CN102031280A

CN102031280A - 利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法

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Publication number: CN102031280A
Application number: CN2009100195244A
Authority: CN
Inventors: 张前前; 梁生康; 薛玉志; 闫学平; 刘丽萍; 李公让; 张妍
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: CN102031280B

Abstract

本发明涉及钻井液的生物毒性评价，具体地说是利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法，将平稳生长期的海洋微藻液与钻井液贮备液进行混合培养3～8小时；取样，测定发射荧光光谱，得到678～685nm处的藻叶绿素荧光强度；以未加储备液的微藻荧光强度作为对照，计算微藻的相对死亡率：根据微藻的相对死亡率，利用Curveexpert或Microsoft Excel2003软件绘制微藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，根据7～8h EC₅₀值按照国家标准确定钻井液有无毒性。本发明建立的微藻法对水基钻井液的毒性评价结果与卤虫的96h LC₅₀的一致，比常规96h生物毒性实验时间缩短了88h，且能够在现场使用。

Description

利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法

技术领域

本发明涉及钻井液的生物毒性评价，具体地说是利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法。

背景技术

钻井液是一种由水以及各种化学处理剂组成的极其复杂的多相稳定胶态悬浮体，其生物毒性主要来源于钻井液各组分。对于钻井液的生物毒性评价的研究始于20世纪60年代，已发展了包括96h急性毒性和慢性毒性等多种评价方法，所采用的受试生物体多种多样，包括糠虾、发光细菌、海洋微藻(如Skeletonema costatum，即本工作所选用的中肋骨条藻)、桡脚类、蚤类和鱼类以及双贝类软体动物、片脚类动物。美国等国家主要检测钻井液的毒性，以欧洲经济合作与发展组织(OECD)为代表的组织和国家则要求同时检测钻井液及其组分的毒性。目前国内外对废弃钻井液的毒性检测及分级评价方法尚无统一标准。

20世纪70年代中期美国环保局(EPA)和石油工业协会(API)共同制订了巴西拟糠虾(Mysidopsis bahia)96h急性毒性实验法，是美国环保局批准的钻井液毒性评价的唯一方法，也是美国试验与材料学会(ASTM)和美国石油工业协会推荐的钻井液毒性的评价标准。由于美国EPA推荐使用的巴西拟糠虾在我国无分布，我国学者致力于寻找新的可以替代糠虾的受试生物。

与美国EPA糠虾法的96h急性毒性试验时间相比，发光细菌法和发光海藻法测量时间大大缩短。其中发光细菌法是根据发光细菌的发光度随样品毒性总体浓度的增高而呈线性降低的特性，测定发光细菌在接触样品15min后的发光量，得出样品的毒性水平。该检测方法具有简易、快速、实时的特点，但由于多数钻井液的黑褐色在发光细菌的发光波段有吸收，需要校正才能应用。另外，该方法与糠虾法的相关性较低，仅为0.3。而发光海藻法采用专用的毒性检测仪，如QwikLiteTM 200，利用夜光发光藻Pyrocystislunula作为测试物种，当海藻接触到污染物时，水中的毒性会杀死海藻，从死亡率预测污染物对人体和生态环境危害的严重性，4～5h时即可得出钻井液的毒性结果。但是发光海藻在实验室培养较为困难，并且要求钻井液储备液的pH在7.5-8.0，通常钻井液储备液的pH值往往超出此范围。

在海洋环境中生物种类繁多，对钻井液的耐受性差异也很大，钻井液对海域污染评价至少需要从海水和沉积物两方面来衡量。因此，20世纪90年代一些欧洲北海沿岸国家(North Sea countries：主要包括英国、挪威、荷兰、丹麦)出台了多种受试生物联合毒性评价指标，如挪威石油工业协会采用海洋微藻Skeletonema costatum、桡脚类动物Acartia tonsa和双贝类软体动物Abra alba、片脚类动物Corophium volutator等分别检测合成基钻井液对海洋生物和底栖生物的毒性。西澳矿业与能源部(WADME)采用三种生物评价钻井液的毒性：等边金藻Isochysis sp.、对虾Panaeus monodon以及桡脚类动物Gladioferens imparipes。

2001年我国颁布的国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》GB/T18420.2-2001(国家技术监督局，2002)规定采用对虾的仔虾、卤虫幼体或蒙古裸腹蚤三者中至少一种进行96h毒性实验(注：尚未正式颁布的2006年该标准修订版中仍采用上述试验动物)。钻井液的急性毒性评价方法列于表1。

表1 钻井液的急性毒性评价方法一览表

总之，通常的96h毒性试验均难以应用于现场，发光细菌法和发光海藻法因其简易、快速的特点可以在现场应用，但前者要求钻井液无色或近无色，后者要求钻井液的pH在7.5-8.0，否则检测结果不准确。因此，寻求其它敏感生物指示物，建立钻井液毒性快速评价方法仍为实际生产所亟需，这对于制定一项科学的、行之有效的毒性评判标准，促进我国钻井清洁生产具有积极意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

首先，筛选对钻井液敏感的海洋微藻；确定钻井液毒性分级指标；

第二，研究钻井液对敏感微藻的3～8h EC₅₀与96hEC₅₀的关系，即得到钻井液与海洋微藻的作用类型，选择出合适的评价指标；

第三，研究快速评价指标以国家标准方法GB/T18420.2-2001中卤虫法96h LC₅₀作为的相关性，同时研究快速评价方法的精密度、准确度。

具体为：

利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法，

1)按体积比取1份钻井液加入9份海水，搅拌静置后取上层混悬液做为贮备液；

2)选择对钻井液敏感的海洋微藻(预先驯化、接种三次，使其生长同步)进行培养至平稳期，得到进入平稳生长期后的海洋微藻藻液；

3)取锥形瓶10个或10个以上，将藻液与储备液于锥形瓶中进行混合培养3-8小时；以每个锥形瓶中液体体积为140mL计，藻液体积为100mL，所加入的储备液体积从0至40mL梯度变化，每个浓度设置2个平行样；若混合容器中藻液与储备液的体积不足的，以过滤灭菌后的天然海水补充至140mL；

4)从锥形瓶中取样，采用荧光分光光度计测定发射荧光光谱，得到678～685nm处的活体藻叶绿素荧光强度；

5)以未加储备液的藻荧光强度作为对照，计算微藻的相对死亡率：微藻的相对死亡率＝(未加钻井液的藻荧光强度-加钻井液的藻荧光强度)/未加钻井液的藻荧光强度；

6)半数有效浓度EC₅₀的计算

根据微藻的相对死亡率，利用Curveexpert或Microsoft Excel 2003软件分别绘制微藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，得出微藻致死率为50％所对应的钻井液储备液的体积V(mL)，根据EC₅₀＝0.1V×1.02×10³/0.14(单位：mg·L^-1)计算相应时间的EC₅₀值，其中，钻井液储备液的密度近似地取海水密度1.02g·mL^-1。

7)根据EC₅₀值按照国家标准确定钻井液有无毒性。

所述海洋微藻为中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、亚心型扁藻(Platymonas subcordiforus)或小球藻(Chlorella pynenoidosa)。

微藻的培养条件为(20±1)℃，4000-7000Lux，明暗周期12∶12h，F/2培养基；接种后密度为1～4×10⁴个/mL；培养4～7d至平稳期。

本发明具有如下优点：

1.快速。本发明建立的利用海洋微藻对水基钻井液毒性的评价方法，比常规96h生物毒性实验时间缩短了88h。

2.准确。对水基钻井液的毒性评价结果与卤虫96h LC₅₀的一致。

3.适用。能够在钻井现场使用。

附图说明

图1为七种钻井液的发射荧光光谱(Ex＝435nm)；

图2为不同浓度钻井液WBF2的发射荧光光谱图，(标号1～6分别代表加入的钻井液WBF2的量为0、5、10、20、30、40mL时的荧光光谱图)；

图3为中肋骨条藻的发射荧光光谱图，1～5分别代表加入钻井液的量为0、10、20、30、40mL时的藻液荧光光谱图；

图4显示了钻井液对海洋微藻作用的三种类型；

图5为本发明采用的技术方案流程框图。

具体实施方式

如图5所示，本发明采用的技术方案工艺流程为：

1.敏感海洋微藻的筛选

2.钻井液对海洋微藻的毒性实验

(1)钻井液与海洋微藻的荧光特征比较；

(2)不同种类钻井液对海洋微藻的不同时间毒性；

(3)研究钻井液毒性分级指标的确定；

(4)基于海洋微藻的钻井液毒性评价方法与卤虫法相关性比较；

(5)基于海洋微藻的钻井液毒性评价方法的重现性和准确性。

本发明主要研究内容包括：

1)比较钻井液对不同生物(不同海洋微藻等)的作用，选择合适的模式生物及敏感生物标志物来快速评价钻井液毒性；

2)探讨钻井液对敏感生物的3～8h EC₅₀与96h EC₅₀的关系；

3)考察所建立的新的钻井液毒性快速评价方法与国标卤虫法的相关性。

实验部分

毒性实验包括样品准备、敏感海洋微藻的筛选和驯化培养、海洋微藻和钻井液的荧光特征分析、钻井液毒性分级指标的确定、毒性实验及荧光检测技术、毒性评价六个部分。

1.钻井液贮备液的制备

按照中国国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》(GB/T18420.2-2001)配制。

(1)水基钻井液储备液的制备：按体积比取1份钻井液加入9份海水，3000r/min搅拌15min，静置60min后取上层混悬液做为贮备液。

(2)油基钻井液储备液的制备：按体积比取1份钻井液加入9份海水，3000r/min搅拌15h，静置60min后取上层水相部分作为贮备液。

本发明试验了胜利油田钻井院提供的7个钻井液样品(6个水基钻井液，1个油基钻井液)分别为WBF1、WBF2、WBF3、WBF4、WBF5、WBF6、OBF，利用荧光技术筛选了对钻井液敏感的海洋微藻；

2.敏感海洋微藻的筛选和培养

(1)海洋微藻来源：东海海域分离，驯化培养，由973项目组提供。

(2)海洋微藻的培养：

以中国近海海域的6种微藻优势种以及2种常见饵料藻为受试生物(包括：中肋骨条藻Skeletonema costatum、柔弱角毛藻Chaetoceros debilis、海洋原甲藻Prorocentrum micans、微小原甲藻Prorocentrum minimum、丹麦细柱藻Leptocylindrus danicus、塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense、小球藻Chlorella pynenoidosa、亚心型扁藻Platymonas subcordiforus)。

预先驯化、接种三次，使其生长同步。培养确定培养条件为(20±1)℃，4000-7000Lux，明暗周期12h∶12h，F/2培养基。接种后密度为1～4×10⁴个/mL；各自培养600mL藻液，培养4-7d至平稳期。

(3)敏感海洋微藻的筛选

进入平稳生长期后均分为6瓶，每瓶的体积为100mL。2瓶作为空白，另外4瓶分别加入WBF2钻井液储备液20mL、40mL(双样平行)，加入过滤灭菌海水使总体积均为140mL，在一定的作用时间(0、3h、6h、24h、48h、72h和96h)取样，采用荧光分光光度计测定发射荧光光谱，得到680nm处藻叶绿素荧光强度，以空白为对照筛选对钻井液敏感的藻种。

本实验和微藻毒性实验过程中使用的过滤海水以及锥形瓶、烧杯、量筒等玻璃器具均经过高压灭菌处理。海水(pH＝8.20)取自青岛麦岛，经过滤灭菌后使用；

标准毒物十二烷基硫酸钠(SDS：AR，天津市广成化学试剂有限公司)；

对钻井液敏感的海洋微藻包括中肋骨条藻、柔弱角毛藻、亚心型扁藻和小球藻。

3.海洋微藻和钻井液的荧光特征分析

在Ex＝435nm时测量七种钻井液的发射荧光光谱，在藻类叶绿素的特征波长Em＝680nm附近几乎无峰(见图1所示)，即钻井液不干扰微藻叶绿素含量的测定。因此，可以用荧光技术检测叶绿素含量来计算钻井液对微藻致死率(微藻的密度与其叶绿素含量成正比)。

4.毒性分级指标

不同的实验生物对污染物的敏感性不同，因此采用标准毒性物质十二烷基硫酸钠SDS对微藻和卤虫的毒性敏感性做校正(王永艳等，1991)将SDS对微藻及卤虫的毒性实验结果列于表2。

表2SDS对微藻及卤虫的毒性实验结果

可见，海洋微藻比甲壳类动物卤虫对SDS更敏感。用SDS对微藻7hEC₅₀和卤虫96hLC₅₀进行换算，换算因子为1.05≈1。(由表2可知，SDS对微藻8h EC₅₀＜8.6，更接近8.2，即SDS对微藻8h EC₅₀/卤虫96h LC₅₀≈1)

根据我国国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性分级》(GB/T18420.1-2001)，对于属于一级海区的渤海、莱州湾，生物毒性容许值为3×10⁴mg·L^-1，以此衡量钻井液是否有毒。即以微藻7～8h EC₅₀大于或等于3×10⁴mg·L^-1时，为符合生物毒性要求，可直接排放入海；小于3×10⁴mg·L^-1时，为不符合生物毒性要求，判定为有毒，需要采取特别的措施进行处理。

5.毒性实验及检测技术

培养海洋微藻2.4L至平稳生长期，均分为24瓶，每瓶的体积为100mL，分别加入钻井液储备液0、5、10、20、30、40mL，用过滤灭菌海水将藻液体积统一到140mL；在一定的时间(0、3h、7h、24h、48h、72h和96h)取样，利用荧光技术测定藻液在Em＝680nm处的荧光强度数值。

6.毒性评价

(1)微藻的相对死亡率的计算

以未加钻井液的藻的荧光强度作为对照，计算微藻的相对死亡率：微藻的相对死亡率＝(未加钻井液的藻荧光强度-加钻井液的藻荧光强度)/未加钻井液的藻荧光强度；

(2)半数有效浓度EC₅₀的计算

半数有效浓度EC₅₀：半效应(致死)浓度(EC₅₀)是指在一定时间内，实验系统中或某一生态系统中50％的实验生物或某一生物种群表现出可观察到的不良效应(或死亡)时毒性物质的浓度(孟紫强，2000；金岚，2001；Nelly，2004)。

原始实验数据经上述计算得到微藻死亡率，利用Curveexpert和Microsoft Excel 2003等软件分别绘制不同时间(3h，7h，24h，48h，72h，96h)的微藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，根据EC₅₀＝0.1V×1.02×10³/0.14(mg·L^-1)计算各时间的EC₅₀值，式中V(mL)是关系曲线得出的致死率50％对应的钻井液储备液的体积；钻井液储备液的密度近似地取海水密度1.02g·mL^-1(注：这将使EC₅₀计算值偏低，导致钻井液检测毒性比实际偏高)(3)钻井液毒性结果：微藻7～8h EC₅₀大于或等于3×10⁴mg·L^-1时，则钻井液为符合生物毒性要求，可直接排放入海；小于3×10⁴mg·L^-1时，为不符合生物毒性要求，判定为有毒。

实验结果

按上述方法，分别试验了胜利油田钻井院提供的7个钻井液样品WBF1、WBF2、WBF3、WBF4、WBF5、WBF6、OBF，利用荧光技术筛选了对钻井液敏感的海洋微藻，得到如下结果：

(1)本实验选用对钻井液敏感的中肋骨条藻；

(2)本项目所用的钻井液对中肋骨条藻的作用方式可以划分为三种类型：一是钻井液对中肋骨条藻无毒，随时间延长其反而促进中肋骨条藻的生长(WBF1)；二是钻井液毒性与时间无关(WBF3、WBF6)；三是钻井液毒性随时间而增大，1～24h毒性增加，24h后毒性基本不变。

显然，要建立快速评价指标，只需对第三种类型钻井液(WBF2、WBF4、WBF5、OBF)的不同时间EC₅₀做详尽分析，找出与96h EC₅₀毒性一致的最小时间即可。

图4钻井液对海洋微藻作用的三种类型：

各种钻井液对中肋骨条藻的96h EC₅₀和7～8hEC₅₀值比较：

96h EC₅₀排序：

WBF2＞OBF＞WBF3≈WBF6≈WBF5≈WBF4＞WBF1

7～8h EC₅₀排序：

WBF2＞OBF≈WBF3＞WBF6＞WBF5＞WBF4＞WBF1

第三种类型钻井液对中肋骨条藻的96h EC₅₀和7～8hEC₅₀值毒性比较：

96hEC₅₀毒性排序：WBF2＞OBF＞WBF5≈WBF4

7～8hEC₅₀毒性排序：WBF2＞OBF＞WBF5＞WBF4

96hEC₅₀和7～8hEC₅₀的比值在0.43～0.67之间。

可见，7～8h毒性排序与96h顺序趋势一致。因此，对于大多数钻井液而言，完全可以运用荧光技术，利用中肋骨条藻在7～8h内快速评价钻井液的急性毒性。

(3)7～8h EC₅₀与96h EC₅₀毒性排序一致。据此提出了以海洋微藻7～8hEC₅₀快速评价钻井液急性毒性的方法——微藻法，该方法重现性理想。

(4)微藻法与国标卤虫法存在相关性，相关系数R大于0.9。

按上述方法分别确认对钻井液敏感的海洋微藻包括中肋骨条藻、柔弱角毛藻、亚心型扁藻和小球藻。

结论

本发明建立的微藻法对水基钻井液的毒性评价结果与卤虫的96h LC₅₀的一致，比常规96h生物毒性实验时间缩短了88h，且能够在现场使用。

并且，本发明还采用由海洋局一所及中国海洋大学水产学院藻种室提供的中肋骨条藻，得到了与上述相同的结论。

F/2培养基：是一种国际通用的、实验室常用的海洋微藻的培养基。其配制方法如下：

F/2培养基(Guillard & Ryther 1962，Guillard 1975)

向950mL过滤灭菌海水中加入：

量	化合物	储备液	最终摩尔浓度
				1mL	NaNO₃	75g/L dH₂O	8.83×10^-4M
1mL	NaH₂PO₄·H₂O	5g/L dH₂O	3.63×10^-5M

1mL	Na₂SiO₃·9H₂O	30g/L dH₂O	1.07×10^-4M
				1mL	f/2痕量金属溶液	(见下面的配方)	-
0.5mL	f/2维生素溶液	(见下面的配方)	-

用过滤灭菌海水将终体积定为1L。紫外灯照射灭菌。

f/2痕量金属溶液：

向950mL经高压灭菌的高纯水中加入：

量	化合物	储备液	最终摩尔浓度
				3.15g	FeCl₃·6H₂O	-	1×10^-5M
4.36g	Na₂EDTA·2H₂O	-	1×10^-5M
				1mL	CuSO₄·5H₂O	9.8g/L dH₂O	4×10^-8M
1mL	Na₂MoO₄·2H₂O	6.3g/L dH₂O	3×10^-8M
				1mL	ZnSO₄·7H₂O	22.0g/L dH₂O	8×10^-8M
1mL	CoCl₂·6H₂O	10.0g/L dH₂O	5×10^-8M
				1mL	MnCl₂·4H₂O	180.0g/L dH₂O	9×10^-7M

用高纯水将终体积定为1L。

f/2维生素溶液：

向950mL经高压灭菌的高纯水中加入：

用高纯水将终体积定为1L，保存在冰箱中。

Claims

1.利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法，其特征在于：

2)选择对钻井液敏感的海洋微藻进行培养至平稳期，得到进入平稳生长期后的海洋微藻藻液；

3)取锥形瓶10个或10个以上，将藻液与储备液于锥形瓶中进行混合培养3～8小时；以每个锥形瓶中液体体积为140mL计，藻液体积为100mL，所加入的储备液体积从0至40mL梯度变化，每个浓度设置2个平行样；若混合容器中藻液与储备液的体积不足的，以过滤灭菌后的天然海水补充至140mL；

6)半数有效浓度EC₅₀的计算

根据微藻的相对死亡率，利用Curveexpert或Microsoft Excel 2003软件分别绘制微藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，得出微藻致死率为50％所对应的钻井液储备液的体积V(mL)，根据EC₅₀＝0.1V×1.02×10³/0.14.(单位：mg·L^-1)计算相应时间的EC₅₀值，其中，钻井液储备液的密度近似地取海水密度1.02g·mL^-1。

7)根据EC₅₀值按照国家标准确定钻井液有无毒性。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述海洋微藻为中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、亚心型扁藻(Platymonas subcordiforus)或小球藻(Chlorella pynenoidosa)。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微藻的培养条件为(20±1)℃，4000～7000Lux，明暗周期12∶12h，F/2培养基；接种后密度为1～4×10⁴个/mL；培养4～7d至平稳期。