KR101232130B1 - 인간의 장암 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간의 장암 진단용 키트 및 인간의 장암 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 육안에 의한 장암 조직의 확인 또는 장기간을 요하는 생화학적 장암 판단 방법에 비해, 낮은 비용으로 신속하게 장암 여부를 판단할 수 있다. 특히, 본 발명은 인간의 장암 진단용 키트는 장암에서 특이적으로 과발현 또는 저발현되는 유전자를 이용한 것으로 간편하고 정확하게 장암을 진단할 수 있는 장점이 있다.

장암, 진단 키트, 마커

Description

인간의 장암 진단용 키트{A Diagnosing Kit for Human Colon Cancer}

본 발명은 인간의 장암 진단용 키트 및 인간의 장암 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 2번째로 빈번하게 발생하는 대장암은 식생활의 변화로 우리나라에서도 발생 빈도가 매우 빠르게 증가하고 있다. 대장암과 직장암은 비슷한 임상병리학적인 특징을 가지고 있어 일반적으로 장암이라고 하며, 이러한 대장암과 직장암의 임상병리학적 특징이나 생물학적 차이에 대해서 연구되고 있다. 형태학적으로는 비슷한 두 장기는 발생학적으로 대장은 중장과 후장에서 발생하였으며, 직장은 대장과는 다르게 배설강으로부터 발생되는 근본적인 차이를 가지고 있다. 뿐만 아니라 기능학적으로도 대장은 물의 흡수와 배설물의 고정화와 저장고 역할을 하는 반면, 직장은 단순히 배설물의 저장고 역할만을 하는 차이를 가지고 있다. 또한, 형태학적인 요소나 조직화학적 기능에서도 차이를 나타내는데, 대장의 경우 뮤코폴리당류(mucopolysaccharide)가 주로 포함되어 있지만 직장의 경우는 산성의 뮤신이 주로 분포하고 있다. 이처럼 대장과 직장의 형태학적 생리학적 차이에 관한 연구는 지속적으로 꾸준히 이루어지고 있다.

대장과 직장의 분자생물학적인 특징에 관한 연구 또한 다양하게 이루어지고 있다. 정상 대장과 직장에서의 분자 생물학적인 차이에 관한 연구는 많이는 이루어지고 있지 않지만, CYP1A1와 CYP3A3 유전자의 mRNA 발현에 관한 차이가 있음이 보고되었으며, 대장에서는 CYP3A3의 발현이 높은 반면, CYP1A1의 발현은 직장에서 더 높게 발현되고 있음이 관찰되었다.

이처럼 정상조직에서의 차이에 관한 연구도 미흡할 뿐만 아니라 대장암과 직장암의 차이에 관한 연구도 아주 미흡한 상태이다. 뿐만 아니라, 최근에는 장암의 예후 예측을 위해서 다양한 임상병리학적 요인들을 이용하고는 있지만, 장암을 포함한 많은 종양들은 하나의 클론 기원을 갖지만 분열과 성장을 계속 하면서 다양한 유전적 변이가 축적되어 임상적으로 진단 당시에는 종양 내의 세포성장율, 핵형, 생물학적 표지효소 및 각종 약물에 대한 민감성 정도뿐만 아니라 침윤과 전이능력 등 생물학적 특성이 다양하게 나타나기 때문에 각각 개인에 맞는 예후를 예측하기에는 상당한 어려움을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 이러한 기원, 형태학적인 차이에도 불구하고 정상 대장 조직 및 직장조직 그리고 대장암 조직 및 직장암 조직간에는 분자생물학적으로 많은 차이를 나타내지 않는 것으로 보고되고 있다. 이러한 이유로 다른 기원을 가지는 장암과 직장암을 구별하는데 아주 많은 어려움을 가지고 있다.

이러한 대장암과 직장암의 분자유전학적 공통점을 확인하고, 장암관련 특이 유전자를 선별하기 위해서는 장암의 특징을 구별할 수 있는 표적유전자를 선정하는 것이 무엇보다도 중요하다. 즉, 장암과 정상조직에 따라 유전자의 발현형태 및 발현량에 차이를 나타내는 유전자를 선별하여 각 유전자가 가지고 있는 특성을 파악하는 것이 중요하다.

본 발명에서 목적하고자 하는 장암 특이 유전자의 선별을 위해 사용한 마이크로어레이 기법은 한번의 실험을 통하여 생물학적 특징에 따른 유전자의 발현정도에 따라 차이를 나타내는 유전자를 구별할 수 있는 실험기법이다. 본 발명에서는 이러한 마이크로어레이 기법을 통하여 인간의 장암에 특이적으로 고발현 또는 저발현되는 유전자들을 선별하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종래의 육안에 의한 장암 조직의 확인 또는 장기간을 요하는 생화학적 장암 판단 방법에 비해 신속하고 정확하게 장암 여부를 판단할 수 있는 방법에 대해 연구한 결과, 마이크로어레이 분석을 통해 대장과 직장의 정상조직에 비해서 대장암과 직장암 조직에서 특이적으로 과발현되거나, 저발현되는 뉴클레오티드 서열들을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 인간의 장암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인간의 장암 마커를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 인간의 장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 종래의 육안에 의한 장암 조직의 확인 또는 장기간을 요하는 생화학적 장암 판단 방법에 비해 신속하고 정확하게 장암 여부를 판단할 수 있는 방법에 대해 연구한 결과, 마이크로어레이 분석을 통해 대장과 직장의 정상조직에 비해서 대장암과 직장암 조직에서 특이적으로 과발현되거나, 저발현되는 뉴클레오티드 서열들을 동정하였다.

장암은 십이지장암, 공장암, 회장암 및 대장암(직장암과 결장암)을 포함하는 개념으로, 인간에게 발생하는 대부분의 장암은 대장암과 직장암이 차지한다. 장암의 발생원인은 아직까지 확실하게 밝혀지지는 않았지만 가족성 대장용종증, 특발성 비특이성 궤양성 대장염, 대장 및 직장의 용종, 특히 이중에서도 융모성 선종인 경우 암으로 변화할 수 있는 병으로 잘 알려져 있다. 현재까지 알려져 있는 장암 의 진단 방법으로는 잠혈검사, 종양표지자 검사, 장조영술, 내시경, 복부 초음파나 복부 컴퓨터 단층촬영 및 종양표지자 검사가 있으나, 이들 검사 방법은 비용 및 시간이 많이 들며, 특히 외부로 드러나지 않는 증상인 환자에 대해서는 부적합하다는 단점이 있다. 따라서, 이러한 단점을 극복하기 위해 본 발명자들은 신속하고 정확하게 장암 여부를 판단할 수 있는 인간의 장암 진단용 키트를 개발하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “장암”은 장에서 발생하는 암으로 직장암, 대장암 및 장암의 전구체(예컨대, 선종성 폴립)까지 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충 액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상 기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 혼성화(hybridization)에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 장암 여부를 판단할 수 있다. 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입 자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 장암 세포, 가장 바람직하게는 대장암 또는 직장암 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3- ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 장암 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 장암 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 서열번호 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(정상 세포)보다 강하게 나오거나 서열번호 제12서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(정상 세포)보다 약하게 나오는 경우에는 장암으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응 (PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발 되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 장암 세포)에서 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되 는 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료(biosamples)에서 서열번호 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 높게 나오거나 서열번호 제12서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 낮게 나오 경우에는 장암으로 진단된다.

따라서 본 발명의 장암 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 인간의 장암 진단용 키트에서 상기 서열번호 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 장암 조직에서 고발현 되고, 상기 서열번호 제12서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 장암 조직에서 저발현 된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료(예컨대, 장암세포)에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료(예컨대, 정상세포)와 비교하여 높은 경우(바람직하게는, 4배 이상)를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “저발현”은 조사 대상의 시료(예컨대, 장암세포)에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료(예컨대, 정상세포)와 비교하여 낮은 경우(바람직하게는, 4배 이상)를 의미한다. 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 고발현 또는 저발현 여부를 분석함으로써, 장암을 진단할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 대장암 또는 직장암 세포를 시료로 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 인간의 장암 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 인간의 장암 마커를 검출하는 방법은 상술한 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트를 이용하기 때문에, 그 발명들 사이의 공통 사항은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간 장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드 서열 중에서 서열번호 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 고발현이 억제되거나 또는 서열번호 제12서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 인간 장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 장암 세포이며, 가장 바람직하게는 인간의 대장암 또는 직장암 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시료가 처리된 세포에서 서열번호 제1서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같으며, 측정 결과, 상기 뉴클레오티드 서열 중에서 서열번호 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 고발현이 억제되거나 또는 서열번호 제12서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 인간 장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 인간의 장암 진단용 키트를 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 기존의 육안에 의한 장암 조직의 확인 또는 장기간을 요하는 생화학적 장암 판단 방법에 비해, 낮은 비용으로 신속하게 장암 여부를 판단할 수 있다.

(ⅲ) 특히, 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 장암에서 특이적으로 과발현 또는 저발현되는 유전자를 이용한 것으로 간편하고 정확하게 장암을 진단할 수 있다는 장점이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

대상 환자 및 검체 채취

2003년부터 2006년까지 연세대학교 의과대학 신촌 세브란스병원, 연세 암센터에 내원하여 장암으로 진단받은 환자들 중 임상병리학 진단을 통하여, 전체 종양 중에서 대장암으로 진단받은 환자 127명의 대장암 조직과 정상 대장조직, 직장암으로 진단 받은 108명의 직장암 조직과 정상 직장조직을 이용하였다. 채취된 조직은 채취 직후 액체질소를 이용하여 급속 냉동하고 실험 시까지 -80℃에서 보관하였다. 모든 연구는 연세대학교 세브란스병원 임상연구 심의위원회(Institutional Review Board)가 승인한 동의서에 자의로 동의한 환자를 대상으로 진행하였다.

RNA 추출 및 증폭

보관된 100 ㎎ 정도의 조직은 액체질소 내에서 막자와 막자사발을 이용하여 균질화 한 후, 1 ㎖의 트리졸(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 용해하였다. 200 ㎕의 클로로포름을 넣고 4℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 4℃에서 14,000 rpm으로 25분 동안 원심분리를 하여 상층액 만을 분리시켰다. 분리된 상층액과 이소프로판올을 -20℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 4℃에서 14,000 rpm으로 25분 동안 원심분리 하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 70% 에탄올로 수세하고, 상온에서 남아있는 알코올을 건조시킨 후, 초순수(ultrapure water)에 녹였다. 총 RNA의 양과 질은 나노드롭(Nanodrop technology, Rockland, USA) 및 1% 아가로즈 젤 전기 영동을 이용하여 확인하였다. 대조군으로 사용할 연세 레퍼런스 RNA(Yonsei reference RNA; 연세의대 암전이연구센터, Seoul, Korea)는 YCC-3, YCC-B1, HCT-116, SK-Hep-1, A549, HL-60, MOLT-4, HeLa, HT-1080, Caki-2 및 T98G의 11개 인간 종양 세포주로부터 추출한 같은 양의 총 RNA를 섞어 준비하였다.

RNA 증폭은 연세 의대 암전이 연구센터의 표준 프로토콜에 따라 진행하였다. 먼저 4 ㎕의 총 RNA를 주형으로 하여 일차 증폭을 수행하였다. RNA 주형에 2 ㎍의 올리고-dT/T7 프라이머(5'-GGCCAGTAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-3'; Genotech, Daejeon, Korea)와 9 ㎕의 RNase가 포함되지 않은 물을 넣고 65℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 후 2분 동안 얼음에서 식힌 후, 4 ㎕의 5x first strand buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 ㎕ 의 100 mM DTT(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 ㎕ 의 10 mM dNTP 혼합용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 ㎕ 의 RNAsin(Promega, Madison, WI, USA) 및 2 ㎕의 SuperScript II(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 넣고 1시간 동안 42℃에서 역전사 반응을 하였다.

이차 주형을 합성하기 위하여 일차 주형 cDNA가 만들어진 용액에 91 ㎕의 RNase가 포함되지 않은 물, 30 ㎕의 5x second strand buffer(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 3 ㎕의 10 mM dNTP 혼합용액, 10 유닛의 DNA 리가아제, 4 유닛의 DNA 중합효소 I 및 2 유닛의 RNase H를 넣어 16℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후에 20 유닛의 T4 DNA 중합효소(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가한 후 16℃에서 5분 동안 반응시켰고, 1 M NaOH 및 0.5 M EDTA를 각각 10 ㎕씩을 첨가하여 65℃에서 10분 동안 두어 반응을 비활성화 시켰다. 그 후에 25 ㎕의 Tris-HCl을 이용하여 중화하고, 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1) 97 ㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 Phase Lock GelTM(Eppendorf, Westbury, NY, USA)에 넣어 13,000 rpm으로 2분 동안 원심 분리하여 cDNA만을 정제하였다. cDNA가 존재하는 상층액을 따로 분리하여 상층액 부피의 0.5 배 만큼의 7.5M 암모늄 아세테이트와 2.5 배의 95％ 에탄올을 넣은 후, 4℃에서 13,000 rpm 이상으로 30분 동안 원심 분리하여 cDNA 펠릿을 얻고, 80% 에탄올로 수세한 후 상온에서 건조시켰다. 건조된 cDNA 펠릿은 RNase가 포함되지 않은 물 8 ㎕를 넣어 용해하였다.

인 비트로 전사는 합성된 두 가닥의 cDNA를 이용하여 T7 MEGAscript 키트(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하였다. 간략히 설명하면, 상기 실시예에서 만들어진 8 ㎕의 cDNA 용액에 75 mM rATP, rUTP, rCTP, rGTP, 효소 혼합액 및 10x 반응 완충용액을 각각 2 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 이렇게 증폭된 mRNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 정제하여 얻었으며, 증폭된 mRNA의 양과 질은 나노드롭(Nanodrop technology, Rockland, USA) 및 1% 아가로즈 젤 전기 영동을 이용하여 평가하였다.

cDNA 마이크로어레이 혼성화

cDNA 마이크로어레이는 알려진 유전자들과 EST를 포함하고 있는 17,104개의 유전자가 집적된 인간 17K cDNA 칩(CMRC-GT, Seoul, Korea)을 사용하였고 실험은 실험군과 레퍼런스 RNA를 서로 비교하는 인다이렉트 방법을 사용하였다. 이때, 실험군은 Cy5-dUTP를 이용하여 염색하고 레퍼런스 RNA는 Cy3-dUTP로 염색하였다.

이 과정은 CMRC 스탠다드 프로토콜에 따라서 수행하였다. 간단히 설명하면, 증폭된 mRNA 2 ㎍에 6 ㎍의 랜덤 프라이머(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 넣어 RNase가 포함되지 않은 물로 전체 양이 21 ㎕가 되도록 맞춘 후 65℃에서 10 분 동안 반응시켰다. 그리고 증폭된 mRNA와 랜덤 프라이머 혼합 용액에 8 ㎕의 5x first strand buffer, 4 ㎕의 100 mM DTT, 2 ㎕의 SuperScript II RT, 2 ㎕의 20x low dT/dNTP 혼합용액, 1 ㎕의 RNase 저해제(RNAsin) 및 4 ㎕의 Cy3 또는 Cy5-dUTP(Genomic Tree, Daejeon, Korea)를 첨가하여 42℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 0.1 M NaOH 15 ㎕를 첨가하여 RNA 주형을 분해시키고 65℃에서 30분 동안 두어 반응을 비활성화 하였다. 0.1 M NaOH와 동량의 0.1 M HCl로 중화한 후, QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 Cy3 또는 Cy5로 염색된 프로브만을 정제하고, 200 ㎕의 초순수로 두 번씩 녹여냈다. 이렇게 얻어진 용액에 각각 20 ㎍의 인간의 COT-1 DNA(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 효모의 tRNA(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 폴리(A) RNA(Sigma, Saint Louis, MO, USA)를 넣고 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, Bedford, MA, USA)을 이용하여 최종 양이 40 ㎕가 되도록 농축시킨 후 100℃에서 2분 동안 변성한 후 사용하였다.

cDNA 마이크로어레이칩은 사용하기 전에 3.5x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트 완충용액(SSC), 0.1 % SDS, 10 ㎎/㎖ 우태아 혈청의 용액에서 42℃로 1시간 동안 전-혼성화한 후 3차 증류수로 2번 수세하고, 이소프로판올을 이용하여 완전히 건조시킨 후 사용하였다. 농축된 프로브는 최종적으로 80 ㎕의 25% 포름아마이드, 5x SSC 및 0.1% SDS의 상태로 맞추어 준비된 cDNA 마이크로어레이칩에 덮개유리를 얹고 그 틈으로 주입한 후, 42℃에서 16시간 동안 빛이 차단된 상태로 반응시켰다. 반응이 끝난 마이크로어레이는 순서대로 2x SSC, 0.1 % SDS 용액, 1x SSC, 0.1 % SDS 용액, 0.2x SSC 용액 및 0.05x SSC 용액에서 각각 2분씩 수세하고 회전 건조기를 이용하여 건조시켰다.

혼성화가 끝난 마이크로어레이는 GenePix 4000B 스캐너(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)를 이용하여 형광 신호를 감지하고 GenePix pro 4.0 소프트웨어(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)를 이용하여 이미지화 하였다. 이때 비특이 형광 신호에 의한 간섭을 최소화하기 위하여 로컬 백그라운드 서브스트레이션(local background subtraction) 방법에 따라 백그라운드 신호를 제거하고 수치화된 결과를 얻었다.

생물 정보학 기법을 이용한 결과 분석

마이크로어레이 실험과 유전자 선발, 교차 확인법(cross validation) 및 예측을 포함하는 분석법 과정을 거쳤으며, 원시 데이터 표준화, 유전자 필터링, 분류 유전자 선별, 트레이닝 세트의 교차 확인, 테스트 및 독립세트의 클래스 예측은 GenePlex 소프트웨어(ISTECH, KOREA) 및 KNN-분석법(k-nearest-neighbor analysis)을 사용하여 수행하였다.

장암관련 유전자를 선별하기 위해서 각 실험군은 128명의 대장암 시료와 108명의 직장암 시료를 이용하여, 트레이닝 그룹은 대장암과 직장암 모두 80명의 시료를 사용하였으며, 나머지 시료들은 각각 테스트 그룹으로 이용하였다. Welch's t-test 방법과 2-fold 변화 방법을 이용하여 대장암 그룹과 직장암 그룹에서 정상조직과 암조직간의 유의하게 차이가 나는 유전자를 선별하였다. 두 그룹간의 공통적인 유전자를 선별하고, 선별된 공통유전자들은 KNN 분석법을 이용하여 예측, 분석하였다. 선별된 유전자들은 SOURCE(http://source.stanford.edu) 데이터베이스를 이용하여 유전자 정보를 획득하였다.

실험 결과

선별된 유전자들의 장암에서의 발현정도 비교

마이크로어레이 수행 결과 다양한 통계 분석 방법을 통하여 선별된 327개의 유전자들이 통계적으로 모두 장암 조직과 정상 장조직에서 유의한 차이를 나타내고 있음을 확인한 후, 트레이닝 세트의 정상조직 또는 종양 조직간의 유의한 차이를 나타내는 유전자 327개의 유전자 발현을 표 1a 내지 표 1h에서 나타내었다.

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AA625655	REG1A	-0.24	-0.86	-0.55	3.60	2.48	3.04
AA031514	MMP7	-3.88	-3.69	-3.78	-0.98	-0.88	-0.93
AA143331	MMP1	-0.11	-0.02	-0.07	2.70	2.40	2.55
W46900	CXCL1	0.04	0.47	0.25	2.95	2.74	2.84
AA844864	REG1B	0.10	-0.20	-0.05	2.83	1.80	2.32
N33920	UBD	1.30	1.06	1.18	3.39	3.53	3.46
AA425217	CDH3	-1.32	-1.16	-1.24	1.00	1.02	1.01
AA935273	CXCL3	0.15	0.35	0.25	2.54	2.35	2.44
AA857496	MMP10	-0.19	0.30	0.05	2.14	2.18	2.16
AA863424	DPEP1	0.45	0.42	0.44	2.40	2.68	2.54
N78828	WNT2	-0.22	-0.14	-0.18	1.78	1.94	1.86
AI889554	CXCL6	-1.18	-0.90	-1.04	1.07	0.91	0.99
R52907	COL11A1	0.69	0.63	0.66	2.63	2.66	2.65
AA046527	TSPAN9	-1.12	-1.30	-1.21	0.67	0.78	0.73
AA419251	IFITM1	1.60	1.37	1.49	3.22	3.55	3.38
R32848	-	-0.88	0.51	-0.18	1.67	1.75	1.71
AI669320	OLFM4	-2.76	-3.28	-3.02	-1.24	-1.04	-1.14
AA010400	ETV4	-1.05	-1.13	-1.09	0.71	0.84	0.78
KU008747	-	-2.82	-3.12	-2.97	-1.01	-1.26	-1.13
AI830324	REG3A	0.44	0.21	0.33	2.49	1.69	2.09
AA598974	CDC2	-2.82	-3.07	-2.95	-1.06	-1.37	-1.22
AI015679	PSAT1	-3.98	-4.12	-4.05	-2.15	-2.50	-2.32
AA490586	-	-1.92	-1.91	-1.92	-0.22	-0.27	-0.24
H38240	THBS2	0.83	0.73	0.78	2.35	2.55	2.45
AI828306	COL10A1	0.34	0.24	0.29	1.87	1.98	1.93
hMU009881	-	-2.62	-2.68	-2.65	-1.03	-1.08	-1.06
AA490172	COL1A2	1.54	1.43	1.48	3.06	3.08	3.07
R16712	ANLN	-2.66	-2.83	-2.75	-1.09	-1.28	-1.19
AI031571	ECT2	-1.76	-1.59	-1.68	-0.09	-0.19	-0.14
AI653116	SULF1	2.69	2.71	2.70	4.23	4.19	4.21
AI925568	PDPN	0.69	0.61	0.65	2.12	2.19	2.15
W80637	-	-2.89	-2.73	-2.81	-1.34	-1.30	-1.32
AA878880	CXCL10	1.58	1.32	1.45	3.01	2.87	2.94
AA131406	CXCL9	1.73	1.59	1.66	3.26	3.01	3.14
AA885869	ATP11A	-1.65	-1.60	-1.63	-0.20	-0.13	-0.16
AA504130	CKAP2	-2.09	-2.31	-2.20	-0.67	-0.82	-0.74
AA461473	NEBL	0.12	0.43	0.28	1.72	1.75	1.73
AA405569	FAP	0.39	0.41	0.40	1.79	1.93	1.86
AA278384	CDC2	-2.48	-2.73	-2.61	-1.04	-1.26	-1.15
AA485151	HSPH1	-0.95	-0.84	-0.89	0.50	0.61	0.55
AA973928	IGHMBP2	0.29	0.35	0.32	1.88	1.64	1.76
AA401441	CFB	1.10	1.03	1.07	2.46	2.56	2.51
AI990075	TOP2A	-1.39	-1.43	-1.41	0.02	0.05	0.03
AA434115	CHI3L1	-0.85	-0.89	-0.87	0.53	0.61	0.57
H39991	SELL	0.26	0.38	0.32	1.63	1.89	1.76

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AI359985	AGT	1.14	1.03	1.09	2.51	2.53	2.52
AA457034	MYBL2	-1.99	-2.15	-2.07	-0.63	-0.64	-0.64
AI285199	CCL20	1.51	1.79	1.65	3.12	3.05	3.08
AI291262	-	-2.13	-2.33	-2.23	-0.75	-0.86	-0.81
AA976642	AXIN2	-1.20	-1.24	-1.22	0.22	0.18	0.20
AA446462	BUB1	-2.30	-2.49	-2.39	-0.86	-1.08	-0.97
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GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
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AI932735	CCNB2	-1.61	-1.85	-1.73	-0.50	-0.62	-0.56
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R52796	IL13RA2	0.11	0.15	0.13	1.10	1.24	1.17

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AA194983	TNFRSF11B	-3.77	-3.71	-3.74	-2.68	-2.72	-2.70
AA251457	-	0.12	0.26	0.19	1.20	1.26	1.23
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AA608572	PPA1	-0.21	-0.16	-0.18	0.80	0.83	0.82
W92011	GPSM2	-0.19	-0.27	-0.23	0.84	0.68	0.76
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AA703652	SLIT3	1.08	1.14	1.11	0.00	0.04	0.02
AI871665	ACAT1	0.52	0.41	0.47	-0.55	-0.70	-0.63
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AI300876	FAM150B	1.64	1.52	1.58	0.48	0.46	0.47
AI935290	CSRP1	1.65	1.61	1.63	0.57	0.46	0.52

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AA018980	PRKACB	1.29	1.08	1.19	0.15	-0.01	0.07
AA677185	ANK3	2.20	2.09	2.15	1.07	1.00	1.03
AA521439	SYTL2	2.02	2.07	2.04	0.96	0.89	0.92
AI418753	VSIG2	1.59	1.85	1.72	0.54	0.66	0.60
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AI924973	KLRB1	3.05	2.99	3.02	1.88	1.90	1.89
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AA664101	ALDH1A1	-2.14	-2.28	-2.21	-3.29	-3.44	-3.36
AI928752	ETHE1	2.36	2.35	2.35	1.26	1.13	1.20
AI935306	WDR68	1.81	1.72	1.76	0.65	0.55	0.60
AA995890	DKFZP564O0823	3.16	3.61	3.39	2.16	2.27	2.21
AA775257	ITM2A	-0.50	-0.39	-0.45	-1.65	-1.60	-1.62
W63749	BCL2	0.79	0.69	0.74	-0.41	-0.47	-0.44
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R40400	CHL1	2.30	2.25	2.28	1.09	1.08	1.09
W58032	FRZB	3.01	3.37	3.19	1.99	2.00	1.99
AI263022	MGC13057	1.73	1.52	1.63	0.45	0.40	0.42
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AA292226	SLC6A8	-0.24	-0.18	-0.21	-1.60	-1.25	-1.42
AI985920	IGHG1	4.95	5.20	5.08	3.80	3.93	3.86
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AI572217	HSPB3	1.52	1.44	1.48	0.24	0.28	0.26
AI668906	-	4.17	4.51	4.34	3.00	3.23	3.12
AA872397	LGALS2	1.24	1.78	1.51	0.13	0.44	0.28
AA857748	MUC2	3.47	3.79	3.63	2.45	2.35	2.40
AA923696	AGPAT9	0.41	0.26	0.34	-0.90	-0.90	-0.90
N24824	KIT	2.09	2.07	2.08	0.86	0.80	0.83
AI769896	PADI2	1.76	1.88	1.82	0.62	0.53	0.57
AA987627	TNFRSF17	2.24	1.95	2.09	0.93	0.75	0.84
AA495835	EPB41L3	1.34	0.97	1.16	0.00	-0.20	-0.10
AA134871	FBLN1	2.14	2.17	2.15	0.76	1.04	0.90
AI368479	-	2.89	2.64	2.77	1.70	1.33	1.51
AI346878	SCNN1B	1.46	1.80	1.63	0.28	0.45	0.37
AI674349	TSPAN1	5.52	5.58	5.55	4.23	4.34	4.28
AA130579	LGALS4	4.75	4.69	4.72	3.55	3.36	3.45
AA969799	CASD1	1.03	1.16	1.09	-0.13	-0.22	-0.17
W47576	NAAA	2.43	2.07	2.25	1.09	0.87	0.98
AA148641	MEIS2	-0.44	-0.44	-0.44	-1.70	-1.72	-1.71

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AA417700	PHLPPL	1.92	1.56	1.74	0.55	0.38	0.47
AI955582	GCNT3	3.15	2.84	3.00	1.67	1.77	1.72
AA485893	RNASE1	3.28	3.50	3.39	2.06	2.16	2.11
AA918646	ENDOD1	1.77	2.00	1.89	0.56	0.65	0.60
AA885311	BCHE	0.19	0.45	0.32	-1.03	-0.91	-0.97
N71003	PDCD4	1.81	1.93	1.87	0.55	0.61	0.58
AA598611	NR4A2	4.87	4.85	4.86	3.61	3.52	3.57
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AA465521	JARID1D	2.17	1.96	2.07	0.86	0.67	0.76
AI675670	RGS2	3.33	3.84	3.59	2.16	2.39	2.28
AA482287	PTP4A1	1.00	1.07	1.03	-0.22	-0.33	-0.28
AA454113	MEP1A	3.08	2.86	2.97	1.67	1.64	1.65
H78386	IL1R2	2.04	2.71	2.37	1.02	1.09	1.05
R20626	CNR1	1.58	1.55	1.56	0.19	0.28	0.24
AI375353	-	1.57	1.41	1.49	0.20	0.12	0.16
AI871588	AOC3	2.41	2.51	2.46	1.11	1.14	1.13
AW009510	GUCA2B	1.57	1.41	1.49	0.17	0.13	0.15
AA974946	SDCBP2	2.26	2.14	2.20	0.87	0.85	0.86
AI675624	-	1.48	1.44	1.46	0.08	0.16	0.12
R45264	PLP1	1.31	1.26	1.29	-0.06	-0.06	-0.06
AA427924	SPON1	3.52	3.79	3.66	2.22	2.38	2.30
AA058357	CEACAM7	5.28	4.86	5.07	3.77	3.65	3.71
AA156031	MT2A	0.39	0.23	0.31	-1.02	-1.08	-1.05
AA463926	PPP1R12B	2.10	2.17	2.13	0.74	0.76	0.75
H72028	GSN	2.93	2.82	2.88	1.50	1.48	1.49
AA974008	MRE11A	1.91	2.04	1.97	0.57	0.60	0.58
AW050484	TSPAN1	5.02	5.03	5.03	3.60	3.67	3.63
AA126989	MYH11	2.04	2.43	2.23	0.72	0.96	0.84
AA425749	-	2.60	2.68	2.64	1.21	1.27	1.24
W84773	ABCG2	1.57	0.98	1.28	-0.07	-0.17	-0.12
AA677432	PLCL2	1.46	1.22	1.34	-0.03	-0.11	-0.07
AA029299	KCNMB1	2.36	2.46	2.41	0.92	1.07	1.00
AI738922	-	3.69	3.57	3.63	2.17	2.25	2.21
N71628	SPIB	1.64	1.89	1.76	0.35	0.33	0.34
AI017442	ENTPD5	2.31	2.20	2.26	0.86	0.80	0.83
H72723	MT1B	0.58	0.46	0.52	-0.85	-0.97	-0.91
AA975399	-	1.62	2.81	2.21	0.61	0.95	0.78
R48303	DPT	2.02	2.28	2.15	0.74	0.69	0.72
AA126009	FXYD3	3.70	3.87	3.79	2.34	2.34	2.34
AA886758	FAM129A	0.07	0.19	0.13	-1.35	-1.29	-1.32
AI655379	TRPC3	1.66	1.55	1.60	0.19	0.10	0.15
AA011096	MAOA	3.28	3.38	3.33	1.81	1.93	1.87

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AI289110	MT1L	1.10	0.91	1.01	-0.42	-0.51	-0.47
AA877166	MYL9	2.88	2.98	2.93	1.32	1.57	1.44
W95082	HSD11B2	4.09	4.05	4.07	2.69	2.46	2.58
AI093975	CDH19	1.94	2.07	2.00	0.41	0.59	0.50
AI336626	C10orf99	4.82	4.92	4.87	3.29	3.43	3.36
AI650713	STMN2	2.28	2.50	2.39	0.72	1.01	0.87
AA034213	ITM2C	2.98	3.03	3.00	1.48	1.46	1.47
AA598478	C7	1.78	1.98	1.88	0.25	0.44	0.35
N92901	FABP4	2.47	2.50	2.48	0.86	1.03	0.95
H19440	RCAN2	3.32	3.54	3.43	1.85	1.92	1.88
AA071473	MATN2	1.25	1.22	1.23	-0.19	-0.46	-0.33
T65736	SELENBP1	4.00	4.04	4.02	2.45	2.46	2.46
AI318385	-	3.88	3.64	3.76	2.30	2.09	2.20
AA405731	PCK1	3.45	3.71	3.58	1.94	2.09	2.01
AA973667	-	1.73	2.54	2.14	0.40	0.73	0.57
AA133469	KRT20	5.13	4.75	4.94	3.38	3.34	3.36
AI301329	AKR1B10	-2.59	-3.18	-2.89	-4.29	-4.64	-4.46
AA775223	HPGD	1.47	0.82	1.15	-0.32	-0.55	-0.44
AI924753	AKR1B10	-2.71	-3.37	-3.04	-4.48	-4.77	-4.63
AA970851	LRRC19	4.45	4.34	4.39	2.88	2.73	2.80
AI001183	REP15	3.49	3.17	3.33	1.84	1.62	1.73
AA776176	GABRA1	0.87	1.81	1.34	-0.35	-0.22	-0.29
R51912	SST	0.86	1.48	1.17	-0.54	-0.41	-0.47
T70999	UGT1A1	0.20	-0.30	-0.05	-1.57	-1.86	-1.72
N80129	MT1X	1.08	0.88	0.98	-0.63	-0.76	-0.70
AA704407	LYVE1	2.37	2.33	2.35	0.63	0.70	0.66
AA171613	CA12	1.63	1.47	1.55	-0.11	-0.20	-0.15
H57494	HSPB8	1.52	1.68	1.60	-0.18	-0.02	-0.10
AA055163	CASQ2	2.04	2.07	2.06	0.29	0.41	0.35
AA676836	SMPDL3A	3.42	3.08	3.25	1.60	1.47	1.53
AA775454	ST6GALNAC6	2.29	3.25	2.77	0.78	1.31	1.04
AI972269	MYLK	2.93	2.99	2.96	1.08	1.37	1.22
AA609992	DHRS9	4.52	4.08	4.30	2.71	2.40	2.56
AA932983	-	0.08	-0.41	-0.16	-1.82	-2.01	-1.91
AI986336	CA12	1.31	1.12	1.22	-0.44	-0.66	-0.55
AA398400	CNN1	2.64	2.69	2.66	0.87	0.89	0.88
AA490471	SPARCL1	5.89	5.71	5.80	4.02	4.02	4.02
N93505	TSPAN7	0.21	0.01	0.11	-1.67	-1.81	-1.74
AA449742	F13A1	4.18	3.90	4.04	2.11	2.20	2.16
AA877815	DMN	2.08	2.01	2.04	0.05	0.21	0.13
AA975820	-	1.59	2.16	1.87	-0.10	-0.01	-0.05
AW072500	CKB	3.35	3.84	3.59	1.63	1.68	1.66

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AI094854	FGL2	5.93	5.63	5.78	3.89	3.71	3.80
AA496149	HMGCS2	3.82	3.35	3.58	1.74	1.46	1.60
AA872383	MT1E	1.76	1.64	1.70	-0.34	-0.43	-0.39
H53340	MT1G	3.06	2.72	2.89	0.90	0.70	0.80
H23978	GTF2B	3.75	3.53	3.64	1.61	1.50	1.55
AA894557	CKB	3.78	4.12	3.95	1.78	1.91	1.85
AI745626	MT1G	2.98	2.73	2.86	0.84	0.66	0.75
AI983150	ALG8	1.56	2.58	2.07	-0.18	0.03	-0.07
AI701018	-	2.41	2.94	2.68	0.43	0.61	0.52
AI373245	FLJ21511	3.08	3.11	3.09	0.89	0.97	0.93
H45668	KLF4	4.22	4.26	4.24	2.20	1.92	2.06
AA455925	FHL1	1.47	1.40	1.44	-0.84	-0.70	-0.77
R93176	CA1	3.27	3.96	3.61	1.17	1.64	1.40
AI921121	ADAMDEC1	4.83	4.57	4.70	2.63	2.23	2.43
AA634308	ABCA8	2.51	2.59	2.55	0.17	0.39	0.28
AI655374	CXCL12	3.09	2.86	2.98	0.72	0.60	0.66
AW073266	SLC26A3	7.19	7.24	7.21	4.92	4.84	4.88
AI688230	PADI2	3.99	4.34	4.17	1.75	1.78	1.77
AI339800	LOC646627	4.60	3.93	4.27	2.01	1.68	1.84
AA452278	SLC4A4	2.18	2.13	2.15	-0.42	-0.42	-0.42
AI339538	SLC26A3	7.90	7.66	7.78	5.41	5.00	5.20
AW009764	CLCA1	6.97	6.77	6.87	4.53	3.94	4.23
AI868227	ADH1C	3.99	3.70	3.84	1.18	1.11	1.15
N73101	SLC26A2	3.81	3.69	3.75	1.08	0.84	0.96
AI673190	GUCA2A	4.56	4.48	4.52	1.51	1.47	1.49
AA976699	CHGA	2.83	3.30	3.06	-0.20	0.23	0.02
N93428	ADH1B	5.02	5.03	5.02	1.85	2.10	1.98
AI420743	ADH1C	4.39	4.01	4.20	1.11	0.95	1.03
AA459257	C9orf23	6.56	6.70	6.63	3.23	3.64	3.43
AI955772	GCG	4.52	5.87	5.19	1.49	2.20	1.84

표 2는 이렇게 선별된 유전자 중에서 암조직과 정상조직 간의 발현 차이가 4배 이상 차이나는 유전자를 선별하여 각 유전자들의 평균값을 나타낸 것이다. 특히, MMP7, CDH3, CXCL6, REG1A, WNT2, MMP1, REG1B, MMP10, CXCL3, CXCL1, DPEP1 및 UBD 유전자는 정상 조직에 비하여 장암조직에서 발현 정도가 많이 증가하였음을 확인하였다. 이에 반해, FHL1, MT1E, ALG8, SLC4A4, ABCA8, ESTs, MT1G, CXCL12, CHGA, FLJ21511, CA1, GTF2B, SLC26A2, ADH1C, CKB, PADI2, KLF4, LOC646627, GUCA2A, ADAMDEC1, ADH1B, GCG, C9orf23, CLCA1 및 SLC26A3 유전자는 장암조직에서 발현 정도가 감소하는 것을 확인하였다. 이렇게 선별된 유전자들에는 모두 40개의 프로브가 속해 있음을 확인하였으며, 이 중에서 ADH1C (알코올 탈수소효소 1C (class I), 감마 폴리펩타이드), MT1G (메탈로티오네인 1G) 및 SLC26A3 (솔루트 캐리어 패밀리 26, 맴버 3)의 유전자는 두 개 이상의 프로브가 선별됨을 확인하였다(표 3).

GeneBank ID	유전자 심볼	정상 조직			암 조직
		대장	직장	모든 정상	대장	직장	모든 암
AA031514	MMP7	-3.88	-3.69	-3.78	-0.98	-0.88	-0.93
AA425217	CDH3	-1.32	-1.16	-1.24	1.00	1.02	1.01
AI889554	CXCL6	-1.18	-0.90	-1.04	1.07	0.91	0.99
AA625655	REG1A	-0.24	-0.86	-0.55	3.60	2.48	3.04
N78828	WNT2	-0.22	-0.14	-0.18	1.78	1.94	1.86
AA143331	MMP1	-0.11	-0.02	-0.07	2.70	2.40	2.55
AA844864	REG1B	0.10	-0.20	-0.05	2.83	1.80	2.32
AA857496	MMP10	-0.19	0.30	0.05	2.14	2.18	2.16
AA935273	CXCL3	0.15	0.35	0.25	2.54	2.35	2.44
W46900	CXCL1	0.04	0.47	0.25	2.95	2.74	2.84
AA863424	DPEP1	0.45	0.42	0.44	2.40	2.68	2.54
N33920	UBD	1.30	1.06	1.18	3.39	3.53	3.46
AA455925	FHL1	1.47	1.40	1.44	-0.84	-0.70	-0.77
AA872383	MT1E	1.76	1.64	1.70	-0.34	-0.43	-0.39
AI983150	ALG8	1.56	2.58	2.07	-0.18	0.03	-0.07
AA452278	SLC4A4	2.18	2.13	2.15	-0.42	-0.42	-0.42
AA634308	ABCA8	2.51	2.59	2.55	0.17	0.39	0.28
AI701018	ESTs	2.41	2.94	2.68	0.43	0.61	0.52
AI745626	MT1G	2.98	2.73	2.86	0.84	0.66	0.75
H53340	MT1G	3.06	2.72	2.89	0.90	0.70	0.80
AI655374	CXCL12	3.09	2.86	2.98	0.72	0.60	0.66
AA976699	CHGA	2.83	3.30	3.06	-0.20	0.23	0.02
AI373245	FLJ21511	3.08	3.11	3.09	0.89	0.97	0.93
R93176	CA1	3.27	3.96	3.61	1.17	1.64	1.40
H23978	GTF2B	3.75	3.53	3.64	1.61	1.50	1.55
N73101	SLC26A2	3.81	3.69	3.75	1.08	0.84	0.96
AI868227	ADH1C	3.99	3.70	3.84	1.18	1.11	1.15
AA894557	CKB	3.78	4.12	3.95	1.78	1.91	1.85
AI688230	PADI2	3.99	4.34	4.17	1.75	1.78	1.77
AI420743	ADH1C	4.39	4.01	4.20	1.11	0.95	1.03
H45668	KLF4	4.22	4.26	4.24	2.20	1.92	2.06
AI339800	LOC646627	4.60	3.93	4.27	2.01	1.68	1.84
AI673190	GUCA2A	4.56	4.48	4.52	1.51	1.47	1.49
AI921121	ADAMDEC1	4.83	4.57	4.70	2.63	2.23	2.43
N93428	ADH1B	5.02	5.03	5.02	1.85	2.10	1.98
AI955772	GCG	4.52	5.87	5.19	1.49	2.20	1.84
AA459257	C9orf23	6.56	6.70	6.63	3.23	3.64	3.43
AW009764	CLCA1	6.97	6.77	6.87	4.53	3.94	4.23
AW073266	SLC26A3	7.19	7.24	7.21	4.92	4.84	4.88
AI339538	SLC26A3	7.90	7.66	7.78	5.41	5.00	5.20

서열번호	GeneBank ID	유전자 심볼	잠정적 주석
1	AA031514	MMP7	매트릭스 메탈로펩티다아제 7
2	AI889554	CXCL6	키모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 6 (과립구 키모태틱 단백질 2)
3	AA625655	REG1A	재생 아이슬릿-유래 1 알파
4	N78828	WNT2	윙리스-타입 MMTV 인테그레이션사이트 패밀리 멤버 2
5	AA143331	MMP1	매트릭스 메탈로펩티다아제 1 (간극성 콜라게나아제)
6	AA844864	REG1B	재생 아이슬릿-유래 1 베타
7	AA857496	MMP10	매트릭스 메탈로펩티다아제 10 (스트로멜라이신 2)
8	AA935273	CXCL3	키모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 3
9	W46900	CXCL1	키모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (멜라노마 성장 촉진 활성, 알파)
10	AA863424	DPEP1	디펩티다아제 1 (신장)
11	N33920	UBD	유비퀴틴 D
12	AA872383	MT1E	메탈로티오네인 1E
13	AI983150	ALG8	아스파라긴-링크 당화 8 호모로그 (S. cerevisiae, 알파-1,3-글루코실트랜스퍼라아제)
14	AA452278	SLC4A4	솔루트 캐리어 패밀리 4, 소듐 바이카보네이트 코트랜스포터, 멤버 4
15	AA634308	ABCA8	ATP-결합 카세트, 서브 패밀리 A (ABC1), 멤버 8
16	AI701018	ESTs	전사된 로커스
17	AI745626	MT1G	메탈로티오네인 1G
18	H53340	MT1G	메탈로티오네인 1G
19	AI655374	CXCL12	키모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로말 세포-유래 인자 1)
20	AA976699	CHGA	크로모그라닌 A (부갑상선 분비 단백질 1)
21	AI373245	FLJ21511	가설 단백질 FLJ21511
22	R93176	CA1	카르보닉 안하이드라아제 I
23	H23978	GTF2B	일반 전사 인자 IIB
24	N73101	SLC26A2	솔루트 캐리어 패밀리 26 (설페이트 트랜스포터), 멤버 2
25	AI868227	ADH1C	알코올 탈수소효소 1C (클래스 I), 감마 폴리펩타이드
26	AA894557	CKB	크레아틴 키나아제, 뇌
27	AI688230	PADI2	펩티딜 아르기닌 디이미나아제, 타입 II
28	AI420743	ADH1C	알코올 탈수소효소 1C (클래스 I), 감마 폴리펩타이드
29	H45668	KLF4	크루펠-유사 인자 4 (장)
30	AI339800	LOC646627	포스포리파아제 억제제
31	AI673190	GUCA2A	구아닐레이트 사이클라아제 활성제 2A (구아닐린)
32	AI921121	ADAMDEC1	ADAM-유사, 데사이신 1
33	N93428	ADH1B	알코올 탈수소효소 1B (class I), 베타 폴리펩타이드
34	AI955772	GCG	글루카곤
35	AA459257	C9orf23	염색체 9 열린해독틀 23
36	AW009764	CLCA1	CLCA 패밀리 멤버 1, 클로라이드 채널 조절자
37	AW073266	SLC26A3	솔루트 캐리어 패밀리 26, 멤버 3
38	AI339538	SLC26A3	솔루트 캐리어 패밀리 26, 멤버 3

또한 선별된 공통 유전자를 이용하여 리브원아웃 교차확인(Leave One-Out Cross Validation, LOOCV) 방법을 이용하여 정상조직과 암조직을 구별할 수 있는 최적의 유전자 조합을 선별하였다(도 2). 도 2의 A 모식도는 프로토타입 매칭의 분류법을 이용하여 분석한 방법이며, 도 2의 B 모식도는 중압적 KNN의 분류법을 이용하여 예측분석한 결과이다. 두 가지의 분석법과 예측 분석모두에서 선별된 유전자들은 장암조직과 정상 조직을 구별하는데 높은 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로어레이 실험 및 분석과정을 총괄적으로 나타낸 개략도이다.

도 2은 선별된 공통 유전자를 이용하여 Leave One-Out 교차 검정 방법을 이용하여 정상조직과 암조직을 구별할 수 있는 최적의 유전자 조합을 선별한 결과이다. A, 모식도는 프로토타입 매칭의 분류법을 위하여 분석한 방법이다. B, 모식도는 웨이티드(weighted) KNN의 분류법을 이용하여 예측 분석한 결과이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Yonsei University <120> A Diagnosing Kit for Human Colon Cancer <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 499 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttttttttt ttaaatttac catggaataa acattttatt tatttgtgta tgtaacattt 60 attgacatct acccactgca agtatagatg aataagacac agtcacacca taaaggagtt 120 tatccttaaa aggagtgaaa gacattcaaa aaccaactgc aataaaaaag ggtgacataa 180 ttgctaaatg gagtggagga acagtgctta tcaattctga ttgtgcaaca atgatataca 240 atccaatgaa tgaatgaatg gatgttctgc ctgaagtttc tatttctttc ttgaattact 300 tctctttcca tatagtttct ggaatgcctt taatatcatc ctgggaaagt ttaaaatttt 360 ggggatctcc atttccatag gttggataca tcactgcatt aggatcagag gaatgtccca 420 tacccaaaga atggccaagt tcatgagttg cagcatacag gaagttaatc cctagactgc 480 taccatccgt ccagcggtc 499 <210> 2 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cagtggttta aaaatctttt attgtttctc caaatgacaa tacaagtacc aaaaaccaac 60 atgacacaca ggaaaaaata aaagtgcaat tttaatatag tgaatgtgat acatgtataa 120 ttcctcataa caaaatggtc aaaaccttta aaagatccac aatagatatc tgaaaatctt 180 agcaatgctg tatatatttt gaggactaaa tgatgaattt atattcaaat tgttcaaata 240 tattttcaaa actttcagag cacagatcat tgttaatttt gcttttattt aaaaaaccaa 300 gagaatacat ttctatgtaa attagcaatc aggaatttat ctgtttttgg gcttcttcat 360 ctatctaaag tgtatattta gtgaccagaa ttatagtcat 400 <210> 3 <211> 597 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tttagtggaa acatgtttat ttttattatt taaggttcca aagactgggg taggtaaaac 60 tattgaagat taacaaggca aactcagcag agaagagagt gtccaggttg agttgagttg 120 gagagatggt ccggtttaat ttttgactcc gttgtaattg ctggatcagt tctagacatg 180 tattttccag ctgcctctag tttttgaact tgcagacaaa ggagaacttg tcttcacaag 240 gcacatcctt ccatttctgg aatcctgtgc ttgaggtcag gctcacacag tagccaggat 300 taacactgct tggggctcca atgccccagg acttgtagga gaccagggac ccactgctcc 360 agtgccagcg gcggttcttt ttggggtcat ggaggccaat ccagacattg aagtcatcag 420 tgccactctc cttaatcagt gaggccacaa aggcaccctc ggcctgggtg agcacagaca 480 ccaggttgcc cgaattcatg ttctggcaat agagatctgc atcaacccag gtctcacggt 540 cttcattaaa gtagtagcag taggagcgat aggcattggt gccttctgng cagctga 597 <210> 4 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cttgatctgt acagatatac ttctgatatt ccatccacta aattattttc caccatattc 60 acccaatagt tacagaatat tgccagacca ttcatcttct ttttaattcc cttcagattc 120 taagtgagaa ggaactctca ttccctaaag attttttata tcaaggggac agtaatgcaa 180 agaatccctt tctgaggctt ttgctcttac aaagatacaa cacaccatag taccaaagga 240 cacacgtccc caccttgtta catcagattt taanatggca ataaatgcct tgaaaaatac 300 acattttaaa cttaaaaggg tattgaaagc cattcttctc caggtaatta ccaattaccc 360 ctaagggtgg gtagctgtaa aaccacttgg atcagacnaa agtcttggnc ttttcaaaag 420 ttaaagttaa gtcagggggc agttgattct gctttcctta ctggt 465 <210> 5 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ataaaacagt agaaacaagg ttgactttat tccaaacata aaacacttat tttgtgttag 60 aagagttatc ccttgcctat ccagggtgac accagtgact gcacatgtgt tcttgagctg 120 cttttcctcc ggcaaagact catgtctcct gtctctttct gtcttgaaag gatatgtttg 180 tcactgaagc tgctctctgg gatcaacgtc agagttgcat actctagaaa agatctttgc 240 aactctggcc tatatgaatc cataagccac aaacttgnct tttttgtacc caccattttg 300 tggaactaaa ttattatcag ntacaaaaan ggggctaaca tt 342 <210> 6 <211> 494 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ttttttttaa aaataagttt gtttttattt ttcagggctc tagagactga gacaggtgaa 60 ggtactgaag atcagcgatg caaactcatt agggaggaga tggtctgaac tgagttggag 120 acatagtcta gtttaatttt tgacttcata gtaattgcag gaccagttct agacatccat 180 ttttcagctt cctctagttt ttgaacttgc aaacaaagga gaacttcttc tcacaagatt 240 catccttcca tttcttgaat cctgagcatg aagtcaggct tgcacagtag ccagcattag 300 cactgctcgg ggatccagtg tcccaggact tgtaggagac cagggaccca ctactccagt 360 gccagcggcg gttctttttt gggtcatgga ggccaatcca gacattgctg tcatcagtgc 420 tactctcctt aatcagtgag gccagaaggc accctccgcc tggtgagcac gacaccagtt 480 gcctaattca tgtt 494 <210> 7 <211> 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ccttatctat atttacagga attttctact tcttcagtgg atcatcacag tttgagtttg 60 accccaatgc caggatggtg acacacatat taaagagtaa cagctggtta cattgctagg 120 cgagataggg ggaagacaga tatgggtgtt tttaataaat ctaataatta ttcatctaat 180 gtattatgag ccaaaatggt taatttttcc tgcatgttct gtgactgaag aagatgagcc 240 ttgcagatat ctgcatgtgt catgaagaat gtttctggaa ttcttcactt gcttttgaat 300 tgcactgaac agaattaaga aatactcatg tgcaataggt gagagaatgt aatttcatag 360 atgtgttatt acttcctcat taaaagtttt attttg 396 <210> 8 <211> 524 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gagaagtaag aagcttatca gcgtatcatt gacacttcct gcagggtggt ccctggccct 60 aacaagacct gaaattgaaa aggagaccag cagctttcta gggacagctg gaaaggactt 120 aatgtgtttg actatttctt acgagggttc tacttattta tgtatttatt tttgaaagct 180 tgtattttaa tattttacat gctgttattt aaagatgtga gtgtgtttca tcaaacatag 240 ctcagtcctg attatttaat tggaatatga tgggttttaa atgtgtcatt aaactaatat 300 ttagtgggag accataatgt gtcagccacc ttgataaatg acagggtggg gaactggagg 360 gtggggggat tgaaatgcaa gcaattagtg gatcactgtt agggtaaggg aatgtatgta 420 cacatctatt ttttaatact tttttttaaa aaaagaatgt cagttgttat ttattccaat 480 tatctcacat tatgtgttcc acatttttat gccgaaggtt gccc 524 <210> 9 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tttttttcta taagtgcttt atttttatat tctctatgaa aacatcaata attaagcccc 60 tttgttctaa gccagaaaca ctgtaaaact accattaaac aaggcagtat gcttacaaga 120 aagacataaa atgtccaagg gatatttaga acattttagt tcttaaagtt tcaacatgag 180 aaatgttgac cacacactgt gaaatcattt caataaataa caactgacat tcatctaaac 240 agttacaaaa cagatgtgca catacattcc cctgccttca caatgatctc attggccatt 300 tgcttggatc cgccagcctc tatcacagtg gctggcatgt tgcaggctcc tcagaaatat 360 taacataatg actggagaac atttggaaaa cattctacct tcaaattaaa tatgaatcca 420 gattgaacta acttggggtt gacatttcaa aaagaatg 458 <210> 10 <211> 278 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ttgaaggggt gttgctttta ttgcgggcct actgtgtgtg tgtcctgaac tgtccccagg 60 catcctgccc cccaggtaag cccaggcgtc ctctcaggag atgctggtcc ttgcatgtgg 120 gcagcagggc tcctggcatc tggagtcctg ggatgggcgg gtcttcccgg agctccggaa 180 ccctaaaggg gactctggtc tcccaggttt cacaggagag acagacagag gaccagggga 240 gcgagggagg ccagcaggag cccccagtgg cgatggag 278 <210> 11 <211> 466 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atcaaagaaa catagagttc 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ttttctaagc aggtccttta ttcattgttt ctttgtcttg ccaatagcag 60 agtcaatcaa tactgaaaca tacagtttga accaagcata tgtgatgcct actgcacaat 120 acactgaggt tagtaacaaa gggatgaagg ggtacttcac cttccaggag gtgaaaggga 180 atacaaattc acagcagact tccagaaggc cccaggccaa gcaggtagaa agtttccatc 240 caattaaaaa gaggtttttc ttttctgaat aaagtcttca gtgacgaaat actatatatg 300 gggaatagta acatgagtaa gattttaatg ggaagttctg gtgcagtgaa gagcanagga 360 aagagggaat aatgtcctgt tgtggtcaga atcagaaaaa tcgaagcgtc tcctgctttt 420 cccacagaca aaaggctcat tgggagaatt gctagaagta tggcttgttc atgaacatgc 480 cacccaaaca taaaggagct caaggcacaa agagttagac atcggagaga gcctttgggc 540 gcttggggtt taaaccagag acagaaaata gagggcaata tggcgatcag ggtgcatatg 600 agggttgcgc atggagtaac tgaggtaagg actgagtgtg gaacggctga gaccagacc 659 <210> 14 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tttttgacag tcataaatgc ataaagttac tttattttta agtatacata taattttgaa 60 aaatataaat gctaaaatat ctcatcttct tcatctctta attccataaa agtcacaata 120 gaaagcttca taaaactgta aaatactatg ttataggaat tttaggattt atattggaaa 180 aagttattag taatatattg aaatgttttc tgttctttat ctttttttgt tccaccatgt 240 tgatctactt catttaaaat aaaaagatgc atcatttctc tctccaaagt ttaataaaga 300 cttaagagaa taaaaataag a 321 <210> 15 <211> 344 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tttcaaaact atatatatga gatttatttc acattttcta cctactcagt catgtgagct 60 gttgctacat ttgtgaactt tctgaaacca agtgacaaat atccacaaaa gatcatttac 120 aatgtagaca tcactaaagt ctagatttaa aagtccagtg aaaatggcac acagttggct 180 tacagaaata aaaaagtaca atatatttga aatagtaggg tttttgtttt ccatttatgc 240 ctacatcatg gtgttacctg tggatatgtt atcaacgata ttgatatcag atactatgac 300 ccatgacatt tagtattttt agcaataaga agcacactta aatc 344 <210> 16 <211> 521 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tgactcttct atttgcagtt ataaccctga catctttctt gaattttttt gccccttaat 60 tccaacgaac tcctggatgt ctatgtagat gtctcataat ttaggccaat gctgtacaac 120 ttcatgtggc atcatccaca tagaatgaat aggggttgtt caatatgaca gccctgccaa 180 gcatctcaaa ttgaacaggt ctataaagga actcagaatc acttgaatat cacagtccat 240 cagcttcctt tcccagtaat ttaatttcca ttaatggtat attaaacatc gtattttcaa 300 tcatttttag gtttagtcag ctacttaaaa ataggctttt tcttcacata aataaattgt 360 ataccattta atgtgtttta tttcaacaga ctaatagatc ttttaacact tcttagtcct 420 caaaataaat tattaaaaac tttgtatttc atgtcatatt atataaggaa atagaatttt 480 gaagaataat tcatgctgtt ttaaattntt acattgtaca t 521 <210> 17 <211> 242 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tttttttttt tttttttttt ttcaagtcta agggtttaat tattattcac atatttcaca 60 aaaaaaaagg aatgtagcaa aggggtcaag attgtagcaa aaaacaaaaa atcctggatt 120 ttacgggtca ctctatttgt acttgggagc agggctgtcc cgacatcagg cgcagcagct 180 gcacttttcc gatgcccctt tgcaaatgca gccctgggca cacttggcac agcccacagg 240 gc 242 <210> 18 <211> 468 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ntnnnttnna agtctaagtg tttaattatt attcacatat ttcacagaaa aaaaggaatg 60 tagcaaaggg gtcaagattg tagcaaaaaa caaaaaatcc tggattttac gggtcactct 120 atttgtactt gggagcaggg ctgtcccgac atcaggcgca nagctgcact tctccgatgc 180 ccctttgcag atgcagccct gggcacactt ggcacagccc acaggnagnc aggagcagca 240 gctcttcttg caggaggtgc atttgcctct ttgcacttgc aggagctggc gcaggtgcag 300 gagacaccag cggcacagga gcagttgggg gtccatttgc aacccgaggg cgagactagg 360 agttcccaag gcgagaaggg gaaggagggc agtggggttg cacgtnggaa gggnttaggg 420 gtnccagcac gtggggttng taccccnggg cctngggttc agacaggg 468 <210> 19 <211> 456 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tttttttttt tttttcacta acaactaatg aattttattt caggtaaata aattcccaca 60 tacagtagga cgtttatacc atgaaacaat tagcatttta ttgctagtgc atataatgtc 120 acatttgata caattttagt acaagtgaaa aaatacactg tggctaacat tgaaaagctg 180 caatcacatt tatatatcat atatatttct ttacaaattg ccagtagttt gagataatag 240 agaagtataa actactgaca ttcatatggc tccacttcaa atatatgaat tgttcgacta 300 taaatatatt ttgaaataca tttgttttct aaagaaacgt aaaaaaaaat gtgcacaaaa 360 atatatataa aaaaatgcct tgcaaaaagt tacaaatacc accaggacct tctgtggatc 420 gcatttatgc atggaaatgt caccttgcca acagtt 456 <210> 20 <211> 246 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 agaggaaaga gcccagaaca gatttatttt tctttagata aagttcatac agaatatgtt 60 acagtcagga gttctcagct ttcaccaaaa ggtcagaagt tattgcagtt gtgcccagtg 120 gataggatgg aggaagggaa acttctagaa agctgcctgt gttcagagaa ggaatcgtca 180 atgtttaaag ttgtggggct gccctgcaaa ggatgttcca gggcaggtag gagtcaggag 240 taggag 246 <210> 21 <211> 485 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tttttttttt ttttagagaa atgtttttat taagcaacat agtttacaaa tggaggtaat 60 ttcccactgc atagatacca tgtgtttttt aagttgaggt tcttcatgtg tattttccca 120 ctttcattaa tctcttcttt ttatcttaca tacttttttt cttagatttt cccagccaat 180 aacttcttgt tttaaatgtt tcataaaaag tatttgggag tattcatatg aaaattatgg 240 ttgttttcat aattgtgtcc ttctttgtag gatccaaatc tgggattaaa atgaattttc 300 tcagaaactt ctctgtggtc tatgaccact ttctggttgt ctctataatt agtggggtca 360 tcagggatcc taaattttgc catctgaatt tctgaatcac tcagttcagc atgggagatt 420 cttgcataac ccaacctgat cagccctcga tacataatgt attcacacca tctgtcatga 480 tcagt 485 <210> 22 <211> 368 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 taagagataa aattatttta ttggttcaaa taaactgaaa aaaatagaca tacaaatcac 60 ttagttgtaa ttttaaagaa ttcctcaaac 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<213> Homo sapiens <400> 29 ttatttaaaa cttaattctc accttgagta tgcaaaatac aaactccaca aaatgttcat 60 tttactttgt agtttacaaa tatacaaaat agacgtttgc ttaaatttat attacatatt 120 tattaaggca aggaactata tagaaaaaca catttgttct gcttaaggca tacttgggaa 180 taaaccattg tacaaattat tgcacatctg aaaccacagt gcataacaga ctgtctgcat 240 aaaaatgcta aagangtaaa ccagggtata ttacctgact tagggtcata aatgttgatc 300 ggaggacaaa tataggattt tccttgtcaa agtatgcagg cagtttgaaa actttgggct 360 tccntgtttg ggnaccttta gganccaagg tctcaccaag 400 <210> 30 <211> 370 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cagtgaatga accagtgctt taataatgaa gaacaaggca gctgtcggca ttgcctggag 60 acctgtgact cccacttact gggcagttaa acggggcaga gcagggaaag agggtgtcag 120 caccgcaggg ggtgctctgg acctcagaga agaagaaatg gggtgctggg caaagtgcag 180 ccccaggacc tcagggcagc agtccccgaa gaaggaggct ggcaagggcc aagaggtaga 240 gggaagcttt ggagcccacg ttgtgggaag tggttggtgc agacgtgggg gttaagctgt 300 ttacatttgc acactcaaac tttcgaaaga tgactcctcc aagagtcttg ttttcaccag 360 acaggaactg 370 <210> 31 <211> 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Claims (11)

1. 서열번호 제24서열의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 인간의 직장암 또는 대장암 진단용 키트로서, 상기 서열번호 제24서열의 뉴클레오타이드 서열은 직장암 또는 대장암 조직에서 정상조직과 비교하여 저발현 되며, 상기 키트는 직장암 또는 대장암 조직에 대하여 정상조직과 비교하여 서열번호 제24서열의 뉴클레오타이드 서열의 저발현을 검출하는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 키트.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 인간의 직장암 또는 대장암 진단용 키트.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 인간의 직장암 또는 대장암 진단용 키트.
4. 삭제
5. 삭제
6. 인간 직장암 또는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 서열번호 제24서열의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 인간의 직장암 또는 대장암 마커를 검출하는 방법으로서, 상기 서열번호 제24서열의 뉴클레오타이드 서열이 직장암 또는 대장암 조직에서 정상조직과 비교하여 저발현 되는 경우, 직장암 또는 대장암의 마커로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특 징으로 하는 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 삭제
10. 삭제
11. 다음의 단계를 포함하는 인간 직장암 또는 대장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:

    (a) 서열번호 제24서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

    (b) 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 제24서열의 뉴클레오타이드 서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 인간 직장암 또는 대장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

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