CN105296142B - 一种快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,通过提取牡丹种子中的总脂,将总脂上样至固相萃取硅胶小柱,再分别以氯仿、丙酮和甲醇作洗脱液进行洗脱,获得中性脂、糖脂和磷脂,再对中性脂、糖脂和磷脂分别做进一步展开,从中性脂中分离出三酰甘油,从糖脂中分离出单半乳糖二脂酰甘油、双半乳糖二脂酰甘油和硫代异鼠李糖二脂酰甘油,从磷脂中分离出磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰甘油。本发明能够对牡丹种子油脂中的9种脂类成分进行有效的分离,获得的脂类成分种类丰富,总脂、中性脂、糖脂和磷脂经甲酯化后获得脂肪酸,该方法快速、简单且成本低,为基础研究提供切实可行的分析方法。
Description
技术领域
本发明属于木本植物油料作物领域,具体涉及一种快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,仅用少量种子就可以快速高效提取牡丹种子中的脂类成分,进一步分离得到的总脂,并分析其中的组分及含量。
背景技术
富贵吉祥的牡丹,素有“国花”的美誉,是中国传统文化的重要组成部分,其根皮可以入药,其籽油富含不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA,18:3Δ9,12,15),使得牡丹兼具有观赏、药用和油用价值于一身。近年来,多不饱和脂肪酸的开发已成为功能食品研究的热点之一,而牡丹籽油中饱和脂肪酸含量很低,不饱和脂肪酸含量非常高。若用牡丹籽油与常见食用油(ALA含量少)进行合理调配,开发营养合理且有保健功能的调和油,将让牡丹资源发挥更好的效益,拥有广阔的应用前景。所以,作为新型资源植物而迅速发展的油用牡丹产业,为缓解我国食用油危机、提升我国油用作物产业的品质内涵带来了新的机遇,同时也提出了新的科技挑战。
细胞中的脂肪酸主要通过酯化反应形成复合脂质。甘油脂是脂肪酸与甘油的酯化反应产物,包括贮存脂或膜脂,分为甘油磷脂(phospholipids,PL)、甘油糖脂(glycolipids,GL)和中性脂(neutral lipids,NL),PL和GL也统称为极性脂。NL包括单酰甘油(monoacylglycerol,MAG)、二酰甘油(diacylglycerol,DAG)和三酰甘油(triacylglycerol,TAG),而TAG作为有机体能量的主要储存方式。PL和GL是膜脂的主要组分,PL是细胞膜的骨架成分,分布于质膜、内质网、叶绿体、线粒体、高尔基体和核膜等,是细胞的基本结构成分,也是重要的信号分子或前体。PL家族主要包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酸(phosphatidyl acid,PA)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)、溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,LPC)。PC在植物的甘油磷脂中最为普遍存在,并且PA和PC在TAG形成中起关键作用,PC是脂肪酸去饱和及其他修饰的底物,并直接为DAG提供脂肪酸供体形成TAG。另外,GL是叶绿体和类囊体膜的主要成分,在植物光合作用中至关重要,主要包括单半乳糖二脂酰甘油(MGDG)、双半乳糖二脂酰甘油(DGDG)、硫代异鼠李糖二脂酰甘油(SQDG)。
α-亚麻酸属于ω-3系列多不饱和脂肪酸,在人体内不能合成、代谢,必须依靠膳食来获得,饮食中缺少ω-3家族的脂肪酸会导致高血脂、心血管疾病、自身免疫疾病、炎症反应和中枢神经系统疾病等[6-7]。FAO/WHO推荐饮食中ω-6与ω-3脂肪酸的比例应低于5(FAO&WHO,1994)。普通食物中,鱼油的ALA含量较高,但是环境污染日趋严重,加上渔业资源的不合理捕捞,且素食主义者无法从鱼油中补充ω-3,故不能作为ALA的理想供给者。因此,植物籽油,如油菜(8%)、大豆(7.95%)、核桃(6%)、橄榄油(0.73%)、油茶油(0.54%)、玉米(0.51%)、花生(0.08%)和葵花籽油(0.01%)等逐渐成为ALA的主要供给原料。但是,这些大宗油料作物中ALA含量均很低。
牡丹籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸(约83.05-90%):ALA(>40%)、油酸(27.73%)、亚油酸(21.4%),这些都是对人体非常重要的脂肪酸,而且ω-6/ω-3脂肪酸的比值很低,仅为0.6,这一比值远远低于其它食用油中ω-6/ω-3的比例,如菜籽油(~2.4)、大豆油(~3.9)、橄榄油(~16.7)、玉米油(~100)、花生油(581.6)、葵花籽油(~670),更为符合FAO/WHO推荐的饮食标准(ω-6/ω-3脂肪酸<5)。虽然紫苏籽(Perilla frutescens)和亚麻籽(Linum usitatissimum)中ALA含量较高,分别为54%和51%,但紫苏和亚麻属于草本植物,在种子产量(亩产约190公斤和33-55公斤)和经济成本方面远不如木本作物的牡丹(亩产400-900公斤)。
牡丹种子油的传统的提取方法是索氏萃取,实验室多采用脂肪提取器来提取,但是该方法不仅需要样品多且耗时长,一般需要几个小时到十几个小时。随着植物籽油提取技术的不断改进,特别是索氏萃取、超临界流体萃取技术及超声波、微波萃取法的应用,极大提高了植物籽油提取率,但是这些提取方法需要的样品量多,对于稀缺资源的样本来说很难达到提取要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,该方法能够快速、高效提取牡丹种子中的总脂,并对其中的不同脂类进行有效的分离,获得的脂类成分种类丰富,该方法快速、简单且成本低,为基础研究提供切实可行的分析方法。
为了达到上述目的,本发明提供的技术方案如下:
一种快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,包括以下步骤:
1)提取总脂
取牡丹种子,于30~60℃烘干、去壳、液氮研磨成粉末,将粉末用氯仿和甲醇的混合液于30~40℃抽提0.5~2h,得到抽提液,再加入氯仿和水,振荡混匀,静置或离心后,分层,分离出有机相;将提取后的剩余残渣重复上述步骤1~2次,合并各次分离出的有机相,用氮气吹干,得到牡丹种子总脂;
2)分离总脂中的中性脂、糖脂和磷脂
用氯仿平衡硅胶柱,将得到的牡丹种子总脂上样至硅胶柱中,先用氯仿洗脱,得到氯仿洗脱液;再用丙酮洗脱,得到丙酮洗脱液;最后用甲醇洗脱,得到甲醇洗脱液;
将氯仿洗脱液、丙酮洗脱液、甲醇洗脱液浓缩干燥后分别得到中性脂、糖脂、磷脂;
3)展开并分离中性脂、糖脂和磷脂中的不同成分
将步骤2)得到的中性脂、糖脂和磷脂溶解后,分别点样于硅胶板上,将硅胶板置于染缸中进行展开;
用展示剂一对糖脂和磷脂进行展开、显色、分离,其中,分离糖脂后得到单半乳糖二脂酰甘油、双半乳糖二脂酰甘油和硫代异鼠李糖二脂酰甘油;展开分离磷脂后得到磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰甘油;展示剂一为乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、甲醇和0.2%~0.3%KCl水溶液的混合液,其中乙酸乙酯:异丙醇:氯仿:甲醇:0.2%~0.3%KCl水溶液的体积比为25:25:25:10:7.2~10.8;
用展示剂二对中性脂进行展开、显色、分离,得到三酰甘油;展示剂二为正己烷、乙醚和冰乙酸的混合液,其中正己烷:乙醚:冰乙酸的体积比为40:10:0.5~1.5。
进一步,步骤1)中氯仿和甲醇的混合液中氯仿和甲醇的体积比为1:1.8~2.2。
又进一步,步骤1)中氯仿总量:甲醇:水的体积比为1:1:0.85~0.95。
进一步,所述的步骤3)的显色方法为:喷洒显色剂后于120~140℃下烘干3~5min完成显色,所述的显色剂为8%的磷酸和10%的硫酸铜溶液。
本发明建立了一种应用材料少、操作方法快速、简单的提取分离牡丹种子油脂的方法,抽提牡丹种子中的总脂时先加入液氮研磨,使得细胞完全破碎、物质完全释放,再利用本发明的提取剂(氯仿、甲醇和水)抽提脂类成分,可以快速、完全将总脂提取出来,操作方法快速、简单,较传统的索氏抽提节省75%的时间。
本发明在提取牡丹种子总脂时将提取剂(氯仿、甲醇和水)分批加入,先用氯仿和甲醇在30~40℃的水浴振荡0.5~2h,快速有效地提取大部分牡丹种子的总脂,再分别加入氯仿和水进一步提取,充分有效地提取牡丹种子中的各种脂类成分,增加了提取剂的体积,利于有机相和水相的分层,提高牡丹种子中提取的总脂含量,本发明提取牡丹种子的总脂含量可达33%以上,总脂中脂类成分的纯度高,甲酯化后得到的脂肪酸含量高。
经过多次的摸索,本发明的展示剂一(乙酸乙酯:异丙醇:氯仿:甲醇:0.2%~0.3%KCl水溶液的体积比为25:25:25:10:7.2~10.8的混合液)、展示剂二(正己烷:乙醚:冰乙酸的体积比为40:10:0.5~1.5的混合液)能够最有效地将糖脂、磷脂和中性脂进行分离,可以快速分离出其中的多种脂类成分。同时,对总脂、糖脂、磷脂和中性脂进行甲酯化后得到脂肪酸,可以直接应用GC-MS检测进行定性定量分析,快速、简单且成本低,而且牡丹种子材料用量少,脂类成分获得率高,节约样品。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
1)本发明抽提牡丹种子中的总脂时先加入液氮研磨,使得细胞完全破碎、物质完全释放,再分批加入本发明的提取剂(氯仿、甲醇和水)抽提脂类成分,可以快速、完全将总脂提取出来,操作方法快速、简单,较传统的索氏抽提节省75%的时间。
2)本发明通过改进洗脱液及展开剂的种类和配比浓度,快速、有效地分离牡丹种子总脂中的不同脂类,适用范围广,最低仅需毫克级别的种子就可以提取到牡丹种子油脂,并将不同脂类家族进行有效的分离。
3)本发明将提取牡丹种子得到的总脂、糖脂、磷脂和中性脂经甲酯化后得到脂肪酸,其中,来自中性脂的脂肪酸约占总脂肪酸的90.2~91.9%;来自糖脂的脂肪酸约占总脂肪酸的3.2~3.8%;来自磷脂的脂肪酸约占总脂肪酸的5.0~6.0%,本发明为油料作物的基础科学研究提供技术指导和参考。
4)本发明将提取牡丹种子得到的总脂进行分离,得到9种不同的脂类成分,大大丰富了牡丹种子中提取到的脂类家族。
附图说明
图1为本发明实施例中提取牡丹种子的总脂和甲酯化后的总脂肪酸含量的比较图。
图2为本发明实施例中牡丹种子总脂展开后的不同脂类。
图3为本发明实施例中杨山牡丹成熟种子脂肪酸色谱图。
图4为本发明实施例中紫斑牡丹成熟种子脂肪酸色谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
实施例
1.材料
杨山牡丹、紫斑牡丹种子分别采收于上海辰山植物园牡丹和芍药基地。甲醇、浓硫酸、三氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、异丙醇、乙醚、冰乙酸、丙酮等购自国药集团化学试剂有限公司,气相色谱-质谱用到的试剂均为色谱纯级别;37种脂肪酸标准品购自Sigma;薄层色谱硅胶板购自默克公司;棕色螺纹口顶空瓶、磁性金属盖(PTFE蓝色硅胶隔垫)、CNW固相萃取硅胶小柱、CNW(亲水)粘合型针式滤器等均购自上海安谱实验科技股份有限公司。
2.方法
1)提取总脂
取3粒牡丹种子于60℃烘干至恒重,去壳后在研钵中加入液氮研磨成粉末,称取100mg粉末于20mL的顶空样品瓶中,制作3个平行样。样品瓶中加入3mL氯仿:甲醇(体积比为1:2)混合液,涡旋振荡1min,35℃恒温水浴中以150rpm振荡1h,涡旋振荡1min后加入1mL氯仿,涡旋振荡1min后加入1.8mL超纯水,氯仿:甲醇:水的最终体积比为1:1:0.9,5500rpm离心15min后抽提液分为两层,脂类成分溶入下层的有机相中,取出有机相通过CNW(亲水)粘合型针式滤器(0.45μm)过滤,滤液直接加入到一个预先称重的玻璃瓶中,剩余残渣重复以上步骤一次,合并有机相于玻璃瓶中,氮气浓缩样品至恒重,得到总脂,根据公式(I)计算总脂的含量。
LW(g/g)=(m2-m0)/m1 公式(I)
其中,m1是种子粉末的重量;m2是玻璃瓶和总脂的重量;m0是空玻璃瓶的重量。
将3个平行样得到的总脂含量取平均值得到总脂含量,计算结果参见图1,由图1可知,杨山牡丹种子的总脂含量为368.2mg/g,甲酯化后总脂肪酸含量为342.1mg/g,紫斑牡丹种子的总脂含量为339.7mg/g,甲酯化后总脂肪酸含量为271.1mg/g。
2)分离总脂中的中性脂、糖脂和磷脂
规格为500mg、6mL的固相萃取硅胶小柱用5mL氯仿平衡后,加入50mg总脂,先用10mL氯仿进行洗脱,中性脂溶于该洗脱液中;再用10mL丙酮进行洗脱,糖脂溶于该洗脱液中;最后用10mL甲醇进行洗脱,磷脂溶于该洗脱液中,将洗脱后的溶液分别用氮气进行浓缩干燥,得到中性脂、糖脂和磷脂。
3)分离中性脂、糖脂和磷脂
将上述得到的中性脂、糖脂和磷脂分别溶于氯仿:甲醇(体积比2:1)混合液后,分别点样于同一块薄层色谱硅胶板上,将硅胶板置于染缸(20cm×20cm×5cm)中进行展开。
首先进行糖脂和磷脂的展开,加入47mL的展示剂一(按照乙酸乙酯:异丙醇:氯仿:甲醇:0.25%KCl体积比为25:25:25:10:9配制)到染缸中,对点样的硅胶板进行展开,展剂液面前沿延伸至硅胶板中央位置时,结束极性脂的展开;然后取出硅胶板置于通风橱中晾干,待液体完全挥发后再放置于新的染缸(20cm×20cm×5cm)中进行中性脂的展开,向染缸中加入51mL的展示剂二(正己烷:乙醚:冰乙酸体积比为40:10:1),当液面达到硅胶板边缘时结束,取出硅胶板置于通风橱中晾干。显色剂为8%的磷酸和10%的硫酸铜溶液,将显色剂均匀喷洒于晾干后的硅胶板上,140℃烘干3min完成显色,具体显色结果参见图2,由图2可知,通过薄层色谱法展开后,本发明的展示剂能够有效的将牡丹种子中性脂中的三酰甘油(TAG),糖脂中的单半乳糖二脂酰甘油(MGDG)、双半乳糖二脂酰甘油(DGDG)和硫代异鼠李糖二脂酰甘油(SQDG)以及磷脂中的磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰甘油(PG),磷脂酸(PA),磷脂酰丝氨酸(PS),磷脂酰胆碱(PC)进行分离,得到9种脂类成分,具体如图2中,1-2为杨山牡丹中性脂:三酰甘油(TAG);3-4为紫斑牡丹中性脂:三酰甘油(TAG);5-6为杨山牡丹糖脂:单半乳糖二脂酰甘油(MGDG),双半乳糖二脂酰甘油(DGDG),硫代异鼠李糖二脂酰甘油(SQDG);7-8为杨山牡丹磷脂:磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰甘油(PG),磷脂酸(PA),磷脂酰丝氨酸(PS),磷脂酰胆碱(PC);9-10为紫斑牡丹糖脂:单半乳糖二脂酰甘油(MGDG),双半乳糖二脂酰甘油(DGDG),硫代异鼠李糖二脂酰甘油(SQDG);11-12为紫斑牡丹磷脂:磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰甘油(PG),磷脂酸(PA),磷脂酰丝氨酸(PS),磷脂酰胆碱(PC)。
4)甲酯化
总脂、中性脂、糖脂和磷脂的甲酯化:将得到的这些脂类成分浓缩后置于顶空样品瓶中,加入4mL含4%浓硫酸的甲醇溶液,涡旋振荡1min,充氮气以排除空气避免氧化;将样品瓶盖旋紧于85℃恒温水浴中进行酯化反应1h,结束后涡旋振荡1min,加入2mL超纯水结束酯化反应,再加入2mL正己烷,5500rpm离心15min后收集上清液,针式滤器(0.45μm)过滤,滤液用氮气浓缩至恒重。酯化物加入适量的正己烷溶解,稀释至一定浓度后直接用于气相色谱-质谱检测。
5)气相色谱-质谱(GC-MS)检测甲酯化的脂肪酸组分
色谱柱为HP-88型毛细管柱(60m×0.25mm×0.2μm);升温程序为70℃保留1min,10℃/min升温至210℃用于0min,10℃/min升温至220℃用于0min,然后10℃/min升温至230℃,最后保留8min;分流比为5:1;进样量为1μL。
3.结果
对总脂和硅胶柱分离后得到的中性脂、糖脂和磷脂进行甲酯化,将脂类成分转化为相应的脂肪酸,参见图3~4,分别显示了杨山牡丹和紫斑牡丹种子的脂肪酸种类色谱图,再检测脂肪酸总量(参见图1)及各种脂肪酸的含量(参见表1)。
由图3~4可见,本发明提取的牡丹种子脂类成分甲酯化后存在5种主要的脂肪酸及几种微量组分的脂肪酸。具体地,图3~4中,1为豆蔻酸(C14:0);2为棕榈酸(C16:0);3为十六碳一烯酸(C16:1Δ9);4为十七碳一烯酸(C17:1Δ10);5为硬脂酸(C18:0);6为油酸(C18:1Δ9);7为异油酸(C18:1Δ11);8为亚油酸(C18:2Δ9,12);9为花生酸(C20:0);10为α-亚麻酸(C18:3Δ9,12,15);11为二十碳一烯酸(C20:1Δ11)。
表1牡丹种子油脂中5种主要脂肪酸含量(mg/g DW)
C16:0 | C18:0 | C18:1<sup>Δ9</sup> | C18:2<sup>Δ9,12</sup> | C18:3<sup>Δ9,12,15</sup> | |
杨山牡丹 | 15.87±0.65 | 4.71±0.36 | 66.21±2.11 | 107.68±4.75 | 144.09±13 |
紫斑牡丹 | 10.88±1.49 | 3.43±0.47 | 59.61±9.51 | 45.73±6.91 | 148.23±23.98 |
可见,本发明提取的牡丹种子脂类成分甲酯化后存在5种主要的脂肪酸成分为:棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1Δ9)、亚油酸(C18:2Δ9,12)、α-亚麻酸(C18:3Δ9,12,15),其具体含量详见表1,甲酯化后存在几种微量组分的脂肪酸,如豆蔻酸(C14:0)、十六碳一烯酸(C16:1Δ9)、十七碳一烯酸(C17:1Δ10)、异油酸(C18:1Δ11)、花生酸(C20:0)、二十碳一烯酸(C20:1Δ11)。
脂肪酸含量检测结果表明,中性脂的脂肪酸含量达到168.01~201.14mg/g,约占总脂肪酸的90.2~91.9%;糖脂中的脂肪酸含量达到5.8~8.53mg/g,约占总脂肪酸的3.2~3.8%;磷脂中的脂肪酸9.01~13.41mg/g,约占总脂肪酸的5.0~6.0%。
按照本发明方法,采用有机试剂氯仿:甲醇可以快速有效的抽提牡丹种子的总脂并进行定量,抽提后的总脂可以直接用固相萃取硅胶小柱分离中性脂、糖脂、磷脂以及通过薄层色谱方法对脂类进行分离,得到的脂类甲酯化后酯化产物直接用于GC-MS检测,通过脂肪酸标准品和谱库检索可以进行脂肪酸的定性定量分析。
Claims (5)
1.一种快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,其包括以下步骤:
1)提取总脂
取牡丹种子,于30~60℃烘干、去壳、液氮研磨成粉末,将粉末用氯仿和甲醇的混合液于30~40℃抽提0.5~2h,得到抽提液,再加入氯仿和水,振荡混匀,静置或离心后,分层,分离出有机相;将提取后的剩余残渣重复上述步骤1~2次,合并各次分离出的有机相,用氮气吹干,得到牡丹种子总脂;
2)分离总脂中的中性脂、糖脂和磷脂
用氯仿平衡硅胶柱,将得到的牡丹种子总脂上样至硅胶柱中,先用氯仿洗脱,得到氯仿洗脱液;再用丙酮洗脱,得到丙酮洗脱液;最后用甲醇洗脱,得到甲醇洗脱液;
将氯仿洗脱液、丙酮洗脱液、甲醇洗脱液浓缩干燥后分别得到中性脂、糖脂、磷脂;
3)展开并分离中性脂、糖脂和磷脂中的不同成分
将步骤2)得到的中性脂、糖脂和磷脂溶解后,分别点样于硅胶板上,将硅胶板置于染缸中进行展开;
用展示剂一对糖脂和磷脂进行展开、显色、分离;其中,分离糖脂后得到单半乳糖二脂酰甘油、双半乳糖二脂酰甘油和硫代异鼠李糖二脂酰甘油;分离磷脂后得到磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰甘油;所述展示剂一为乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、甲醇和0.2%~0.3%KCl水溶液的混合液,其中乙酸乙酯:异丙醇:氯仿:甲醇:0.2%~0.3%KCl水溶液的体积比为25:25:25:10:7.2~10.8;
用展示剂二对中性脂进行展开、显色、分离,得到三酰甘油;所述展示剂二为正己烷、乙醚和冰乙酸的混合液,其中正己烷:乙醚:冰乙酸的体积比为40:10:0.5~1.5。
2.根据权利要求1所述快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,其特征在于,步骤1)中氯仿和甲醇的混合液中氯仿和甲醇的体积比为1:1.8~2.2。
3.根据权利要求1或2所述快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,其特征在于,步骤1)中氯仿总量:甲醇:水的体积比为1:1:0.85~0.95。
4.根据权利要求1所述快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,其特征在于,步骤3)中的显色方法为:喷洒显色剂后于120~140℃下烘干3~5min完成显色。
5.根据权利要求4所述快速提取和分离牡丹种子中脂类成分的方法,其特征在于,所述的显色剂为磷酸和硫酸铜溶液。
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