KR102061950B1 - 방사선 치료에 대한 직장암의 예후 예측용 조성물 - Google Patents

방사선 치료에 대한 직장암의 예후 예측용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사선 치료에 대한 직장암 예후 예측용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 및 FZD9으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단 마커는 직장암 환자의 수술전 방사선 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써 수술전 방사선 치료에 의해 종양 세포가 완전히 제거되거나, 거의 제거되는 환자를 신속하고 정확하게 예측할 수 있다. 또한 본 발명의 마커를 2 이상 조합하여 발현 정도를 정량적으로 비교함으로써 진단 특이성 및 효율을 현저히 향상시킬 수 있다.

Description

방사선 치료에 대한 직장암의 예후 예측용 조성물{Composition for prognosis of rectal cancer response to radiotherapy}
본 발명은 방사선 치료에 대한 직장암 예후 예측용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 및 FZD9으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
대장암(colorectal cancer, CRC)은 전 세계적으로 세 번째로 많은 악성종양으로, 매년 거의 94만 명의 대장암 환자가 발생하며150만 명에 이르는 환자들이 매년 대장암으로 사망한다. 2012년 우리나라의 국가암등록사업 보고에 의하면 대장암(결장암, 직장암)은 갑상선암, 위암에 이어 세 번째(28,919명, 12.9%)로 많이 발생하는 것으로 나타났다. 남자의 경우 위암 다음으로 두 번째로 많은 17,419명(15.5%)에서 발생하였으며, 여자의 경우 갑상선, 유방암 다음으로 많은 11,514명(10.3%)에서 발생하는 다빈도 암으로 나타난다. 대장암 진단을 받은 환자 중 50 ~ 55%는 직장암 환자로 직장암의 치료 성적 향상은 현재뿐 아니라 미래에도 우리나라 전체의 보건 건강 증진에 그 어느 암종보다 더 큰 영향을 미칠 것으로 생각된다.
직장암이란　직장에 생긴 암세포로 이루어진 악성 종양을 말한다. 대장은 크게　결장과 직장으로 구분되는데, 암이 발생하는 위치에 따라 결장에 생기는 암을 결장암, 직장에 생기는 암을 직장암이라고 하며, 이를 통칭하여　대장암　혹은 결장 직장암이라고 한다. 직장은 대장의 마지막 부분으로 길이는 약 15㎝이며 상부, 중부 하부 직장으로 나눌 수 있고, 천골의 앞면에서 가운데를 따라 내려가　항문에서 끝난다. 직장은 파이프 모양의 관으로 안쪽에서부터 점막층,　점막하층, 근육층, 장막층 등 4개의 층으로 나뉘어져 있다. 대부분의 직장암은 장의 점막에서 발생하는 선암이며, 이 외에도　유암종,　림프종, 육종, 편평상피암, 다른 암의　전이성 병변 등이 있다.
현재 직장암의 표준 치료로 수술 전 항암방사선 치료를 시행하는 것이 권장되고 있어 전체 직장암 환자의 약 50%가 항암방사선 치료를 받은 후 수술을 진행하게 된다. 그러나 방사선 치료에 대해 반응하는 정도는 사람마다 매우 다양하다. 방사선 치료에 대해 반응이 좋은 경우는 치료로 인해 수술 방법도 선택할 수 있는 가능성이 있고 암 치료 성적도 좋아지는 것으로 알려져 있지만, 반응이 좋지 않은 경우는 불필요한 방사선 치료를 받게 될 뿐 아니라 치료 후 수술을 기다리기까지의 과정 중 암이 진행하게 되어 치료를 지연시기는 경우도 발생한다. 또한 방사선 치료 후 반응이 좋지 않거나 오히려 병이 진행된 경우는 치료한 환자의 50 ~ 60%에 이른다.
직장암의 효율적인 치료를 위하여 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 바이오마커 및 진단 방법에 대한 연구가 계속되고 있으나, 예측 특이성 및 효율성이 우수한 마커 및 진단 키트의 개발 및 상용화가 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은 SPRY2(sprouty homolog 2), MMP7(matrix metallopeptidase 7), LAMB3(laminin, beta 3), IL2RA(interleukin 2 receptor, alpha), PPP3CA(protein phosphatase 3, catalytic subunit, alpha isozyme), IL21RA(interleukin 21 receptor, alpha), ITGA6(integrin, alpha 6), IL11(interleukin 11), MYC(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), NKD1(naked cuticle homolog 1), DLL1(delta-like 1), FANCG(Fanconi anemia, complementation group G), FGF2(fibroblast growth factor 2), FGF7(fibroblast growth factor 7), IL1R1(interleukin 1 receptor, type I), MMP3(matrix metallopeptidase 3), FGF21(fibroblast growth factor 21), ITGA7(integrin, alpha 7), PLA2G4(phospholipase A2, group IV), MECOM(MDS1 and EVI1 complex locus), PLAU(plasminogen activator, urokinase), PIK3CD(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit delta), CASP10(Caspase 10, apoptosis-related cysteine peptidase), PRKCB(protein kinase C, beta), NFKB1(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1) 및 FZD9(frizzled family receptor 9)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 및 FZD9으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료로부터 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 및 FZD9으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 및 FZD9으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 및 FZD9로 이루어진 군에서 2 이상의 마커를 조합하여 발현 정도를 정량적으로 비교함으로써 단일 마커의 발현량 변화를 비교하였을 때에 비해 진단 특이성 및 효율성이 향상된 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 본 발명은 CASP10, ITGA7, MECOM, NKD1 및 PIK3CD의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 본 발명은 IL11, IL2RA, MYC 및 NKD1의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 본 발명은 DLL1, FANCG, FGF2, FGF21, FGF7, IL11, IL21RA, IL2RA, ITGA6, MMP3, MYC, NKD1 및 PLA2G4의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 본 발명은 CASP10, FGF21, FZD9, ITGA7, MECOM, NFKB1, NKD1 및 PIK3CD의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 본 발명은 FANCG, FZD9, ITGA7, NFKB1, PIK3CD, PLAU 및 PRKCB의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 본 발명은 FANCG, IL2RA 및 NFKB1의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "수술전 항암방사선 치료"는 직장암을 수술하기 전 항암치료와 함께 방사선을 조사하는 치료를 의미한다.
본 발명의 용어, "예측"이란 환자가 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 직장암 발병 환자에 대한 바이오마커 검사를 실시하여 수술전 항암 방사선 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 예측 방법은 환자가 항암방사선 치료에 선호적으로 반응하는 지를 계산할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커(biomarker)"란 방사선 치료에 반응이 좋았던 군의 조직과 그런지 않은 군의 조직을 구분하여 판정할 수 있는 물질로, 반응이 좋지 않은 세포에 비하여 반응이 좋은 세포에서 발현에 차이를 보이는 mRNA를 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 방사선 치료 반응 예측 바이오마커는 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 또는 FZD9유전자로서, 이들 바이오마커가 하나 또는 둘 이상 포함된 세트를 이용하여 진단 효율을 높일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어, "mRNA 또는 단백질의 발현 수준 측정"이란 직장암의 방사선 치료에 대한 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 직장암의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 마커(단백질) 또는 이를 암호화하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다. 상기 단백질의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 직장암의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물에서 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자, 또는 압타머일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 또는 FZD9 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 바이오마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein(1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 또한 본 발명의 항체는 상업적으로 입수한 것일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리킨다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O(December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 진단용 단백질을 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물에 있어서, SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 또는 FZD9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 각각의 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 키트를 제공한다. 상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다.
상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 면역분석법 또는 면역염색법에 따라 이용될 수 있다. 상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring)인 것일 수 있다.
또한, 상기 키트는 질량분석에 이용될 수 있다. 이 경우, 상기 단백질의 특정 아미노산 잔기는 미리스토일화(myristoylation), 이소프레닐화, 프레닐화, 글리피칸화(glypiation), 리포일화(lipoylation), 아실화, 알킬화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 유비퀴틴화, 인산화, 탈아미드화, 글리코실화, 산화, 또는 아세틸화 등과 같은 변형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 직장암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 SPRY2, MMP7, LAMB3, IL2RA, PPP3CA, IL21RA, ITGA6, IL11, MYC, NKD1, DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL1R1, MMP3, FGF21, ITGA7, PLA2G4, MECOM, PLAU, PIK3CD, CASP10, PRKCB, NFKB1 및 FZD9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서 "생물학적 시료"(biological sample)란 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 반응성 차이로 인해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미한다.
상기 단백질 수준은 전술된 면역분석법 또는 면역염색법에 의해 측정될 수 있다. 또한, 상기 방법은 시료에서 상기 바이오마커 단백질 또는 이의 단편을 검출할 수 있는 마이크로칩 또는 자동화된 마이크로어레이 시스템의 형태로 실시될 수 있다.
상기 단백질 수준은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 측정될 수도 있다. MRM은 물질의 정확한 단편을 결정하여 이를 질량분석기에서 깬 후, 한 번 깨진 이온 중 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 검출기를 이용하여 그 수를 얻는 방법이다. MRM 방법을 이용하는 경우, 방사선 치료에 대한 반응성이 좋은 개체와 좋지 않은 개체의 혈액 시료에서 해당 단백질 또는 그의 단편을 질량분석기를 이용하여 정량할 수 있다.
상기 mRNA 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯, 또는 DNA 칩에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서는 CASP10, ITGA7, MECOM, NKD1 및 PIK3CD의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서는 IL11, IL2RA, MYC 및 NKD1의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서는 DLL1, FANCG, FGF2, FGF21, FGF7, IL11, IL21RA, IL2RA, ITGA6, MMP3, MYC, NKD1 및 PLA2G4의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서는 CASP10, FGF21, FZD9, ITGA7, MECOM, NFKB1, NKD1 및 PIK3CD의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서는 FANCG, FZD9, ITGA7, NFKB1, PIK3CD, PLAU 및 PRKCB의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서는 FANCG, IL2RA 및 NFKB1의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 진단 마커는 직장암 환자의 수술전 방사선 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써 수술전 방사선 치료에 의해 종양 세포가 완전히 제거되거나, 거의 제거되는 환자를 신속하고 정확하게 예측할 수 있다. 또한 본 발명의 마커를 2 이상 조합하여 발현 정도를 정량적으로 비교함으로써 진단 특이성 및 효율을 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1은 NanoString Human Pan Cancer Pathway Kit에 포함된 유전자와 관계된 암 관련경로를 나타낸다.
도 2는 병리학적 검사를 통해 방사선 반응 정도를 5단계로 구분한 경우의 조직학적 진단도를 나타낸다. 본 발명에서 이 중 완전(total) 및 준완전(near total) 퇴축은 방사선 반응군으로 그 외의 퇴축군은 방사선 비반응군으로 구분하였다.
도 3은 본 발명의 유전자 선발단계를 나타내는 것으로, 3단계를 거쳐 최종 유보유전자를 선발하게 된다.
도 4는 훈련 단계에서 평가된 선발유전자가 군집분석(clustering analysis)에 의해 방사선 반응군과 비반응군 간 차이를 보이는 유전자를 선별할 수 있음을 보여주는 것이다. 발현의 증가와 감소로 표현한 히트맵에서 일부 유전자는 명확한 발현 정도의 차이를 보임을 알 수 있다.
도 5는 훈련단계에서 평가된 유전자를 이용하여 얻은 정량적 수치의 진단적 가치를 평가해 본 그림이다. ROC 곡선을 이용했을 때 조합한 유전자에 따라 AUC의 차이를 보이지만 전반적으로 적용 가능한 모델을 형성할 수 있음을 보여준다: 도 5a는 CASP10, ITGA7, MECOM, NKD1 및 PIK3CD; 도 5b는 IL11, IL2RA, MYC 및 NKD1; 도 5c는 DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL11, IL21RA, IL2RA, MMP3, MYC, NKD1, FGF21, ITGA6 및 PLA2G4을 포함하는 진단 키트에 의한 진단 효과를 확인한 결과이다.
도 6는 검증단계에서 평가된 유전자를 이용하여 얻은 정량적 수치의 진단적 가치를 평가해 본 그림이다. ROC 곡선을 이용했을 때 조합한 유전자에 따라 AUC의 차이를 보이지만 전반적으로 적용 가능한 모델을 형성할 수 있음을 보여준다: 도 6a는 CASP10, FGF21, FZD9, ITGA7, MECOM, NFKB1, NKD1 및 PIK3CD; 도 6b는 FANCG, FZD9, ITGA7, NFKB1, PIK3CD, PLAU 및 PRKCB; 도 6c는 FANCG, IL2RA 및 NFKB1을 포함하는 진단 키트에 의한 진단 효과를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실험준비
(1) 시료의 준비
본 실험에 이용된 인체 유래 시료는 총 239명의 직장암 환자로부터 방사선 치료 전 진료 과정에서 시행한 내시경에서 조직 검사를 위해 획득한 조직 중 남은 FFPE(foRNAlin-fixed, paraffin-embedded) 조직을 이용했다. 서울아산병원 기관 윤리 위원회의 규정을 준수하여 실험을 시행했다.
(2) 조직 처리 및 준비
선택한 조직은 4 μm 두께로 5-10 단면을 이용해 mRNA 추출을 준비했다. 종양 조직이 아닌 부분은 미세박리하여 제거했다. 선택한 조직은 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거한 뒤 mRNA 추출을 위해 준비했다. RNA는 RNeasy FFPE Kit (Qiagen)을 이용하여 추출했고, 질검검(QC, quality control)을 실시하여 RNA 농도가 33 μg/uL 미만인 경우 또는 A262/A230 비가 1.3 미만인 경우는 분석에서 제외했다.
실시예 2. 조직 내 유전자 발현 변화 분석
추출한 mRNA로부터 유전자의 발현 분석은 NanoString Human Pan Cancer Pathway Kit를 이용하였다. NanoString Human Pan Cancer Pathway Kit는 13개의 암 관련 경로를 대표하는 770개의 유전자로 구성되어 있으며 이 중 40개의 하우스키핑(housekeeping) 유전자를 포함하고 있다. NanoString nCounter Digital Analyzer를 이용하여 전사체(transcripts)의 수를 나타내는 바코드를 세어 발현을 평가하였다. 분석된 초기자료는 nSolver Analysis software를 이용하여 정상화(noRNAlization) 하였다. 정상화 요소는 각 시료에 사용된 양성 대조군의 기하평균(Geometric mean)을 측정하여 계산하였고, 시료와 무관한 가변성을 제거하기 위해 nCounter 추출값의 초기자료에 적용하였다(도 1).
실시예 3. 방사선 치료 반응의 결정
선정된 환자의 수술 후 원발 직장암 조직을 추출하여 H&E 염색(Hematoxylin and eosin, H&E)을 한 후 치료 반응성을 평가하였다. 방사선 치료에 대한 반응 정도는 원발암 조직에 포함된 섬유화와 잔여 암세포의 양을 비교하여 5단계로 평가하며 이는 대한 소화기병리연구회에서 제안한 방법에 따랐다. 5단계의 반응구분은 하기와 같으며, 도 2에 나타내었다.
1단계) 완전퇴축(total regression) - 잔여 암세포가 없으며 섬유화만 존재
2 단계) 준완전퇴축(near total regression) - 섬유화된 배경 내 현미경적 잔여암 세포 존재
3 단계) 중간정도퇴축(moderate regression) - 쉽게 발견할 수 있는 암세포가 존재하나 방사선 관련 변화가 주된 반응임
4 단계) 최소퇴축(minimal regression)- 방사선 변화가 있으나 종양세포가 주된 요소임
5 단계) 무퇴축(no regression)- 방사선 관련 변화가 없음
상기 5단계의 구분 중 완전퇴축과 준완전퇴축을 보인 경우를 방사선 반응군(good response group)으로, 그 외의 단계를 보인 경우를 방사선 비반응군 (poor response group)으로 구분하였다.
실시예 4. 후보 유전자 선별 단계 및 통계적 방법
후보 유전자 선별을 위해 도 3에 나타낸 바와 같이, 3단계의 실험을 수행하였다.
<4-1> 개발 단계(development phase)
96명 환자의 시료에서 NanoString Human Pan Cancer Pathway Kit에 포함된 770개 유전자 전체의 발현을 검사함으로써 방사선 반응군과 비반응군 간 발현의 유의한 차이를 보이는 유전자를 선정하였다.
하기 [표 1]에서 본 발명의 개발 단계에서 확인한 방사선 반응군과 비반응군 사이의 754개 유전자 발현 차이를 순위별로 나타내었다(하기 표에서 평균은 각 군의 mRNA 발현 평균; 표준편차는 mRNA 발현의 표준편차; Raw-p 값은 반응군과 비반응군과의 차이를 나타내며, < 0.05 인 경우 유의미한 것으로 판단함).
반응군 비반응군 P value
gene 평균 표준편차 평균 표준편차 Raw-p
CACNB2 111.36 51.26 161.28 99.06 0.0044
STAT1 2257.46 1229.87 1669.38 740.16 0.0044
SHC2 63.14 30.34 99.34 76.89 0.0058
IL2RA 153.88 84.12 113.32 57.51 0.0061
SUV39H 336.45 87.39 405.97 139.71 0.0066
SOS2 405.19 129.45 496.64 180.31 0.0073
NKD1 266.33 212.51 616.41 789.15 0.0075
ETV7 275.57 151.82 204.99 102.93 0.0079
GRB2 1559.15 430.78 1346.98 351.21 0.0093
PLA2G4 106.23 62.03 170.31 146.81 0.0109
BMP4 625.42 507.86 935.17 657.53 0.0144
HDAC11 286.86 121.09 358.57 150.47 0.0145
SPRY2 886.07 395.66 1133.6 552.81 0.0174
AMH 22.22 31.76 55.64 83.99 0.0186
ARID2 834.3 152.61 931.99 234.28 0.0232
CD40 201.22 114.07 158.57 69.65 0.0255
MMP7 671.25 581.08 1784.77 3108.36 0.0278
BAIAP3 44.05 40.08 64.22 46.35 0.0287
ETV4 335.94 159.28 438.87 262.12 0.0297
NFKB1 273.07 70.58 241.28 69.57 0.0307
SMAD2 883.28 348.44 1046.99 371.6 0.0315
FGFR3 325.39 201.33 475.83 403.99 0.0327
CDC25B 1005.81 417.17 1314.14 835.23 0.0342
PTCH1 484.83 181.98 578.35 229.69 0.035
TSPAN7 112.06 69.76 149.27 93.08 0.0354
VHL 1086.17 227.79 1190.88 252.7 0.0398
LAMB3 602.75 257.54 507.77 197.68 0.0438
FTSJ2 483.84 131.75 433.92 107.18 0.0438
HDAC10 414.38 153.76 485.31 178.21 0.0448
VEGFC 139.43 91.65 108.12 59.8 0.0457
PIK3CB 351.32 83.81 390.74 100.8 0.0459
PRKCB 148.29 106.29 114.67 54.84 0.046
PIK3R2 656.72 261.44 763.43 250.4 0.0461
EFNA1 589.08 342.31 746.81 402.61 0.0471
NFATC1 70.41 57.18 52.95 29.39 0.0536
SGK2 190.55 145.94 262.08 195.89 0.0538
FOSL1 454.53 344.28 338.13 240.27 0.0539
CBLC 189.18 93.81 225.29 86.19 0.0541
PLCE1 296.24 149.54 369.47 201.08 0.0543
PDGFA 199.38 99.42 246.91 130.79 0.0563
PLA2G2 3394.65 3575.6 5002.57 4323.55 0.057
ITGA7 64.59 48.66 83.93 48.5 0.0574
GNG4 307.25 271.2 210.85 219.34 0.0576
IL19 5.51 7.72 3.33 3.09 0.0593
PIK3CD 187.9 107.65 153.47 69.86 0.0606
WNT2 183.33 150.34 132.54 116.32 0.0652
HES1 969.69 438.87 1141.87 457.91 0.0678
HGF 419.28 471.8 291.45 183.56 0.0683
HNF1A 274.12 93.1 320.57 138.77 0.0688
LAMA3 292.38 200.3 228.04 144.29 0.0704
ARID1B 804.2 160.73 870.87 186.94 0.0713
ERCC3 298.89 63.54 325.99 77.05 0.0713
KMT2C 1017.62 236.45 1104.28 224.8 0.0716
BAMBI 144.38 99.62 204.11 191.12 0.074
PPP3CA 513.22 160.51 455.63 149.86 0.0748
DTX3 77.01 54.43 98.92 62.49 0.0774
FZD9 12.5 17.92 23.07 34.82 0.0818
COG7 470.68 99.5 506.52 98.97 0.0842
TCF3 679.82 181.23 743.87 174.85 0.0846
BIRC7 30.81 25.02 48.3 60.13 0.0863
FOXO4 242.61 85.39 278.64 110.51 0.0877
CCNO 10.19 14.93 21.88 41.31 0.0908
PCK1 59.3 54.09 96.22 128.68 0.091
USP39 369.27 90.52 333.05 110.63 0.0919
SETD2 510.09 127.34 558.9 147.72 0.0947
HMGA2 65.57 39.24 93.29 98.56 0.0955
LEFTY1 1753.42 1371.95 2361.84 1974.93 0.0964
PITX2 54.83 42.63 86.3 113.27 0.0978
NUPR1 340.95 319.76 457.43 350.94 0.0997
CACNB4 21.4 26.32 13.97 17.86 0.1022
CAPN2 1913.61 721.82 1681.84 652.34 0.104
STAT4 95.98 53.89 80.93 36.53 0.1062
HIST1H 7107.84 2485.18 6332.93 2153.51 0.1065
THEM4 215.69 77.16 244.26 89.83 0.1069
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IRS1 235.48 112.28 205.2 70.53 0.1084
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EPHA2 565.86 441.9 503.19 272.26 0.3929
IL10 23.07 26.18 19.27 17.16 0.3932
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PIK3R1 474.33 216.35 510.27 193.34 0.3951
EGFR 607.65 184.5 574.93 185.47 0.3952
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FGF1 31.11 28.04 26.78 21.89 0.3973
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ETS2 6440.54 2721.37 6917.03 2718.04 0.3995
NEG _G 1 0 1.01 0.05 0.4009
PPP3CC 109.75 48.38 102.55 35.95 0.4048
CHAD 24.51 32.07 31.65 46.66 0.4052
DKK1 35.04 42.96 45.76 72.49 0.4054
MAPT 6.76 11.7 4.96 9.37 0.406
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FGF14 23.28 37.32 22.57 55.96 0.9446
APH1B 118.84 73.07 117.68 85.8 0.9449
HOXA9 683.38 374.77 676.59 544.87 0.9458
U2AF1 3709.61 1866.18 3687.71 1296.53 0.946
PRKCA 317.58 119.09 319.14 105.59 0.9464
RPA3 14.84 16.23 15.12 23.38 0.9474
PAK7 17.02 26.4 17.52 45.12 0.951
MUTYH 88.03 37.05 87.55 40.82 0.9525
POLR2J 101.6 39.35 102.09 41.62 0.9537
LFNG 321.03 138.46 322.69 146.58 0.9556
TIAM1 99.71 42.71 99.23 44.98 0.9575
BNIP3 213.71 164.63 215.61 187.27 0.959
TNC 169.78 176.44 171.49 147.01 0.959
PAK3 7.78 11.31 7.9 13.32 0.9607
WEE1 695.4 271.18 698.3 291.31 0.9607
TRAF7 1904.38 682.53 1910.7 573.4 0.9609
TGFB3 209.98 141.15 208.41 172.59 0.9623
LIF 892.11 832.65 900.31 865.68 0.963
NEG _B 1.15 0.54 1.15 0.55 0.9643
TPO 27.44 35.92 27.08 45.38 0.9673
SIRT4 37.59 33.79 37.94 52.27 0.9701
MPL 12.79 20.08 12.6 27.79 0.9713
IL3 21.09 28.87 20.84 36.43 0.9719
WNT5A 1247.62 863.58 1241.01 959.61 0.9724
GRIN2A 17.67 24.6 17.89 34.83 0.9728
WHSC1 948.27 492.6 945.37 379.28 0.9741
FGF16 18.41 28 18.65 41.64 0.9747
NF1 776.09 197.03 777.37 205.31 0.9757
MSH6 445.3 138.96 446.12 145.27 0.9778
PTEN 1546.33 413.95 1544.1 369.94 0.978
MED12 410.58 100.77 411.17 144.2 0.9822
NR4A1 1184.56 1403.67 1177.66 1602.63 0.9826
MAPK9 500 121.3 500.48 168 0.9877
COL27A 439.24 319.16 438.46 224.24 0.9888
IL7 67.41 42.77 67.3 51.79 0.991
HSPA2 215.5 193.23 215.85 175.8 0.9926
EFNA5 54.78 54.22 54.7 60.66 0.9945
IL23R 48.34 31.03 48.29 34.79 0.9948
SPRY4 485.57 344.92 485.22 166.47 0.9948
DUSP6 1077.59 548.9 1078.19 380.92 0.995
GRIA3 34.14 39.52 34.14 45.05 0.9997
SHC4 34.45 32.6 34.45 38.7 0.9998
<4-2> 훈련 단계(training phase)
상기 개발단계에서 선별한 유전자에 대해 독립적 분석을 시행하였다. 방사선 반응군과 비반응군간에 발현 차이를 보이는 유전자를 군집분석(clustering analysis)(도 4 참조) 및 단계적 로지스틱 회귀분석(stepwise logistic regression analysis)를 통해 분석하였고, 이를 통해 검증 단계로 넘어갈 유전자 100개를 선별하였다. 선정된 100개의 유전자와 14개의 하우스키핑 유전자를 포함시켜 맞춤키트(customized kit)를 제작하고, 독립적으로 선발된 47예의 시료에 대해 상기 100개 유전자의 발현을 평가하였다. 훈련 단계에는 독립적으로 실험한 47예에 대해 상기 100개의 유전자의 발현을 분석할 뿐 아니라, 기존의 96예에 대해서도 100개 유전자의 발현 차이를 분석하여 총 143예에 대해 발현 분석을 수행하였고, 그 결과 키트에 포함된 114개의 유전자의 발현 차이를 하기 [표 2]에 나타내었다.
Good response
Mean ± SD 		Poor response
Mean ± SD 		p-value rank rank_ FC
ETV7 286.96 151.12 214.99 111.99 0.0013 1 21
DUSP2 175.95 155.23 118.82 72.32 0.0033 2 9
PRKCB 150.45 96.25 114.22 62.37 0.0069 3 24
SHC2 76.28 61.75 107.72 77 0.0111 4 15
BAMBI 170.65 109.9 261.14 250.59 0.0119 5 7
BMP4 678.45 510.57 930.45 624.11 0.0125 6 17
SUV39H 346.8 100.29 397.56 128.28 0.0131 7 41
WNT2 235.6 179.02 166.37 153.82 0.0147 8 13
PIK3CD 245.12 170.53 191.4 103.65 0.02 9 27
NKD1 471.63 560.02 825.26 1032.39 0.0201 10 2
NFATC1 81.19 66.07 61.45 35.53 0.0214 11 23
PLA2G4 122.5 97.13 169.78 135.55 0.025 12 16
FOSL1 501.05 451.77 371.54 246.29 0.0278 13 18
ZIC2 293.03 425.94 167.79 252.65 0.0283 14 3
ITGA7 75 54.24 98.33 67.7 0.0315 15 25
BAIAP3 44.34 36.7 59.43 44.39 0.0355 16 19
PAX5 78.15 105.78 48.03 66.32 0.0373 17 5
AKT2 1402.1 319.28 1552.72 498.44 0.0461 18 52
STAT4 110.62 74.05 90.92 44.34 0.0477 19 32
PTCH1 551.07 262.86 659.11 357.91 0.0534 20 34
PPP3CA 661.3 329.95 571.31 228.87 0.0554 21 39
CD40 362.26 302.3 281.06 236.92 0.0743 22 26
STAT1 3170.37 2200.58 2584.39 1720.06 0.0764 23 30
CACNB4 24.09 38.81 15.62 18.38 0.08 24 6
IL2RA 210.4 149.72 167.72 140.08 0.0849 25 29
MMP7 1215.41 1592.49 2282.51 4787.93 0.1095 26 1
CCND1 5551.54 11272.68 3647.15 2231.47 0.1256 27 8
IL19 5.7 7.38 4.28 3.77 0.1296 28 22
FGF23 41.31 95.14 24.61 41.78 0.1509 29 4
MMP9 1024.76 900.74 836.48 716.56 0.167 30 31
NEG _D 1.09 0.35 1.24 0.81 0.18 31 42
AMH 32.94 52.25 47.6 70.89 0.1843 32 11
PPP2CB 1791.89 1732.44 1508.55 887.95 0.1984 33 35
WNT10B 41.28 74.03 29.18 38.3 0.1997 34 14
HES1 951.77 386.95 1041.86 430.36 0.2052 35 58
FEN1 365.17 122.95 338.84 120.31 0.2064 36 63
CDC25B 1637.16 1419.66 1965.48 1572.17 0.2069 37 33
MAPK1 866.75 420.56 979.93 597.79 0.2189 38 45
NFKB1 343.93 126.25 316.77 135.72 0.2313 39 60
VHL 1642.22 996.21 1490.2 517.07 0.2317 40 54
NUBP1 115.91 51.48 129.94 77.41 0.2331 41 47
SPRY2 1096.5 616.74 1217.97 585 0.2363 42 50
BRIP1 336.64 190.71 302.15 159.66 0.2437 43 49
VEGFC 148.92 91.66 131.09 88 0.2457 44 43
CASP10 57.05 122.56 39.07 62.39 0.2476 45 10
CBLC 261.47 168.2 291.56 151.74 0.268 46 48
CASP7 578.58 284.66 641.11 356.33 0.2701 47 51
HDAC10 482.59 202.92 519.36 195.3 0.2799 48 64
CDK2 260.95 76.68 276.75 90.64 0.2816 49 72
PLA2G2 5079.83 8410.85 6495.15 7436.27 0.292 50 28
IL1RAP 272.43 240.31 236.8 179.67 0.3117 51 40
ARID2 944.15 260.12 985.46 235.79 0.3266 52 77
EFNA1 670.79 365.39 730.89 352.83 0.3273 53 59
TSPAN7 207.88 220.71 241.36 192.24 0.3381 54 38
PPARG 635.2 431.74 580.05 274.99 0.3503 55 57
ZNF143 211.13 89.17 227.09 106.29 0.352 56 65
TPO 38.71 85.08 28.93 43.2 0.364 57 20
CACNB2 155.94 148.41 176.2 117.35 0.3644 58 46
FGF21 29.87 73.52 20.9 45.3 0.366 59 12
NEG _B 1.94 2.03 2.27 2.28 0.3699 60 37
PDGFA 229.94 122.49 248.72 124.6 0.3765 61 62
SMAD2 929.44 376.77 980.75 333.25 0.3935 62 74
RFC4 456.83 238.63 427.62 189.88 0.4174 63 69
NEG _G 1 0 1 0.04 0.427 64 114
SPRY4 863.13 761.51 779.6 509.8 0.4316 65 53
CDKN1C 181.16 172.68 204.91 184.01 0.4407 66 44
SOS2 635.44 429.02 682.78 338.25 0.4626 67 66
KDM5C 1064.84 432.04 1126 536.15 0.4741 68 73
IGF1 96.38 88.52 106.16 81.24 0.4978 69 55
NEG _F 6.91 4.01 7.39 4.49 0.5192 70 67
NEG _C 1.3 0.9 1.2 0.86 0.5213 71 61
FANCB 127.99 84.22 120.35 65.52 0.5428 72 70
BIRC7 61.43 121.08 52.26 60.1 0.5471 73 36
PLCE1 456.13 300.49 487.7 313.9 0.5507 74 68
ZC3H14 681.36 256.52 703.38 200.42 0.5658 75 82
POS_F 43.02 19.11 41.32 18.02 0.5921 76 79
CHEK1 639.88 383.81 609.29 311.78 0.601 77 75
HDAC11 355.88 199.89 370.61 140.54 0.6046 78 78
ENDOG 513.83 256.52 536.76 282.66 0.6238 79 76
FANCA 258.49 99.56 250.82 88.52 0.6302 80 85
PIK3R2 965.71 560.79 930.53 378.76 0.6538 81 80
POS_B 7943.71 3025.59 8168.86 3193.95 0.6745 82 87
NEG _A 2.7 2.73 2.54 2.21 0.6902 83 71
H3F3C 6159.77 2241.79 6353.25 3197.35 0.6934 84 84
HNF1A 381.34 225.49 369.65 158.45 0.7154 85 83
XRCC4 232.34 83.03 237.12 72.67 0.7165 86 91
PIK3R4 357.64 106.4 363.61 103.08 0.7384 87 96
ARID1B 1106.56 510.77 1130.85 426.21 0.7582 88 89
GNAS 5709.5 2777.58 5583.88 2176.73 0.7625 89 88
NEG _H 1.09 0.42 1.07 0.38 0.7635 90 94
IKBKG 425.3 165.16 433.52 167.54 0.7733 91 92
HMGA2 86.71 72.71 89.96 82.98 0.8106 92 81
COL2A1 65.19 119.99 71.58 183.67 0.8176 93 56
KMT2C 1151.99 416.07 1164.31 247.93 0.8241 94 104
EPHA2 843.07 861.19 818.27 582.53 0.837 95 86
NTHL1 610.95 336.61 621.41 278.33 0.8398 96 95
POS_A 28834.12 11674.67 28459.58 10946.66 0.8456 97 99
POS_C 2032.18 762.94 2057.07 772.45 0.85 98 100
RAD51 133.92 82.67 136.7 90.27 0.8526 99 90
CAPN2 1981.23 735.81 1958.02 833.24 0.865 100 102
GRB2 1835.5 587.94 1855.55 810.45 0.873 101 103
RFC3 980.95 548.52 965.77 599.15 0.8785 102 97
MECOM 862.88 563.85 850.8 395.77 0.8802 103 98
SGK2 294.62 260.44 300.13 193.05 0.8846 104 93
NEG _E 5.03 4.43 5.09 4.12 0.9241 105 101
JAG2 994.17 733.16 987.69 601.03 0.954 106 105
LAMB3 751.4 454.62 755.88 476.91 0.9555 107 106
PKMYT1 391.89 195.07 393.31 156.84 0.9615 108 108
POS_D 466.93 172.04 468.18 170.66 0.966 109 110
ITGA2 1030.89 539.51 1028.21 531.21 0.9767 110 111
SMC1A 712.86 390.08 711.65 279.34 0.9828 111 112
ETV4 723.66 718.68 726.17 664.98 0.9829 112 109
FZD9 27.56 60 27.71 39.18 0.9861 113 107
POS_E 85.34 49.09 85.41 44.87 0.9924 114 113
상기 훈련 단계의 실험 결과로부터 최종 후보 유전자 26개를 선발하였다. 선발된 후보 유전자는 하기 [표 3]에 나타내었다.
선별된 유전자 중 선택적으로 조합하여 ROC curve를 통해 정량적으로 확인함으로써 방사선 반응 예측 효과를 진단적 가치를 예비평가 하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CASP10, ITGA7, MECOM, NKD1 및 PIK3CD를 조합하는 경우 AUC값이 0.8436(도 5a), IL11, IL2RA, MYC 및 NKD1을 조합하는 경우 AUC값이 0.86065(도 5b), DLL1, FANCG, FGF2, FGF7, IL11, IL21RA, IL2RA, MMP3, MYC, NKD1, FGF21, ITGA6 및 PLA2G4를 조합하는 경우 AUC값이 0.9333(도 5c)으로 정량적 방사선 반응예측치의 활용 가능성을 확인하였다.
유전자 명칭 관련 경로(pathway)
CASP10 Caspase 10, apoptosis-related cysteine peptidase Cell Cycle, Apoptosis
DLL1 delta-like 1 (Drosophila) Notch pathway
FANCG Fanconi anemia, complementation group G DNA damage control
FGF2 fibroblast growth factor 2 (basic) MAPK, PI3K, RAS
FGF7 fibroblast growth factor 7 MAPK, PI3K, RAS
FGF21 fibroblast growth factor 21 MAPK, PI3K, RAS
FZD9 frizzled family receptor 9 Wnt pathway
IL11 interleukin 11 JAK-STAT pathway
IL1R1 interleukin 1 receptor, type I JAK-STAT pathway
IL2RA interleukin 2 receptor, alpha JAK-STAT pathway
IL21RA interleukin 21 receptor, alpha JAK-STAT pathway
ITGA6 integrin, alpha 6 PI3K pathway
ITGA7 integrin, alpha 7 PI3K pathway
LAMB3 laminin, beta 3 PI3K pathway
MECOM MDS1 and EVI1 complex locus MAPK pathway
MMP3 matrix metallopeptidase 3 Transcriptional regulation
MMP7 matrix metallopeptidase 7 Wnt pathway
MYC v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog Wnt, transcriptional regulation, TGF-B, MAPK, JAK-STAT, PI3K, Cell cycle
NKD1 naked cuticle homolog 1 (Drosophila) Wnt pathway
NFKB1 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 transcriptional regulation, , MAPK, PI3K, RAS, Cell cycle
PLA2G4 phospholipase A2, group IV MAPK, RAS
PLAU plasminogen activator, urokinase transcriptional regulation,
PIK3CD phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit delta JAK-STAT, PI3K, Cell cycle
PPP3CA protein phosphatase 3, catalytic subunit, alpha isozyme Wnt, MAPK, Cell cycle
PRKCB protein kinase C, beta Wnt, MAPK, RAS
SPRY2 sprouty homolog 2 (Drosophila) JAK-STAT
<4-3> 검증 단계(validation phase)
상기 훈련 단계에서 선별한 유전자의 발현을 독립적 환자군에서 평가한 후 전체 대상 코호트에서 종합평가를 시행하였다. 구체적으로 선발된 26개 유전자를 포함한 맞춤키트를 이용하여, 독립적으로 선발한 96예의 환자에 대해 방사선 반응군과 비반응군간의 차이를 검증하였다. 이 단계에서도 새롭게 선발한 96예뿐 아니라 기존에 실험했던 143 예를 함께 분석하여 총 239예에 대해 최종 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 그 결과 하기 [표 4]에 나타낸 바와 같이 선별된 유전자의 발현이 방사선 반응군과 비반응군 간에 유의한 차이를 보인다는 점을 알 수 있었다.
Gene Point estimate 95% Confidence interval Pr> Chi Squar
DLL1 0.0101 0.00358 7.9795 0.0047
FANCG 0.00904 0.00362 6.214 0.0127
FGF2 -0.0133 0.00581 5.2279 0.0222
FGF7 0.0179 0.00516 12.0393 0.0005
IL11 0.00421 0.00147 8.2009 0.0042
IL1R1 -0.00683 0.00316 4.6814 0.0305
IL2RA 0.0112 0.00388 8.3513 0.0039
MMP3 -0.0003 0.000103 8.4209 0.0037
MYC 0.000634 0.000222 8.159 0.0043
NKD1 -0.00234 0.000949 6.1014 0.0135
FGF21 0.0375 0.011 11.6521 0.0006
ITGA7 -0.0517 0.0114 20.409 <.0001
MECOM -0.00172 0.000797 4.6757 0.0306
PLAU 0.00098 0.000295 11.0132 0.0009
PIK3CD 0.0149 0.00475 9.8366 0.0017
SPRY2 -0.001 0.000428 5.4662 0.0194
PLA2G4 -0.00844 0.00351 5.7896 0.0161
상기 훈련 단계에서와 동일하게 선별된 유전자를 선택적으로 조합하여 ROC curve를 통해 정량적으로 확인함으로써 방사선 반응 예측 효과를 진단적 가치를 평가 하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, CASP10, FGF21, FZD9, ITGA7, MECOM, NFKB1, NKD1 및 PIK3CD 를 조합하는 경우 AUC값이 0.8224(도 6a), FANCG, FZD9, ITGA7, NFKB1, PIK3CD, PLAU 및 PRKCB 를 조합하는 경우 AUC값이 0.9757(도 6b), FANCG, IL2RA 및 NFKB1을 조합하는 경우 AUC값이 0.9467(도 6c)로 정량적 방사선 반응예측치의 활용 가능성을 확인하였다.
상기와 같은 3단계를 거쳐 최종 후보 유전자를 확인하였다.
<4-4> 통계적 방법
유전자 선발 시 사용한 통계적인 방법은 단계적 로지스틱 회귀분석(stepwise logistic regression)울 사용하였고, 이를 통해 방사선 반응군을 예측할 수 있는 예측능을 비교하여 우선순위에 따라 선발하였다. 포함된 암 발현 관련 경로(pathway)에 대한 평가를 함께 시행하여 순위가 후위에 있는 경우라도 기존 문헌상 중요하다고 생각되는 유전자는 이후 단계에 포함시켰다. 예측능의 정량적 평가는 수식을 이용한 방사선 반응 예측치(Radiation-response prediction value: RPV) 를 이용하였다. 방사선 반응 예측치는 다음 수식에 의해 결정하였다.
방사선 반응 예측치(RPV) = exp(β0 + β1*gene1 + ... + β5*geneX)/(1+exp(기울기?0+β1*gene1+... + β5*geneX)
방사선 반응 예측치의 진단적 가치의 평가는 수신자조작특성곡선(Receiver operating characteristics curve, ROC curve)에 의해 곡선 아래의 면적(area under the curve, AUC)으로 확인하였다. 상기 통계는 SPSS package for Windows ver 23.0을 이용하며, p 값이 0.05 이하인 경우 의미 있는 것으로 평가하였다.

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  7. FANCG, IL2RA 및 NFKB1의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자 또는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 조성물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측용 키트.
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  18. 생물학적 시료로부터 FANCG, IL2RA 및 NFKB1의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 대조군 지표에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는 직장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
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