサンプルの相対的なmRNAレベルはstandard ΔΔCt methodで算出した。
配列番号:2は、LbCpf1の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号:3は、LpCpf1-NLS-3xHA tagのアミノ酸配列を示す。
配列番号:4は、NLS-N730-FRBのアミノ酸配列を示す。
配列番号:5は、FKBP-C731-NLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:6は、NLS-N730-pMagのアミノ酸配列を示す。
配列番号:7は、nMagHigh1-C731-NLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:8は、NLSx3-dN730-FRB-NLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:9は、VPR-FKBP-dC731-NLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:10は、NLS-N574-NLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:11は、NLS-C575-NLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:12は、BPNLS-CIB1-dN574-CIB1-BPNLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:13は、BPNLS-CIB1-dC575-NLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:14は、NLSx3-CRY2-PHR-p65-HSF1のアミノ酸配列を示す。
配列番号:15は、BPNLS-p65-HSF1-NLS-dN574-p65-HSF1-BPNLSのアミノ酸配列を示す。
配列番号:16は、BPNLS-p65-HSF1-dC575-p65-HSF1-BPNLSのアミノ酸配列を示す。
Claims (15)
- 2分割されたCpf1タンパク質の2つのポリペプチドのセットであって、2つのポリペプチドが、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントである、2つのポリペプチドのセット。
- 2分割されたCpf1タンパク質の2つの融合ポリペプチドのセットであり、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドのそれぞれに、Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントのいずれかが結合する、請求項1に記載のポリペプチドのセット。
- Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが自発会合する、請求項1又は2に記載のポリペプチドのセット。
- Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ活性型である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドのセット。
- Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ不活性型である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドのセット。
- Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及び/又はCpf1タンパク質のC末端側フラグメントに機能性ドメインが結合する、請求項5に記載のポリペプチドのセット。
- Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ不活性型であり、
Cpf1タンパク質のN末端側フラグメント及びCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが自発会合し、
光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドの一方にCpf1タンパク質のN末端側フラグメント及び/又はCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが結合し、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドの他方に機能性ドメインが結合する、請求項1に記載のポリペプチドのセット。 - Cpf1タンパク質のN末端側フラグメントとCpf1タンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:2のアミノ酸配列を、69位〜73位、83位〜89位、131位〜138位、244位〜252位、265位〜296位、309位〜312位、371位〜387位、404位〜409位、437位〜445位、549位〜552位、567位〜577位、606位〜609位、619位〜628位、727位〜736位、802位〜811位、1037位〜1042位、1140位〜1148位、1155位〜1161位、1163位〜1178位のいずれかの位置で切断した2つのポリペプチドの組み合わせ、
上記いずれかの組み合わせにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む組み合わせ;並びに
上記いずれかの組み合わせにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列が上記配列と80%以上の配列同一性を有するフラグメントである組み合わせである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドのセット。 - 請求項1から8のいずれか1項に記載のポリペプチドのセットをコードする核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 標的二本鎖核酸を切断する方法であって、
前記標的二本鎖核酸と、請求項4に記載のポリペプチドのセットとを、インキュベートする工程を含む、方法。 - 標的二本鎖核酸を切断する方法であって、
前記標的二本鎖核酸と、請求項4に記載のポリペプチドのセットと、前記標的二本鎖核酸のそれぞれの配列に相補的な配列を含むガイドRNAのペアとを、光照射して又は薬物存在下でインキュベートする工程を含む、方法。 - 標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、請求項6に記載のポリペプチドのセットとを、インキュベートする工程を含む、方法。 - 標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、請求項6に記載のポリペプチドのセットと、前記標的二本鎖核酸のそれぞれの配列に相補的な配列を含むガイドRNAのペアとを、光照射して又は薬物存在下でインキュベートする工程を含む、方法。 - 標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、請求項7に記載のポリペプチドのセットとを、光照射して又は薬物存在下でインキュベートする工程を含む、方法。
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