CN105925726A - 一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的引物对及其应用，所公开的引物对由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。申请人进行的实验显示，本发明所公开的引物对能够特异性的、高灵敏的判别病羊鼻腔分泌物样品中是否含有羊地方性鼻内肿瘤病毒基因。

Description

一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的引物对及其应用

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物对及其在检测羊地方性鼻内肿瘤病毒中的应用。

背景技术

羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor，ENT)是由羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus，ENTV)引起的一种慢性、进行性、接触传染性的肿瘤性疾病，该病表现为食欲减退，极度消瘦，呼吸困难，鼻漏，出现鼻内单侧或双侧性增生物，至今报道的病例多数为腺癌，少数为乳头状腺瘤。本病目前已呈世界性分布，我国的内蒙古、湖南、四川、陕西等地也有该病发生。ENTV感染细胞后可诱导羊鼻内粘膜上皮细胞非急性转化(即具有致瘤性)，诱导肿瘤的产生。ENT一年四季均可发生，呈地方性流行，也有爆发或散发，发病率5％～16％，死亡率100％。由于该病的潜伏期长达数月甚至数年，引起肿瘤，给养羊业造成了一定的经济损失。

ENTV在分类学上属于逆转录病毒科，β逆转录病毒属的B/D嵌合型逆转录病毒。病毒粒子呈圆形，直径90nm～110nm，有囊膜，核衣壳为二十面体对称，ENTV的基因组是单股正链线性RNA(ssRNA)的二聚体，单体长约7.5kb。目前，我国用于羊地方性鼻内肿瘤的实验室诊断手段比较落后，主要依据临床症状及其剖检观察进行判断，缺乏快速、简便的诊断方法。国外已有利用RT-PCR方法从肿瘤组织中检测羊地方性鼻内肿瘤病毒的报道，但这需要屠宰羊，提取肿瘤组织，所需时间较长，耗时费力，最主要不能进行活体感染羊的检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可用于羊地方性鼻内肿瘤病毒检测引物对。

本发明所提供的用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的引物对，由SEQ IDNo.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。

上述所公开的引物对特异性的针对羊地方性鼻内肿瘤病毒不同基因中的高度保守区域，能够准确、快速、方便的判别待测样品中是否含有羊地方性鼻内肿瘤病毒基因，且具有较高的灵敏度。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的PCR试剂，包含由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对。

本发明的还一个目的是提供一种羊地方性鼻内肿瘤病毒的检测试剂盒，包含上述的引物对或PCR试剂。

本领域技术人员容易理解，作为完整商业和应用封装的试剂盒，为了提高检测的准确性，便于进行阴性和阳性对照，上述试剂盒中还可含有羊地方性鼻内肿瘤病毒的阳性对照和阴性对照。

本领域技术人员容易理解，为了便于应用，上述试剂盒中还可包含便于快速操作使用的其它辅助试剂，如DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂等，这些成分是PCR扩增检测中常用的，其用量和使用也为本领域技术人员熟练掌握，此处不予赘述。

最后，本发明还公开了上述的引物对、PCR试剂、检测试剂盒在鉴别和检测羊地方性鼻内肿瘤病毒中的应用。

具体的说，是以SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA分别作为上游引物、下游引物，对待测样品中提取的DNA进行PCR扩增产物；检测所得PCR扩增产物，若PCR扩增产物具有314bp特异性片段(该片段的碱基排列如SEQ ID No.3所示)，则表明待测样品羊地方性鼻内肿瘤病毒阳性。相应的，如果没有扩增出对应片段，则表明待检样品中羊地方性鼻内肿瘤病毒阴性。

在上述应用中，PCR扩增反应条件可采用常见分子生物学实验教材上记载的常规条件、时间、温度、循环次数，作为一种优选，PCR扩增条件为变性温度94℃、退火温度55℃、延伸温度72℃。

与已有技术方案相比，本发明具有如下技术进步：本发明采用的引物对来自羊地方性鼻内肿瘤病毒不同基因中高度保守的区域，能准确、快速、方便的判别病料中是否含有羊地方性鼻内肿瘤病毒，灵敏度达0.5pg；本发明的引物对在PCR检测羊地方性鼻内肿瘤病毒中具有敏感性高、特异性好的特点。

附图说明

图1为PCR扩增产物检测电泳图：其中，M为标准分子量DL-2000，1～5为羊地方性鼻内肿瘤的PCR扩增产物；

图2为PCR方法敏感性试验：其中，1～6为所用模板的量分别为5ng，500pg，50pg，5pg，0.5pg，0.05pg，M为标准分子量DL-2000；

图3为PCR方法检测羊地方性鼻内肿瘤病毒的特异性试验：其中，M为标准分子量DL-2000，1为羊地方性鼻内肿瘤患羊肿瘤样品，2为羊地方性鼻内肿瘤患羊鼻拭子样品，3为羊口疮疫苗，4为口蹄疫疫苗，5为小反刍兽疫疫苗，6为山羊痘疫苗，7为正常羊鼻液样品，8为羊胚胎成纤维细胞样品，9为阴性对照；

图4为试剂盒保存不同时间后PCR扩增结果：其中，M为标准分子量DL-2000，1为保存一个月，2为保存三个月，3为保存六个月，4为保存九个月，5为保存十二个月；

图5为试剂盒冻融不同次数后PCR扩增结果：其中，M为标准分子量DL-2000，1为冻融1次，2为冻融3次，3为冻融6次，4为冻融10次，5为冻融20次。

具体实施方式

为了更好的说明本发明技术方案的效果及其操作方法，在如下实施例中申请人提供了本发明引物对、试剂盒、PCR试剂等的具体类型、规格、用量、操作过程。本领域技术人员容易理解，如下所提供的实现仅为示意性的，并不对本发明构成特别限定。本发明的保护范围涵盖于权利要求及其等同变换。

实施例1：引物对以及采用本发明引物对和相关PCR试剂的试剂盒的制备

羊地方性鼻内肿瘤病毒病料的获取：临床病料于2015年8月采自陕西省宝鸡市和杨凌高新农业技术示范区羊养殖场发病羊的鼻腔棉拭子共21份，将棉拭子加300μL生理盐水浸泡20min，转入1.5mL的EP管，反复冻溶2～3次后，于-20℃保存。

引物：上游引物P1(ENTVS)：5’-AATATTTCTTTAGATCTTC-3’，下游引物P2(ENTVA)：5’-CCTAAAAGCTCCATTAGC-3’，预期扩增片段大小为314bp。引物由上海英俊合成，2OD/管。

试剂盒所用其它PCR扩增实验用试剂：

DNA提取试剂：购自天根生化科技(北京)有限公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(血液组织细胞基因组提取试剂盒DP304)。

超纯水(ddH2O)：自行过滤制备，1mL/管。

2×PCP master Mix：购自北京康为世纪生物科技有限公司，1mL/管。

50×TAE电泳缓冲液采用0.5mol/L乙铵四乙酸二钠((EDTA)溶液(pH8.0)配制，配置过程为：EDTA 18.61g、灭菌双蒸水80mL、氢氧化钠调pH至8.0、灭菌双蒸水加至100mL。

50×TAE电泳缓冲液配制过程为：三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)100mL、灭菌双蒸水加至1000mL，使用时灭菌双蒸水稀释50倍。

Glodview核酸染料：购自上海赛百盛基因技术有限公司，1mL/管。

上样缓冲液：购自北京康为世纪生物科技有限公司(2×PCP master Mix中已加入)，1mL/管。

将上述试剂和器材封装到试剂盒中，用量可如下所示：

羊地方性鼻内肿瘤病毒阳性对照和阴性对照各500μL；

DNA提取试剂：可直接采用天根生化科技(北京)有限公司生产的病毒核酸提取试剂盒(血液组织细胞基因组提取试剂盒DP304)；

PCR反应试剂：由引物P1 15μL(10mM)，引物P2 15μL(10mM)，2×PCRMasterMix 200μL和ddH2O(超纯水)200μL组成；

电泳检测试剂：由50×TAE电泳缓冲液20mL，GoldView 50μL组成。

实施例2：基于本发明的检测方法

主要仪器如下：PCR扩增仪(Eppendorf)、离心机(1-14，Sigma)、紫外凝胶成像仪(JS-780全自动凝胶成像分析系统，上海培清)、电泳槽(DYCP-31BN，北京六一生物科技有限公司)。

具体方法如下：

首先进行待测样品DNA的提取：采用天根生化科技(北京)有限公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(血液组织细胞基因组提取试剂盒DP304)，根据说明书提取病毒的DNA，具体为：

(1a)取羊鼻腔棉拭子放入含有200μL PBS液的EP管，浸泡20min，使羊鼻腔内容物进入PBS液中，弃去棉拭子，留下的液体作为样品，如果样品不足200μL，可加PBS至200μL。

(1b)加入20μl Proteinase K溶液，混匀，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。。

(1c)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(1d)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(1e)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(1f)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(1g).向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(1h)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(1I)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。

如采用其它厂家的病毒核酸提取试剂盒，按照其提供的说明书操作即可。

然后进行PCR扩增试验：

25μLPCR扩增体系：2×PCR Master Mix 12.5μL；ddH2O 6.5μL；上游引物P1 1μL；下游引物P2 1μL和模板2μL；

PCR反应条件：94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

最后进行琼脂糖凝胶电泳：

将0.5g琼脂糖和50mL 1×TAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldView 1.0μL，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取10μL点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以110V电压于1×TAE中电泳35min

基于上述过程，判断结果：

紫外灯下观察结果。如果扩增出一条314bp特异性片段，则表明待检棉拭子羊地方性鼻内肿瘤病毒阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检棉拭子羊地方性鼻内肿瘤病毒阴性，结果见图1。

实施例3：本发明检测方法的敏感性试验。

以羊地方性鼻内肿瘤组织提取的DNA为模板，从5ng DNA开始按10倍递增稀释，用羊地方性鼻内肿瘤组织提取的DNA为模板进行PCR反应程序进行扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明PCR方法可检测出5pg的模板DNA，具有较高的敏感性，结果如图2所示。

实施例4：特异性试验。

用相同的方法提取羊地方性鼻内肿瘤患羊肿瘤样品，羊地方性鼻内肿瘤患羊鼻棉拭子样品，羊口疮疫苗，口蹄疫疫苗，小反刍兽疫疫苗，山羊痘疫苗，正常羊鼻棉拭子样品，羊胚胎成纤维细胞样品组织的DNA，并以此为摸板，用设计的引物进行PCR扩增，1％的琼脂糖进行凝胶电泳，只有羊地方性鼻内肿瘤患羊肿瘤样品和鼻棉拭子样品扩增出一条314bp的片段，将羊地方性鼻内肿瘤病毒的PCR产物进行基因测序，与Genbank中已发表的序列进行比较，结果与已发表的羊地方性鼻内肿瘤病毒基因序列达99％的同源性，这表明所扩增的片段为羊地方性鼻内肿瘤病毒，而羊口疮疫苗，口蹄疫疫苗，小反刍兽疫疫苗，山羊痘疫苗，正常羊鼻棉拭子样品，羊胚胎成纤维细胞样品组织的DNA和阴性对照都未扩增出条带来，这表明该方法所扩增的片段为羊地方性鼻内肿瘤病毒的特异性片段，结果如图3所示。

实施例5：稳定性试验。

将试剂保存于-20℃，经过一年的保存和反复冻融后，对羊地方性鼻内肿瘤病毒的模板重新进行检测，见图4和图5，结果表明，该试剂盒的稳定性较好，可以长期保存。

Claims (7)

1.一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的引物对，其特征在于由SEQ IDNo.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。

2.一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的PCR试剂，其特征在于包含权利要求1中的由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对。

3.一种羊地方性鼻内肿瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的PCR试剂。

4.根据权利要求3的检测试剂盒，其特征在于包含羊地方性鼻内肿瘤病毒的阳性对照和阴性对照。

5.权利要求1的引物对，或权利要求2的PCR试剂，或权利要求3的检测试剂盒，在鉴别和检测羊地方性鼻内肿瘤病毒中的应用。

6.根据权利要求5的应用，其特征在于以SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ IDNo.2所示的单链DNA分别作为上游引物、下游引物，对待测样品中提取的DNA进行PCR扩增产物；检测所得PCR扩增产物，若PCR扩增产物具有314bp特异性片段，则表明待测样品羊地方性鼻内肿瘤病毒阳性。

7.根据权利要求5的应用，其特征在于PCR扩增条件为变性温度94℃、退火温度55℃、延伸温度72℃。