BR112020010329A2

BR112020010329A2 - modulação genética de organismos fotossintéticos para crescimento aprimorado

Info

Publication number: BR112020010329A2
Application number: BR112020010329-2A
Authority: BR
Inventors: Imad Ajjawi; Fedor I. Kuzminov; Randor R. Radakovits; John H. Verruto; Sarah Potts; Roberto Spreafico; William F. Lambert; Jessica Nichole Greiner
Original assignee: Synthetic Genomics, Inc.
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-11-17
Also published as: CA3084828A1; CN111527101A; EP3732189A4; US20190203221A1; JP2021509018A; AU2018395264B2; EP3732189A1; US11193132B2; WO2019133726A1; JP7295864B2; AU2018395264A1; MX2020006904A

Abstract

Organismos fotossintéticos mutantes com clorofila reduzida e eficiência fotossintética aumentada são fonecidos . As cepas mutantes mutaram ou atenuaram: gene SRP54 cloroplástico e gene SGI1; gene SRP54 cloroplástico e gene SGI2; são divulgados o gene cloroplástico SRP54, os genes SGI1 e SGI2. Os organismos fotossintéticos mutantes exibem produtividade aumentada em relação a cepas do tipo selvagem. Também são fornecidos organismos fotossintéticos mutantes com genes SRP54 citosólicos mutantes ou atenuados. São fornecidos neste documento métodos de produção de biomassa e outros produtos, tais como lipídeos, com uso de cepas com mutações em um gene SRP54, SGI1, SGI2, uma combinação de genes SGI1/SRP54 e uma combinação dos genes SGI2 e SRP54. Construções e métodos também estão incluídos para atenuar ou interromper os genes SRP54, SGI1 e SGI2.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MODU-

LAÇÃO GENÉTICA DE ORGANISMOS FOTOSSINTÉTICOS PARA CRESCIMENTO APRIMORADO”. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade disposto no Título 35 do USC §119(e) do pedido No. de Série US 62/612.251, depo- sitado em 29 de dezembro de 2017 e do pedido No. de Série US 62/690.205, depositado em 26 de junho de 2018, cuja totalidade do con- teúdo está incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O material na listagem de sequências anexa está incorpo- rado a título de referência neste pedido. O arquivo de texto da listagem de sequências anexa, nome SGI2140_2WO_Sequence_Listing.txt, foi criado em 18 de dezembro de 2018 e é de 419 kb. O arquivo pode ser acessado usando o Microsoft Word em um computador que usa o sis- tema operacional Windows.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Aprimoramentos na produtividade de biomassa de organis- mos fotossintéticos são relevantes para várias aplicações comerciais - de biocombustíveis a produtos de alto valor. A manipulação genética para aumentar o teor total de proteínas da biomassa é altamente dese- jável, mas as estratégias para isso não estão evidentes na técnica.

[0004] Modificar geneticamente organismos fotossintéticos para au- mentar a eficiência fotossintética para uma maior produtividade é um objetivo antigo de biólogos de plantas e algas. As Patentes No US 2014/0220638 e No US 2016/030489, ambas incorporadas neste docu- mento a título de referência, descrevem triagens de mutantes para obter mutantes de algas com clorofila reduzida que têm sua capacidade de aclimatação à luz baixa prejudicada, ou seja, mantêm o estado de baixa clorofila de células adaptadas à luz alta, mesmo com pouca luz. A Pa- tente No US 2014/0220638 descreve mutantes de algas com mutações nos genes LAR1, LAR2 e LAR3 do Regulador de Aclimação de Luz, e a patente No US 2016/0304896 divulga mutantes de algas com mutações no gene cloroplástico SRP54.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] São divulgados, neste documento, organismos fotossintéti- cos que compreendem genes modulados com maior eficiência e produ- tividade fotossintética, o uso dos mesmos na produção de produtos sob condições fotoautotróficas e métodos de produção de tais organismos fotossintéticos e moléculas de ácido nucleico e construções para modu- lar esses genes.

[0006] Em um aspecto, são fornecidos organismos fotossintéticos mutantes que compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica o gene 2 de aprimoramento significativo de crescimento (SGI2).

[0007] Em um aspecto, são fornecidos organismos fotossintéticos mutantes que compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cres- cimento (SGI2).

[0008] Em um aspecto, são fornecidos organismos fotossintéticos mutantes que compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cres- cimento (SGI1).

[0009] Em um aspecto, são fornecidos organismo fotossintético mu- tante que compreende um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína de reconhecimento de sinal cloroplástico 54 (cpSRP54), um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cresci-

mento (SGI1) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento sig- nificativo de crescimento (SGI2).

[0010] Em um aspecto, são fornecidos organismos fotossintéticos mutantes que compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal citosólico (cytoSRP54) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cres- cimento (SGI2).

[0011] Em um aspecto, são fornecidos organismos fotossintéticos mutantes que compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal citosólico (cytoSRP54) e um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cres- cimento (SGI1).

[0012] Em um aspecto, são fornecidos organismos fotossintéticos mutantes que compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal citosólico (cytoSRP54), um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cresci- mento (SGI1) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento sig- nificativo de crescimento (SGI2).

[0013] Em um aspecto, são fornecidas biomassas que compreen- dem organismos fotossintéticos mutantes em que os organismos fotos- sintéticos mutantes compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento signifi- cativo de crescimento (SGI1) e/ou um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de crescimento (SGI2).

[0014] Em um aspecto, são fornecidos métodos de produção de um produto biológico. Os métodos incluem a cultura de organismos fotos- sintéticos mutantes em que os organismos fotossintéticos mutantes compreendem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54), e um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de crescimento (SGI1) e/ou um gene 2 mutante ou atenuado de aprimoramento signifi- cativo de crescimento (SGI2); e o isolamento de pelo menos um produto da cultura.

[0015] Em um aspecto, são fornecidos métodos para inserir uma única cópia de um gene CRISPR em um lócus selecionado de um mi- crorganismo. Em algumas modalidades, o gene CRISPR tem códon oti- mizado para expressão no microrganismo. Em algumas modalidades, o gene CRISPR inserido compreende múltiplos íntrons heterólogos. Em algumas modalidades, o número de íntrons heterólogos pode ser pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 ou mais. Exemplos não limitativos do gene CRISPR incluem Cas9 e Cpf1. Em algumas modalidades, o gene CRISPR pode ser operacionalmente aglutinado a um promotor nativo ao microrganismo. Em algumas modalidades, o promotor é induzível. Em algumas modalidades, o gene CRISPR pode ser operacionalmente aglutinado a um promotor heterólogo ao microrganismo.

[0016] Em algumas modalidades, o produto biológico é um lipídeo, uma proteína, um peptídeo, um ou mais aminoácidos, um aminoácido, um ou mais nucleotídeos, uma vitamina, um cofator, um hormônio, um antioxidante ou um pigmento ou corante. Em algumas modalidades, o produto biológico é uma biomassa. Em algumas modalidades, o orga- nismo fotossintético mutante são algas e a biomassa é biomassa algal.

[0017] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante é modificado para incluir pelo menos um gene exógeno que codi- fica um polipeptídeo que participa da produção de um lipídeo. Em algu- mas modalidades, o organismo fotossintético mutante é cultivado fototroficamente. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante são algas, e as algas são cultivadas em tanque ou cava.

[0018] Em um aspecto, são fornecidas construções de moléculas de ácido nucleico para recombinação homóloga que compreende uma sequência nucleotídica de, ou adjacente a, um gene de organismo fo- tossintético de ocorrência natural que codifica a proteína SGI2, em que a proteína SGI2 compreende uma sequência de aminoácidos que pos- sui pelo menos 55% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0019] Em um aspecto, é fornecida uma pluralidade de construções de moléculas de ácido nucleico para recombinação homóloga que com- preende uma sequência nucleotídica de, ou adjacente a, um gene de organismo fotossintético de ocorrência natural que codifica uma prote- ína cpSRP54 e um gene de organismo fotossintético que codifica uma proteína SGI1, em que a proteína cpSRP54 compreende uma sequên- cia de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene, e em que o gene SGI1 codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com uma sequên- cia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:

29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 antes de mutação ou atenuação do gene SGI1.

[0020] Em um aspecto, é fornecida uma pluralidade de construções de moléculas de ácido nucleico para recombinação homóloga que com- preende uma sequência nucleotídica de, ou adjacente a, um gene de organismo fotossintético de ocorrência natural que codifica uma prote- ína cpSRP54 e um gene de organismo fotossintético que codifica a pro- teína SGI2, em que a proteína cpSRP54 compreende uma sequência de aminoácidoácido com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene, e em que a proteína SGI2 compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0021] Em um aspecto, são fornecidas construções de moléculas de ácido nucleico para expressão de um RNA de antissenso, shRNA, microRNA ou ribozima que compreende uma sequência nucleotídica complementar a pelo menos uma porção de um gene de organismo fo- tossintético de ocorrência natural que codifica a proteína SGI2, em que a proteína SGI2 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53,

SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0022] Em um aspecto, é fornecida uma pluralidade de construções de moléculas de ácido nucleico para expressão de um RNA de antis- senso, shRNA, micro-RNA ou ribozima que compreende uma sequência nucleotídica complementar a pelo menos uma porção de um gene de organismo fotossintético de ocorrência natural que codifica uma prote- ína cpSRP54 e um gene de organismo fotossintético que codifica a pro- teína SGI1, em que a proteína cpSRP54 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene, e em que a proteína SGI1 compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39 antes de mutação ou atenuação do gene SGI1.

[0023] Em algumas modalidades, a construção compreende pelo menos uma porção de um 5'UTR de um cpSRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de dois ou mais dos genes, pelo menos uma porção da região promotora de um cpSRP54, SGI1, SGI2, ou uma combinação de dois ou mais dos genes e/ou pelo menos uma porção de uma 3’ UTR de um cpSRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de dois ou mais dos genes. Em alguns exemplos, a construção pode ser uma construção de

RNAi, ribozima ou de antissenso e pode incluir uma sequência da região transcrita de cpSRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de dois ou mais dos genes na orientação de sentido ou antissenso. Em outros exemplos, uma construção pode ser projetada para a expressão in vitro ou in vivo de um RNA guia projetado para atingir um cpSRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de dois ou mais dos genes e pode incluir uma sequên- cia homóloga a uma porção de qualquer um dos genes, incluindo, por exemplo, um íntron, um 5'UTR, uma região promotora e/ou um 3’ UTR do gene. Em ainda outros exemplos, uma construção para atenuar a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo de cpSRP54, SGI1 ou SGI2 pode ser um RNA guia ou oligonucleotídeo de antissenso, em que a sequência tem homologia com uma região transcrita de um cpSRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de dois ou mais genes na orientação de antissenso.

[0024] Em um aspecto, é fornecida uma pluralidade de construções de moléculas de ácido nucleico para expressão de um RNA de antis- senso, shRNA, microRNA ou ribozima que compreende uma sequência nucleotídica complementar a pelo menos uma porção de um gene de organismo fotossintético de ocorrência natural que codifica uma prote- ína cpSRP54 e um gene do organismo fotossintético que codifica a pro- teína SGI2, em que a cpSRP54 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene, e em que o gene SGI2 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID

NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0025] Em um aspecto, é fornecida uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico que codificam um RNA guia, em que o RNA guia com- preende pelo menos uma porção de um gene de organismo fotossinté- tico de ocorrência natural SGI2, em que o gene SGI2 codifica uma pro- teína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenu- ação do gene.

[0026] Em um aspecto, é fornecida uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico que codificam pelo menos dois RNAs guia, em que os RNAs guia compreendem pelo menos uma porção de um gene de or- ganismo fotossintético de ocorrência natural que codifica uma cpSRP54 e um gene de organismo fotossintético que codifica SGI1, em que a cpSRP54 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenu- ação do gene e em que o gene SGI1 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39 antes de mutação ou atenuação do gene SGI1.

[0027] Em um aspecto, é fornecida uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico que codificam pelo menos dois RNAs guia, em que os RNAs guia compreendem pelo menos uma porção de um gene cpSRP54 de um organismo fotossintético de ocorrência natural e um gene SGI2 de gene de organismo fotossintético, em que o gene cpSRP54 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenu- ação do gene, e em que o gene SGI2 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0028] Em um aspecto, são fornecidos métodos para aumentar a biomassa de um organismo fotossintético, compreendendo a modula- ção do gene SGI2.

[0029] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a bi- omassa de um organismo fotossintético, compreendendo a modulação da proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e do Gene 1 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI1), em que o gene cpSRP54 codifica uma proteína que compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ

ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene, e em que o gene SGI1 compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39 antes de mutação ou atenuação do gene SGI1.

[0030] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a bi- omassa de um organismo fotossintético, compreendendo a modulação do gene da proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e do Gene 2 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI2), em que o gene cpSRP54 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 55% de identidade com a SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene, e em que o gene SGI2 com- preende uma sequência de aminoácidos com pelo menos SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0031] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a bi- omassa de um organismo fotossintético, compreendendo a modulação da proteína 54 de reconhecimento de sinal citosólico (cytoSRP54) e o Gene 2 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI2), em que o gene SGI2 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0032] Em algumas modalidades, a cultura do organismo fotossin- tético mutante exibe produtividade de biomassa maior do que uma cul- tura de um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante demonstra maior produtividade de biomassa na cultura fotoautotrófica. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante exibe produtividade de biomassa maior do que uma cultura de um organismo fotossintético de controle da mesma espécie sob condições de luz contínua. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante exibe produtividade de biomassa maior do que uma cultura de um organismo fotossintético de controle da mesma espécie sob condições de ciclo de 24h. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante exibe produtividade de biomassa maior do que uma cultura de um organismo fotossintético de controle da mesma espécie sob condições de ciclo de 24h em que o perfil de luz imita um perfil de luz natural.

[0033] Em algumas modalidades, o aumento da biomassa de um organismo fotossintético compreende um aumento no carbono orgânico total. Em algumas modalidades, o aumento da biomassa de um orga- nismo fotossintético compreende um aumento no teor lipídico total. Em algumas modalidades, o aumento da biomassa de um organismo fotos- sintético compreende um aumento no teor total de nitrogênio.

[0034] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante exibe uma redução na clorofila sob condições de pouca luz e maior rendimento quântico máximo da fotoquímica no fotossistema II (Fv/FM) em todas as irradiâncias fisiologicamente relevantes acima de 100, 125, 150, 200 ou 250 µE m-2s-1 em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, a redução na clorofila é de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% de redu- ção em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante exibe menor arrefecimento brusco não fotoquímico (NPQ) em todas as irradiâncias fisiologicamente relevantes acima de 125, 150, 200 ou 250 µE m-2 s-1 em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

[0035] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante exibe uma maior taxa de fixação de carbono em uma base por clorofila do que um organismo fotossintético de controle da mesma es- pécie. Em algumas modalidades, a taxa de fixação de carbono é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% maior do que de um orga- nismo fotossintético de controle da mesma espécie.

[0036] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante exibe uma taxa de evolução de oxigênio de pelo menos 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou mais alta por mg de clorofila do que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante exibe uma taxa de evolução de oxigênio de pelo menos 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou mais alta por µg de carbono orgânico total (TOC).

[0037] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu-

tante exibe produtividade lipídica maior do que uma cultura de um orga- nismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas moda- lidades, o organismo fotossintético mutante exibe maior produtividade lipídica na cultura fotoautotrófica. Em algumas modalidades, o orga- nismo fotossintético mutante são algas.

[0038] Em algumas modalidades, os organismos fotossintéticos mutantes são gerados modulando-se os genes SGI2 dos organismos. Em algumas modalidades, os organismos fotossintéticos mutantes são gerados modulando-se o gene cpSRP54 em conjunto com o gene SGI1 ou o gene SGI2 dos organismos. Em algumas modalidades, a modula- ção dos genes compreende radiação UV, radiação gama ou mutagê- nese química. Em algumas modalidades, a modulação dos genes com- preende mutação de substituição de base, mutagênese insercional, re- colocação de genes, RNAi, RNA de antissenso, modificação genética de meganucleases, uma ou mais ribozimas e/ou um sistema CRISPR/Cas no gene cpSRP54, gene SGI1, Gene SGI2 ou uma com- binação dos genes.

[0039] Em algumas modalidades, os organismos fotossintéticos mutantes compreendem um gene cpSRP54 que codifica uma proteína com uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene. Em algumas modalidades, os organis- mos fotossintéticos mutantes compreendem um gene cpSRP54 que co- difica uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 100, 150,

200, 250, 300 aminoácidos ou com todo o comprimento de uma sequên- cia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0040] Em algumas modalidades, os organismos fotossintéticos mutantes compreendem uma mutação no gene cpSRP54 que ocorre fora da sequência que codifica os primeiros 169 aminoácidos do domí- nio cpSRP54 GTPase. Em algumas modalidades, a mutação no gene cpSRP54 que codifica uma proteína SRP54 ocorre fora da sequência que codifica o domínio cpSRP54 GTPase. Em algumas modalidades, a mutação no gene cpSRP54 não inclui uma mutação de interrupção de gene no domínio cpSRP54 GTPase.

[0041] Em algumas modalidades, o gene SGI2 dos organismos fo- tossintéticos mutantes codifica uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene. Em algumas modali- dades, o gene SGI2 dos organismos fotossintéticos mutantes codifica uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos com pelo me- nos 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidade com pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250, 300 ami- noácidos ou com todo o comprimento de uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ

ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

[0042] Em algumas modalidades, o gene SGI1 dos organismos fo- tossintéticos mutantes codifica uma proteína com uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39 antes de mutação ou atenuação do gene SGI1. Em algumas modalida- des, o gene SGI1 dos organismos fotossintéticos mutantes codifica uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos que tem pelo me- nos 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidade com pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250, 300 ami- noácidos ou com todo o comprimento de uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39 antes de mutação ou atenuação do gene SGI1.

[0043] Em algumas modalidades dos aspectos acima, o organismo fotossintético é multiploidia, por exemplo, diploide, triploide, tetraploide.

Em algumas modalidades, uma ou mais cópias do gene: cpSRP54, SGI1 ou SGI2 são mutadas ou atenuadas, deixando outras cópias dos genes inalteradas ou não atenuadas para gerar um organismo fotossin- tético mutante. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante assim gerado exibe uma redução na clorofila sob condições de pouca luz e maior rendimento quântico máximo da fotoquímica no fotos- sistema II (Fv/FM) em todas as irradiâncias fisiologicamente relevantes acima de 100, 125, 150, 200 ou 250 µE m-2s-1 em relação a um orga- nismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas moda- lidades, o organismo fotossintético mutante assim gerado exibe maior produtividade de biomassa do que um organismo fotossintético de con- trole da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fotos- sintético mutante assim gerado exibe maior produtividade lipídica do que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

[0044] Em algumas modalidades dos aspectos acima, o organismo fotossintético mutante são algas. Em algumas modalidades, as algas pertencem ao gênero Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodes- mus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustig- matos, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haematococcus, Halocafe- teria, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micracti- nium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navi- cula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Parachlorella, Pasche- ria, Pelagomonas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneo- chloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus,

Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetraselmis, Thalassiosira, Tri- bonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeriae Volvox. Em algumas modali- dades, o organismo fotossintético mutante é um membro das clorófitas ou carófitas, e pode ser, por exemplo, um membro de qualquer uma das classes de Clorófitas Chlorophyceae, Trebouxiophyceae, Chloroden- drophyceae, Ulvophyceae, Pedinophyceae ou Prasinophyceae. Por exemplo, o mutante de algas pode ser uma espécie pertencente a Chlo- rophyceae, Trebouxiophyceae ou Chlorodendrophyceae. Em algumas modalidades, a célula de algas mutante é uma célula de algas Clorófita, e pode ser uma célula de algas Clorófita da classe Trebouxiophyceae, por exemplo, uma célula de algas de uma espécie de um gênero, tal como Botryococcus, Chlorella, Auxenochlorella, Heveochlorella, Marini- chlorella, Parachlorella, Pseudochlorella, Tetrachlorella, Eremosphaera, Franceia, Micractinium, Nannochloris, Oocystis, Picochlorum ou Proto- theca. Em algumas modalidades, a alga mutante pode ser uma espécie pertencente a uma espécie de Auxenochlorella, Chlorella, Heveochlore- lla, Marinichlorella, Parachlorella, Pseudochlorella ou Tetrachlorella.

[0045] Em algumas modalidades, o microrganismo fotossintético mutante é uma cianobactéria. Em algumas modalidades, a cianobacté- ria é uma espécie Acaryochloris, Agmenellum, Anabaena, Anabae- nopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroo- coccus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanos- pira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococ- copsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Lep- tolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudana- baena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria,

Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, thermosynechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema ou Xe- nococcus.

[0046] Em algumas modalidades, o microrganismo fotossintético mutante é uma planta. Exemplos não limitativos de plantas incluem plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como culturas que in- cluem grãos (por exemplo, trigo, maís, arroz, milho, cevada), culturas de frutas (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), culturas de forragem (por exemplo, alfafa), culturas de vegetais de raiz (por exemplo, batata, cenoura, beterraba, inhame), culturas de vegetais fo- lhosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas com flores (por exem- plo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, pi- nheiro, abeto), plantas usadas em fitorremediação (por exemplo, acu- muladores de metais pesados); culturas para produção de óleo (por exemplo, girassol, colza) e plantas utilizadas para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis).

[0047] Exemplos não limitativos de plantas dicotiledôneas mutantes incluem plantas pertencentes às ordens Magniolales, Miciales, Laura- les, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitne- riales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violales, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, San tales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Planta- ginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales e Astera- les.

[0048] Exemplos não limitativos de plantas monocotiledôneas mu- tantes incluem plantas pertencentes às ordens Alismatales, Hydrochari- tales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Are- cales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales e Orchid ales, ou plan- tas pertencentes a Gymnospermae, por exemplo, aquelas pertencentes às ordens Pinales, Ginkgoales, Cycadales, Araucariales, Cupressales e Gnetales.

[0049] Em algumas modalidades, as plantas mutadas podem ser Arabidopsis arenicola, Arabidopsis arenosa, Arabidopsis cebennensis, Arabidopsis croatica, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis neglecta, Arabidopsis pedemontana, Arabidopsis suecica, Arabidopsis thaliana, Zea mays, Oryza sativa, Triticum aestivum, Solanum tubero- sum, Allium cepa, Allium sativum, Glycine max, Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Gossypium herbaceum, Gossypium arboreum, Gossypium tomentosum, Brassica nigra ou Brassica sp.

[0050] Em algumas modalidades, a modulação de SRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de um ou mais dos genes em uma planta pode ser específica de tecido. Em algumas modalidades, o tecido de planta pode ser folha, caule ou raízes. Em algumas modalidades, a mo- dulação dos genes específicos de tecido pode ser alcançada através da modulação das regiões específicas de tecido não codificadoras dos ge- nes, por exemplo, promotores, potenciadores, íntrons ou regiões não traduzidas 3’ ou 5’. Em algumas modalidades, a modulação de SRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de um ou mais dos genes em uma planta pode ser feita em diferentes estágios de desenvolvimento da planta.

[0051] Estes e outros objetos e características da invenção se tor- narão mais evidentes quando a descrição detalhada a seguir da inven- ção for lida em conjunto com os desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0052] FIGURAS 1A E 1B. A Figura 1A mostra um esquema do gene SGI1. É indicada uma localização putativa do RNAm projetado para interromper o gene SGI1 (alvo CRISPR). A Figura 1B mostra um esquema do gene SPR54. É indicada uma localização putativa do RNAm projetado para interromper o gene SPR54 (alvo CRISPR).

[0053] FIGURAS 2A A 2C. A Figura 2A mostra um esquema do gene SGI1. É indicada uma localização putativa do RNAm projetado para interromper o gene SGI1 (alvo CRISPR). A Figura 2B mostra um esquema da proteína SGI1. A Figura 2C mostra um esquema do gene SPR54. É indicada uma localização putativa do RNAm projetado para interromper o gene SPR54 (alvo CRISPR).

[0054] FIGURA 3. A Figura 3 mostra uma análise de arquitetura de domínio exemplificativa da proteína SGI2 de Parachorella sp.

[0055] FIGURA 4. A Figura 4 mostra uma análise de arquitetura de domínio exemplificativa da proteína SGI2 de Oocystis sp.

[0056] FIGURA 5. A Figura 5 mostra uma análise de arquitetura de domínio exemplificativa da proteína SGI2 de Tetraselmis sp.

[0057] FIGURA 6. A Figura 6 mostra uma análise de arquitetura de domínio exemplificativa da proteína SGI2 de Arabidopsis thaliana.

[0058] FIGURA 7. A Figura 7 mostra uma análise de arquitetura de domínio exemplificativa da proteína SGI2 de Arabidopsis thaliana.

[0059] FIGURA 8. A Figura 8 mostra uma análise de arquitetura de domínio exemplificativa da proteína SGI2 de Arabidopsis thaliana.

[0060] FIGURA 9. A Figura 9 mostra uma análise de arquitetura de domínio exemplificativa da proteína SGI2 de Arabidopsis thaliana.

[0061] FIGURAS 10A E 10B. A Figura 10A mostra um esquema de um cassete de DNA que contém um gene Cre otimizado por códon, flan- queado por promotores e terminadores de nitrito redutase. A Figura 10B mostra um esquema de um cassete de DNA que compreende sequên- cias bleR e GFP.

[0062] FIGURA 11. A Figura 11 mostra os resultados do ensaio de produtividade para a cepa do tipo selvagem de Parachorella, cepa no- caute de SRP54, cepa nocaute de SGI2 e cepa de nocaute duplo de SGI2 e SRP54.

[0063] FIGURAS 12A E 12B. A Figura 12A mostra os resultados do ensaio de produtividade de TOC de área semicontínua para a cepa do tipo selvagem de Parachorella (STR00010), mutante de nocaute de SRP54 (STR00625), mutante de nocaute de SGI1 (STR24183), mutan- tes de nocaute duplos de SGI1/SRP54 (STR24538 e STR24550). A Fi- gura 12B mostra os resultados do ensaio de produtividade de TOC em lote para a cepa do tipo selvagem de Parachorella (STR00010), mutante de nocaute de SRP54 (STR00625), mutante de nocaute de SGI1 (STR24183), mutantes de nocaute duplo de SGI1/SRP54 (STR24538 e STR24550).

[0064] FIGURAS 13A E 13B. A Figura 13A mostra os resultados dos ensaios indicando produtividade de TOC de área semicontínua para a cepa de tipo selvagem de Parachorella (STR00010), mutante de no- caute de SRP54 (STR00625), mutante nocaute de SGI1 (STR00012), mutante de nocaute duplo de SGI2/SRP54 (STR25761) e mutantes de nocaute triplo de SGI1/SGI2/SRP54 (STR25761 e STR25762). A Figura 13B mostra os resultados dos ensaios indicando produtividade de TOC em lote para a cepa do tipo selvagem de Parachorella (STR00010), mu- tante de nocaute de SRP54 (STR00625), mutante de nocaute de SGI1 (STR00012), mutante de nocaute de SGI2/SRP54 (STR25761) e mu- tantes de nocaute triplo de SGI1/SGI2/SRP54 (STR25761 e STR25762).

[0065] FIGURA 14. A Figura 14 mostra os resultados do ensaio de produtividade de FAME em lote para a cepa do tipo selvagem de Para- chorella (STR00010), mutante de nocaute de SRP54 (STR00625), mu- tante de nocaute de SGI1 (STR24183), mutantes de nocaute duplo de SGI1/SRP54 (STR24538 e STR24540).

[0066] FIGURA 15. A Figura 15 mostra os resultados do ensaio de produtividade de FAME em lote para a cepa de tipo selvagem de Para- chorella (STR00010), mutante de nocaute de SGI1 (STR00012), mu- tante de nocaute duplo de SGI2/SRP54 (STR00516) e mutantes de no- caute triplo de SGI1/SGI2/SRP54 (STR25761 e STR25762).

[0067] FIGURAS 16A e 16B. A Figura 16A mostra o esquema do cassete de seleção para nocaute de Parachlorella SPR54. A Figura 16B mostra o esquema do cassete de seleção para nocaute de Parachlorella SGI2.

[0068] FIGURA 17. A Figura 17 mostra um diagrama esquemático do vetor pCC1BAC recombinante compreendendo os genes Cas9, GFP, BleR, Cre e um sítio lox.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0069] Os inventores do presente pedido constataram, de maneira surpreendente e inesperada, que a modulação dos genes SGI1 e SGI2 em organismos fotossintéticos resulta em uma redução na clorofila sob condições de pouca luz e maior rendimento quântico máximo da foto- química no fotossistema II (Fv/FM) em todas as irradiâncias fisiologica- mente relevantes. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante que compreende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe um menor arrefecimento brusco não fotoquímico (NPQ) em todas as irradiâncias fisiologicamente relevantes. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante que compreende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe biomassa aumentada em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante que compreende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe uma taxa mais alta de fixação de carbono em uma base por clorofila do que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante que compreende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe uma taxa mais alta de fixação de car- bono em uma base por TOC do que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fo- tossintético mutante que compreende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe uma taxa mais alta de evolução de oxigênio por mg de clorofila do que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mutante que compreende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe uma taxa mais alta de evolução de oxigênio em uma base por TOC do que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em al- gumas modalidades, o organismo fotossintético mutante que compre- ende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe maior produti- vidade lipídica do que uma cultura de um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. Em algumas modalidades, o organismo fo- tossintético mutante que compreende um gene SGI1 ou SGI2 mutado ou atenuado exibe maior produtividade lipídica na cultura fotoautotró- fica.

[0070] Os inventores do presente pedido também constataram, sur- preendentemente, um efeito sinérgico mediante modulação dos genes SGI1 ou SGI2 juntamente com a modulação do gene SRP54 em orga- nismos fotossintéticos. Em algumas modalidades, a clorofila é adicio- nalmente reduzida, mais biomassa aumentada, maior fixação de car- bono em uma base por clorofila, maior fixação de carbono em uma base por TOC, maior produtividade lipídica em um organismo fotossintético mutante em que genes SRP54 e SGI1 ou SGI2 são modulados em com- paração com um organismo fotossintético mutante em que apenas os genes SGI1 ou SGI2 são modulados. GENE SGI1

[0071] Conforme descrito neste documento, os polipeptídeos do Gene 1 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI1) são po- lipeptídeos que incluem dois domínios: um Receptor de Resposta ou domínio "RR" (Pfam PF00072) e um domínio Myb (Pfam PF00249), em que o domínio RR está posicionado no terminal N em relação ao domí- nio Myb. O domínio RR e o domínio Myb são separados por uma se- quência de aminoácidos que se encontra malconservada ou não con- servada entre os polipeptídeos SGI1, por vezes denominados, neste do- cumento, um aglutinante entre os dois domínios, em que o aglutinante pode variar de um a 300 aminoácidos, ou de dez a 200 aminoácidos, por exemplo. A região de aglutinante pode incluir, opcionalmente, uma sequência de localização nuclear (NLS).

[0072] A presença de um domínio “RR” Receptor de Resposta (Pfam PF00072) é responsável por sua anotação de bioinformática como um polipeptídeo do tipo CheY. Este domínio RR se estende, apro- ximadamente, do aminoácido 36 ao aminoácido 148 do polipeptídeo de Parachlorella SGI1 (SEQ ID NO: 3) e também é caracterizado como um "domínio receptor de sinal", cd00156, no banco de dados de domínio conservado (CDD), estendendo-se, aproximadamente, do aminoácido 37 ao aminoácido 154. O mesmo também é caracterizado como um "do- mínio receptor do tipo CheY (REC)", COG0784, no banco de dados de proteínas Clusters of Orthologous Groups e como um domínio "superfa- mília do tipo CheY" da Interpro, IPR011006, com esses dois domínios caracterizados se estendendo, aproximadamente, do aminoácido 33 a, aproximadamente, o aminoácido 161 do polipeptídeo de Parachlorella SGI1 de SEQ ID NO: 3. O domínio RR é encontrado em sistemas regu- ladores de dois componentes bacterianos (como o sistema bacteriano de dois componentes de quimiotaxia que inclui um polipeptídeo conhe- cido como CheY), em que recebe um sinal de um parceiro sensor. O domínio RR de tais sistemas é frequentemente encontrado no terminal N em relação a um domínio de ligação ao DNA e inclui um sítio de fos- foacceptor que pode ser fosforilado, o que pode ser responsável por sua ativação ou desativação.

[0073] Um domínio RR dentro de uma proteína SGI1 pode ser ca- racterizado, por exemplo, como Pfam PF00072, ou como um "domínio receptor de sinal" ou simplesmente "domínio receptor" e/ou pode ser classificado como cd00156 no banco de dados de domínio conservado (CDD), como COG0784 no banco de dados de proteínas Clusters of Orthologous Groups, ou como um domínio da Interpro "superfamília do tipo CheY", IPR011006. O domínio RR é encontrado em sistemas regu- ladores de dois componentes bacterianos (como o sistema bacteriano de dois componentes de quimiotaxia que inclui um polipeptídeo conhe- cido como CheY), em que recebe um sinal de um parceiro sensor. O domínio RR de tais sistemas é frequentemente encontrado no terminal N em relação a um domínio de ligação ao DNA e inclui um sítio de fos- foacceptor que pode ser fosforilado, o que pode ser responsável por sua ativação ou desativação.

[0074] Um domínio myb dentro de uma proteína SGI1 pode ser ca- racterizado, por exemplo, como pfamPF00249: "domínio de ligação ao DNA do tipo Myb" e/ou pode ser identificado como domínio conservado TIGR01557 "domínio de ligação ao DNA do tipo myb, classe SHAQKYF ("SHAQKYF" divulgado como SEQ ID NO: 102)” ou como um domínio de superfamília de domínio tipo Interpro Homeobox (IPR009057) e/ou um domínio Interpro Myb (IPR017930).

[0075] Além de ter um domínio RR no terminal N em relação a um domínio myb, uma proteína SGI1, conforme fornecido neste documento, pode ter uma pontuação de 300 ou superior, 320 ou superior, 340 ou superior, 350 ou superior, 360 ou superior ou 370 ou superior quando submetida à varredura com um modelo oculto de Markov (HMM) proje- tado para classificar proteínas com base em quão bem a sequência de aminoácidos da proteína de consulta corresponde aos aminoácidos conservados de uma região de homólogos SGI1 em algas, em que as posições de aminoácidos altamente conservadas são mais pesadas do que posições de aminoácidos malconservadas dentro de uma região comparada dos polipeptídeos para chegar à classificação.

Polipeptí- deos com classificação igual ou superior a 350, tal como 370 ou supe- rior, quando submetidos à varredura com um modelo HMM baseado em sequências de proteínas de polipeptídeos de alga SGI1 que incluem uma única sequência contínua que inclui o domínio RR, o aglutinante e o domínio myb desenvolvidos em uso incluem, sem limitação, polipeptí- deos das espécies de alga e planta Parachlorella sp. 1185 (SEQ ID NO: 3), Coccomyxa subellipsoidea (SEQ ID NO: 9), Ostreococcus lucimari- nus (SEQ ID NO: 10), Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO: 11), Vol- vox carteri (SEQ ID NO: 13), Tetraselmis sp. 105 (SEQ ID NOs: 14, 15 e 16), Oocystis sp. (SEQ ID NO: 17), Micromonas sp.

RCC299 (SEQ ID NO: 18), Micromonas pusilla (SEQ ID NO: 19), Sphagnum fallax (SEQ ID NO: 20), Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 21), Arabidopsis thali- ana ((SEQ ID NO: 22), Arabidopsis halleri (SEQ ID NO: 23), Arabidopsis lyrata (SEQ ID NO: 24), Helianthus annuus (SEQ ID NO: 25), Vitis vini- fera (SEQ ID NO: 26), Amborella trichopoda (SEQ ID NO: 27), Ricinus communis (SEQ ID NO: 28), Solanum lycopersicum (SEQ ID NO: 29), Solanum tuberosum (SEQ ID NO: 30), Gossypium hirsutum (SEQ ID NO: 31), Theobroma cacao (SEQ ID NO: 32), Phaeolis vulgaris (SEQ ID NO: 33), Glycine max (SEQ ID NO: 34), Chenopodium quinoa (SEQ ID NO: 35), Malus domesticus (SEQ ID NO: 36), Zea mays (SEQ ID NO: 37), Brassica rapa (SEQ ID NO: 38) e Oryza sativa (SEQ ID NO: 39), bem como polipeptídeos com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer um dos anteriores, em que o polipeptídeo tem um domínio RR e um domínio myb, e o domínio RR está em um terminal N em relação ao domínio myb. Em várias modalidades, o polipeptídeo SGI1 é de uma espécie de planta ou alga. Um gene que codifica um polipeptídeo SGI1, conforme fornecido neste documento, por exemplo, um gene que é interrompido ou cuja expressão é atenuada em um mu- tante, conforme fornecido neste documento, pode ser, em várias moda- lidades, um gene de ocorrência natural de uma espécie de planta ou alga que codifica um polipeptídeo, conforme divulgado neste docu- mento.

[0076] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI1, conforme fornecido neste documento, é um polipeptídeo de alga SGI1, por exem- plo, com a sequência de um polipeptídeo de alga SGI1 de ocorrência natural, em que o polipeptídeo de alga inclui um domínio RR e um do- mínio myb, e o domínio RR está no terminal N em relação ao domínio myb. O polipeptídeo de alga pode ter, opcionalmente, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer um dos polipeptídeos de alga SGI1 divulgados neste documento. Em algumas modalidades, um gene SGI1 pode ser um gene que codifica um polipeptídeo de alga SGI1, tal como, por exemplo, um polipeptídeo com a sequência de um polipeptídeo de alga SGI1 de ocorrência natural. Um gene SGI1 que codifica um polipeptídeo com a sequência de um polipeptídeo de alga SGI de ocorrência natural pode ser um gene com uma sequência de genes de ocorrência natural de sequência de codificação de genes ou pode ter uma sequência que varia da sequência de um gene de ocor- rência natural. Em várias modalidades, um gene SGI1 que é atenuado, mutado ou interrompido em organismos fotossintéticos mutantes, con- forme divulgado neste documento, pode ser um gene que é identificado através do BLAST, por exemplo, com uso de sequências divulgadas neste documento e/ou por varredura HMM, em que o HMM se baseia em uma sequência de aminoácidos contígua, por exemplo, derivada por comparação de pelo menos seis polipeptídeos SGI, em que a sequência de aminoácidos contígua inclui um domínio RR e um domínio myb, em que o domínio RR está no terminal N em relação ao domínio myb, e em que há uma sequência aglutinante entre os domínios RR e myb que não pertence a nenhum domínio.

[0077] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI tem a se- quência de um polipeptídeo de alga SGI1 ou é uma variante de um po- lipeptídeo de alga SGI1 de ocorrência natural com pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um polipeptí- deo de alga SGI1 de ocorrência natural e/ou tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.

[0078] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI tem a se- quência de um polipeptídeo SGI1 de planta ou é uma variante de um polipeptídeo SGI1 de planta de ocorrência natural que possui pelo me- nos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um polipeptídeo de alga SGI de ocorrência natural e/ou tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos

70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39.

[0079] Uma sequência de genes de Parachlorella SGI1 é fornecida como SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 3) que inclui dois domínios funcionais principais, ambos ocorrendo na metade do terminal N da proteína de 619 aminoácidos. Uma sequência de cDNA de Parachlorella SGI1 exemplificativa é fornecida como SEQ ID NO: 2.

[0080] Não foram encontrados domínios proteicos conservados na região do polipeptídeo SGI1 no terminal C em relação ao domínio myb, isto é, no terminal C (aproximadamente) metade da proteína. Os domí- nios RR e Myb, por outro lado, em que o domínio myb está posicionado no terminal C em relação ao domínio RR, podem ser encontrados em muitas proteínas codificadas nos genomas de Viridiplantae (planta verde, abrangendo algas). A análise de bioinformática foi usada para identificar prováveis ortólogos de SGI1 em outras espécies de plantas e algas.

[0081] Para identificar uma classe de proteínas SGI1 em organis- mos fotossintéticos adicionais, um modelo oculto de Markov (HMM) foi construído para a arquitetura de domínio RR - domínio myb encontrada em Parachlorella SGI1. Como uma primeira etapa, a sequência polipep- tídica de Parachlorella SGI1 (SEQ ID NO: 3) foi usada para que o BLAST pesquisasse no banco de dados JGI Phytozome v.12 que incluía os ge- nomas de plantas e algas. Quatro genomas de algas proprietários (das espécies Parachlorella, Nannochloropsis, Tetraselmis e Oocystis) tam- bém foram adicionados ao banco de dados pesquisado. A pesquisa foi interrompida quando atingiu aproximadamente 2.000 ocorrências. Es- ses resultados foram, então, analisados pelo InterProScan (disponível junto a EMBL-EBI [Laboratórios Europeus de Biologia Molecular-Insti- tuto Europeu de Bioinformática, por exemplo, em ebi.ac.uk]) para garan- tir que os resultados selecionados tivessem o domínio da superfamília do tipo Interpro CheY (IPR011006) e o domínio do tipo Interpro Homeo- box ou Myb (IPR009057 ou IPR017930). Esta etapa reduziu o número de ocorrências selecionadas para entre 900 e 1.000, com os polipeptí- deos tendo a arquitetura de dois domínios (domínio RR na terminal N em relação ao domínio myb) claramente identificada em polipeptídeos de algas e plantas superiores. As sequências resultantes foram usadas para montar uma árvore filogenética com base na homologia de sequên- cia. A árvore filogenética mostrou um claro agrupamento de polipeptí- deos relacionados de espécies de alga, incluindo homólogos SGI1 de Parachlorella, Tetraselmis, Oocystis, Chlamydomonas, Volvox, Ostreo- coccus, Micromonas e Coccomyxa. TABELA: ORTÓLOGOS SGI1 EM ESPÉCIE DE ALGA Sequência Organismo Classificação HMM polipeptídica Parachlorella sp. SEQ ID NO: 3 400,20

1.185 Coccomyxa SEQ ID NO: 9 403,0 subellipsoidea Ostreococcus SEQ ID NO: 10 425,8 lucimarinus Chlamydomonas SEQ ID NO: 11 413,3 reinhardtii Chromochloris SEQ ID NO: 12 292,6 zofingiensis Volvox carteri SEQ ID NO: 13 441,4 Tetraselmis sp. 105 SEQ ID NO: 14 403,6 Tetraselmis sp. 105 SEQ ID NO: 15 403,0 Tetraselmis sp. 105 SEQ ID NO: 16 402,9 Oocystis sp. SEQ ID NO: 17 426,9 Micromonas sp. SEQ ID NO: 18 418,4 RC299 Micromonas pusilla SEQ ID NO: 19 405,9

[0082] Para estabelecer um critério para prováveis ortólogos de SGI1 em outros organismos fotossintéticos, então, um modelo oculto de Markov (HMM) foi desenvolvido com base no agrupamento de algas de sequências polipeptídicas SGI1. O HMM foi desenvolvido com base na porção N-terminal do polipeptídeo SGI1 que abrange os domínios RR e myb, incluindo a região aglutinante entre os dois domínios conservados. A sequência dos polipeptídeos no terminal em relação ao domínio myb que não incluiu nenhuma estrutura conservada reconhecível foi excluída da construção do modelo. O HMMER 3.1b2 foi usado para construir o HMM usando Alinhamentos Múltiplos de Sequência (MSAs) a partir de sequências proprietárias de polipeptídeos de Parachlorella, Oocystis e Tetraselmis, bem como sequências de bancos de dados públicos de po- lipeptídeos de Chlamydomonas reinhardtii, Volvox carteri, Chromochlo- ris zofingiensis, Coccomyxa subellipsoidea, Micromonas sp. RCC299 e Ostreococcus luminarinus. Múltiplos alinhamentos de sequência (MSAs) da metade de terminal N da proteína foram gerados usando o kit de ferramentas ETE3 e o fluxo de trabalho eggnog41. Este programa usa internamente os programas Muscle, MAFFT, Clustal Omega e M- coffee para alinhamento, trimAI para aparagem de alinhamento e PhyML para interferência filogenética. Um HMM, ao contrário de uma única sequência de proteínas usada para comparação de homologia, por exemplo, captura informações de várias sequências de proteínas e, portanto, é capaz de distinguir resíduos altamente conservados de alta- mente divergentes e leva isso em consideração ao determinar a relação das sequências. Quando um HMM é usado para pontuar uma sequên- cia, resíduos altamente conservados recebem mais peso que resíduos altamente divergentes, proporcionando, assim, sensibilidade e precisão superiores a PSAs mais simples.

[0083] O SGI1 HHM foi utilizado para atribuir uma classificação aos polipeptídeos identificados na pesquisa BLAST que também foram veri- ficados como tendo os dois domínios conservados (RR e myb). As mai- ores classificações, encontradas praticamente em espécies de alga e em um único polipeptídeo de planta, em uma pesquisa de bioinformática permitiram identificar proteínas de interesse em outras espécies de al- gas (Tabela 1). Estes representam prováveis ortólogos cujos genes po- dem ser atenuados ou submetidos a nocaute para fornecer mutantes de alta produtividade em outros organismos. TABELA 2: ORTÓLOGOS SGI1 EM ESPÉCIES DE PLANTA Sequência Organismo Classificação HMM polipeptídica Sphagnum fallax SEQ ID NO: 20 397,3 Physcomitrella patens SEQ ID NO: 21 372,3 Arabidopsis_thaliana SEQ ID NO: 22 371,1 Arabidopsis halleri SEQ ID NO: 23 475,9 Arabidopsis lyrata SEQ ID NO: 24 395,5 Helianthus annuus SEQ ID NO: 25 391,2 Vitis vinifera SEQ ID NO: 26 390,6 Amborella trichopoda SEQ ID NO: 27 390,1 Ricinus communis SEQ ID NO: 28 390,1 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 29 388,4

Solanum tuberosum SEQ ID NO: 30 387,2 Gossypium hirsutum SEQ ID NO: 31 385,8 Theobroma cacao SEQ ID NO: 32 383,0 Phaseolus vulgaris SEQ ID NO: 33 381,6 Glycine max SEQ ID NO: 34 381,4 Chenopodium quino SEQ ID NO: 35 373,7 Malus domestica SEQ ID NO: 36 372,6 Zea mays SEQ ID NO: 37 371,5 Brassica rapa SEQ ID NO: 38 370,5 Oryza sativa SEQ ID NO: 39 369,6

[0084] Um esquema de gene SGI1 é mostrado na Figura 1A.

[0085] Em algumas modalidades, modulações do gene SGI1, Tais como mutação, atenuação ou nocaute do gene SGI1 em espécies de alga, por exemplo, aumentam o rendimento quântico máximo da foto- química no fotossistema II (Fv/FM) (em cerca de 10 a 14%) enquanto exibem um tamanho de antena reduzido (isto é, corte transversal de ab- sorção funcional) em comparação com a cepa de tipo selvagem da qual foram derivadas.

[0086] Em algumas modalidades, as modulações do gene SGI1 também podem causar tamanho reduzido de antena (isto é, corte trans- versal de absorção funcional) do fotossistema II (PSII) e fotossistema I (PSI) (queda de 40 a 50% em relação ao tipo selvagem), altas taxas de transporte de elétrons no lado aceitador do PSII (1/τ'Qa) sob luz satu- rante (aumentaram entre cerca de 35% e cerca de 130% e em pelo me- nos aproximadamente 100% em relação ao tipo selvagem nos mutantes geneticamente modificados) e altas taxas de fixação de carbono (Pmax) (até pelo menos 30 a 40% em relação ao tipo selvagem), enquanto, conforme determinado pela determinação de proteína de Monitora- mento de Reação Múltipla, é mantido o número de fotossistemas em uma base por TOC.

GENE SGI2

[0087] Os inventores do presente pedido identificaram o Gene 2 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI2) como ortólogos presentes em organismos fotossintéticos, por exemplo, algas, plantas de uma classe de genes reguladores chamada sistemas de dois com- ponentes (TCS) visto que são conhecidos por regular processos celula- res importantes incluindo progressão e desenvolvimento do ciclo celular bacteriano (Skerker et al. 2015; Two-component signal transduction pathways regulating growth and cell cycle progression in a bacterium: a system-level analysis, PLoS Biology. 3 (10): e334), detecção de ni- trogênio (Sanders et al., 1992; Phosphorylation site of NtrC, a protein phosphatase whose covalent intermediate activates transcription. Jour- nal of Bacteriology. 174 (15): 5.117 a 5.122) e quimiotaxia bacteriana (Sanders et al. 1989; Identification of the site of phosphorylation of the chemotaxis response regulator protein, CheY; The Journal of Biological Chemistry. 264 (36): 21.770 a 21.778). Nas bactérias, essas proteínas normalmente consistem em uma histidina quinase que detecta um estí- mulo ambiental específico e um domínio regulador de resposta corres- pondente (PF00072) que medeia a resposta celular, principalmente através da expressão diferencial de genes-alvo. No entanto, nos orga- nismos fotossintéticos, os genes SGI2 compreendem o domínio regula- dor de resposta correspondente (PF00072) e carecem do outro domínio do sistema de dois componentes.

[0088] Um esquema do gene SGI1 é mostrado na Figura 2A e o esquema da proteína correspondente na Figura 2B.

[0089] Uma sequência de gene exemplificativa de Parachlorella SGI2 é fornecida como SEQ ID NO: 4 que codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 5) que compreende um domínio regulador de resposta (SEQ ID NO: 6).

[0090] Sequências polipeptídicas ortólogas exemplificativas em vá- rios organismos fotossintéticos são mostradas na Tabela 3 abaixo. TABELA 3: SEQUÊNCIAS ORTÓLOGAS SGI2 EM VÁRIOS ORGANIS-

MOS FOTOSSINTÉTICOS Organismo fotossintético Sequência polipeptídica Oocystis sp. SEQ ID NO: 40 Tetraselmis sp. SEQ ID NO: 41 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 42 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 43 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 44 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 45 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 46 Glycine max SEQ ID NO: 47 Vitis vinifera SEQ ID NO: 48 Theobroma cacao SEQ ID NO: 49 Oryza sativa SEQ ID NO: 50 Zea mays SEQ ID NO: 51 Physcomitrella patens SEQ ID NO: 52 Volvox carteri SEQ ID NO: 53 Chlamydomonas reinhardtii SEQ ID NO: 54 Chlorella zofingiensis SEQ ID NO: 55 Coccomyxa subellipsoidea C-169 SEQ ID NO: 56

[0091] Uma sequência de cDNA de Parachlorella SGI2 exemplifica- tiva é fornecida como SEQ ID NO: 7. As sequências ortológicas de cDNA do gene SGI2 em outros organismos fotossintéticos são mostra- das na Tabela 4 abaixo. TABELA 4: SEQUÊNCIAS ORTOLÓGICAS DE CDNA DO GENE SGI2

EM OUTROS ORGANISMOS FOTOSSINTÉTICOS Organismo fotossintético Sequência de cDNA

Oocystis sp. SEQ ID NO: 57 Tetraselmis sp. SEQ ID NO: 58 Glycine max SEQ ID NO: 59 Vitis vinifera SEQ ID NO: 60 Theobroma cacao SEQ ID NO: 61 Oryza sativa SEQ ID NO: 62 Zea mays SEQ ID NO: 63 Physcomitrella patens SEQ ID NO: 64 Volvox carteri SEQ ID NO: 65 Chlamydomonas reinhardtii SEQ ID NO: 66 Coccomyxa subellipsoidea SEQ ID NO: 67

[0092] Em algumas modalidades, o polipeptídeo SGI2 de um orga- nismo fotossintético compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 por cento idêntica à SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o polipeptídeo SGI2 de um organismo fotossintético compreende uma sequência de amino- ácidos que é pelo menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 por cento idêntica a pelo menos 100, 150, 200, 250 aminoácidos ou a todo o comprimento das SEQ ID NOs: 5, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ou 56.

[0093] Em algumas modalidades, um organismo fotossintético com- preende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo SGI2 em que a sequência de ácidos nucleicos do polinucleotídeo é pelo menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 por cento idêntica a pelo menos 100, 150, 200, 250 nucleotídeos ou a todo o comprimento das SEQ ID NOs: 4, 7, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 ou 67.

[0094] Em algumas modalidades, a modulação do gene SGI2, tal como mutação, atenuação ou nocaute do gene SGI2 em organismos fotossintéticos, tais como espécies de algas, aumenta o rendimento quântico máximo da fotoquímica no fotossistema II (Fv/FM) (em cerca de

10 a 14%), diminui a clorofila/por carbono orgânico total (TOC), aumenta a biomassa. GENE SPR54

[0095] A modulação do gene SPR54 foi descrita na publicação do pedido de Patente No US 2016/0304896, incorporada a título de refe- rência em sua totalidade. Uma sequência exemplificativa de cDNA de SRP54 cloroplástica de Parachlorella (cpSRP54) é fornecida como SEQ ID NO: 8 que codifica um polipeptídeo que tem SEQ ID NO: 68.

[0096] Outros polipeptídeos cpSRP54 ortólogos exemplificativos não limitativos incluem os Acessos de GenBank: EDP00260 para Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO: 75); EEH59526 para Micromo- nas pusilla (SEQ ID NO: 76); EEH59526 para Micromonas sp. (SEQ ID NO: 77); ACB42577 para Paulinella chromatophora (SEQ ID NO: 78); ABO94038 para Ostreococcus lucimarinus (SEQ ID NO: 79); Q01H03 para Ostreococcus tauri (SEQ ID NO: 80); EFJ41797 para Volvox carteri (SEQ ID NO: 81); EEC48599 para Phaeodactylum tricornutum (SEQ ID NO: 82); EED94755 para Thalassiosira pseudonana (SEQ ID NO: 83); EGB12501 para Aureococcus anophagefferens (SEQ ID NO: 84); CBN76263 para Ectocarpus siliculosus (SEQ ID NO: 85).

[0097] Em algumas modalidades, o gene cpSRP54 de um orga- nismo fotossintético que codifica um polipeptídeo tem pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com um cpSRP54 divulgado acima.

[0098] A modulação de SGI2, uma combinação de SGI1 e SRP54, uma combinação de genes SGI2 e SRP54 ou uma combinação de ge- nes SGI1, SGI2 e SRP54 de organismos fotossintéticos

[0099] A modulação de SGI2, uma combinação de SGI1 e SRP54, uma combinação de genes SGI2 e SRP54 ou uma combinação de ge-

nes SGI1, SGI2 e SRP54 de organismos fotossintéticos resulta em or- ganismos fotossintéticos mutantes. Os genes SGI1, SGI2, SRP54 po- dem ser modulados por mutagênese UV, irradiação gama ou técnicas de modificação genética. As sequências gênicas podem ser alteradas, as sequências gênicas podem ser parcial ou completamente deletadas, a expressão dos genes pode ser alterada.

[0100] Em algumas modalidades, os genes SGI1, SGI2 e/ou SRP54 podem ser operacionalmente aglutinados a promotores de algas e se- quências terminadoras, conforme descrito na Publicação de Pedido No US 2017/0058303, incorporada a título de referência em sua totalidade.

[0101] Em algumas modalidades, um organismo fotossintético mu- tante, por exemplo, planta, alga, tem pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65% ou pelo menos 70% de redução na clorofila total em relação a uma célula de controle, opcionalmente ainda em que o mu- tante tem uma razão entre clorofila a e clorofila b que é aumentada em pelo menos com relação a uma célula de controle, ainda opcionalmente, em que a razão entre clorofila a e clorofila b é de pelo menos cerca de 2,8:1, pelo menos cerca de 3:1, pelo menos cerca de 3,2:1, cerca de 3,3:1, pelo menos cerca de 3,5:1, pelo menos cerca de 3,7:1, pelo me- nos cerca de 3,9:1, pelo menos cerca de 4:1 ou pelo menos cerca de 4,3:1.

[0102] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante, por exemplo, planta ou alga, exibe: a) qP mais alto em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie em todas as irradiâncias entre cerca de 100 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2s-1, entre cerca de 150 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 75 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 40 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, ou entre cerca de 10 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1;

[0103] (b) NPQ mais baixo em relação a uma alga de controle em todas as irradiâncias entre cerca de 100 e cerca de 2800 µmol de fótons m-2s-1, entre cerca de 150 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 75 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 40 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, ou entre cerca de 10 e cerca de

2.800 µmol de fótons m-2 s-1;

[0104] (c) Y(II) mais alto em relação a um organismo fotossintético, por exemplo, alga, em todas as irradiâncias entre cerca de 100 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 150 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 75 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 40 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, ou entre cerca de 10 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1;

[0105] (d) maior Fv/FM em relação a uma alga de controle entre cerca de 100 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 150 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 75 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 40 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, ou entre cerca de 10 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1;

[0106] (e) ESR (II) mais alto em relação a uma alga de controle en- tre cerca de 250 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 150 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 75 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, entre cerca de 40 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1, ou entre cerca de 10 e cerca de 2.800 µmol de fótons m-2 s-1;

[0107] (f) a evolução de oxigênio por clorofila aumentou em pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% em relação a uma alga de con- trole; e

[0108] (g) a fixação de carbono em uma base por clorofila aumentou em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos

80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

[0109] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante demonstra pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8% ou pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 25% ou pelo menos 30% mais produtividade de biomassa do que uma alga de controle cul- tivada em condições idênticas.

[0110] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante, por exemplo, planta, alga, demonstra maior produtividade em re- lação à alga de controle em uma cultura de ciclo de 24h com uma inten- sidade de luz variável que imita a luz natural, opcionalmente em que a intensidade da luz atinge um pico entre cerca de 1.900 e cerca de 2.000 µmol de fótons m-2 s-1.

[0111] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético mu- tante, por exemplo, planta ou alga, tem maior produtividade lipídica, por exemplo, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo me- nos 20% ou pelo menos 25% mais produtividade lipídica em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie que não têm um gene alterado ou atenuado (ou genes alterados ou atenuados).

DEFINIÇÕES

[0112] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica a quem esta invenção pertence. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. A menos que exigido de outra maneira pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas neste documento são incorporadas a título de referência em sua totalidade para todos os fins, como se cada publica- ção ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[0113] Conforme usado na presente divulgação e reivindicações, as formas singulares “um", “uma", “o” e “a" também incluem formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0114] Todas as faixas fornecidas no pedido incluem os valores das extremidades superior e inferior da faixa.

[0115] O termo "e/ou", conforme usado em uma expressão, tal como "A e/ou B" neste documento, se destina a incluir "A e B", "A ou B", "A" e "B".

[0116] O termo "gene" é amplamente utilizado para se referir a qual- quer segmento de uma molécula de ácido nucleico (normalmente DNA, mas opcionalmente RNA) que codifica um polipeptídeo ou RNA ex- presso. Assim, os genes incluem sequências que codificam RNA ex- presso (que pode incluir sequências codificadoras de polipeptídeos ou, por exemplo, RNAs funcionais, tais como RNAs ribossomais, tRNAs, RNAs de antissenso, microRNAs, RNAs em formato de grampo curto, ribozimas, etc.). Os genes podem compreender, ainda, sequências re- guladoras necessárias para, ou que afetam sua expressão, bem como sequências associadas à sequência que codifica a proteína ou RNA em seu estado natural, como, por exemplo, sequências de íntrons, sequên- cias não traduzidas 5’ ou 3', etc. Em alguns exemplos, "gene" pode re- ferir-se apenas a uma parte que codifica a proteína de uma molécula de DNA ou RNA, que pode ou não incluir íntrons. Um gene tem, preferen- cialmente, maios que 50 nucleotídeos de comprimento, mais preferen- cialmente maios que 100 nucleotídeos de comprimento e pode ter, por exemplo, entre 50 nucleotídeos e 500.000 nucleotídeos de compri- mento, tal como entre 100 nucleotídeos e 100.000 nucleotídeos de com- primento ou entre cerca de 200 nucleotídeos e cerca de 50.000 nucleo- tídeos de comprimento, ou cerca de 200 nucleotídeos e cerca de 20.000 nucleotídeos de comprimento. Os genes podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo a clonagem de uma fonte de inte- resse ou a síntese de informações de sequência conhecidas ou previs- tas.

[0117] O termo "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" re- fere-se a um segmento de DNA ou RNA (por exemplo, mRNA) e tam- bém inclui ácidos nucleicos com cadeias principais modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos bloqueados) ou nucleobases de ocorrência não natural ou modificadas. As moléculas de ácido nucleico podem ser de fita dupla, cadeia parcialmente dupla ou cadeia simples; um ácido nucleico de fita simples que compreende um gene ou uma porção dele pode ser uma fita codificadora (de sentido) ou uma fita não codificadora (de antissenso).

[0118] Uma molécula de ácido nucleico pode ser "derivada" de uma fonte indicada, que inclui o isolamento (total ou parcial) de um segmento de ácido nucleico a partir de uma fonte indicada. Uma molécula de ácido nucleico também pode ser derivada de uma fonte indicada por, por exemplo, clonagem direta, amplificação por PCR ou síntese artificial a partir da fonte de polinucleotídeo indicada ou com base em uma sequên- cia associada à fonte de polinucleotídeo indicada. Os genes ou molécu- las de ácido nucleico derivados de uma fonte ou espécie específica tam- bém incluem genes ou moléculas de ácido nucleico com modificações de sequência em relação às moléculas de ácido nucleico da fonte. Por exemplo, um gene ou molécula de ácido nucleico derivado de uma fonte (por exemplo, um determinado gene referido) pode incluir uma ou mais mutações em relação ao gene ou molécula de ácido nucleico de fonte que não são intencionais ou que são introduzidas deliberadamente e, se uma ou mais mutações, incluindo substituições, deleções ou inser- ções, forem introduzidas deliberadamente, as alterações em sequência podem ser introduzidas por mutação aleatória ou direcionada de células ou ácidos nucleicos, por amplificação ou outra síntese gênica ou técni- cas de biologia molecular, ou por síntese química ou qualquer combina- ção das mesmas. Um gene ou molécula de ácido nucleico que é deri- vado de um gene ou molécula de ácido nucleico referida que codifica um RNA ou polipeptídeo funcional pode codificar um RNA ou polipeptí- deo funcional com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o RNA ou polipeptídeo funcional referido ou de fonte, ou com um frag- mento funcional do mesmo. Por exemplo, um gene ou molécula de ácido nucleico que é derivado de um gene ou molécula de ácido nucleico re- ferida que codifica um RNA ou polipeptídeo funcional pode codificar um RNA ou polipeptídeo funcional com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o RNA ou polipep- tídeo funcional referido ou de fonte, ou com um fragmento funcional do mesmo.

[0119] Conforme usado neste documento, um ácido nucleico ou proteína "isolado" é removido de seu meio natural ou do contexto em que o ácido nucleico ou proteína existe na natureza. Por exemplo, uma proteína ou molécula de ácido nucleico isolada é removida da célula ou organismo ao qual está associada em seu ambiente nativo ou natural. Um ácido nucleico ou proteína isolada pode ser, em alguns casos, par- cial ou substancialmente purificada, mas nenhum nível particular de pu- rificação é necessário para o isolamento. Assim, por exemplo, uma mo- lécula de ácido nucleico isolada pode ser uma sequência de ácidos nu- cleicos que foi excisada do cromossomo, genoma ou epissomo em que está integrada na natureza.

[0120] Uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotí- deos "purificada", ou sequência de proteína ou polipeptídeo, está subs-

tancialmente livre de material celular e componentes celulares. A molé- cula de ácido nucleico ou proteína purificada pode estar substancial- mente livre de produtos químicos além de tampão ou solvente, por exemplo. "Substancialmente livre" não pretende significar que outros componentes além das novas moléculas de ácido nucleico são indetec- táveis.

[0121] Os termos "ocorrência natural" e "tipo selvagem" se referem a uma forma encontrada na natureza. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos ou proteína de ocorrência natural ou tipo selvagem pode estar presente em uma forma isolada de uma fonte natural e não é intencionalmente modificada por manipulação humana.

[0122] Conforme usado neste documento, "atenuado" significa re- duzido em quantidade, grau, intensidade ou força. A expressão gênica atenuada pode se referir a uma quantidade e/ou taxa de transcrição sig- nificativamente reduzida do gene em questão, ou de tradução, dobra ou montagem da proteína codificada. Conforme exemplos não limitativos, um gene atenuado pode ser um gene mutado ou interrompido (por exemplo, um gene interrompido por deleção parcial ou total, trunca- mento, mudança de quadro ou mutação insercional), com expressão di- minuída devido à alteração ou interrupção de sequências reguladoras de genes ou pode ser um gene alvejado por uma construção que reduz a expressão do gene, tal como, por exemplo, um RNA de antissenso, microRNA, molécula de RNAi ou ribozima.

[0123] "Molécula de ácido nucleico exógena" ou "gene exógeno" re- fere-se a um gene ou molécula de ácido nucleico que foi introduzida (“transformada") em uma célula. Uma célula transformada pode ser de- nominada uma célula recombinante, na qual pode ser introduzido gene exógeno adicional (ou podem ser introduzidos genes exógenos adicio- nais). Um descendente de uma célula transformada com uma molécula de ácido nucleico também é denominado "transformado" se tiver her- dado a molécula de ácido nucleico exógena. O gene exógeno pode ser de uma espécie diferente (e, portanto, "heteróloga"), ou da mesma es- pécie (e, portanto, "homóloga"), em relação à célula que está sendo transformada. Uma molécula de ácido nucleico, gene ou proteína “en- dógena” é uma molécula de ácido nucleico, gene ou proteína nativa, visto que ocorre no hospedeiro, ou é produzida naturalmente pelo hos- pedeiro.

[0124] O termo "nativo" é usado neste documento para se referir a sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos con- forme ocorrem naturalmente no hospedeiro. O termo "não nativo" é usado neste documento para se referir a sequências de ácidos nuclei- cos ou sequências de aminoácidos que não ocorrem naturalmente no hospedeiro. Uma sequência de ácido nucleico ou sequência de amino- ácidos que foi removida de uma célula, submetida a manipulação de laboratório e introduzida ou reintroduzida em uma célula hospedeira é considerada “não nativa". Genes sintéticos ou parcialmente sintéticos introduzidos em uma célula hospedeira são “não nativos". Genes não nativos incluem, ainda, genes endógenos ao microrganismo hospedeiro operacionalmente ligados a uma ou mais sequências reguladoras hete- rólogas que foram recombinadas no genoma de hospedeiro.

[0125] Uma molécula de ácido nucleico "recombinante" ou “geneti- camente modificada" é uma molécula de ácido nucleico que foi alterada através da manipulação humana. Conforme exemplos não limitativos, uma molécula de ácido nucleico recombinante inclui qualquer molécula de ácido nucleico que: 1) tenha sido parcial ou totalmente sintetizada ou modificada in vitro, por exemplo, usando técnicas químicas ou enzimá- ticas (por exemplo, pelo uso de síntese química de ácido nucleico, ou pelo uso de enzimas para replicação, polimerização, digestão (exonu- cleolítica ou endonucleolítica), ligação, transcrição reversa, transcrição,

modificação de bases (incluindo, por exemplo, metilação), integração ou recombinação (incluindo recombinação homóloga e específica de sítio) de moléculas de ácido nucleico); 2) inclua sequências nucleotídicas con- juntas que não são de natureza conjunta; 3) tenha sido modificada usando técnicas de clonagem molecular, de modo que não possua um ou mais nucleotídeos em relação à sequência de moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural; e/ou 4) tenha sido manipulada utilizando técnicas de clonagem molecular, de modo que tenha uma ou mais alte- rações ou rearranjos de sequência em relação à sequência de ácido nucleico de ocorrência natural. Conforme exemplos não limitativos, um cDNA é uma molécula de DNA recombinante, assim como qualquer mo- lécula de ácido nucleico que tenha sido gerada por reação (ou reações) de polimerase in vitro, ou à qual aglutinantes foram anexados ou que tenha sido integrada a um vetor, tal como um vetor de clonagem ou vetor de expressão.

[0126] O termo "proteína recombinante", conforme usado neste do- cumento, refere-se a uma proteína produzida por modificação genética.

[0127] Quando aplicado a organismos, o termo recombinante, ma- nipulado ou geneticamente modificado refere-se a organismos que fo- ram manipulados pela introdução de uma sequência de ácidos nuclei- cos recombinante heteróloga ou exógena no organismo e inclui nocau- tes genéticos, mutações direcionadas, recolocação gênica e recoloca- ção de promotores, deleção ou inserção, bem como introdução de trans- genes ou genes sintéticos no organismo. Organismos recombinantes ou geneticamente modificados também podem ser organismos nos quais foram introduzidas construções para “knock down” de gene. Tais cons- truções incluem, mas sem limitação, construções de RNAi, microRNA, shRNA, siRNA, antissenso e ribozima. Também estão incluídos orga- nismos cujos genomas foram alterados pela atividade de meganuclea- ses, nucleases de dedos de zinco, TALENs ou sistemas Cas/CRISPR.

Uma molécula de ácido nucleico exógena ou recombinante pode ser integrada ao genoma de organismo recombinante/geneticamente modi- ficado ou, em outros casos, pode não ser integrada ao genoma de hos- pedeiro. Conforme usado neste documento, "microrganismo recombi- nante" ou "célula hospedeira recombinante" inclui progênie ou derivados dos microrganismos recombinantes da invenção. Como certas modifi- cações podem ocorrer em gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie ou derivados podem não ser, de fato, idênticos à célula-mãe, mas ainda estão incluídos no escopo do termo, conforme utilizado neste documento.

[0128] O termo "promotor" refere-se a uma sequência de ácido nu- cleico capaz de ligar a RNA polimerase em uma célula e iniciar a trans- crição de uma sequência de codificação a jusante (direção 3'). Um pro- motor inclui o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima de nível de referência. Um promotor pode incluir um sítio de iniciação de transcrição, bem como domínios de ligação a proteínas (sequências de consenso) responsá- veis pela ligação de RNA polimerase. Os promotores eucarióticos con- têm, frequentemente, mas nem sempre, caixas “TATA” e caixas “CAT”. Os promotores procarióticos podem conter 10 e 35 sequências de con- senso de promotores procarióticos. Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, induzíveis e repressíveis, de uma va- riedade de fontes diferentes são bem conhecidos na técnica. As fontes representativas incluem, por exemplo, tipos de células de algas, vírus, mamíferos, insetos, plantas, leveduras e bactérias, e promotores ade- quados dessas fontes estão prontamente disponíveis ou podem ser fei- tos sinteticamente, com base em sequências disponíveis publicamente online ou, por exemplo, de depositários, tais como o ATCC, bem como outras fontes comerciais ou individuais. Os promotores podem ser uni- direcionais (iniciar a transcrição em uma direção) ou bidirecionais (iniciar a transcrição em qualquer direção). Um promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor repressível ou um promotor induzível. Uma região promotora pode incluir, além do promotor gene-proximal, em que a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição, sequências adicio- nais a montante do gene que podem estar dentro de 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb ou mais do sítio inicial de transcrição de um gene, em que as sequências adicionais podem influenciar a taxa de transcrição do gene a jusante e, opcionalmente, a capacidade de resposta do promotor a condições ambientais, bioquímicas (por exemplo, metabólicas) ou de desenvolvimento.

[0129] O termo "heterólogo" quando usado em referência a um po- linucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima, refere-se a um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima que é de uma fonte ou derivado de uma fonte diferente da espécie do orga- nismo hospedeiro. Em contraste, um polinucleotídeo, gene, ácido nu- cleico, polipeptídeo ou enzima “homóloga” é utilizado neste documento para denotar um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima que é derivada da espécie do organismo hospedeiro. Ao se re- ferir a uma sequência reguladora de genes ou a uma sequência auxiliar de ácidos nucleicos usada para manter ou manipular uma sequência de genes (por exemplo, um promotor, uma região 5' não traduzida, região 3’ não traduzida, sequência de adição poli A, sequência de íntrons, sítio de splice, sítio de ligação de ribossomo, sequência de entrada interna do ribossomo, região de homologia do genoma, sítio de recombinação etc.), "heterólogo" significa que a sequência reguladora ou auxiliar não está naturalmente associada ao gene com o qual a sequência regula- dora ou auxiliar de ácido nucleico é justaposta em uma construção, ge- noma, cromossomo ou epissoma. Assim, um promotor operacional- mente aglutinado a um gene ao qual não está operacionalmente ligado em seu estado natural (isto é, no genoma de um organismo não geneti- camente modificado) é denominado, neste documento, um "promotor heterólogo", mesmo que o promotor possa derivar da mesma espécie (ou, em alguns casos, do mesmo organismo) que o gene ao qual está ligado.

[0130] Conforme usado neste documento, o termo "proteína" ou "polipeptídeo" destina-se a abranger um "polipeptídeo" singular, além de "polipeptídeos" no plural, e refere-se a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) linearmente aglutinados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptí- deos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácidos" ou qualquer outro termo usado para se referir a uma ca- deia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos são incluídos na definição de "polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de, ou de forma intercambiável com, qualquer um desses termos.

[0131] Os números de acesso a genes e proteínas, geralmente for- necidos entre parênteses após o nome de um gene ou espécie, são identificadores exclusivos para um registro de sequência disponível pu- blicamente no site do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov), mantido pelo Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos. O número de identificação de sequência "GenInfo Identifier" (GI) é específico para uma sequência de nucleotídeos ou ami- noácidos. Se uma sequência mudar de alguma forma, um novo número de IG é atribuído. Uma ferramenta de Histórico de Revisão de Sequên- cia está disponível para rastrear os vários números de IG, números de versão e datas de atualização para sequências que aparecem em um registro GenBank específico. A pesquisa e obtenção de sequências de ácidos nucleicos ou genes ou sequências de proteínas com base nos números de acesso e nos números GI é bem conhecida nas técnicas de, por exemplo, biologia celular, bioquímica, biologia molecular e ge- nética molecular.

[0132] Conforme usado neste documento, os termos "identidade percentual" ou "homologia" com relação às sequências de ácidos nu- cleicos ou polipeptídeos são definidos como a porcentagem de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos na sequência candidata que são idên- ticos aos polipeptídeos conhecidos, após o alinhamento das sequências para porcentagem máxima de identidade e introdução de espaçamen- tos, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de homologia. A inserção ou deleções no terminal N ou no terminal C não devem ser interpretadas como afetando a homologia, e as deleções e/ou inserções internas na sequência polipeptídica inferiores a cerca de 30, inferiores a cerca de 20 ou inferiores a cerca de 10 resíduos de aminoácidos não devem ser interpretadas como afetando a homologia. A homologia ou identidade no nível da sequência de nucleotídeos ou aminoácidos pode ser determinada pela análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) com uso do algoritmo utilizado pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx (Altschul (1997), Nucleic Acids Res 25, 3389 a 3402 e Karlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 2.264 a 2.268), que são adaptados para pesquisa de similaridade de sequência. A aborda- gem usada pelo programa BLAST é considerar, primeiramente, seg- mentos semelhantes, com e sem espaçamentos, entre uma sequência de consulta e uma sequência de banco de dados, avaliar a significância estatística de todas as correspondências identificadas e, por fim, resu- mir apenas as correspondências que satisfazem um limiar de significân- cia pré-selecionado. Para uma discussão de questões básicas na busca por similaridade de bancos de dados de sequência, consulte Altschul (1994), Nature Genetics 6, 119 a 129. Os parâmetros de pesquisa para histograma, descrições, alinhamentos, expectativa (isto é, o limite de significância estatística para relatar correspondências com as sequên- cias do banco de dados), ponto de corte, matriz e filtro (baixa complexi- dade) podem estar nas configurações padrão. A matriz de pontuação padrão usada por blastp, blastx, tblastn e tblastx é a matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10.915 a 10.919), reco- mendada para sequências de consultas com mais de 85 de compri- mento (nbases de ucleotídeo ou aminoácidos).

[0133] Para blastn, projetado para comparar sequências de nucleo- tídeos, a matriz de pontuação é definida pelas proporções de M (isto é, a classificação de recompensa para um par de resíduos corresponden- tes) e N (isto é, a classificação de penalidade para resíduos de incom- patibilidade), em que os valores-padrão de M e N podem ser +5 e -4, respectivamente. Quatro parâmetros de blastn podem ser ajustados da seguinte forma: Q = 10 (penalidade de criação de espaçamento); R = 10 (penalidade de extensão de espaçamento); wink = 1 (gera ocorrên- cias de palavras em todas as posições de wink ao longo da consulta); e gapw = 16 (define a largura da janela na qual os alinhamentos espaça- dos são gerados). As configurações equivalentes dos parâmetros de Blastp para comparação de sequências de aminoácidos podem ser: Q = 9; R = 2; wink = 1; e gapw = 32. Uma comparação Bestfit entre se- quências, disponível no pacote GCG versão 10.0, pode usar os parâ- metros de DNA GAP = 50 (penalidade de criação de espaçamento) e LEN = 3 (penalidade de extensão de espaçamento), e as configurações equivalentes nas comparações de proteínas podem ser GAP = 8 e LEN = 2.

[0134] Assim, ao se referir às sequências polipeptídicas ou de áci- dos nucleicos da presente invenção, estão incluídas identidades de se- quência de pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou cerca de 100% de identidade de se- quência com a sequência completa de polipeptídeos ou ácidos nuclei- cos, ou com fragmentos da mesma compreendendo uma sequência consecutiva de pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150 ou mais resíduos de aminoácidos da pro- teína inteira; variantes de tais sequências, por exemplo, em que pelo menos um resíduo de aminoácido foi inserido no terminal N e/ou C na, e/ou dentro da sequência divulgada que contém (ou das sequências di- vulgadas que contêm) a inserção e substituição. As variantes contem- pladas podem incluir, de maneira adicional ou alternada, aquelas que contêm mutações predeterminadas por, por exemplo, recombinação ho- móloga ou mutagênese por PCR ou sítio-direcionada, e os polipeptídeos ou ácidos nucleicos correspondentes de outras espécies, incluindo, po- rém sem limitação aos descritos neste documento, os alelos ou outras variantes de ocorrência natural da família de polipeptídeos ou ácidos nucleicos que contêm uma inserção e substituição; e/ou derivados em que o polipeptídeo foi modificado covalentemente por substituição, pro- duto químico, enzimático ou outro meio apropriado com uma porção quí- mica que não seja um aminoácido de ocorrência natural que contém a inserção e substituição (por exemplo, uma porção química detectável, tal como uma enzima).

[0135] Conforme usado neste documento, a expressão "substitui- ção conservadora de aminoácidos" ou "mutação conservadora" refere- se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido com uma pro- priedade comum. Uma maneira funcional de definir propriedades co- muns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normali- zadas de alterações de aminoácidos entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz (1979) Principles of Protein Struc- ture, Springer-Verlag). De acordo com tais análises, grupos de aminoá- cidos podem ser definidos em que os aminoácidos de um grupo são trocados preferencialmente entre si e, portanto, se assemelham mais ao seu impacto na estrutura geral da proteína (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer- Verlag). Exemplos de grupos de aminoáci- dos definidos dessa maneira podem incluir: um "grupo polar/carregado" incluindo Glu, Asp, Asn, Gln, Lys, Arg e His; um "grupo aromático ou cíclico", incluindo Pro, Phe, Tyr e Trp; e um "grupo alifático", incluindo Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Ser, Thr e Cys.

Dentro de cada grupo, os subgrupos também podem ser identificados.

Por exemplo, o grupo de aminoácidos carregados/polares pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: o "subgrupo carregado positivamente" compreendendo Lys, Arg e His; o "subgrupo com carregado negativamente" compreendendo Glu e Asp; e o "subgrupo polar" compreendendo Asn e Gln.

Em outro exemplo, o grupo aromático ou cíclico pode ser subdividido em subgru- pos, incluindo: o "subgrupo de anel de nitrogênio" compreendendo Pro, His e Trp; e o "subgrupo fenila" compreendendo Phe e Tyr.

Em outro exemplo adicional, o grupo alifático pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: o "subgrupo alifático não polar grande" compreendendo Val, Leu e Ile; o "subgrupo alifático levemente polar" compreendendo Met, Ser, Thr e Cys; e o "subgrupo de pequenos resíduos" compreendendo Gly e Ala.

Exemplos de mutações conservadoras incluem substituições de aminoácidos de aminoácidos dentro dos subgrupos acima, tais como, porém sem limitação: Lis para Arg ou vice-versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida; Glu para Asp ou vice-versa, de modo que uma carga negativa possa ser mantida; Ser para Thr ou vice- versa, de modo que um -OH livre possa ser mantido; e Gln para Asn ou vice-versa, de modo que um -NH2 livre possa ser mantido.

Uma "vari-

ante conservadora" é um polipeptídeo que inclui um ou mais aminoáci- dos que foram substituídos para recolocar um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência (por exemplo, um polipeptídeo cuja sequên- cia é divulgada em uma publicação ou banco de dados de sequência, ou cuja sequência foi determinada por sequenciamento de ácido nu- cleico) com um aminoácido possuindo propriedades comuns, por exem- plo, pertencendo ao mesmo grupo ou subgrupo de aminoácidos, con- forme delineado acima.

[0136] Conforme usado neste documento, o termo “modular" ou "modulação" de um gene refere-se à alteração da sequência de ácidos nucleicos do gene, deleção total ou parcial do gene, causando uma fra- gmentação no gene, alteração da expressão do gene, inibição ou silen- ciamento da expressão do gene. Em algumas modalidades, alterar a sequência de um gene é por inserção de um ou mais nucleotídeos, de- leção de um ou mais nucleotídeos, substituição dos nucleotídeos. A al- teração das sequências pode ser obtida por radiação UV, radiação gama, modificação genética.

[0137] Conforme utilizado neste documento, "atenuar a expressão de um gene" significa reduzir ou eliminar a expressão do gene de qual- quer maneira que reduza a produção da proteína totalmente funcional.

[0138] Conforme usado neste documento, "expressão" inclui a ex- pressão de um gene pelo menos no nível da produção de RNA, e um "produto de expressão" inclui o produto resultante, por exemplo, um po- lipeptídeo ou RNA funcional (por exemplo, um RNA ribossômico, um tRNA, um RNA de antissenso, um micro RNA, um shRNA, uma ribozima etc.) de um gene expresso. O termo "expressão aumentada" inclui uma alteração na expressão gênica para facilitar a produção aumentada de mRNA e/ou expressão aumentada de polipeptídeo. "Produção aumen- tada" inclui um aumento na quantidade de expressão de polipeptídeo,

no nível da atividade enzimática de um polipeptídeo ou em uma combi- nação de ambos, conforme comparada com a produção nativa ou ativi- dade enzimática do polipeptídeo.

[0139] Alguns aspectos da presente invenção incluem deleção, si- lenciamento, inativação ou regulação decrescente parcial, substancial ou completa da expressão de sequências polinucleotídicas específicas. Os genes podem ser parcial, substancial ou completamente deletados, silenciados, inativados ou sua expressão pode ser regulada de forma decrescente a fim de afetar a atividade realizada pelo polipeptídeo que os mesmos codificam, tal como a atividade de uma enzima. Os genes podem ser parcial, substancial ou completamente deletados, silencia- dos, inativados ou regulados de forma decrescente pela inserção de se- quências de ácidos nucléicos que interrompem a função e/ou expressão do gene (por exemplo, inserção viral, mutagênese de transposões, me- ganucleases geneticamente modificadas, recombinação homóloga ou outros métodos conhecidos na técnica). Os termos "eliminar", "elimina- ção" e “nocaute" podem ser usados de forma intercambiável com os termos “deleção", “deleção parcial", “deleção substancial" ou “deleção completa". Em certas modalidades, um microrganismo de interesse pode ser geneticamente modificado por recombinação homóloga de sí- tio-direcionado para fazer nocaute de um gene específico de interesse. Ainda, em outras modalidades, as construções de RNAi ou DNA de an- tissenso (asDNA) podem ser usadas para silenciar, regular de forma decrescente ou desativar parcial, substancial ou completamente um gene específico de interesse.

[0140] Essas inserções, deleções ou outras modificações de certas moléculas de ácido nucleico ou sequências polinucleotídicas específi- cas podem ser entendidas como englobando "modificação genética (ou modificações genéticas)" ou "transformação (ou transformações)", de modo que as cepas resultantes dos microrganismos ou células hospe- deiras possam ser entendidas como sendo "geneticamente modifica- das", "geneticamente projetadas" ou “transformadas".

[0141] Conforme usado neste documento, “regulado de forma cres- cente" ou “regulação crescente" inclui um aumento na expressão de um gene ou molécula de ácido nucleico de interesse ou na atividade de uma enzima, por exemplo, um aumento na expressão genética ou na ativi- dade enzimática conforme comparado com a expressão ou atividade em um gene ou enzima de outra forma idêntica, que não tenha sido regulada de forma crescente.

[0142] Conforme usado neste documento, “regulado de forma de- crescente" ou "regulação decrescente" inclui uma diminuição na expres- são de um gene ou molécula de ácido nucleico de interesse ou na ativi- dade de uma enzima, por exemplo, uma diminuição na expressão do gene ou atividade enzimática em comparação com o expressão ou ati- vidade em um gene ou enzima idêntica de outra forma, que não tenha sido regulada de forma decrescente.

[0143] Conforme usado neste documento, "mutante" refere-se a um organismo que não ocorre naturalmente e tem uma mutação em um gene que surgiu como resultado da mutagênese clássica, por exemplo, com uso de irradiação gama, UV ou mutagenese química. "Mutante", conforme usado neste documento, também se refere a uma célula re- combinante que possui estrutura ou expressão alterada de um gene como resultado de modificação genética que pode incluir, como exem- plos não limitativos, superexpressão, incluindo a expressão de um gene sob diferentes regulações temporais, biológicas ou ambientais e/ou em um grau diferente do que ocorre naturalmente e/ou expressão de um gene que não é expresso naturalmente na célula recombinante; recom- binação homóloga, incluindo nocautes e knockins (por exemplo, substi- tuição de genes por genes que codificam polipeptídeos com atividade maior ou menor que o polipeptídeo de tipo selvagem e/ou polipeptídeos negativos dominantes); atenuação de genes via RNAi, RNA de antis- senso, ou ribozimas, ou similares; e modificação genética com uso de meganucleases, TALENs e/ou tecnologias CRISPR e similares.

Um or- ganismo mutante de interesse normalmente terá um fenótipo diferente daquele da cepa de tipo selvagem ou progenitora correspondente que não possui a mutação, em que o fenótipo pode ser avaliado por ensaios de crescimento, análise de produtos, propriedades fotossintéticas, en- saios bioquímicos, etc.

Ao fazer referência a um gene "mutante" signi- fica que o gene tem pelo menos uma alteração, deleção ou inserção de base (nucleotídeo) em relação a um gene nativo ou de tipo selvagem.

A mutação (alteração, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos) pode ser na região codificante do gene ou em um íntron, 3’ UTR, 5’ UTR ou região promotora, por exemplo, dentro de 2 kb do sítio inicial de trans- crição ou dentro de 3 kb ou o sítio inicial de tradução.

Conforme exem- plos não limitativos, um gene mutante pode ser um gene que possui uma inserção na região promotora que pode aumentar ou diminuir a ex- pressão do gene; pode ser um gene que possui uma deleção, resul- tando na produção de uma proteína não funcional, proteína truncada, proteína negativa dominante ou nenhuma proteína; pode ser um gene que possui uma ou mais mutações pontuais que levam a uma alteração no aminoácido da proteína codificada ou resulta em splicing aberrante da transcrição do gene, etc.

Conforme utilizado neste documento, "mu- tante" refere-se a um organismo que não ocorre naturalmente e tem uma mutação em um gene que surgiu como resultado da mutagênese clássica, por exemplo, com uso de irradiação gama, UV ou mutagenese química. "Mutante", conforme usado neste documento, também se re- fere a uma célula recombinante que possui estrutura ou expressão alte- rada de um gene como um resultado de modificação genética que pode incluir, como exemplos não limitativos, superexpressão, incluindo a ex- pressão de um gene sob diferentes regulações temporais, biológicas, ou ambientais e/ou em um grau diferente do que ocorre naturalmente e/ou expressão de um gene que não é naturalmente expresso na célula recombinante.

[0144] O termo "Pfam" refere-se a uma grande coleção de domínios e famílias de proteínas mantidos pelo Consórcio Pfam e disponíveis junto ao Welcome Trust, Sanger Institute); pfam.sbc.su.se (Stockholm Bioinformatics Center; Janelia Farm, Howard Hughes Medical Institute; Institut national de la Recherche Agronomique. A versão mais recente do Pfam é a Pfam 27.0 (março de 2013), com base no banco de dados de proteínas UniProt, versão 2012_06. Os domínios e famílias da Pfam são identificados com uso de vários alinhamentos de sequência e mo- delos de Markov ocultos (HMMs). As atribuições de família ou domínio Pfam-A são atribuições de alta qualidade geradas por um alinhamento de sementes com curadoria, com uso de membros representativos de uma família de proteínas e modelos de Markov ocultos com base no alinhamento de sementes. (Salvo especificado de outra forma, as cor- respondências de uma proteína consultada a um domínio ou família Pfam são correspondências Pfam-A.) Todas as sequências identifica- das pertencentes à família são, então, usadas para gerar automatica- mente um alinhamento completo para a família (Sonnhammer (1998) Nucleic Acids Research 26, 320 a 322; Bateman (2000) Nucleic Acids Research 26, 263 a 266; Bateman (2004) Nucleic Acids Research 32, Database Issue, D138 a D141; Finn (2006) Nucleic Acids Research Da- tabase Edição 34, D247 a 251; Finn (2010) Nucleic Acids Research Da- tabase Issue 38, D211 a 222). Ao acessar o banco de dados da Pfam, por exemplo, com uso de qualquer um dos sites da web mencionados acima, as sequências de proteínas podem ser consultadas nos HMMs com uso do software de pesquisa de homologia HMMER (por exemplo,

HMMER2, HMMER3 ou uma versão superior). Correspondências signi- ficativas que identificam uma proteína consultada como estando em uma família Pfam (ou como possuindo um domínio Pfam específico) são aquelas nas quais a classificação de bits é maior ou igual ao limite de coleta para o domínio Pfam. Os valores de expectativa (valores e) tam- bém podem ser usados como critério para inclusão de uma proteína consultada em um Pfam ou para determinar se uma proteína consultada possui um domínio Pfam específico, em que baixos valores e (valores inferiores a 1,0, por exemplo, inferiores a 0,1, ou inferior ou igual a 0,01) representam baixas probabilidades de uma correspondência ser devida ao acaso.

[0145] Conforme usado neste documento, o termo "organismo fo- tossintético" refere-se a um organismo que pode converter energia lu- minosa em energia química. Em algumas modalidades, a energia quí- mica pode ser liberada posteriormente para alimentar as atividades dos organismos (transformação de energia). Em algumas modalidades, essa energia química é armazenada em moléculas de carboidratos, tais como açúcares, que são sintetizadas a partir de dióxido de carbono e água.

[0146] Exemplos não limitativos de organismos fotossintéticos in- cluem plantas, algas e cianobactérias. Exemplos não limitativos de al- gas pertencem aos gêneros Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankis- trodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botry- dium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydo- monas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclo- tella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haemato- coccus, Halocafeteria, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepo-

cinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nan- nochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzs- chia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Pa- rachlorella, Pascheria, Pelagomonas, Phaeodactylum, Phagus, Pico- chlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseu- dochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Te- traselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria e Volvox.

[0147] Exemplos não limitativos de plantas incluem Arabidopsis are- nicola, Arabidopsis arenosa, Arabidopsis cebennensis, Arabidopsis cro- atica, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis neglecta, Ara- bidopsis pedemontana, Arabidopsis suecica, Arabidopsis thaliana, Zea mays, Oryza sativa, Triticum aestivum, Solanum tuberosum, Allium cepa, Allium sativum, Glycine max, Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Gossypium herbaceum, Gossypium arboreum, Gossypium to- mentosum, Brassica nigra e Brassica sp.

[0148] Conforme usado neste documento, o termo "organismo fo- tossintético mutante" ou "algas mutantes" refere-se a um organismo ou algas fotossintéticas em que pelo menos o SGI1, SGI2, uma combina- ção de SGI1 e SRP54, uma combinação de SGI2 e SRP54 ou uma com- binação de SGI1, SGI2 e SRP54 é modulado. Tais modulações podem incluir uma alteração na sequência de ácidos nucleicos ou alternância da expressão do gene (ou expressão dos genes).

[0149] Conforme utilizado neste documento, a modulação de uma combinação dos genes SGI1 e SRP54 refere-se à modulação de SGI1 e modulação dos genes SRP54 no mesmo organismo fotossintético. Da mesma forma, a modulação de uma combinação dos genes SGI2 e SRP54 refere-se à modulação de SGI2 e modulação dos genes SRP54 no mesmo organismo fotossintético. Do mesmo modo, a modulação de uma combinação dos genes SGI1, SGI2 e SRP54 refere-se à modula- ção de SGI1, modulação de SGI2 e modulação de genes SRP54 no mesmo organismo fotossintético.

[0150] Conforme usado neste documento, o termo organismo fotos- sintético de controle refere-se a um organismo fotossintético que é subs- tancialmente idêntico do ponto de vista genético em todos os aspectos relevantes ao organismo fotossintético mutante, com a exceção de que o organismo fotossintético de controle não possui um SRP54, SGI1, SGI2 mutado ou atenuado ou uma combinação de dois ou mais dos genes. Por exemplo, um organismo fotossintético de controle é da mesma espécie e, com exceção das alterações nos genes cpSRP54, citosólico SRP54, SGI1 ou SGI2 ou construções para atenuar os genes cpSRP54, citosólico SRP54, SGI1, SGI2 presentes no mutante, é gene- ticamente idêntico, com exceção de pequenas alterações no genoma (por exemplo, "SNPs") que não afetam a fisiologia celular que podem ocorrer durante a mutagênese através da propagação normal. Em vá- rias modalidades, um organismo fotossintético de controle é uma cepa da qual o organismo fotossintético mutante atenuou a expressão de um SRP54 citosólico, cpSRP54, SGI1, SGI2 ou uma combinação de pelo menos dois genes é derivado.

[0151] Ao se referir a um organismo fotossintético, tal como uma alga, o termo "aclimatado à pouca luz" significa ter a clorofila aumentada e propriedades fotossintéticas do organismo fotossintético após ser ex- posto a uma baixa intensidade de luz por um período de tempo sufici- ente para mudanças em clorofila e propriedades fotossintéticas para es- tabilizar em condições de pouca luz. Por exemplo, pouca luz pode ser menos que 200 µE·m-2·s-1 e, de preferência, cerca de 100 µE·m-2·s-1 ou menos ou 50 µE·m-2·s-1 ou menos, e o período de aclimatação pode ser de pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de seis horas, pelo menos cerca de oito horas ou pelo menos cerca de doze horas,

pelo menos 24 horas ou pelo menos 48 horas, e pode durar até 2, 3, 4 ou 5 dias.

[0152] Um "cDNA" é uma molécula de DNA que compreende pelo menos uma porção da sequência nucleotídica de uma molécula de mRNA, com a exceção de que a molécula de DNA substitui a nucleo- base timina, ou T, no lugar da uridina ou U, que ocorre na sequência mRNA. Um cDNA pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples e pode ser, por exemplo, o complemento da sequência de mRNA. Em exemplos preferenciais, um cDNA não inclui uma ou mais sequências de íntrons que ocorrem no gene de ocorrência natural a que o cDNA corresponde (isto é, o gene que ocorre no genoma de um organismo). Por exemplo, um cDNA pode ter sequências a montante de um íntron de um gene que ocorre naturalmente justapostas a sequências a jusante do íntron de um gene que ocorre naturalmente, em que as sequências a montante e a jusante não são justapostas em uma molécula de DNA na natureza (isto é, as sequências não são justapostas no gene que ocorre natural- mente). Um cDNA pode ser produzido por transcrição reversa de molé- culas de mRNA ou pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese quí- mica e/ou com uso de uma ou mais enzimas de restrição, uma ou mais ligases, uma ou mais polimerases (incluindo, porém sem limitação, po- limerases tolerantes a altas temperaturas que podem ser usadas em reações em cadeia da polimerase (PCRs)), uma ou mais recombinases, etc., com base no conhecimento da sequência de cDNA, em que o co- nhecimento da sequência de cDNA pode, opcionalmente, se basear na identificação de regiões de codificação das sequências do genoma ou compiladas a partir das sequências de múltiplos cDNAs parciais.

[0153] Um mutante de algas “desregulado em aclimatação com pouca luz” (ou um mutante “preso em aclimatação com muita luz” ou LIHLA) é um mutante que não exibe as alterações no fenótipo e na ex- pressão gênica que são características de uma célula de alga do tipo selvagem aclimatada com pouca luz, incluindo: um aumento substancial na clorofila e um aumento substancial na expressão da maioria dos ge- nes da proteína do complexo de captação de luz (LHCP). Um mutante de algas desregulado em aclimatação com pouca luz, quando aclima- tado com pouca luz, diminuiu a expressão em relação a células do tipo selvagem aclimatadas com pouca luz, de múltiplos genes (por exemplo, pelo menos dez, pelo menos vinte, pelo menos trinta, pelo menos qua- renta ou pelo menos cinquenta genes) que são regulados de forma cres- cente durante a aclimatação com pouca luz das células do tipo selva- gem. Além disso, um mutante de algas desregulado em aclimatação com pouca luz aumentou a expressão de genes em relação a células do tipo selvagem aclimatadas com pouca luz (por exemplo, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez genes) que são reguladas de forma decres- cente durante a aclimatação com pouca luz das células do tipo selva- gem. Além disso, conforme divulgado neste documento, um mutante de algas desregulado em aclimatação com pouca luz pode ter proprieda- des fotossintéticas significativamente diferentes das propriedades fotos- sintéticas de células do tipo selvagem quando ambas as células mutante e do tipo selvagem são aclimatadas com pouca luz.

[0154] "Propriedades fotossintéticas", "propriedades fotossintéti- cas", "propriedades fotofisiológicas" ou “parâmetros fotofisiológicos” in- cluem, sem limitação, taxa fotossintética máxima, Pmax (calculada com base na clorofila por célula ou por mg), a intensidade na qual a fotossín- tese satura, Ek, conforme medido pela evolução de oxigênio, e a curva de ɑ (“alfa”) a inclinação inicial da curva da fotossíntese (evolução de oxigênio) versus intensidade de irradiância (P/I). Propriedades fotossin- téticas adicionais incluem vários parâmetros que podem ser medidos usando a detecção de fluorescência, incluindo, por exemplo, rendimento quântico máximo da fotoquímica no fotossistema II, Fv/FM; o rendimento quântico fotossintético do fotossistema II (PSII), ɸPSII; arrefecimento brusco fotoquímico ou a proporção de centros abertos de PSII, qP; ar- refecimento brusco não fotoquímico, NPQ; taxa de transporte de elé- trons PSII, ETRPSII; taxa de transporte de elétrons PSI, ETRPSI; tama- nho do corte transversal de absorção funcional do PSI (σ PSI) e corte transversal da absorção funcional do PSII (σPSII). A lista neste docu- mento não é abrangente e os termos não excluem outros parâmetros que medem vários aspectos da fotossíntese.

[0155] A referência a propriedades "substancialmente iguais" pre- tende significar que as propriedades estão dentro de 10% e, de prefe- rência, dentro de 5% do valor de referência.

[0156] Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou du- rante teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustra- tivos e não pretendem ser limitativos. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada e das rei- vindicações.

ATENUAÇÃO DOS GENES

[0157] Um organismo fotossintético mutante pode ser um mutante gerado por qualquer método viável, porém sem limitação, irradiação por UV, irradiação gama ou mutagênese química e triagem de mutantes com baixo teor de clorofila com as propriedades fotossintéticas divulga- das neste documento. Os métodos para gerar mutantes de cepas mi- crobianas são bem conhecidos. Os mutantes podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, sequencia- mento de genoma, PCR, imunodetecção da proteína cpSRP54 ou cytoSRP54 e análise de expressão (por exemplo, transcrição re- versa/PCR).

[0158] Um organismo fotossintético mutante, conforme fornecido neste documento, também pode ser geneticamente modificado no SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação de SGI2 e cpSRP54, por exemplo, que foi alvo de recombinação homóloga para nocaute ou substituição gênica (por exemplo, com uma forma mutada do gene que pode codificar um polipeptídeo com atividade reduzida em relação ao polipeptídeo do tipo selvagem). Em exemplos adicionais, uma cepa de alga de interesse pode ser manipulada por recombinação homóloga de sítio-direcionado para inserir um gene de interesse específico com ou sem uma sequên- cia de controle de expressão como um promotor, em um lócus genômico específico ou para inserir um promotor em um lócus genético do micror- ganismo hospedeiro para afetar a expressão de um determinado gene ou conjunto de genes no lócus.

[0159] Por exemplo, nocaute genético ou substituição por recombi- nação homóloga pode ser por transformação de um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, DNA) que inclui uma sequência homóloga à re- gião do genoma a ser alterada, em que a sequência homóloga é inter- rompida por uma sequência estranha, tipicamente um gene marcador selecionável que permite a seleção para o construto integrado. As se- quências de flanqueamento homólogas ao genoma em ambos os lados da sequência estranha ou sequência genética mutada podem ter, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1.000, pelo menos

1.200, pelo menos 1.500, pelo menos 1.750 ou pelo menos 2.000 nu- cleotídeos de comprimento. Um nocaute genético ou construção "knockin" de gene em que uma sequência estranha é flanqueada por sequências de genes-alvo, pode ser fornecido em um vetor que pode ser, opcionalmente, linearizado, por exemplo, fora da região que deve sofrer recombinação homóloga ou pode ser fornecido como um frag- mento linear que não está no contexto de um vetor, por exemplo, a cons- trução nocaute ou knockin pode ser um fragmento isolado ou sinteti- zado, incluindo, porém sem limitação, um produto de PCR. Em alguns casos, um sistema de marcador de divisão pode ser usado para gerar nocautes de genes por recombinação homóloga, em que dois fragmen- tos de DNA podem ser introduzidos que podem regenerar um marcador selecionável e interromper o lócus genético de interesse por meio de três eventos de cruzamento (Jeong et al. (2007) FEMS Microbiol Lett 273: 157 a 163).

[0160] Em um aspecto, a invenção fornece organismos genetica- mente modificados, por exemplo, microrganismos que têm uma ou mais modificações genéticas para atenuar a expressão de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54. Conforme utilizado neste documento "expressão atenuante de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54" significa reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais genes mencionados acima de qualquer ma- neira que reduza a produção da proteína totalmente funcional.

[0161] Por exemplo, um organismo fotossintético recombinante ge- neticamente modificado para ter uma expressão atenuada de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54 pode ter um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54 interrompido, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54, na qual o microrganismo recombinante pode ter um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54 que inclui pelo menos uma inserção, mutação ou deleção que reduz ou abole a expressão do gene, de modo que um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54 totalmente funcional, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54 ou cytoSRP54 não seja produzido ou seja produzido em quantidades inferiores às produzidas por um organismo fotossintético de controle da mesma espécie. O SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54 interrompido, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, uma combinação de SGI2 e cpSRP54 ou o gene cytoSRP54 pode ser interrompido por, por exemplo, uma inserção ou substituição de genes mediada por recombinação homóloga e/ou pela atividade de uma meganuclease, nuclease de dedo de zinco (Perez- Pinera et al. (2012) Curr. Opin. Chem. Biol. 16: 268 a 277), TALEN (WO 2014/207043; WO 2014/076571) ou uma endonuclease guiada por RNA, tal como uma proteína cas (por exemplo, uma proteína Cas9) de um sistema CRISPR.

[0162] Sistemas CRISPR, analisados recentemente por Hsu et al. (Cell 157: 1.262 a 1.278, 2014) incluem, além do polipeptídeo ou com- plexo da nuclease de Cas, um RNA alvo, frequentemente designado "crRNA", que interage com o sítio alvo do genoma por complementari- dade com uma sequência do sítio alvo, um RNA de trans-ativação ("tracr") que complexa com o polipeptídeo Cas e também inclui uma re- gião que se liga (por complementaridade) ao crRNA alvo.

[0163] A invenção contempla o uso de duas moléculas de RNA (um "crRNA" e um "tracrRNA") que podem ser transformadas em uma cepa hospedeira (ou expressa em uma cepa hospedeira) que expressa ou é transfectada com uma proteína cas para edição do genoma, ou o uso de um único RNA guia que inclui uma sequência complementar a uma sequência-alvo, bem como uma sequência que interage com uma pro- teína cas. Ou seja, em algumas estratégias, um sistema CRISPR, con- forme usado neste documento, pode compreender duas moléculas de RNA separadas (polinucleotídeos de RNA: um "RNA tracr" e um "RNA alvo" ou "crRNA", veja abaixo) e denominadas, neste documento, como " RNA de molécula dupla de DNA alvoou um "RNA de duas moléculas de DNA alvo". Alternativamente, como ilustrado nos exemplos, o RNA de DNA alvo também pode incluir a sequência transativadora para inte- ração com a proteína Cas (além das sequências-alvo homólogas ("cr")), ou seja, o RNA de DNA alvo pode ser uma molécula de RNA único (po- linucleotídeo de RNA único) e é denominado, neste documento, um "RNA guia quimérico", um “RNA de guia único” ou um "sgRNA". Os ter- mos “RNA de DNA alvo” e "gRNA" são inclusivos, referindo-se tanto a RNAs de DNA alvo de molécula dupla quanto a RNAs de DNA alvo de molécula única (isto é, sgRNAs). Os RNAs de guia de molécula única e os dois sistemas de RNA foram descritos em detalhes na literatura e, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente No. US 2014/0068797, incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade.

[0164] Qualquer proteína Cas pode ser usada nos métodos deste documento, por exemplo, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecidas como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos das mesmas ou versões modificadas das mesmas. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas classe II. A proteína Cas pode ser uma proteína Cas9, tal como uma proteína Cas9 de Staphylococcus pyogenes, S. thermophilus, S. pneu- monia, S. aureus, or Neisseria meningitidis, conforme exemplos não li- mitativos. Outras proteínas Cas de interesse incluem, sem limitação, a endonuclease Cpf1 guiada por RNA (Zetsche et al. (2015) Cell 163: 1 a 13), bem como as nucleases C2c1, C2c2 e C2c3 guiadas por RNA

(Shmakov et al. (2015) Molecular Cell 60: 1 a 13). Também são consi- deradas as proteínas Cas9 fornecidas como SEQ ID NOs: 1 a 256 e 795 a 1.346 na Publicação do Pedido de Patente No. US 2014/0068797 e proteínas quiméricas Cas9 que podem combinar domínios de mais de uma proteína Cas9, bem como variantes e mutantes das proteínas cas9 identificadas. (Por exemplo, uma proteína Cas9 codificada por uma mo- lécula de ácido nucleico introduzida em uma célula hospedeira pode compreender pelo menos uma mutação em relação a uma proteína Cas9 de tipo selvagem; por exemplo, a proteína Cas9 pode ser inativada em um dos domínios de clivagem da proteína resultando em uma vari- ante de "nickase". Exemplos não limitativos de mutações incluem D10A, H840A, N854A e N863A). A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Cas pode ser otimizada com códon para a célula hospedeira de interesse.

[0165] A atividade da nuclease Cas cliva o DNA alvo para produzir quebras de cadeia dupla. Essas quebras são, então, reparadas pela cé- lula de uma dentre as duas maneiras: união de extremidade não homó- loga ou reparo direcionado à homologia. Na união de extremidades não homólogas (NHEJ), as quebras de cadeia dupla são reparadas pela li- gação direta das extremidades de quebra entre si. Nesse caso, nenhum material de ácido nucleico novo é inserido no sítio, embora algum ma- terial de ácido nucleico possa ser perdido, resultando em uma deleção, ou alterado, geralmente resultando em uma mutação. No reparo direci- onado à homologia, um polinucleotídeo doador (por vezes denominado "DNA doador" ou "DNA de edição") que pode ter homologia com a se- quência de DNA alvo clivada é usado como um modelo para reparo da sequência de DNA alvo clivada, resultando na transferência de informa- ção genética do polinucleotídeo doador para o DNA alvo. Como tal, um novo material de ácido nucleico pode ser inserido/copiado no sítio. As modificações do DNA alvo devido à NHEJ e/ou reparo direcionado à homologia (por exemplo, usando uma molécula de DNA doadora) po- dem levar a, por exemplo, correção de genes, substituição de genes, marcação de genes, inserção de transgene, deleção de nucleotídeos, interrupção de genes, mutação genética, etc.

[0166] Em alguns casos, a clivagem do DNA por um polipeptídeo modificador de sítio-direcionado (por exemplo, uma nuclease de Cas, nuclease de dedo de zinco, meganuclease ou TALEN) pode ser usada para deletar material de ácido nucleico de uma sequência de DNA alvo, clivando a sequência de DNA alvo e permitindo que a célula repare a sequência na ausência de um polinucleotídeo doador fornecido exoge- namente. Tais eventos da NHEJ podem resultar em mutações (“reparo incorreto”) no sítio da união das extremidades clivadas que podem re- sultar em interrupção do gene.

[0167] Alternativamente, se um RNA de DNA alvo for coadminis- trado a células que expressam uma nuclease de cas junto com um DNA doador, os métodos em questão podem ser usados para adicionar, isto é, inserir ou substituir, material de ácido nucleico a uma sequência de DNA alvo (por exemplo, “nocaute” por mutagênese de inserção ou “knockin” de um ácido nucleico que codifica uma proteína (por exemplo, um marcador selecionável e/ou qualquer proteína de interesse), um siRNA, um miRNA, etc. para modificar uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, introduzir uma mutação) e similares.

[0168] Um DNA doador pode incluir, em modalidades particulares, uma sequência reguladora do gene (por exemplo, um promotor) que pode ser, com uso do alvejamento de CRISPR, inserido a montante das regiões codificadoras do gene e a montante da região promotora proxi- mal presumida do gene, por exemplo, pelo menos 50 pb, pelo menos 100 pb, pelo menos 120 pb, pelo menos 150 pb, pelo menos 200 pb, pelo menos 250 pb, pelo menos 300 pb, pelo menos 350 pb, pelo menos 400 pb, pelo menos 450 pb, ou pelo menos 500 pb a montante do ATG de início da região de codificação do gene cpSRP54. O DNA do doador pode incluir uma sequência, tal como, por exemplo, um marcador sele- cionável ou qualquer sequência conveniente, que possa interferir no promotor nativo. A sequência adicional inserida a montante do ATG de início do SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos ge- nes ou uma combinação da estrutura de leitura aberta (por exemplo, no 5'UTR ou a montante do sítio inicial da transcrição do gene cpSRP54) pode diminuir ou mesmo eliminar a expressão do SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes. De modo alternativa ou adici- onal, o SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54 nativos, ou uma combinação dos genes, pode ter seu promotor endógeno total ou parcialmente subs- tituído por um promotor mais fraco ou diferentemente regulado ou uma sequência não promotora.

[0169] Em alguns exemplos, uma molécula de ácido nucleico intro- duzida em uma célula hospedeira para gerar uma linhagem celular de edição de genoma de alta eficiência codifica uma enzima Cas9 que é mutada em relação à enzima de tipo selvagem correspondente, de modo que a enzima Cas9 mutada não tenha a capacidade de clivar uma ou ambas as cadeias de um polinucleotídeo alvo contendo uma sequên- cia-alvo. Por exemplo, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvCI de Cas9 de S. pyogenes converte Cas9 de uma nuclease que quebra as duas cadeias em uma nickase (uma en- zima que quebra uma única fita). Outros exemplos de mutações que tornam Cas9 uma nickase incluem, sem limitação, H840A, N854A e N863A. Em algumas modalidades, uma nickase Cas9 pode ser usada em combinação com a sequência guia (ou as sequências guia), por exemplo, duas sequências guia, que têm como alvo, respectivamente, as cadeias de sentido e antissenso do alvo de DNA. Essa combinação permite que ambas as cadeias sejam cortadas e usadas para induzir

NHEJ. Dois alvos de nickase (próximos, mas alvejando diferentes ca- deias do DNA) podem ser usados para induzir NHEJ mutagênico. Esse alvejamento de um lócus usando enzimas que clivam cepas opostas em posições escalonadas também podem reduzir a clivagem não alvejada, pois ambas as cadeias devem ser clivadas com precisão e especifica- mente para alcançar a mutação do genoma.

[0170] Em exemplos adicionais, uma enzima Cas9 mutante que é prejudicada em sua capacidade de clivar o DNA pode ser expressa na célula, em que também são introduzidos um ou mais RNAs guias para uma sequência a montante do sítio inicial da transcrição ou da tradução do gene-alvo. Nesse caso, a enzima Cas pode se ligar à sequência-alvo e bloquear a transcrição do gene-alvo (Qi et al. (2013) Cell 152: 1.173 a

1.183).

[0171] Em alguns casos, um polipeptídeo Cas, como um polipeptí- deo Cas9, é um polipeptídeo de fusão, que compreende, por exemplo: i) um polipeptídeo Cas9 (que pode ser, opcionalmente, o polipeptídeo Cas9 variante, conforme descrito acima); e b) um polipeptídeo heteró- logo aglutinado covalentemente (também denominado "parceiro de fu- são"). Uma sequência heteróloga de ácido nucleico pode ser aglutinada a outra sequência de ácido nucleico (por exemplo, por modificação ge- nética) para gerar uma sequência nucleotídica quimérica que codifica um polipeptídeo quimérico. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão Cas9 é gerado pela fusão de um polipeptídeo Cas9 com uma sequência heteróloga que fornece localização subcelular (isto é, a se- quência heteróloga é uma sequência de localização subcelular, por exemplo, um sinal de localização nuclear (NLS) para alvejar para o nú- cleo; um sinal de localização mitocondrial para alvejar para as mitocôn- drias; um sinal de localização de cloroplasto para alvejar para um cloro- plasto; um sinal de retenção de ER; e similares). Em algumas modali- dades, a sequência heteróloga pode fornecer uma etiqueta (isto é, a sequência heteróloga é um rótulo detectável) para facilitar o rastrea- mento e/ou purificação (por exemplo, uma proteína fluorescente, por exemplo, proteína verde fluorescente (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato e similares; uma etiqueta de hemaglutinina (HA); uma etiqueta FLAG; uma etiqueta Myc; e similares).

[0172] As células hospedeiras podem ser geneticamente modifica- das (por exemplo, transduzidas ou transformadas ou transfectadas) com, por exemplo, uma construção vetorial que pode ser, por exemplo, um vetor para recombinação homóloga que inclui sequências de ácidos nucleicos homólogas a uma porção de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação do lócus do gene SGI2 e cpSRP54 da célula hospedeira ou de regiões adjacentes à mesma, ou pode ser um vetor de expressão para a expressão de qualquer ou de uma combinação dentre: uma pro- teína Cas (por exemplo, uma proteína Cas Classe II), um RNA guia qui- mérico CRISPR, um crRNA e/ou um tracrRNA, uma construção de RNAi (por exemplo, um shRNA), um RNA de antissenso ou uma ribozima. O vetor pode estar, por exemplo, na forma de plasmídeo, partícula viral, fago, etc. Um vetor para expressão de um polipeptídeo ou RNA para edição de genoma também pode ser projetado para integração no hos- pedeiro, por exemplo, por recombinação de homólogos. Um vetor con- tendo uma sequência polinucleotídica, conforme descrito nesse docu- mento, por exemplo, sequências com homologia para hospedar SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação das sequências dos genes SGI2 e cpSRP54 (incluindo sequências que estão a montante e a jusante das sequências de codificação cpSRP54 ou cytoSRP54), bem como, opcio- nalmente, um gene marcador ou repórter selecionável, pode ser utili- zado para transformar um hospedeiro apropriado para causar atenua- ção de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação de

SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54.

[0173] O organismo fotossintético recombinante, em alguns exem- plos, pode ter expressão reduzida, mas não abolida, de SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54 e o organismo fotos- sintético recombinante pode ter uma redução na clorofila de cerca de 10% a cerca de 90%, por exemplo, uma redução na clorofila total de cerca de 20% a cerca de 80%. Um microrganismo geneticamente mo- dificado, conforme fornecido neste documento, pode incluir, em alguns exemplos, uma construção de ácido nucleico para atenuar a expressão de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54. Por exemplo, um microrganismo hospedeiro pode incluir uma construção para expressar uma molécula de RNAi, ribozima ou molécula de antis- senso que reduz a expressão de SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54. Em alguns exemplos, um microrganismo re- combinante, conforme fornecido neste documento, pode incluir pelo me- nos uma construção introduzida (exógena ou não nativa) para reduzir a expressão de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação de genes SGI2 e cpSRP54.

[0174] As cepas geneticamente modificadas podem ser seleciona- das para expressão de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos ge- nes SGI2 e cpSRP54 que é diminuída em relação a uma célula de con- trole que não inclui uma modificação genética para atenuar SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação da expressão do gene SGI2 e cpSRP54, mas não eliminada, com uso de métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, RNA-Seq ou transcrição-PCR reversa (RT-PCR).

[0175] Uma cepa geneticamente modificada, conforme fornecido neste documento, pode ser projetada para incluir uma construção para atenuar a expressão gênica, reduzindo a quantidade, estabilidade ou traduzibilidade do mRNA de um gene que codifica um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54. Por exemplo, um or- ganismo fotossintético, tal como uma planta ou uma cepa de algas ou heterocontas, pode ser transformado com uma construção de RNA de antissenso, de RNAi ou de ribozima visando um mRNA de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54 com uso dos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma construção de RNA de antissenso que inclui toda ou uma porção da região transcrita de um gene pode ser introduzida em um microrganismo para diminuir a expressão gênica (Shroda et al. (1999) The Plant Cell 11: 1.165 a 1.178; Ngiam et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 775 a 782; Ohnuma et al. (2009) Protoplasma 236: 107 a 112; Lavaud et al. (2012) PLoS One 7: e36806). De modo alternativa ou adicional, uma construção de RNAi (por exemplo, uma construção que codifica um RNA em formato de grampo curto) alvejando um gene cpSRP54 ou cytoSRP54 pode ser in- troduzida em um microrganismo, tal como uma alga ou um heteroconte para reduzir a expressão do gene cpSRP54 ou cytoSRP54 (consulte, por exemplo, Cerruti et al. (2011) Eukaryotic Cell (2011) 10: 1.164 a

1.172; Shroda et al. (2006) Curr. Genet. 49: 69 a 84).

[0176] As ribozimas são complexos de RNA-proteína que clivam ácidos nucleicos de uma maneira específica do sítio. As ribozimas têm domínios catalíticos específicos que possuem atividade de endonuclea- ses. Por exemplo, o Pedido de Patente US No. 5.354.855 relata que certas ribozimas podem atuar como endonucleases com uma especifi- cidade de sequência maior que a das ribonucleases conhecidas e se aproximando daquela das enzimas de restrição de DNA. As constru- ções de RNA catalítico (ribozimas) podem ser projetadas para parear bases com um mRNA que codifica um gene, conforme fornecido neste documento, para clivar o alvo de mRNA. Em alguns exemplos, as se- quências de ribozimas podem ser integradas dentro de uma construção de RNA de antissenso para mediar a clivagem do alvo. Vários tipos de ribozimas podem ser considerados, sua projeção e uso são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585 a 591.

[0177] As ribozimas são alvejadas para uma dada sequência em virtude de anelamento em um sítio por meio de interações complemen- tares de pares de bases. São necessários dois trechos de homologia para esse alvejamento. Estes trechos de sequências homólogas flan- queiam a estrutura catalítica das ribozimas definida acima. Cada trecho da sequência homóloga pode variar em comprimento de 7 a 15 nucleo- tídeos. O único requisito para definir as sequências homólogas é que, no RNA alvo, as mesmas sejam separadas por uma sequência especí- fica que é o sítio de clivagem. Para a ribozima cabeça de martelo, o sítio de clivagem é uma sequência de dinucleotídeo no RNA alvo, é uma ura- cila (U) seguido por uma adenina, citosina ou uracila (A, C ou U) (Tho- mpson et al., (1995) Nucl Acids Res 23: 2.250 a 2.268). A frequência desse dinucleotídeo que ocorre em um determinado RNA é estatistica- mente de 3 em 16. Portanto, para um determinado RNA mensageiro alvo de 1.000 bases, 187 sítios de clivagem de dinucleotídeos são es- tatisticamente possíveis.

[0178] O projeto geral e a otimização da atividade de clivagem do RNA direcionado à ribozima foram discutidos em detalhes (Haseloff e

Gerlach (1988) Nature 334: 585 a 591; Symons (1992) Ann Rev Bio- chem 61: 641 a 671; Chowrira et al. (1994) J. Biol Chem 269: 25.856 a

25.864; Thompson et al. (1995) supra). A projeção e teste de ribozimas para a clivagem eficiente de um RNA alvo são processos bem conheci- dos pelos versados na técnica. Exemplos de métodos científicos para projetar e testar ribozimas são descritos por Chowrira et al., (1994) su- pra e Lieber e Strauss (1995) Mol Cell Biol. 15: 540 a 551, cada um incorporado a título de referência. A identificação de sequências opera- tivas e preferenciais para uso na regulação decrescente de um determi- nado gene é uma questão de preparar e testar uma determinada se- quência e é um método de "triagem" rotineiramente praticado, conhe- cido pelos versados na técnica.

[0179] O uso de construções de RNAi é descrito na literatura citada acima, bem como nos documentos US2005/0166289 e WO 2013/016267, por exemplo. Um RNA de cadeia dupla com homologia com o gene-alvo é entregue à célula ou produzido na célula pela ex- pressão de uma construção de RNAi, por exemplo, uma construção em formato de grampo curto (sh) de RNAi. A construção pode incluir uma sequência que é idêntica ao gene-alvo, ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou entre 95% e 100% idêntica a uma sequência do gene-alvo. A construção pode ter pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo me- nos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900 ou pelo menos 1 kb de sequência homóloga ao gene-alvo. Os vetores de expressão podem ser geneticamente modifi- cados com uso de promotores selecionados para expressão contínua ou induzível de uma construção de RNAi, tal como uma construção que produz um shRNA.

[0180] Uma construção de ácido nucleico para atenuação de genes, por exemplo, uma construção de ribozima, RNAi ou de antissenso pode incluir pelo menos quinze, pelo menos vinte, pelo menos trinta, pelo me- nos quarenta, pelo menos cinquenta ou pelo menos sessenta nucleotí- deos com pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% ou complemen- taridade com pelo menos uma porção da sequência de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54 do microrganismo a ser geneticamente modificado.

Uma construção de ácido nucleico para atenuação de genes, por exemplo, uma construção de ribozima, RNAi ou de antissenso pode incluir pelo menos quinze, pelo menos vinte, pelo menos trinta, pelo menos quarenta, pelo menos cinquenta ou pelo me- nos sessenta nucleotídeos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 95% ou cerca de 100% de identidade ou complementaridade com a se- quência de um gene que ocorre naturalmente, tal como um gene que codifica um polipeptídeo com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de um SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54 endógeno, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma com- binação dos genes SGI2 e cpSRP54. Por exemplo, uma construção de ácido nucleico para atenuação de genes, por exemplo, uma construção de ribozima, de RNAi ou de antissenso pode incluir pelo menos quinze, pelo menos vinte, pelo menos trinta, pelo menos quarenta, pelo menos cinquenta ou pelo menos sessenta nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade ou complementaridade com a sequência de um gene cpSRP54 de ocorrência natural, tal como qualquer um fornecido neste documento.

A sequência de nucleotídeos pode ter, por exemplo, de cerca de 30 nucleotídeos a cerca de 3 quilobases ou mais, por exemplo, de 30 a 50 nucleotídeos de comprimento, de 50 a 100 nucleotídeos de comprimento, de 100 a 500 nucleotídeos de comprimento, de 500 nu- cleotídeos a 1 kb de comprimento, de 1 kb a 2 kb de comprimento ou de 2 a 5 kb. Por exemplo, uma sequência de antissenso pode ter de cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 1 kb de comprimento. Por exemplo, uma construção de ácido nucleico para atenuação de genes, por exemplo, uma construção de ribozima, de RNAi ou de antissenso pode incluir pelo menos quinze, pelo menos vinte, pelo menos trinta, pelo menos qua- renta, pelo menos cinquenta, pelo menos sessenta ou pelo menos 100 nucleotídeos com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, por exemplo pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% ou pelo menos 95% de identidade ou complementaridade com um gene endógeno SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação dos genes SGI2 e cpSRP54 ou uma por- ção dos mesmos.

[0181] Os promotores usados nas construções de antissenso, RNAi ou ribozima podem ser quaisquer que sejam funcionais no organismo hospedeiro e que sejam adequados para os níveis de expressão reque- ridos para reduzir a expressão do gene-alvo para uma quantidade de- sejada. Os promotores funcionais em algas e heterocontas são conhe- cidos na técnica e divulgados neste documento. A construção pode ser transformada em algas com uso de qualquer método viável, incluindo qualquer divulgado neste documento. Um organismo ou microrganismo recombinante transformado com uma molécula de ácido nucleico para atenuar SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos ge- nes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação da expressão dos genes SGI2 e cpSRP54, tal como, porém sem limitação, um antissenso, RNAi ou construção de ribozima, pode ter as propriedades de um SGI1, SGI2,

cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação dos mutantes SGI2 e cpSRP54, conforme descrito neste documento, incluindo, por exemplo, clorofila reduzida, eficiência fotossintética aumentada, e produtividade em cultura aumentada, com relação a um organismo hospedeiro ou microrganismo que não inclui a molécula de ácido nucleico exógena que resulta em expressão gênica atenuada.

MOLÉCULAS E CONSTRUÇÕES DE ÁCIDOS NUCLEICOS

[0182] Um versado na técnica compreenderá que vários métodos de transformação podem ser utilizados para transformação genética de microrganismos e, portanto, podem ser implantados para os métodos da presente invenção. "Transformação estável" pretende significar que a construção de ácido nucleico introduzida em um organismo se integra ao genoma do organismo ou faz parte de uma construção epissomal estável e é capaz de ser herdada pela progênie do mesmo. “Transfor- mação transiente” pretende significar que um polinucleotídeo é introdu- zido no organismo e não se integra ao genoma ou, de outra forma, se estabelece e é herdado estavelmente por gerações sucessivas.

[0183] A transformação genética pode resultar em inserção e/ou ex- pressão estável de transgenes, construções do núcleo ou do plastídeo e, em alguns casos, pode resultar na expressão transiente de transge- nes. Os métodos de transformação também podem ser usados para a introdução de RNAs guia ou edição de DNAs. A transformação genética de microalgas tem sido relatada com sucesso em mais de 30 cepas di- ferentes de microalgas, que pertencem a pelo menos 22 espécies de algas verdes, vermelhas e marrons, diatomáceas, euglenids e dianofla- gelados (consultar, por exemplo, Radakovits et al., Eukaryotic Cell, 2010; e Gong et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2011). Exemplos não limitativos de tais métodos úteis de transformação incluem agitação de células na presença de microesferas de vidro ou whiskers de carboneto de silício, conforme relatado, por exemplo, por Dunahay, Biotechniques, 15 (3): 452 a 460, 1993; Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1990; Mi- chael e Miller, Plant J., 13, 427 a 435, 1998. Técnicas de eletroporação têm sido utilizadas com sucesso na transformação genética de várias espécies de microalgas, incluindo Nannochloropsis sp. (consultar, por exemplo, Chen et al., J. Phycol., 44: 768 a 776, 2008), Chlorella sp. (consultar, por exemplo, Chen et al., Curr. Genet. 39: 365 a 370, 2001; Chow e Tung, Rep. Cell Vol. 18, No. 9, 778 a 780, 1999), Chlamydomo- nas (Shimogawara et al., Genetics, 148: 1.821 a 1.828, 1998), Dunaliella (Sun et al., Mol. Biotechnol., 30 (3): 185 a 192, 2005). O bombardeio de microprojéteis, também conhecido como bombardeio de micropartícu- las, transformação de armas gênicas ou bombardeio biolístico, tem sido usado com sucesso para várias espécies de alga, incluindo, por exem- plo, espécies de diatomáceas, tal como Phaeodactylum (Apt et al., Mol. Gen. Genet., 252: 572 a 579, 1996), Cyclotella e Navicula (Dunahay et al., J. Phycol., 31: 1.004 a 1.012, 1995), Cylindrotheca (Fischer et al., J. Phycol., 35: 113 a 120, 1999) e Chaetoceros sp. (Miyagawa-Yamaguchi et al., Phycol. Res. 59: 113 a 119, 2011), bem como espécies de algas verdes, tais como Chlorella (El-Sheekh, Biologia Plantarum, Vol.42, No.2: 209 a 216, 1999) e espécies Volvox (Jakobiak et al., Protist, 155: 381 a 393, 2004). Além disso, as técnicas de transferência de genes mediada por Agrobacterium também podem ser úteis para a transfor- mação genética de microalgas, como foi relatado, por exemplo, por Ku- mar, Plant Sci., 166 (3): 731 a 738, 2004 e Cheney et al. J. Phycol. 37, supl. 11, 2001.

[0184] Um vetor ou construção de transformação, conforme descrito neste documento, tipicamente compreende um gene marcador que con- fere um fenótipo selecionável ou classificável nas células hospedeiras alvo, por exemplo, células de algas, ou pode ser cotransformado com uma construção que inclui um marcador.

Vários marcadores selecioná- veis foram desenvolvidos com sucesso para isolamento eficiente de transformantes genéticos de algas.

Marcadores selecionáveis comuns incluem resistência a antibióticos, marcadores fluorescentes e marca- dores bioquímicos.

Vários genes diferentes de resistência a antibióticos foram utilizados com sucesso na seleção de transformantes de microal- gas, incluindo blasticidina, bleomicina (consultar, por exemplo, Apt et al., 1996, supra; Fischer et al., 1999, supra; Fuhrmann et al., Plant J., 19, 353 a 361, 1999, Lumbreras et al., Plant J., 14 (4): 441 a 447, 1998; Zaslavskaia et al., J.

Phycol., 36: 379 a 386, 2000), espectinomicina (Cerutti et al., Genetics, 145: 97 a 110, 1997; Doetsch et al., Curr.

Genet. 39, 49 a 60, 2001; Fargo, Mol.

Cell.

Biol., 19: 6.980 a 6.990, 1999), es- treptomicina (Berthold et al., Protist, 153: 401 a 412, 2002), paromomi- cina (Jakobiak et al., Protist, supra.; Sizova et al., Gene, 277: 221 a 229, 2001), nourseotricina (Zaslavskaia et al., 2000, supra), G418 (Dunahay et al., 1995, supra; Poulsen e Kroger, FEBS Lett., 272: 3413 a 3423, 2005, Zaslavskaia et al. 2000, supra), higromicina (Berthold et al., 2002, supra), cloranfenicol (Poulsen e Kroger, 2005, supra) e muitos outros.

Marcadores selecionáveis adicionais para uso em microalgas, tais como Chlamydomonas podem ser marcadores que fornecem resistência à ca- namicina e amicacina (Bateman, Mol.

Gen.

Genet. 263: 404 a 410, 2000), resistência à zeomicina e fleomicina (por exemplo, ZEOCIN™ feomicina D1) (Stevens, Mol.

Gen.

Genet. 251: 23 a 30, 1996) e resis- tência à paramomicina e neomicina (Sizova et al., 2001, supra). Outros marcadores fluorescentes ou cromogênicos que foram utilizados in- cluem luciferase (Falciatore et al., J.

Mar.

Biotechnol., 1: 239 a 251, 1999; Fuhrmann et al., Plant Mol.

Biol., 2004; Jarvis e Brown, Curr.

Genet., 19: 317 a 322, 1991), β-glucuronidase (Chen et al., 2001, supra; Cheney et al., 2001, supra; Chow e Tung, 1999, supra; El-Sheekh, 1999, supra; Falciatore et al., 1999, supra; Kubler et al., J.

Mar.

Biotechnol., 1:

165 a 169, 1994), β-galactosidase (Gan et al., J. Appl. Phycol., 15: 345 a 349, 2003; Jiang et al., Plant Cell Rep., 21: 1.211 a 1.216, 2003; Qin et al., High Technol. Lett., 13: 87 a 89, 2003) e proteína fluorescente verde (GFP) (Cheney et al., 2001, supra; Ender et al., Plant Cell, 2002, Franklin et al., Plant J., 2002; 56, 148, 210).

[0185] Um versado na técnica verificará prontamente que uma vari- edade de sequências promotoras conhecidas pode ser implementada de forma útil para sistemas de transformação de espécies de microal- gas, de acordo com a presente invenção. Por exemplo, os promotores comumente usados para acionar a expressão do transgene em micro- algas incluem várias versões do promotor 35S do vírus do mosaico de couve-flor (CaMV35S), que foi usado tanto em dinoflagelados quanto em Clorofita (Chow et al., Plant Cell Rep., 18: 778 a 780, 1999; Jarvis e Brown, Curr. Genet. 317 a 321, 1991; Lohuis e Miller, Plant J., 13: 427 a 435, 1998). O promotor SV40 do vírus símio também relatou ser ativo em várias algas (Gan et al., J. Appl. Phycol., 151 345 a 349, 2003; Qin et al., Hydrobiologia 398 a 399, 469 a 472, 1999). Os promotores de RBCS2 (ribulose bifosfato carboxilase, subunidade pequena) (Fuhr- mann et al., Plant J., 19: 353 a 361, 1999) e PsaD (proteína abundante do complexo do fotossistema I; Fischer e Rochaix, FEBS Lett. 581:

5.555 a 5.560, 2001) de Chlamydomonas também podem ser úteis. Os promotores de fusão de HSP70A/RBCS2 e HSP70A/β2TUB (tubulina) (Schroda et al., Plant J., 21: 121 a 131, 2000) também podem ser úteis para uma expressão aprimorada de transgenes, na qual o promotor HSP70A pode servir como um ativador transcricional quando colocado a montante de outros promotores. A expressão de alto nível de um gene de interesse também pode ser alcançada, por exemplo, em espécies de diatomáceas, sob o controle de um promotor de um gene fcp que codi- fica uma proteína de ligação diatomina fucoxantina-clorofila a/b (Falcia- tore et al., Mar. Biotechnol., 1: 239 a 251, 1999; Zaslavskaia et al., J.

Phycol. 36: 379 a 386, 2000) ou o gene vcp que codifica uma proteína de ligação eustigmatophyte violaxantina-clorofila a/b (consultar a Pa- tente No. US 8.318.482). Se desejado, promotores induzíveis podem fornecer expressão rápida e rigidamente controlada de genes em micro- algas transgênicas. Por exemplo, as regiões promotoras dos genes NR que codificam a nitrato redutase podem ser usadas como tais promoto- res induzíveis. A atividade de promotor de NR é tipicamente suprimida pelo amônio e induzida quando o amônio é substituído pelo nitrato (Poulsen e Kroger, FEBS Lett 272: 3.413 a 3.423, 2005), assim a ex- pressão gênica pode ser desativada ou ativada quando células de mi- croalgas são cultivadas na presença de amônio/nitrato. Promotores de algas adicionais que podem ser utilizados nas construções e sistemas de transformação fornecidos neste documento incluem aqueles divulga- dos na Patente No. US 8.883.993; Publicação de Pedido De Patente No. US 2013/0023035; Publicação de Pedido de Patente No. US 2013/0323780; e Publicação de Pedido de Patente No. US 2014/0363892.

[0186] As células hospedeiras podem ser células não transforma- das ou células que já estão transfectadas com pelo menos uma molé- cula de ácido nucleico. Por exemplo, uma célula hospedeira de alga que é modificada para ter expressão atenuada de um gene cpSRP54 pode incluir, ainda, um ou mais genes que podem conferir qualquer traço de- sejável, tal como, porém sem limitação, aumento da produção de bio- moléculas de interesse, tal como uma ou mais proteínas, pigmentos, álcoois ou lipídeos. MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE PRODUTOS A PARTIR DE ORGANIS-

MOS FOTOSSINTÉTICOS

[0187] Também são fornecidos, neste documento, métodos de pro- dução de produtos a partir de organismos fotossintéticos, tais como al-

gas, pela cultura do organismo fotossintético com eficiência fotossinté- tica aumentada, tal como SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma com- binação dos genes SGI1 e cpSRP54 ou uma combinação de mutantes SGI2 e cpSRP54 divulgados neste documento. Os métodos incluem cul- tivar um mutante de organismo fotossintético SGI1, SGI2, cpSRP54, cytoSRP54, uma combinação dos genes SGI1 e cpSRP54, ou uma combinação de SGI2 e cpSRP54 em um meio adequado para fornecer uma cultura de organismo fotossintético e recuperar biomassa ou pelo menos um produto da cultura. Em algumas modalidades, o produto é um lipídeo. A cultura que compreende organismo fotossintético é, pre- ferencialmente, uma cultura fotoautotrófica, e o meio de cultura, prefe- rencialmente, não inclui uma quantidade substancial de carbono redu- zido, ou seja, a cultura não inclui carbono reduzido em uma forma ou em um nível que possa ser usado pelas algas para crescimento.

[0188] Em algumas modalidades, o organismo fotossintético pode ser cultivado em qualquer vaso adequado, incluindo frascos ou biorrea- tores, onde o organismo fotossintético pode ser exposto à luz artificial ou natural. A cultura que compreende organismo fotossintético mutante pode ser cultivada em um ciclo claro/escuro que pode ser, por exemplo, um ciclo claro/escuro natural ou programado e, conforme exemplos ilus- trativos, pode fornecer doze horas de luz a doze horas de escuridão, catorze horas de luz a dez horas de escuridão, dezesseis horas de luz a oito horas de escuridão, etc.

[0189] Cultura refere-se à promoção intencional de crescimento (por exemplo, aumento no tamanho da célula, conteúdo celular e/ou ati- vidade celular) e/ou propagação (por exemplo, aumento no número de células por meio de mitose) de uma ou mais células pelo uso de condi- ções selecionadas e/ou controladas. A combinação de crescimento e propagação pode ser denominada proliferação. Conforme demonstrado nos exemplos deste documento, os mutantes fornecidos neste docu- mento que exibem adaptação desregulada à baixa intensidade de luz podem atingir maior densidade celular da cultura ao longo do tempo, por exemplo, durante um período de uma semana ou mais, com relação a uma cultura de células de algas do tipo selvagem da mesma cepa que não é desregulada em aclimatação com baixa luminosidade. Por exem- plo, um mutante cpSRP54 pode ser cultivado por pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos catorze ou pelo menos quinze dias, ou pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez semanas ou mais.

[0190] Exemplos não limitativos de condições selecionadas e/ou controladas que podem ser usadas para a cultura do microrganismo re- combinante podem incluir o uso de um meio definido (com característi- cas conhecidas, tais como pH, força iônica e/ou fonte de carbono), tem- peratura especificada, tensão de oxigênio, níveis de dióxido de carbono, crescimento em um biorreator, ou similares, ou combinações dos mes- mos. Em algumas modalidades, o microrganismo ou célula hospedeira pode ser cultivado mixotroficamente, usando luz e uma fonte de carbono reduzida. Alternativamente, o microrganismo ou a célula hospedeira pode ser cultivado fototroficamente. Ao ser cultivada fototroficamente, a cepa de alga pode usar, vantajosamente, a luz como fonte de energia. Uma fonte de carbono inorgânico, tal como CO2 ou bicarbonato pode ser utilizada para a síntese de biomoléculas pelo microrganismo. "Car- bono inorgânico", conforme usado neste documento, inclui compostos ou moléculas contendo carbono que não podem ser usados como fonte de energia sustentável por um organismo. Tipicamente, o "carbono inor- gânico" pode estar na forma de CO2 (dióxido de carbono), ácido carbô- nico, sais de bicarbonato, sais de carbonato, sais de hidrogenocarbo- nato ou similares, ou combinações dos mesmos, que não podem mais ser oxidados para energia sustentável nem utilizados como uma fonte de redução de potência pelos organismos. Um microrganismo cultivado fotoautotroficamente pode ser cultivado em um meio de cultura em que o carbono inorgânico é substancialmente a única fonte de carbono. Por exemplo, em uma cultura em que o carbono inorgânico é substancial- mente a única fonte de carbono, qualquer molécula de carbono orgânico (reduzido) ou composto de carbono orgânico que possa ser fornecido no meio de cultura não pode ser absorvido e/ou metabolizado pela cé- lula para energia e/ou não está presente em quantidade suficiente para fornecer energia sustentável para o crescimento e proliferação da cul- tura celular.

[0191] Microrganismos e células hospedeiras que podem ser úteis de acordo com os métodos da presente invenção podem ser encontra- dos em vários locais e ambientes ao redor do mundo. O meio de cres- cimento específico para a propagação e geração ideais de lipídeos e/ou outros produtos pode variar e pode ser otimizado para promover o cres- cimento, a propagação ou a produção de biomassa ou um produto, tal como lipídeos, proteínas, pigmentos, antioxidantes, etc. Meios de cres- cimento sólido e líquido geralmente estão disponíveis em uma grande variedade de fontes, assim como instruções para a preparação de meios específicos adequados para uma grande variedade de cepas de micror- ganismos. Por exemplo, vários meios de água doce e água salgada po- dem incluir os descritos em Barsanti (2005) Algae: Anatomy, Biochemis- try & Biotechnology, CRC Press for media and methods for culturing al- gae. Métodos para preparação de meios de alga também podem ser encontrados nos sites da web de várias coleções de culturas de algas, incluindo, como exemplos não limitativos, a Coleção de Cultura de Alga UTEX (www.sbs.utexas.edu/utex/media.aspx); Coleção de Cultura de Alga e Protozoários (www.ccap.ac.uk); e Katedra Botaniky (botany.na- tur.cuni.cz/algo/caup-media.html).

[0192] Os métodos de cultura podem incluir, opcionalmente, a indu- ção de expressão de um ou mais genes para a produção de um produto, tal como, porém sem limitação, uma proteína que participa da produção de um lipídeo, uma ou mais proteínas, antioxidantes ou pigmentos e/ou regulação de uma via metabólica no microrganismo. A expressão de indução pode incluir a adição de um nutriente ou composto à cultura, a remoção de um ou mais componentes do meio de cultura, o aumento ou diminuição da luz e/ou temperatura e/ou outras manipulações que promovam a expressão do gene de interesse. Tais manipulações po- dem depender, em grande parte, da natureza do promotor (heterólogo) operacionalmente aglutinado ao gene de interesse.

[0193] Em algumas modalidades da presente invenção, os micror- ganismos desregulados em aclimatação com pouca intensidade de luz podem ser cultivados em um "fotobiorreator" equipado com uma fonte de luz artificial e/ou tendo uma ou mais paredes suficientemente trans- parentes para a luz, incluindo a luz solar, para permitir, facilitar e/ou manter o crescimento e a proliferação aceitáveis de microrganismos. Para a produção de produtos de ácidos graxos ou triglicerídeos, micror- ganismos fotossintéticos ou células hospedeiras podem ser adicional ou alternativamente cultivados em frascos de agitação, tubos de ensaio, ampolas, placas de microtitulação, placas de Petri ou similares, ou com- binações dos mesmos.

[0194] De modo adicional ou alternativo, microrganismos fotossin- téticos recombinantes ou células hospedeiras podem ser cultivados em tanques, canais, recipientes de crescimento à base de mar, trincheiras, cavas, calhas ou similares, ou combinações dos mesmos. Em tais sis- temas, a temperatura pode não ser regulada ou vários métodos ou dis- positivos de aquecimento ou resfriamento podem ser utilizados. Como nos biorreatores padrão, uma fonte de carbono inorgânico (tal como, porém sem limitação, CO2, bicarbonato, sais de carbonato e similares),

incluindo, porém sem limitação, ar, ar enriquecido com CO2, gás de combustão, ou similares, ou combinações dos mesmos, pode ser su- prida à cultura. Ao fornecer gases de combustão e/ou outras fontes de inorgânicos que podem conter CO além do CO2, pode ser necessário pré-tratar essas fontes de modo que o nível de CO introduzido no (foto)biorreator não constitua uma dose perigosa e/ou letal em relação ao crescimento, proliferação e/ou sobrevivência dos microrganismos.

[0195] O organismo fotossintético mutante pode incluir um ou mais genes não nativos que codificam um polipeptídeo para a produção de um produto, tal como, mas limitado a, um lipídeo, um corante ou pig- mento, um antioxidante, uma vitamina, um nucleotídeo, um ácido nu- cleico, um aminoácido, um hormônio, uma citocina, um peptídeo, uma proteína ou um polímero. Por exemplo, o polipeptídeo codificado pode ser uma enzima, regulador metabólico, cofator, proteína carreadora ou transportador. Os métodos incluem cultivar um mutante cpSRP54 ou mutante cytoSRP54 que inclui pelo menos um gene não nativo que co- difica um polipeptídeo que participa da produção de um produto, para produzir biomassa ou pelo menos um produto de alga. Produtos, tais como lipídeos e proteínas, podem ser recuperados da cultura pelos meios de recuperação conhecidos pelos versados na técnica, tais como por extração total da cultura, por exemplo, com uso de solventes orgâ- nicos. Em alguns casos, a recuperação de produtos de ácidos graxos pode ser aumentada pela homogeneização das células. Por exemplo, lipídeos, tais como ácidos graxos, derivados de ácidos graxos e/ou tri- glicerídeos podem ser isolados de algas por extração das algas com um solvente à temperatura e/ou pressão elevadas, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente copendente, cedida à mesma cessio- nária No. US 2013/0225846, incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade.

[0196] Outras modalidades e métodos alternativos serão evidentes para os versados na técnica após a análise desta divulgação. A discus- são dos métodos gerais apresentados neste documento destina-se ape- nas a fins ilustrativos. Os exemplos não limitativos são fornecidos abaixo.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE CEPAS DE PARACHLORELLA SUPEREXPRES- SANDO CAS9

[0197] A geração de cepas de Parachlorella que superexpressam Cas9 foi descrita na Publicação de Pedido de Patente No. US 2016/0304896, incorporada a título de referência em sua totalidade.

[0198] Resumidamente, um vetor, pSGE-6709, foi geneticamente modificado para a expressão do gene Cas9 de Streptococcus pyogenes em Parachlorella. O vetor incluía os seguintes três elementos: 1) um cassete de expressão Cas9 que continha um gene Cas9 geneticamente modificado de códon otimizado para Parachlorella e contendo íntrons de Parachlorella, que também incluía uma etiqueta FLAG N-terminal, sinal de localização nuclear e aglutinante peptídico operacionalmente aglutinando ao promotor de Parachlorella RPS17 e terminado pelo ter- minador de Parachlorella RPS17 um cassete de expressão de marcador selecionável, que continha o gene de resistência à blasticidina de As- pergillus terreus de códon otimizado para Parachlorella e contendo ín- trons de Parachlorella, operacionalmente aglutinado ao promotor de Pa- rachlorella RPS4 e terminado pelo terminador de Parachlorella RPS4, um cassete de expressão repórter GFP, que continha o gene TurboGFP (Evrogen, Moscou, Rússia), acionado pelo promotor de Parachlorella ACP1 e terminado pelo terminador de Parachlorella ACP1.

[0199] O vetor foi transformado em Parachlorella por biolística. A transformação da cepa de tipo selvagem de Parachlorella WT-1185 foi alcançada utilizando o Sistema de Arma Genética BioRad Helios® es- sencialmente conforme descrito na Publicação de Patente No. US 2014/0154806, incorporada neste documento a título de referência. O DNA para transformação foi precipitado em partículas de ouro, as partí- culas de ouro aderiram ao interior de tubos e uma explosão de gás de hélio foi disparada através do tubo posicionado dentro da arma gênica para impulsionar as partículas de ouro revestidas de DNA para as célu- las da cepa de Parachlorella WT-1185 que aderiram em meio sólido não seletivo (placas de ágar a 2% que contêm meio de crescimento de algas PM074). A Arma Genética Helios® foi usada para disparar dois projéteis por círculo celular a 4,137 MPa (600 psi) a uma distância de 3 a 6 cm da placa. No dia seguinte, as células foram transferidas para um meio seletivo para o crescimento de colônias transformadas.

[0200] As colônias foram triadas quanto à penetrância total de GFP por citometria de fluxo e identificação de cepas transformadas que ti- nham um único pico de fluorescência alterado para um valor mais ele- vado do que o pico de fluorescência de tipo selvagem. As cepas Cas9 totalmente penetrantes que demonstram um pico de fluorescência cla- ramente alterado em relação às células não transformadas foram testa- das quanto à expressão de Cas9 por transferência ocidental anti-Cas9 para evidências de expressão de Cas9. Com base nessas triagens, o isolado 6709-2 foi transportado adiante e recebeu o identificador de cepa GE-15699. EXEMPLO 2: NOCAUTE DE CPSRP54 COM USO DE LINHA DE EDITOR DE PARA- CHLORELLA CAS9 TOTALMENTE PENETRANTE

[0201] O nocaute de cpSRP54 com uso de linha de editor de Para- chlorella Cas9 totalmente penetrante foi descrito na Publicação de Pe- dido de Patente No. US 2016/0304896, incorporada a título de referên-

cia em sua totalidade. Resumidamente, foi projetado um gRNA quimé- rico (SEQ ID NO: 103), os três últimos nucleotídeos representam o PAM, e sintetizado in vitro para alvejar o gene SRP54 cloroplástico na sequên- cia de codificação de Parachlorella.

[0202] O GE-15699 foi transformado por eletroporação com 1 a 2 µg de RNA guia quimérico purificado e 1 µg de DNA marcador selecio- nável que continha um gene "BleR" de resistência à bleomicina otimi- zado com códon para Parachlorella e contendo íntrons de Parachlorella (SEQ ID: 70). O gene BleR foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 71) e terminado pelo terminador de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 72).

[0203] A eletroporação foi realizada através da inoculação de 100 ml de uma cultura de sementes inoculada a 1 x 106 células/ml seis dias antes de a transformação ser utilizada para inocular uma cultura de 1l a 1 x 106 células/ml dois dias antes da transformação. No dia da transfor- mação, as células foram peletizadas por centrifugação a 5.000 x g du- rante 20 minutos, lavadas três vezes com 0,1 um de sorbitol a 385 mM filtrado e ressuspensas a 5 x 109 células/ml em sorbitol a 385 mM. A eletroporação de 100 µL de células concentradas foi realizada em cu- betas de 0,2 cm em um Pulsor Genético BioRad Xcell ™ sob condições variadas. O DNA usado para otimização de eletroporação foi pSG6640 linearizado incluindo os cassetes de expressão bleR e TurboGFP. O cassete TurboGFP incluiu o promotor de Parachlorella ACP1 (SEQ ID NO: 67) operacionalmente aglutinado ao gene TurboGFP (SEQ ID NO: 24) e o terminador de Parachlorella ACP1 (SEQ ID NO: 68). Imediata- mente após a eletroporação de células e cubetas pré-resfriadas, 1 ml de sorbitol frio foi adicionado e usado para transferir células para 10 ml de PM074. Após a recuperação durante a noite, as células foram con- centradas e espalhadas em meio PM074 de 13 cm de diâmetro con- tendo zeocina a 250 mg/l e cultivadas nas condições listadas na seção de biolística.

[0204] As condições de eletroporação foram de 1,0 a 1,2 kV (5.000 a 6.000 V/cm), 200 a 300 ohms e 25 a 50 µF. O uso de quantidades maiores de DNA aumentou o número resultante de colônias resistentes à zeocina, embora o efeito tenha se estabilizado em quantidades maio- res que 4 µg. Após a eletroporação, as células foram plaqueadas em meio de ágar (PM130) contendo 250 µg/ml de zeocina para selecionar os transformantes que incorporaram o cassete ble. Os transformantes foram triados por PCR de colônia com uso de iniciadores projetados para amplificar através do lócus alvo nativo (oligo-AE596 e oligo- AE597). Os iniciadores foram projetados para produzir uma banda de 700 pb na ausência de integração (por exemplo, "knockin" do cassete BleR) no lócus, ou uma banda de 4,3kb se houvesse a integração de um cassete ble único no local alvo. Além disso, a PCR de colônia tam- bém foi realizada usando iniciadores projetados para amplificar um fra- gmento que se estende do gene cpSRP54 (oligo-AE597) até o marcador selecionável. Dependendo da orientação do cassete ble integrado, uma banda de 1,2 kb resultaria da amplificação pelos iniciadores 405/597 ou iniciadores 406/597 que se estendem desde o interior do cassete ble até o gene cpSRP54. Os resultados mostraram uma alta frequência (entre 40 e 45% nesta amostra) de knockin do cassete BleR no lócus alvo na ausência de braços de homologia. Os nocautes de cpSRP54 resultaram em um fenótipo verde pálido. EXEMPLO 3 NOCAUTE DE SGI2 COM USO DE LINHA DE EDITOR DE PARA- CHLORELLA CAS9 TOTALMENTE PENETRANTE

[0205] O nocaute de SGI2 com uso de linha de editor de Parachlo- rella Cas9 totalmente penetrante foi realizado essencialmente como descrito acima, para cpSRP54. Resumidamente, um gRNA quimérico foi projetado (SEQ ID NO: 104), os três últimos nucleotídeos represen- tam o PAM, e sintetizado in vitro para alvejar o gene SGI2 cloroplástico na sequência de codificação de Parachlorella.

[0206] O GE-15699 foi transformado por eletroporação com 1 a 2 µg de RNA guia quimérico purificado e 1 µg de DNA marcador selecio- nável que continha um gene "BleR" de resistência à bleomicina otimi- zado com códon para Parachlorella e contendo íntrons de Parachlorella (SEQ ID: 70). O gene BleR foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 71) e terminado pelo terminador de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 72).

[0207] As colônias resistentes a Ble foram selecionadas e o nocaute é confirmado por PCR. EXEMPLO 4 NOCAUTE DE SGI1 COM USO DE LINHA DE EDITOR DE PARA- CHLORELLA CAS9 TOTALMENTE PENETRANTE

[0208] A cepa de nocaute de SGI1 24183 foi criada começando com o Cas9 expressando a cepa-mãe, GE--15699. As células GE-15699 fo- ram eletroporadas por um gRNA quimérico (SEQ ID NO: 105, os três últimos nucleotídeos da SEQ ID NO: 105 representam o PAM) e um cassete de DNA que contém um gene Cre otimizado com códon, flan- queado por promotores e terminadores de nitrito redutase e mostrado na Figura 10A. O cassete também continha os genes ble e GFP que foram usados anteriormente. Ble e GFP foram flanqueados pelos sítios lox2272. Quando Cre é expresso, os sítios lox se recombinam, fazendo uma alça do DNA entre essas sequências. As sequências homólogas ao gene SGI1 que circunda o alvo CRISPR também estavam nas extre- midades do cassete, para aperfeiçoar a integração de cópia única. A sequência foi confirmada por sequenciamento de DNA quanto à pre- sença do cassete no lócus SGI1. O número da cópia foi confirmado como um único integrante de cópia com uso de ddPCR. A cepa foi, en- tão, cultivada em meio sem amônio, para expressar Cre. Quando Cre é expresso, os sítios lox se recombinam, fazendo uma alça do DNA entre essas sequências. EXEMPLO 5 NOCAUTE DUPLO DE SGI2 E CPSRP54 COM USO DE LINHA DE EDITOR DE PARACHLORELLA CAS9 TOTALMENTE PENETRANTE

[0209] O nocaute duplo de SGI2 e SRP54 com uso de linha de edi- tor de Parachlorella Cas9 totalmente penetrante foi realizado essencial- mente como descrito acima, para cpSRP54. Resumidamente, dois gRNAs quiméricos, um para cpSRP54 (SEQ ID NO: 69) e outro para SGI2 (SEQ ID NO: 73) foram projetados, os três últimos nucleotídeos representam o PAM, e sintetizados in vitro para alvejar o gene SGI1 cloroplástico em sequência de codificação de Parachlorella.

[0210] O GE-15699 foi transformado por eletroporação com 1 a 2 µg de RNAs guia quiméricos purificados e 1 µg de DNA marcador sele- cionável que continha um gene "BleR" de resistência à bleomicina oti- mizado com códon para Parachlorella e contendo íntrons de Parachlo- rella (SEQ ID: 70). O gene BleR foi operacionalmente aglutinado ao pro- motor de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 71) e terminado pelo terminador de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 72).

[0211] As colônias resistentes a Ble foram selecionadas e o nocaute é confirmado por PCR. EXEMPLO 6 NOCAUTE DUPLO DE SGI1 E CPSRP54 COM USO DE LINHA DE EDITOR DE PARACHLORELLA CAS9 TOTALMENTE PENETRANTE

[0212] A cepa de nocaute 24183 de Parachlorella SGI1, conforme descrito acima, foi eletroporada com gRNA quimérico alvejando cpSRP54 (SEQ ID NO: 69) com um cassete de DNA compreendendo sequências ble e GFP (Figura 10B) para gerar o nocaute duplo de SGI1 e cpSRP54. As colônias resistentes a Ble foram selecionadas e o no- caute é confirmado por PCR. Foram geradas três cepas de nocaute du- plo: STR24538, STR24540 e STR24541, que eram idênticas em suas propriedades fotofisiológicas e fenótipos físicos. EXEMPLO 7 GERAÇÃO DE UMA CEPA DE NOCAUTE DE PARACHLORELLA SGI1 QUE COMPREENDE UM GENE CAS9 DE CÓPIA ÚNICA

[0213] Um gene "BleR" de resistência à bleomicina otimizado com códon para Parachlorella e compreendendo os íntrons de Parachlorella (SEQ ID: 70), gene GFP, gene Cre, um sítio lox e gene Cas9 foram clonados em um vetor pCC1BAC. O gene Cas9 foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlorella RPS17 e compreende 29 ín- trons nativos de PBP e estava fora dos sítios lox2272. O gene Cas9 foi finalizado pelo terminador de Parachlorella RPS17. O gene BleR foi ope- racionalmente aglutinado ao promotor de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 71) e terminado pelo terminador de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 72). O gene GFP foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlore- lla ACP1 e terminado pelo terminador de Parachlorella ACP1. O gene Cre foi operacionalmente aglutinado ao promotor de nitrito redutase de Parachlorella e ao terminador de nitrito redutase de Parachlorella. Estes genes são flanqueados por porções de sequências SGI1 (CheY) que servem como sítios de recombinação homóloga. Um diagrama esque- mático do vetor pCC1BAC recombinante é mostrado na Figura 17.

[0214] Cepa hospedeira de Parachlorella WT de Transformação: STR00010

[0215] Um gene Cas9, a cepa hospedeira de Parachlorella WT foi cotransformada com o gRNA que alveja o gene SGI1 (SEQ ID NO: 74) e um cassete de seleção digerida com PvuI e purificada por centrifuga- ção (NAS00460, SEQ ID NO: 86).

[0216] O cassete de seleção (NAS00460) compreende um frag- mento que inclui 1,7 kb da cadeia principal de vetor (correspondente às sequências 1 a 1.761 da SEQ ID NO: 86) a montante do braço superior de recombinação homóloga (HR) de SGI1 e nenhuma porção do vetor a jusante o braço inferior de HR de SGI1, o gene "BleR" de resistência à bleomicina otimizado com códon para Parachlorella e contendo ín- trons de Parachlorella (SEQ ID: 70), gene GFP (correspondente às se- quências 8.260 a 8.961 da SEQ ID NO: 86) e gene Cas9. O cassete de seleção contém ble e GFP nos sítios lox. O gene CRE (correspondente às sequências 10.418 a 13.326 da SEQ ID NO: 86) compreende 6 ín- trons de Parachlorella otimizados com códon de nitrito redutase, estava sob o promotor induzível por nitrito redutase (correspondente às se- quências 9.906 a 10.417 da SEQ ID NO: 86). O gene Cre é terminado pelo terminador de nitrito redutase (correspondente às sequências

13.327 a 15.140 da SEQ ID NO: 86). O gene Cas9 incluindo os 29 ín- trons de PBP nativos corresponde à sequência 15.754 à sequência

25.918 da SEQ ID NO: 86. O gene Cas9 estava sob o promotor de Pa- rachlorella RPS17 (correspondente às sequências 15.166 a 15.753 da SEQ ID NO: 86) e contém 29 íntrons de PBP nativos e estava fora dos sítios lox. O gene Cas9 foi terminado pelo terminador Parachlorella RPS17 (correspondente às sequências 25.919 a 26.373 da SEQ ID NO: 86). O gene BleR foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlore- lla RPS4 (SEQ ID: 71) e terminado pelo terminador de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 72). O gene GFP foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlorella ACP1 (correspondendo às sequências 7.688 a 8.259 da SEQ ID NO: 86) e terminado pelo terminador de Parachlore- lla ACP1 (correspondendo às sequências 8.692 a 9.830 da SEQ ID NO: 86). O braço superior de recombinação homóloga (HR) de SGI1 corres-

ponde às sequências 1.762 a 3.578 da SEQ ID NO: 86.. O braço a ju- sante de recombinação homóloga (HR) de SGI1 corresponde às se- quências 26.448 a 28.447 da SEQ ID NO: 86. O sítio 5 'lox2272 corres- ponde às sequências 3.831 a 3.864 da SEQ ID NO: 86 e o 3' lox2272 corresponde às sequências 9.839 a 9.872 da SEQ ID NO: 86. Todas as sequências estão dentro de regiões homólogas de 2kb a montante e a jusante do alvo SGI1 CRISPR.

[0217] Após a cotransformação do gRNA SGI1 (SEQ ID NO: 105) e do cassete de seleção (SEQ ID NO: 86), é feito o nocaute do gene SGI1 e um cassete de seleção que compreende os genes Cas9, BleR e GFP é inserido no sítio SGI1 por recombinação homóloga. Os genes BleR e GFP são flanqueados por sítios lox2272, enquanto os genes Cas9 e Cre do cassete de seleção estão fora dos sítios lox2272, mas dentro das partes das sequências de SGI1 que servem como sítios de recombina- ção homóloga.

[0218] Uma vez que o cassete de seleção é inserido no lócus SGI1, o gene Cre é operacionalmente aglutinado a um promotor induzível de nitrito redutase. Assim, quando o microrganismo é cultivado em um meio de crescimento que compreende nitrito, a expressão do gene Cre é in- duzida. Após a expressão do gene Cre, a enzima Cre atua nos sítios lox2272 e remove as sequências BleR e GFP que são flanqueadas nos sítios lox. Isso resulta em um sistema em que os marcadores selecioná- veis (por exemplo, GFP, outros marcadores de antibióticos, por exem- plo, BleR) podem ser reintroduzidos durante a transformação subse- quente de outras sequências.

[0219] Triagem de cepas de Parachlorella transformadas para in- serção de Cas9

[0220] As células de Parachlorella transformadas foram plaqueadas em colônias únicas em placas seletivas contendo amônio para reprimir a expressão de CRE, colônias emplastradas novamente em placas re- pressivas seletivas, e triadas quanto a nocautes com uso de desloca- mentos de PCR e GFP. Os iniciadores de PCR usados para confirmar o nocaute são mostrados abaixo:

[0221] AE803: AGGCTACTCTCAGACATGACGGTGGCTCTG (SEQ ID NO: 87)

[0222] ST815: GCCACAAATGAAGGTTGGCAGGGTCAGTGC (SEQ ID NO: 88)

[0223] Reações positivas para PCR foram enviadas para sequenci- amento para confirmar nocautes (inserção do cassete) e HR perfeita. Os inventores do presente pedido constataram, de maneira surpreen- dente e inesperada, que uma única cópia do gene Cas9 foi inserida no lócus SGI1. EXEMPLO 8 NOCAUTE TRIPLO DE SGI1, SGI2 E CPSRP54 COM USO DE LINHA

DE EDITOR DE PARACHLORELLA TOTALMENTE PENETRANTE DE CÓPIA ÚNICA DE CAS9

[0224] Foi criada uma cepa de nocaute STR24129 de Parachlorella SGI1, conforme descrito acima, que possui uma única cópia de Cas9 e Cre inserida no lócus SGI1, com marcadores (ble/GFP) vazados com uso de uma sequência guia de nocaute de SGI1: ACACCACCTTAAGG- CACATGAGG (SEQ ID NO: 89).

[0225] A cepa de nocaute para SGI1 STR24129 foi usada como hospedeiro de transformação para fazer nocaute dos genes SGI2 e SRP54. A cepa hospedeira STR24129 foi cotransformada com gRNA que alveja os genes SGI2 e SRP54 e cassete de Seleção (pSGE06866) compreendendo Ultrameros compreendendo braços de recombinação homóloga (HR) para cada alvo (por exemplo, SRP54 e SGI2). O gene BleR foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlorella RPS4 (SEQ ID: 71) e terminado pelo terminador de Parachlorella RPS4

(SEQ ID: 72). O gene GFP foi operacionalmente aglutinado ao promotor de Parachlorella ACP1 e terminado pelo terminador de Parachlorella ACP1. O cassete de seleção compreende marcadores ble e GFP cir- cundados por sítios lox para potencial reciclagem de marcadores. Quando Cre é expresso, os sítios lox se recombinam, fazendo uma alça do DNA entre essas sequências.

[0226] As células hospedeiras transformadas foram plaqueadas em placas seletivas, colônias remendadas e colônias únicas foram selecio- nadas e triadas quanto a nocautes com uso de PCR. As reações positi- vas para PCR foram enviadas para sequenciamento para confirmar o nocaute (inserção do cassete) de cada alvo.

[0227] As Figuras 16 A e 16B mostram os esquemas dos cassetes de seleção para fazer nocaute de Parachlorella SRP54 e Parachlorella SGI2. As sequências do gRNA, Ultrameros com braços de HR são mos- trados abaixo.

[0228] SRP54- EMRE3EUKT592650

[0229] Sequência de gRNA: GGCGTGGGACATGGTGCGCAAGG (SEQ ID NO: 90)

[0230] Ultrameros com braços HR para amplificar pSGE06866:

[0231] ST938_HR_SRP54-UP

[0232] TGAAGCACCCCCCGGCCTCTCCCCCCGCAGGGCCG- CCCCTCCCGCCTCGTCGTGC (SEQ ID NO: 91)

[0233] ST939_HR_SRP54-DOWN

[0234] CGCAACGCTCTCCCTCCCCACCCCCCAGCCTCACA- TCCGCCTCAAGCAGCGCCCTG (SEQ ID NO: 92)

[0235] Sequências de iniciadores:

[0236] ST949_CasPipe9GT_SRP54-fwd: caagctatgcgag- gaagggagggtc (SEQ ID NO: 93)

[0237] ST950_CasPipe9GT_SRP54-rev: ctgccgcaagtgagtgtgctgtc (SEQ ID NO: 94)

[0238] Outros iniciadores utilizados para triagem - localizados no cassete de seleção:

[0239] JV946-Linker5-For: caccagatataggtgacccgataac (SEQ ID NO: 95)

[0240] AE608 ble rev: AAAACTCCACTGCACCTGCAACAT (SEQ ID NO: 96)

[0241] SGI2-EMRE3EUKT590485

[0242] Sequência de gRNA:

[0243] ST937_crRNA_064_EMRE3EUKT590485: TGCGGTGAA- GCTTGGAGCTG (SEQ ID NO: 97)

[0244] Sequências Ultramero para colocar os braços de HR em PSGE06866

[0245] ST940_HR_SGI2-UP

[0246] TTGCCGTCGACGAGACTTCGGGGCGCGCATTTATCGA- CTCTCTTGAAGATACACCGGTT (SEQ ID NO: 98)

[0247] ST941_HR_SGI2-DOWN

[0248] TCCAATTGTAGATATCATATTGTTTCCGGACCTACCT- TACGCACTGAGTGCTGCCAGATGTTCTT (SEQ ID NO: 99)

[0249] Sequências de iniciadores:

[0250] ST046CasPipe9GT-064-fwd: gaggtgggtggtagtgcttcgcgaggtg (SEQ ID NO: 100)

[0251] ST047CasPipe9GT-064-rev: atcacagctcacagggcagacac- tgcgtc (SEQ ID NO: 101)

[0252] Sequências de iniciadores:

[0253] Os iniciadores JV946 e AE608 também foram utilizados como iniciadores de triagem. EXEMPLO 9

ANÁLISE DE BIOINFORMÁTICA DA ARQUITETURA DE DOMÍNIO DE PROTEÍNAS SGI2

[0254] A arquitetura de domínio de proteínas SGI2 exemplificativas de Parachlorella sp., Oocystis sp., Tetraselmis sp., Arabidopsis thaliana foi analisada com uso de uma ferramenta online InterProScan (ferra- menta versão 5.27, versão de banco de dados 66.0, de EMBL-EBI, Hin- xton, Cambridgeshire, CB10 1SD, Reino Unido).

[0255] Um único domínio receptor de resposta conservado foi iden- tificado no terminal N das proteínas SGI2, conforme mostrado nas Figu- ras 3 a 9. EXEMPLO 10

ANÁLISE DE BIOINFORMÁTICA DE DOMÍNIOS DE RECEPTOR DE RESPOSTA DE VÁRIAS PROTEÍNAS SGI2

[0256] O alinhamento local do domínio receptor de resposta a Pa- rachlorella (SEQ ID NO: 6) foi realizado com outras proteínas ortólogas de outras espécies de alga e várias plantas com uso da matriz BLO- SUM62, penalidade de espaçamento de 10 e penalidade de extensão de 0,5. O alinhamento local do domínio receptor de resposta de Para- chlorella (SEQ ID NO: 6) com vários organismos fotossintéticos é mos- trado abaixo na Tabela 5. TABELA 5: RESULTADOS DOS ALINHAMENTOS LOCAIS DO DOMÍ- NIO RECEPTOR DE RESPOSTA DE PARACHLORELLA COM VÁ- RIAS PROTEÍNAS ORTÓLOGAS.

SEQ ID Espécies Resultado do alinhamento NO: Comprimento: 121 Identidade: 39/121 (32,2%) Arabidopsis 42 Similaridade: 61/121 (50,4%) thaliana Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 149,5 Comprimento: 128 Arabidopsis 43 Identidade: 30/128 (23,4%) thaliana Similaridade: 60/128 (46,9%)

Espaçamentos: 20/128 (15,6%) Classificação: 84,5 Comprimento: 121 Identidade: 37/121 (30,6%) Arabidopsis 44 Similaridade: 59/121 (48,8%) thaliana Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 133,5 Comprimento: 121 Identidade: 37/121 (30,6%) Arabidopsis 45 Similaridade: 60/121 (49,6%) thaliana Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 136,5 Comprimento: 129 Identidade: 29/129 (22,5%) Arabidopsis 46 Similaridade: 54/129 (41,9%) thaliana Espaçamentos: 22/129 (17,1%) Classificação: 66,0 Comprimento: 120 Identidade: 53/120 (44,2%) Oocystis sp. 40 Similaridade: 77/120 (64,2%) Espaçamentos: 4/120 (3,3%) Classificação: 242,5 Comprimento: 125 Identidade: 45/125 (36,0%) Tetraselmis sp. 41 Similaridade: 69/125 (55,2%) Espaçamentos: 16/125 (12,8%) Classificação: 167,5 Comprimento: 121 Glycine max 47 Identidade: 36/121 (29,8%) Similaridade: 61/121 (50,4%)

Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 140,5 Comprimento: 121 Identidade: 37/121 (30,6%) Vitis vinifera 48 Similaridade: 62/121 (51,2%) Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 143,5 Comprimento: 121 Identidade: 38/121 (31,4%) Theobroma 49 Similaridade: 60/121 (49,6%) cacao Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 148,5 Comprimento: 121 Identidade: 40/121 (33,1%) Oryza sativa 50 Similaridade: 64/121 (52,9%) Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 169,5 Comprimento: 121 Identidade: 41/121 (33,9%) Zea mays 51 Similaridade: 61/121 (50,4%) Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 153,5 Comprimento: 121 Identidade: 39/121 (32,2%) Physcomitrella 52 Similaridade: 64/121 (52,9%) patens Espaçamentos: 9/121 (7,4%) Classificação: 164,5 Comprimento: 123 Volvox carteri 53 Identidade: 39/123 (31,7%) Similaridade: 63/123 (51,2%)

Espaçamentos: 14/123 (11,4%) Classificação: 143,0 Comprimento: 125 Identidade: 35/125 (28,0%) Chlamydomonas 54 Similaridade: 61/125 (48,8%) reinhardtii Espaçamentos: 12/125 (9,6%) Classificação: 135,5 Comprimento: 121 Identidade: 38/121 (31,4%) Chlorella 55 Similaridade: 60/121 (49,6%) zofingiensis Espaçamentos: 11/121 (9,1%) Classificação: 138,0 Comprimento: 120 Coccomyxa Identidade: 57/120 (47,5%) subellipsoidea 56 Similaridade: 79/120 (65,8%) C-169 Espaçamentos: 1/120 (0,8%) Classificação: 256,0

[0257] O domínio receptor de resposta de Parachlorella sp. mostrou maior porcentagem de identidade com outras espécies de alga e um alto grau de similaridade com várias espécies de plantas. EXEMPLO 11 TRIAGENS PARA MUTANTES DE CEPA WT-1185 DE PARACHLO- RELLA SP. DE BAIXA CLOROFILA

[0258] Após o nocaute de SGI1, SGI2, nocaute duplo de SGI1 e cpSRP54, ou nocaute duplo de SGI2 e cpSRP54 de genes de Parachlo- rella sp., conforme descrito acima, as células de colônias de cores claras foram selecionadas e deixadas crescer entre um e cinco dias sob luz baixa (100 µmol de fótons m-2 s-1), em seguida, foram classificadas por citometria de fluxo com uso de um citômetro de fluxo BD FACSAria II

(BD Biosciences, San Jose, CA) para selecionar células com baixa flu- orescência de clorofila. Em geral, a porção de células com a menor taxa aproximadamente 0,5 a 2% de fluorescência de clorofila em compara- ção com a população total de células foi selecionada. A triagem primária adicional de linhas reduzidas por antena, isoladas por citometria de fluxo, foi conduzida através da seleção visual de colônias em tom claro de verde ou amarelo após células terem sido plaqueadas. A fim de triar linhas putativas de antena reduzida de outros mutantes de pigmento re- duzido e falsos positivos, as colônias selecionadas foram submetidas a uma triagem de cultivo secundário de média produtividade para aclima- tar os isolados a condições de pouca luz antes das medições fotofisio- lógicas. A fluorescência da clorofila foi monitorada durante a aclimata- ção com pouca luz para selecionar clones que mantinham a caracterís- tica de fluorescência de clorofila reduzida do estado de aclimatação com alta luminosidade. Os clones que foram selecionados demonstraram apenas pequenos aumentos na clorofila (em relação às células do tipo selvagem) quando transferidos de luminosidade alta para baixa.

[0259] Ensaios de cultura semicontínuos com alta luminosidade constante (aproximadamente 1.700 µmol de fótons m-2 s-1) com uso de 165 ml de culturas em frascos de cultura de tecidos de 75 cm2 foram realizados para identificar cepas com maior produtividade (taxa aumen- tada de produção de biomassa, medida como acúmulo de Carbono Or- gânico Total (TOC)) em relação à cepa progenitora do tipo selvagem WT-1185. Dois frascos de 75 cm2 foram inoculados com a cultura de sementes de uma determinada cepa mutante. Os frascos tinham rolhas com tubulação conectada a filtros de seringa para fornecer ar enrique- cido com CO2 (1% de CO2) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram alinhados com a largura (dimensão mais estreita) contra um banco de luz de LED. A profundidade das culturas (a distância entre a parede do frasco mais próxima à fonte de luz e a parede na parte traseira do frasco) era de aproximadamente 8,0 cm. As culturas foram diluídas diariamente no início do período de luz, removendo 65% do vo- lume da cultura e substituindo por meio de PM119 fresco diluído para ajustar o aumento da salinidade devido à evaporação ocorrida nas cul- turas (212 ml de H2O para 1l de meio PM119). Amostras para análise de TOC foram retiradas da cultura removida para a diluição. EXEMPLO 12

ENSAIOS DE PRODUTIVIDADE SEMICONTÍNUOS DE MUTANTES DE PARACHLORELLA SP.

[0260] As cepas de Parachlorella que foram constatadas como tendo clorofila reduzida em condições de baixa luminosidade, foram analisadas quanto à produtividade aumentada. No ensaio de produtivi- dade, as culturas fotoautotróficas dos mutantes foram cultivadas ao longo de vários dias em modo semicontínuo de luz constante (CL- SCPA) com amostras de cultura removidas diariamente para determi- nação de biomassa. A luz foi mantida em uma constante de 1.900 a

2.000 µmol de fótons m-2 s-1 durante 24 horas por dia. Neste ensaio, meio de cultura PM119 em um frasco de 225 cm2 foi inoculado com cul- tura de semente de uma determinada cepa mutante. Três culturas foram iniciadas por cepa. Os frascos incluíam barras de agitação e tinham ro- lhas com tubulação conectada com filtros de seringa para fornecer ar enriquecido com CO2 (1% de CO2) que foi borbulhado através das cul- turas. Os frascos foram alinhados com a largura (dimensão mais es- treita) contra um banco de luz de LED. A dimensão de "profundidade" dos frascos, que se estendia desde a fonte de luz, era de 13,7 cm. Tendo em vista o posicionamento dos frascos, a maior distância das células nos frascos da superfície da fonte de luz era de aproximada- mente 15,5 cm. As culturas foram diluídas diariamente removendo 65% do volume da cultura e substituindo por meio de cultura PM119 fresco diluído para ajustar o aumento da salinidade devido à evaporação ocor- rida nas culturas. Amostras para análise de TOC foram retiradas da cul- tura removida para a diluição. O ensaio de produtividade semicontínuo foi realizado por 12 dias após as culturas terem alcançado o estado es- tacionário.

[0261] A produtividade do ensaio foi avaliada medindo-se o carbono orgânico total (TOC) das amostras que foram removidas diariamente. O carbono orgânico total (TOC) foi determinado diluindo 2 ml de cultura de células até um volume total de 20 ml com água desionizada. Três inje- ções por medição foram injetadas em um analisador Shimadzu TOC- Vcsj para a determinação de Carbono total (TC) e Carbono Inorgânico Total (TIC). O forno de combustão foi ajustado para 720°C e o TOC foi determinado subtraindo TIC de TC. A faixa de calibração de 4 pontos foi de 2 ppm a 200 ppm, correspondendo a 20 a 2.000 ppm para culturas não diluídas com um coeficiente de correlação de r2> 0,999.

[0262] Várias modalidades da invenção foram descritas. No en- tanto, será entendido que os elementos das modalidades descritas neste documento podem ser combinados para gerar modalidades adici- onais e várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Por conseguinte, outras modalidades, alter- nativas e equivalentes estão dentro do escopo da invenção, conforme descrito e reivindicado neste documento. EXEMPLO 13

ENSAIO SEMICONTÍNUO DE UREIA EM LOTE DE MUTANTES DE PARACHLORELLA SP.

[0263] No SCUBA (Ensaio Semicontínuo de Ureia em Lote), as cul- turas fotoautotróficas dos mutantes foram cultivadas ao longo de vários dias no modo semicontínuo repleto de nitrogênio em luz por período de 24h seguido por um modo de esgotamento de nitrogênio em lote. A luz foi programada para simular um dia típico de 4 de maio no Vale Imperial,

Califórnia, variando de escuridão a 2.000 µmol de fótons m-2 s-1 ao meio- dia. As amostras foram coletadas ao “anoitecer” a cada dia. Neste en- saio, 420 ml de meio de cultura PM153 à base de ureia em um frasco quadrado de 500 ml foram inoculados com cultura de sementes de uma determinada cepa mutante.

[0264] O PM152 é um meio de esgotamento de nutrientes que é baseado no PM074, mas inclui ureia em vez de nitrato como fonte de nitrogênio. Para isso, são adicionados 1,3 ml de PROLINE® F/2 Algae Feed Part A (Aquatic EcoSystems) e 1,3 ml de ‘Solução C’ a um volume final de 1 litro de uma solução de sais de Instant Ocean (17,5 g/l) (Aqua- tic Eco Systems, Apopka, FL). A solução C tem 38,75 g/l de NaH2PO4 H2O, 758 mg/l de Tiamina HCl, 3,88 mg/l de vitamina B12 e 3,84 mg/l de biotina.

[0265] Três culturas foram iniciadas por cepa. Os frascos incluíam barras de agitação e tinham rolhas com tubulação conectada com filtros de seringa para fornecer ar enriquecido com CO2 (1% de CO2) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram alinhados com uma abertura em direção à luz de 0,0875m2 e a dimensão de "profundidade" dos frascos, que se estendia desde a fonte de luz, era de 8 cm. Para determinação semicontínua de biomassa, as culturas foram diluídas di- ariamente, removendo 40% do volume da cultura e substituindo por meio de cultura fresco PM153 diluído para ajustar o aumento da salini- dade devido à evaporação ocorrida nas culturas. Amostras para análise de TOC foram retiradas da cultura removida para a diluição. O ensaio de produtividade semicontínuo foi realizado até as culturas alcançarem o estado estacionário. Após o ensaio semicontínuo, as culturas foram removidas do ensaio, peletizadas em centrifugação e ressuspensas em 420 ml de meio PM152 com depleção de nitrogênio. As culturas foram cultivadas em lote por 4 a 5 dias, usando as mesmas condições de cres-

cimento que o modo semicontínuo. Durante o modo em lote, foram co- letadas amostras de FAME para determinar a produtividade lipídica e amostras de TOC para determinar FAME/TOC. EXEMPLO 14 TEOR DE CLOROFILA, TAMANHO DA ANTENA E FOTOFISIOLOGIA

DE MUTANTES DE NOCAUTE DE PARACHLORELLA DE GENES SGI1, SGI2, NOCAUTE DUPLA DE GENES SGI1 E SRP54 E SGI2 E SRP54

[0266] O teor de clorofila dos mutantes de alta produtividade foi de- terminado extraindo células com metanol e analisando o sobrenadante por espectrofotometria. Resumidamente, alíquotas de 500 µl de cultura foram pipetadas em tubos de topo torcido de 2,0 ml e peletizadas com uso de uma microcentrífuga de mesa a 15.000 rpm por 10 minutos. Os sobrenadantes foram aspirados dos péletes, e cada pélete foi ressus- penso em 1,5 ml de metanol a 99,8% (previamente neutralizado com carbonato de magnésio). Foram adicionados 0,2 ml de microesferas de vidro (0,1 mm de diâmetro) a cada frasco e microesferas batidas por 3 minutos. 1,0 ml de sobrenadante foi transferido para novos tubos articu- lados de 1,7 ml e centrifugado em uma microcentrífuga de mesa a

15.000 rpm por 10 minutos. Os péletes resultantes eram brancos, indi- cando que uma extração completa havia sido realizada. Pipetaram-se 0,8 ml de cada sobrenadante em uma cubeta de vidro óptico e os com- primentos de onda de absorção foram lidos imediatamente em 720 nm, 665 nm e 652 nm comprimentos de onda. As medições espectrofotomé- tricas foram efetuadas em um modo de feixe duplo com uso de um branco de metanol a 99,8%. As seguintes equações foram usadas para calcular a concentração de clorofila: Clorofila a [g m-3] = 16,72(A665- A720) + 9,16 (A652-A720) e Clorofila b [g m-3] = 34,09(A652-A720) - 15,28(A665-A720). A quantidade de clorofilas a e b foi padronizada em uma base por célula e por TOC. Embora a quantidade de clorofila total por célula tenha variado de algum modo entre os mutantes SGI1-2261, a mesma foi universalmente diminuída em relação às células de tipo selvagem em uma quantidade que varia de cerca de 30% a cerca de 65%, consistente com a redução observada no tamanho da antena. Em uma base por TOC, a redução na clorofila total nos mutantes SGI1 em relação às células de tipo selvagem variou de cerca de 30% a cerca de 50%.

[0267] Além do teor de clorofila, os mutantes de nocaute SGI1 e SGI2 e o nocaute duplo de SGI1 e SRP54 e SGI2 e SRP54 foram ana- lisados quanto ao corte transversal de absorção funcional do PSII, corte transversal de absorção funcional do PSI, 1/τ’Qa (a taxa de luz saturada de transporte de elétrons no lado aceitador do fotossistema II na satu- ração da luz, uma medida da eficiência do transporte linear de elétrons fotossintéticos) bem como a taxa máxima de fixação de carbono, Pmax. As células das cepas de tipo selvagem e mutantes foram cultivadas no ensaio de cultura semicontínua de luz constante (CL-SCPA) descrito acima.

[0268] A análise de vários parâmetros fotossintéticos foi realizada usando a técnica de Indução e Relaxação de Fluorescência (FIRe), de- senvolvida para medir uma série abrangente de características fotossin- téticas e fisiológicas de organismos fotossintéticos (Gorbunov e Falkowski (2005), “Fluorescence Induction and Relaxation (FIRe) Tech- nique and Instrumentation for Monitoring Photosynthetic Processes and Primary Production in Aquatic Ecosystems” em: Photosynthesis: Funda- mental Aspects to Global Perspectives, Proc. 13º Congresso Internaci- onal de Fotossíntese, Montreal, 29 de agosto a 3 de setembro de 2004. (Eds: A. van der Est e D. Bruce), Allen Press, V.2, pp. 1.029 a 1.031). A técnica de FIRe baseia-se na medição e análise de perfis de "fluores- cência variável" da clorofila (revisada por Falkowski et al., 2004 “Deve-

lopment and Application of Variable Chlorophyll Fluorescence Techni- ques in Marine Ecosystems” em: Chlorophyll a Fluorescence: A Signa- ture of Photosynthesis (C Papageorgiou e Govingjee, eds), Springer, pp. 757 a 778), que dependem da relação entre a fluorescência da clorofila e a eficiência dos processos fotossintéticos. Essa técnica fornece um conjunto de parâmetros que caracterizam os processos fotossintéticos de captação de luz, a fotoquímica no Fotossistema II (PSII) e o trans- porte de elétrons fotossintéticos até a fixação do carbono. As medições realizadas neste documento usaram um minidispositivo FIRe produzido por Maxim Gorbunov da Rutgers University, East Brunswick, NJ. Um dispositivo de FIRe disponível comercialmente está disponível junto à Sea-Bird Scientific (Halifax, Canadá, satlantic.com e planet- ocean.co.uk). Mais informações sobre o uso do dispositivo de FIRe es- tão disponíveis nos manuais da empresa. Todas as medições foram fei- tas usando culturas semicontínuas de luz constante (CL-SCPA) (2.000 µmol de fótons ∙m-2 ∙s-1) (consultar o Exemplo 3). Para obter medições de FV/FM e σPSII de Indução e Relaxação de Fluorescência (FIRe), a cinética foi realizada no escuro. Os valores para F v/FM e σPSII apresen- tados na Tabela 6 foram calculados como uma média de 6 medições (3 medições de cada uma das 2 réplicas biológicas), os erros para esses parâmetros não excederam 5%.

[0269] As medições de corte transversal do PSI foram realizadas usando um espectrômetro JTS-10 modificado com um conjunto de filtros para medir o deslocamento eletrocrômico (ECS) a 520 nm, equipado com um pisca-pisca de volume único (STF) personalizado. O pico de densidade de potência na câmara de amostra foi alto o suficiente para garantir o fechamento total de centros de reação em aproximadamente 10 µs. A taxa de excitação resultante foi de cerca de 1 a 3 ocorrências por centro de reação por 10 µs (dependendo do corte transversal de absorção funcional do fotossistema). O STF gerou pulsos curtos ultra brilhantes de luz azul (455 nm, com meia largura de banda de 30 nm), e o tempo do pulso foi controlado pelo gatilho do espectrômetro JTS-10. A duração de pulso foi controlada pela caixa de controle de pulso do STF e foi ajustável na faixa de 1 µs a 50 µs usando o potenciômetro no painel frontal. Para medir o corte transversal do PSI, as culturas foram diluídas para uma OD de cerca de 0,2 no máximo de clorofila (cerca de 440 nm) com base na medição dos espectros de absorção da suspen- são de células usando um espectrofotômetro Perkin Elmer Lambda 650 equipado com uma esfera de integração. O ECS foi medido usando flas- hes de 10 µs com intensidades variando de 4.000 a 120.000 µmol de fótons m-2 s-1 na presença de DCMU e hidroxilamina. A curva experi- mental foi ajustada com uma função exponencial simples 𝐸𝐶𝑆 = 𝐶𝐸𝑆𝑀 × (1 − 𝑒 𝐼𝑡×𝜎𝑃𝑆𝐼 )

[0270] em que 𝐸𝐶𝑆𝑀 𝐸𝐶𝑆𝑀 é o sinal ECS máximo; 𝐼𝑡𝐼𝑡 é a densidade de fótons em fótons/m2; e 𝜎𝑃𝑆𝐼 𝜎𝑃𝑆𝐼 é um corte transversal funcional de PSI. Os valores obtidos para um corte transversal funcional do PSI para o tipo selvagem de Parachlorella (WT-1185) foram de (4,0 ± 0,5) × 10−18 (4,0 ± 0,5) × 10−18 m2. Esses valores são próximos aos obtidos para o corte transversal funcional do PSII cultivado sob as mesmas con- dições (𝜎𝑃𝑆𝐼𝐼 = (4,3 ± 0,1) × 10−18 𝜎𝑃𝑆𝐼𝐼 = (4,3 ± 0,1) × 10−18 m2). Es- tima-se que os erros para esses parâmetros não excedam 20%.

[0271] Taxas de fixação de carbono (C14 Pmax) foram medidas usando as culturas normalizadas para 5 µg chl ml-1 em meios contendo 0,5 g l-1 (5,95 mM) de bicarbonato de sódio. 20,4 µCi ml-1 de bicarbo- nato de sódio marcado com C14 foram adicionados a cada cultura e expostos a 2.500 µE por um período de 10 minutos. As amostras foram imediatamente acidificadas com HCl a 2N e deixadas sair do gás du- rante a noite. No dia seguinte, as amostras foram medidas usando um contador de cintilação Beckman LS6500 e quantificadas.

[0272] τ’Qa (o tempo de transporte de elétrons no lado aceitador de

PSII medido sob condições de saturação da luz - efetivamente determi- nado pela etapa mais lenta do transporte linear de elétrons fotossintéti- cos) foi medido a partir de curvas de luz FIRe e perfis de cinética de relaxação induzida pela escuridão (DIRK). A concentração volumétrica de PSII em relação ao tipo selvagem foi estimada como (Fv/σ 530PSII). Estima-se que os erros para esses parâmetros não excedam 15%. O corte transversal de absorção óptica (promediado sobre o espectro de emissão de uma fonte de luz) foi estimado usando a seguinte equação: 700 1 OD(λ) I( λ ) achl/TOC = ∫ ln(10) × × 700 dλ [Chl/TOC] 400 Δl ∫ I(λ)dλ400

[0273] em que [Chl/TOC] é a clorofila/TOC da amostra, OD(λ)OD(λ) é a densidade óptica medida da amostra em um comprimento de onda λλ, ΔlΔl é o comprimento da via do feixe de medição na cubeta (1 cm), I(λ)I(λ) é a intensidade da fonte de luz usada para cultivar algas no comprimento de onda λλ. TABELA 6. PARÂMETROS FLUORESCENTES E FOTOSSINTÉTICOS

MEDIDOS COM A TÉCNICA FIRE FIRe, parâme- tros recupera- Descrição dos JTS-10 Máximo rendimento quântico da fotoquímica em PSII, medido em um estado de adaptação ao escuro (sem FV/FM dimensão). Este parâmetro caracteriza a eficiência das reações fotossintéticas primárias.

FIRe, parâme- tros recupera- Descrição dos JTS-10 Corte transversal de absorção funcional de PSII (Å2) em um estado adaptado ao escuro. O parâmetro é o pro- duto do corte transversal de absorção óptica do PSII σPSII (isto é, o tamanho físico da unidade PSII) e o rendi- mento quântico da fotoquímica no PSII. Pode ser me- dido usando diferentes comprimentos de onda de exci- tação, por exemplo, 450 nm, 530 nm ou 590 nm Corte transversal de absorção funcional de PSI (Å2) em um estado adaptado ao escuro. O parâmetro é o pro- σPSI duto do corte transversal de absorção óptica de PSII (isto é, o tamanho físico da unidade de PSI) e o rendi- mento quântico da fotoquímica em PSI.

Taxa de luz saturada de transporte de elétrons no lado aceitador do fotossistema II. Este parâmetro indica a 1/τ’Qa eficiência do transporte linear de elétrons fotossintéti- cos

[0274] Os dados fotofisiológicos, o teor de clorofila e os dados de produtividade da cepa de Parachlorella WT-1185 de tipo selvagem, no- caute único dos genes SRP54 e SGI2 e o nocaute duplo dos genes SGI2 e SRP54 em Parachlorella são resumidos e foram avaliados. To- das as medições foram realizadas usando culturas de CL-SCPA. Para obter medições de FV/FM e σPSII de Indução e Relaxação de Fluores- cência (FIRe), a cinética foi realizada no escuro. Os valores apresenta- dos para Fv/Fm e σPSII foram calculados como uma média de 6 medi- ções (3 medições de cada uma das 2 réplicas biológicas) - os erros para esses parâmetros não excederam 5%. τ'Qa (tempo de transporte de elé- trons no lado aceitador de PSII medido sob condições de saturação da luz - efetivamente determinado pela etapa mais lenta do transporte li- near de elétrons fotossintéticos) foi medido a partir das curvas de luz FIRe e do perfil DIRK. As medições do corte transversal do PSI foram realizadas conforme descrito acima. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 7. TABELA 7. DADOS DE FOTOFISIOLOGIA, CLOROFILA E PRODUTI-

VIDADE

[0275] Há uma diminuição substancial no corte transversal de ab- sorção funcional de PSII (50%) e alguma diminuição no número de com- plexos funcionais de PSII. As células têm capacidade melhorada de fi- xação de carbono (aumento de 26% na Pmax). O nocaute único de SGI2 ou SRP54 apresentou aumento de pelo menos 17% na produtivi- dade do TOC em comparação com a cepa do tipo selvagem. No geral, a cepa de nocaute duplo SGI2/SRP54 apresentou uma melhoria de 32% na produtividade de TOC (em ambas as vezes que a cepa de nocaute duplo SGI2/SRP54 foi realizada no ensaio CL-SCPA, mostrou produti- vidades > 40 g/m2/dia), entre os maiores aumentos de produtividade ob- servados para Parachlorella e maior do que as melhorias médias do no- caute único de SRP54 ou SGI2, conforme mostrado na Figura 11. Os resultados demonstram que parece haver um efeito sinérgico na produ- tividade quando é feito nocaute de ambos os genes SGI2 e SRP54.

[0276] Foram avaliados os dados fotofisiológicos da cepa de Para- chlorella WT-1185 do tipo selvagem, nocaute único dos genes SRP54 e

SGI1 e três cepas com o nocaute duplo dos genes SGI1 e SRP54 em Parachlorella. Todas as medições foram realizadas usando culturas de CL-SCPA. Para obter medições de FV/FM e σPSII de Indução e Rela- xação de Fluorescência (FIRe), a cinética foi realizada no escuro. Os valores apresentados para FV/FM e σPSII foram calculados como uma média de 6 medidas (3 medições de cada uma das 2 réplicas biológicas) - os erros para esses parâmetros não excederam 5%. τ’Qa (tempo de transporte de elétrons no lado aceitador do PSII medido sob condições de saturação da luz - efetivamente determinado pela etapa mais lenta de transporte linear de elétrons fotossintéticos) foi medido a partir das curvas de luz FIRe e dos perfis DIRK. Os resultados estão resumidos na Tabela 8 abaixo. TABELA 8. FOTOFISIOLOGIA DE CEPAS DE PARACHLORELLA FIRe Cepa σPSII τ’Qa FV/FM [PSII]/TOC (relativo) (Å2, 530nm) (ms) STR24538 (SRP54/SGI1 KO) 0,707 64 4,5 19,3 STR24540 (SRP54/SGI1 KO) 0,699 61 4,6 18,6 STR24541 (SRP54/SGI1 KO) 0,694 61 4,7 19,4 GE-17407 (SRP54 KO) 0,646 85 5,5 16,4 STR24183 (SGI1 KO) 0,637 102 6,2 18,2

[0277] Há uma diminuição substancial no corte transversal funcional do PSII da cepa de nocaute duplo SGI1/SRP54 em comparação com os nocaute de genes únicos SGI1 ou SRP54, bem como uma diminuição na taxa de luz saturada do transporte de elétrons, indicando taxas me- lhores de fotossíntese. Há também algum aumento no número de com- plexos funcionais de PSII. Existe um rendimento quântico máximo me- lhorado da fotoquímica no fotossistema II (FV/FM) na cepa de nocaute duplo em comparação com o knock único de SRP54 ou SGI1 sozinho.

EXEMPLO 15

ANÁLISE MICROPROXIMA DE MUTANTES DE NOCAUTE DE SGN1/SGI2, SGI1/SRP54 e SGI1/SGI2/SRP54

[0278] Para determinar a composição geral de biomassa dos mu- tantes de nocaute de SGI1/SGI2, SGI1/SRP54 e SGI1/SGI2/SRP54, foi realizada análise quantitativa de amostras de culturas cultivadas no modo semicontínuo com diluição diária de 40% para determinar o car- bono orgânico total (TOC) e teor lipídico das células em cultura semi- contínua. Após as culturas atingirem o estado estacionário, alíquotas da cultura removida para diluição diária foram usadas para análise de lipí- deos, proteínas e carboidratos. O carbono orgânico total (TOC) das amostras de cultura de algas foi determinado diluindo 2 ml de cultura de células até um volume total de 20 ml com água deionizada. Três inje- ções por medição foram injetadas em um analisador Shimadzu TOC- Vcsj para a determinação de Carbono total (TC) e Carbono Inorgânico Total (TIC). O forno de combustão foi ajustado para 720 °C e o TOC foi determinado subtraindo TIC de TC. A faixa de calibração de 4 pontos foi de 2 ppm a 200 ppm, correspondendo a 20 a 2.000 ppm para culturas não diluídas com um coeficiente de correlação de r2> 0,999.

[0279] Para determinar o teor lipídico, a análise de FAME foi reali- zada em amostras de 2 mL que foram secas com uso de um GeneVac HT-4X. Aos péletes secos foi adicionado o seguinte: 500 µl de KOH 500 mM em metanol, 200 µl de tetra-hidrofurano que contêm hidroxil tolueno butilado a 0,05%, 40 µl de uma mistura padrão interna de ácido graxo livre a 2 mg/ml de C11:0 ácido graxo livre/C13:0 triglicerídeo/C23:0 de éster metílico de ácido graxo e 500 µl de microesferas de vidro (425 a 600 µm de diâmetro). Os frascos foram tapados com tampas de forro de septos de PTFE de topo aberto e colocados em um SPEX GenoGrinder a 1,65 krpm por 7,5 minutos. As amostras foram, então, aquecidas a 80°C por cinco minutos e deixadas esfriar. Para derivatização, 500 µl de

10% de trifluoreto de boro em metanol foram adicionados às amostras antes do aquecimento a 80°C por 30 minutos. Os tubos foram deixados esfriar antes da adição de 2 ml de heptano e 500 µl de NaCl a 5 M. As amostras foram agitadas em vórtex por cinco minutos a 2 krpm e, por fim, centrifugadas por três minutos a 1 krpm. A camada de heptano foi amostrada usando um amostrador automático Gerstel MPS. A quantifi- cação usou os 80 µg do padrão interno C23: 0 de FAME.

[0280] Os resultados dos ensaios indicando produtividade de TOC de área semicontínua e TOC em lote para a cepa de tipo selvagem de Parachorella (STR00010), mutante de nocaute SRP54 (STR00625), mutante de nocaute SGI1 (STR24183), mutantes de nocaute duplo SGI1/SRP54 (STR24538 e STR24540) são mostrados nas Figuras 12A e 12B, respectivamente. Mutante de nocaute SRP54, mutante de no- caute SGI1, mutantes de nocaute duplo SGI1/SRP54 mostraram au- mento da produtividade de TOC em relação à cepa do tipo selvagem de Parachorella.

[0281] Os resultados dos ensaios que indicam produtividade de TOC de área semicontínua e TOC em lote para a cepa de tipo selvagem de Parachorella (STR00010), mutante de nocaute SRP54 (STR00625), mutante de nocaute SGI1 (STR00012), mutante de nocaute duplo SGI2/SRP54 (STR00516), e mutantes de nocaute triplo SGI1/SGI2/SRP54 (STR25761 e STR25762) são mostrados nas Figu- ras 13A e 13B, respectivamente. O mutante de nocaute SGI1, o mutante de nocaute duplo SGI2/SRP54 e os mutantes de nocaute triplo SGI1/SGI2/SRP54 mostraram aumento de produtividade de TOC em relação à cepa de Parachorella do tipo selvagem.

[0282] Os resultados do ensaio de produtividade de FAME em lote para a cepa de tipo selvagem de Parachorella (STR00010), mutante de nocaute SRP54 (STR00625), mutante de nocaute SGI1 (STR24183), mutantes de nocaute duplo SGI1/SRP54 (STR24538 e STR24540) são mostrados na Figura 14. O mutante de nocaute de SGI1 e mutantes de nocaute SGI/SRP54 mostraram aumento da produtividade de FAME em relação à cepa do tipo selvagem de Parachorella.

[0283] Os resultados do ensaio de produtividade de FAME em lote para a cepa de Parachorella do tipo selvagem (STR00010), mutante de nocaute de SGI1 (STR00012), mutantes de nocaute duplo de SGI2/SRP54 (STR00516) e mutantes de nocaute triplo de SGI1/SGI2/SRP54 (STR25761 e STR25762) são mostrados na Figura

15.

[0284] Os subtítulos no pedido são exclusivamente para a conveni- ência do leitor e não limitam, de forma alguma, o escopo da invenção ou de modalidades da mesma.

[0285] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento a título de referência da mesma maneira como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Organismo fotossintético mutante caracterizado pelo fato de que compreende um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cresci- mento (SGI2).

2. Organismo fotossintético mutante caracterizado pelo fato de que compreende um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cresci- mento (SGI1).

3. Organismo fotossintético mutante caracterizado pelo fato de que compreende um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de crescimento (SGI2).

4. Organismo fotossintético mutante caracterizado pelo fato de que compreende um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54), um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cresci- mento (SGI1) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento sig- nificativo de crescimento (SGI2).

5. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mutante exibe uma redução na clorofila sob condições de pouca luz e maior rendimento quântico máximo da fotoquímica no fotossistema II (Fv/FM) em todas as irradiâncias fisiologicamente relevantes acima de 100 µE m-2s-1 em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

6. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivin- dicação 5, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mu- tante exibe uma redução na clorofila de pelo menos 20% em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

7. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivin- dicação 6, caracterizado pelo fato de que a redução de clorofila é pelo menos uma redução de 30% em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

8. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivin- dicação 7, caracterizado pelo fato de que a redução de clorofila é pelo menos uma redução de 40% em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

9. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivin- dicação 7, caracterizado pelo fato de que a redução de clorofila é pelo menos uma redução de 50% em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

10. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 9, caracterizado pelo fato de que a redução de clorofila é pelo menos uma redução de 60% em relação a um organismo fotossin- tético de controle da mesma espécie.

11. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 10, caracterizado pelo fato de que a redução de clorofila é pelo menos uma redução de 70% em relação a um organismo fotossin- tético de controle da mesma espécie.

12. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mutante exibe menor arrefecimento brusco não fotoquímico (NPQ) em todas as irradiâncias fisiologicamente relevantes acima de 100 µE m-2 s-1 em relação a um organismo fotossintético de controle da mesma es- pécie.

13. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 12, caracterizado pelo fato de que o mutante exibe NPQ me- nor em todas as irradiâncias fisiológicas acima de 250 µE m-2 s-1 que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

14. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mutante demonstra uma taxa mais alta de fixação de carbono em uma base por clorofila do que um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

15. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 14, caracterizado pelo fato de que a taxa de fixação de car- bono é pelo menos 50% maior que a de um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

16. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 15, caracterizado pelo fato de que a taxa de fixação de car- bono é pelo menos 100% maior que a de um organismo fotossintético de controle da mesma espécie.

17. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a taxa de evolução de oxigênio é pelo menos 100% maior que a de um orga- nismo fotossintético de controle da mesma espécie.

18. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 17, caracterizado pelo fato de que a taxa de evolução de oxigênio é pelo menos 200% maior que a de um organismo fotossinté- tico de controle da mesma espécie.

19. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que uma cultura do mutante demonstra maior produtividade de biomassa do que uma cultura de um organismo fotossintético de controle da mesma es- pécie.

20. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 19, caracterizado pelo fato de que o mutante demonstra maior produtividade de biomassa na cultura fotoautotrófica.

21. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizado pelo fato de que o mutante demonstra maior atividade de biomassa sob condições de luz contínua.

22. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizado pelo fato de que o mutante demonstra maior atividade de biomassa sob condições de ciclo de 24h.

23. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizado pelo fato de que o mutante demonstra maior atividade de biomassa sob condições de ciclo de 24h, em que o perfil de luz imita um perfil de luz natural.

24. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mutante foi gerado por irradiação UV, irradiação gama ou mutagênese química.

25. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mutante é um mutante geneticamente modificado.

26. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 25, caracterizado pelo fato de que o mutante foi genetica- mente modificado por mutagênese insercional, substituição de genes, RNAi, RNA de antissenso, meganucleases geneticamente modificadas, uma ou mais ribozimas e/ou um sistema CRISPR/Cas.

27. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 26, caracterizado pelo fato de que o mutante foi genetica- mente modificado por um sistema CRISPR/Cas.

28. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a cpSRP54 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ

ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 85 antes de mutação ou atenuação do gene.

29. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 26, caracterizado pelo fato de que o gene cpSRP54 tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8 antes de mutação ou atenuação do gene.

30. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 28, caracterizado pelo fato de que a cpSRP54 tem pelo me- nos 65% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 antes de mutação ou atenuação do gene.

31. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo SGI1 tem pelo menos 50% de identidade com uma sequên- cia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 antes de mutação ou atenuação do gene.

32. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica uma proteína SRP54 compreende uma mutação que ocorre fora da sequência que codifica os primeiros 169 aminoácidos do domínio cpSRP54 GTPase.

33. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 32, caracterizado pelo fato de que a mutação no gene que codifica uma proteína SRP54 ocorre fora da sequência que codifica o domínio cpSRP54 GTPase.

34. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 33, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica uma proteína SRP54 não inclui uma mutação de interrupção de gene no do- mínio cpSRP54 GTPase.

35. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o gene SGI2 com- preende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% de identidade com uma sequên- cia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

36. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 35, caracterizado pelo fato de que o gene SGI2 compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 66 antes de mutação ou atenuação do gene.

37. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 35, caracterizado pelo fato de que o gene SGI2 compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de ami- noácidos com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56 antes de mutação ou atenuação do gene.

38. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético são algas e em que as algas mutantes perten- cem a um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Brac- teococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emi- liania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haematococcus, Halocafeteria, Hetero- sigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Parachlorella, Pascheria, Pelagomo- nas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseu- dostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Skeleto- nema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria e Volvox.

39. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético são algas e em que a alga mutante é selecio- nada a partir do grupo que consiste em um mutante clorófito, bacilariófita, prasinófito, glaucófitas, haptófitas, cloraracnófito, euglenó- fitas, cromófitos e dinoflagelado.

40. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético são algas e em que a alga mutante é um clo- rófito.

41. Mutante de algas, de acordo com a reivindicação 37, ca- racterizado pelo fato de que o mutante pertence a um gênero selecio- nado a partir do grupo que consiste em: Botryococcus, Bracteococcus, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Crypto- monas, Dunaliella, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Franceia, Gloeothamnion, Haematococcus, Heterosigma, Hymenomonas, Iso- chrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monoraphidium, Nannochloris, Neo- chloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Ochromonas, Oedogonium, Oo- cystis, Ostreococcus, Parachlorella, Pascheria, Pelagomonas, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Te- traselmis, Tribonema, Viridiella e Volvox.

42. Biomassa caracterizada pelo fato de que compreende um organismo fotossintético mutante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

43. Biomassa, de acordo com a reivindicação 42, caracteri- zada pelo fato de que o organismo fotossintético são algas.

44. Método para produzir um produto biológico caracterizado pelo fato de que compreende cultivar organismo fotossintético mutante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e isolar pelo menos um produto da cultura.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético são algas e em que o pro- duto biológico é a biomassa algal.

46. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o produto biológico é um lipídeo, uma proteína, um peptídeo, um ou mais aminoácidos, um aminoácido, um ou mais nucle- otídeos, uma vitamina, um cofator, um hormônio, um antioxidante ou um pigmento ou corante.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o produto biológico é um lipídeo.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante é modificado para incluir pelo menos um gene exógeno que codifica um polipeptídeo que participa da produção de um lipídeo.

49. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante é cultivado fototroficamente.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante é alga e em que a alga é cultivada em um tanque ou cava.

51. Organismo fotossintético mutante caracterizado pelo fato de que tem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal citosólico (cytoSRP54) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de crescimento (SGI2).

52. Organismo fotossintético mutante caracterizado pelo fato de que tem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal citosólico (cytoSRP54) e um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de crescimento (SGI1).

53. Organismo fotossintético mutante caracterizado pelo fato de que tem um gene mutado ou atenuado que codifica uma proteína 54 de reconhecimento de sinal citosólico (cytoSRP54), um gene 1 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de crescimento (SGI1) e um gene 2 mutado ou atenuado de aprimoramento significativo de cresci- mento (SGI2).

54. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato de que uma cultura do organismo fotossintético mutante demonstra maior produtivi- dade lipídica do que uma cultura de um organismo fotossintético de con- trole da mesma espécie.

55. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 51 a 53, caracterizado pelo fato de que o mutante demonstra maior produtividade lipídica na cultura fotoautotró- fica.

56. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 55, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante são algas e em que as algas mutantes demonstram maior ati- vidade de biomassa sob condições de ciclo de 24h.

57. Alga mutante, de acordo com a reivindicação 56, carac- terizada pelo fato de que a alga mutante demonstra maior atividade de biomassa em condições de ciclo de 24h, nas quais o perfil de luz imita um perfil de luz natural.

58. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 51 a 53, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante foi gerado por irradiação UV, irradia- ção gama ou mutagênese química.

59. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 51 a 53, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante é um mutante geneticamente modifi- cado.

60. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 58, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante foi geneticamente modificado por mutagênese de inserção, substituição de genes, RNAi, RNA de antissenso, meganuclease gene- ticamente modificada, uma ou mais ribozimas e/ou um sistema CRISPR/Cas.

61. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a rei- vindicação 59, caracterizado pelo fato de que o mutante foi genetica- mente modificado por um sistema CRISPR/Cas.

62. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 51 a 60, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante é alga e em que a alga mutante per- tence a um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Brac- teococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emi- liania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haematococcus, Halocafeteria, Hetero- sigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Parachlorella, Pascheria, Pelagomo- nas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseu- dostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Skeleto- nema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria e Volvox.

63. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 51 a 60, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mutante é alga, e em que a alga mutante é se- lecionada a partir do grupo que consiste em um mutante Bacillariophyta, eustigmatophyte e chromophytes mutantes.

64. Alga mutante, como definida na reivindicação 63, carac- terizada pelo fato de que o mutante é um eustigmatophyte.

65. Alga mutante, de acordo com a reivindicação 64, carac- terizada pelo fato de que a alga mutante pertence a um gênero selecio- nado a partir do grupo que consiste em Ellipsoidion, Eustigmatos, Vischeria, Monodus, Nannochloropsis e Pseudostaurastrum.

66. Método para produção de lipídeos, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um mutante de algas, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 65, e isolar pelo menos um lipídeo da cultura.

67. Método para aumentar a biomassa de um organismo fo- tossintético caracterizado pelo fato de que compreende a modulação da proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e do Gene 2 de Aprimoramento Aignificativo de Crescimento (SGI2).

68. Método para aumentar a biomassa de um organismo fo- tossintético caracterizado pelo fato de que compreende a modulação dos genes de proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e do Gene 1 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI1).

69. Método para aumentar a biomassa de um organismo fo- tossintético caracterizado pelo fato de que compreende a modulação dos genes de proteína 54 de reconhecimento de sinal cloroplástico (cpSRP54) e Gene 1 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI1) e Gene 2 de Aprimoramento Significativo de Crescimento (SGI2).

70. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a modulação dos genes compreende mutação de subs- tituição de base, mutagênese insercional, recolocação de genes, RNAi, RNA de antissenso, meganuclease geneticamente modificada, uma ou mais ribozimas e/ou um sistema CRISPR/Cas no gene cpSRP54 e no gene SGI2.

71. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a modulação dos genes compreende mutação de subs- tituição de base, mutagênese insercional, recolocação de genes, RNAi, RNA de antissenso, meganuclease geneticamente modificada, uma ou mais ribozimas e/ou um sistema CRISPR/Cas no gene cpSRP54 e no gene SGI1.

72. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a modulação dos genes compreende mutação de subs- tituição de base, mutagênese insercional, recolocação de genes, RNAi, RNA de antissenso, meganuclease geneticamente modificada, uma ou mais ribozimas e/ou um sistema CRISPR/Cas no gene cpSRP54, no gene SGI1 e no gene SGI2.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 72, caracterizado pelo fato de que o aumento da biomassa de um organismo fotossintético compreende um aumento no carbono orgânico total.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 72, caracterizado pelo fato de que o aumento da biomassa de um organismo fotossintético compreende um aumento no teor lipídico total.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 72, caracterizado pelo fato de que o aumento da biomassa de um organismo fotossintético compreende um aumento no teor total de nitro- gênio.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

67 a 75, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mu- tante é alga e em que a alga mutante pertence a um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomo- nas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodes- mius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Hae- matococcus, Halocafeteria, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pa- vlova, Parachlorella, Pascheria, Pelagomonas, Phaeodactylum, Pha- gus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Proto- theca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyrami- monas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococ- cus, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vis- cheria e Volvox.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 76, caracterizado pelo fato de que o organismo fotossintético mu- tante é uma planta.