ES2307320T3 - Una region reguladora de 5' de oleosina para la modificacion de la composicion lipidica de semillas de plantas. - Google Patents
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Abstract
Un "cassette" de expresión que comprende la región reguladora 5'' de oleosina que dirige la expresión específica en la semilla, consistente en la secuencia nucleotídica que se expone en la SEQ ID NO:12, enlazada operativamente a al menos un ácido nucleico que codifica un gen heterólogo de Delta6-desaturasa.
Description
Una región reguladora de 5' de oleosina para la
modificación de la composición lípidica de semillas de plantas.
Tradicionalmente se ha modificado el contenido
de aceite de semillas por medio del desarrollo de variedades
vegetales. El empleo de tecnología de ADN recombinante para alterar
la composición del aceite de semillas puede acelerar este proceso,
y en algunos casos modificar los aceites de semillas de un modo que
no se puede conseguir sólo con el desarrollo de variedades. La
composición del aceite de Brassica ha sido alterada de
manera significativa mediante la modificación de la expresión de
diversos genes del metabolismo lipídico. Estas manipulaciones de la
composición de los aceites de semillas se han centrado en modificar
la proporción de ácidos grasos que son componentes endógenos. Por
ejemplo, la represión antisentido del gen de la
\Delta12-desaturasa en la semilla de colza
transgénica ha dado como resultado un incremento en el contenido de
ácido oleico de hasta 83% (Topfer y otros, 1995, Science
268:681-686).
Se han producido algunos intentos satisfactorios
de modificar la composición de los aceites de semillas en plantas
transgénicas introduciendo nuevos genes que permiten la producción
de un ácido graso que la planta anfitriona no era antes capaz de
sintetizar. Van de Loo y otros (1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA
92:6743-6747) han conseguido introducir un gen
de \Delta12-hidroxilasa en tabaco transgénico,
dando como resultado la introducción de un ácido graso nuevo, el
ácido ricinoleico, en el aceite de su semilla. La acumulación
descrita era modesta en plantas que portaban constructos en los
cuales la transcripción del gen de la hidroxilasa estaba bajo el
control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
(siglas inglesas CaMV). De manera similar, se han modificado
plantas de tabaco para producir bajos niveles de ácido petroselínico
mediante la expresión de una
acil-ACP-desaturasa del cilantro
(Cahoon y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA
89:11184-11188).
Los ácidos grasos de cadena larga (C18 y más),
tienen un significativo valor económico como alimentos con
importancia nutricional y médica, y también como productos
industriales (Ohlrogge, J.B., 1994, Plant Physiol.
104:821-826). El ácido linoleico (18:2
\Delta9,12) y el ácido \alpha-linolénico (18:3
\Delta9,12,15) son ácidos grasos esenciales que se encuentran en
muchos aceites de semilla. Mediante el desarrollo de variedades y
la biotecnología se han manipulado los niveles de estos ácidos
grasos en los cultivos que producen aceites de semilla (Ohlrogge y
otros, 1991, Biochim. Biophys. Acta
1082:1-26; Topfer y otros, 1995, Science
268:681-686). Además, la producción de nuevos
ácidos grasos en aceites de semilla puede tener un uso considerable
tanto en aplicaciones relacionadas con la salud humana como en
aplicaciones industriales.
Se cree que el consumo de aceites vegetales
ricos en ácido \gamma-linolénico (siglas inglesas
GLA) (18:3 \Delta6,9,12) alivia la hipercolesterolemia y otros
trastornos clínicos afines ligados a la susceptibilidad frente a
cardiopatías coronarias (Brenner R.R., 1976, Adv. Exp. Med. Biol.
83:85-101). Los beneficios terapéuticos del GLA
presente en la dieta pueden ser consecuencia de su papel como
precursor en la síntesis de prostaglandinas (Weete, J.D., 1980, en
Lipid Biochemistry of Fungi and Other Organisms, Plenum
Press, Nueva York, páginas 59-62). El ácido
linoleico (18:2) (siglas inglesas LA) es transformado en ácido
gamma-linolénico (18:3) (GLA) por la enzima
\Delta6-desaturasa.
Pocos aceites de semilla contienen GLA, a pesar
de sus elevados contenidos de ácido linoleico precursor. Ello se
debe a la ausencia de actividad de
\Delta6-desaturasa en la mayoría de los vegetales.
Por ejemplo, sólo la borraja (Borago officinalis), la
prímula u onagra (Oenothera biennis), y la grosella negra
(Ribes nigrum) producen cantidades apreciables de ácido
linolénico. De estas tres especies, sólo Oenothera y
Borago se cultivan como fuente comercial de GLA. Sería
beneficioso que se pudieran modificar aceites de semilla agrícolas
con el fin de producir GLA en cantidades significativas, mediante la
introducción de un gen heterólogo de
\Delta6-desaturasa. También resultaría beneficioso
que se pudieran producir en vegetales otros productos de expresión
asociados con la síntesis de ácidos grasos y el metabolismo lipídico
a niveles lo suficientemente elevados como para que sea factible la
producción comercial de un producto de expresión particular.
Tal como se describe en el documento WO
96/21022, recientemente se ha aislado un gen cianobacteriano de
\Delta^{6}-desaturasa. La expresión de este gen
cianobacteriano en tabaco transgénico ha originado un nivel
significativo, aunque bajo, de acumulación de GLA (Reddy y otros,
1996, Nature Biotech. 14:639-642). La
solicitud de patente de EE.UU., presentada por el mismo solicitante
que la presente, y también pendiente, con el número de serie
08,366,779, describe un gen de \Delta6-desaturasa
aislado de la planta Borago officinalis y su expresión en la
planta del tabaco bajo el control del promotor 35S de CaMV. Dicha
expresión ha originado un nivel significativo, aunque bajo, de
acumulación de GLA y de ácido octadecatetra-enoico
(ODTA u OTA) en las semillas. Por tanto, existe la necesidad de un
promotor que funcione en vegetales y que dirija de manera
consistente una expresión a alto nivel de genes del metabolismo
lipídico en semillas de plantas transgénicas.
Las oleosinas son abundantes proteínas de
semilla que están asociadas con la membrana de monocapa de
fosfolípido de los oleosomas. El primer gen de oleosina, el L3, ha
sido clonado a partir del maíz mediante la selección de clones
cuyos productos traducidos in vitro eran reconocidos por un
anticuerpo anti-L3 (Vance y otros, 1987, J.
Biol. Chem. 262:11275-11279). Posteriormente se
han clonado diferentes isoformas de genes de oleosina procedentes
de especies tan diversas como Brassica, soja, zanahoria,
pino, y Arabidopsis (Huang, A.H.C., 1992, Ann. Reviews
Plant Phys. and Plant Mol. Biol. 43:177-200;
Kirik y otros, 1996, Plant Mol. Biol.
31:413-417; Van Rooijen y otros, 1992, Plant
Mol. Biol. 18:1177-1179; Zou y otros, Plant
Mol. Biol. 31:429-433. Las secuencias proteicas
de oleosina predichas a partir de estos genes están muy conservadas,
en especial en lo que se refiere al dominio hidrófobo central.
Todas estas oleosinas comparten el rasgo característico de poseer
tres dominios distintivos. En el extremo N-terminal
está presente un dominio anfipático de 40-60
aminoácidos; en el centro se sitúa un dominio totalmente hidrófobo
de 68-74 aminoácidos; y en el extremo
C-terminal se sitúa un dominio en hélice \alpha
anfipático de 33-40 aminoácidos (Huang, A.H.C.,
1992).
Se han descrito, además, secuencias reguladoras
5' de un gen de oleosina que dirigen la expresión a alto nivel de
genes del metabolismo lipídico en plantas transgénicas. De acuerdo
con la presente invención, se describen constructos quiméricos que
comprenden una región reguladora 5' de oleosina enlazada
operativamente a la secuencia codificadora de un gen del
metabolismo lipídico tal como un gen de
\Delta6-desaturasa. Plantas transgénicas que
comprenden los constructos quiméricos que son dicho objeto producen
niveles de GLA que se acercan al nivel encontrado en las escasas
especies vegetales que producen GLA de modo natural, tales como la
prímula u onagra (Oenothera biennis).
La presente invención proporciona
"cassettes" de expresión y vectores de expresión que comprenden
la región reguladora 5' de oleosina que dirige la expresión
específica en la semilla, consistentes en la secuencia nucleotídica
que se indica en la SEQ ID NO:12, enlazada operativamente a al menos
un ácido nucleico que codifica un gen heterólogo de
\Delta6-desaturasa.
También se proporcionan vectores de
transformación vegetal que comprenden los cassettes de expresión y
vectores de expresión, así como células vegetales transformas por
estos vectores, y plantas y su progenie que contienen los
vectores.
En otro aspecto se describe un método para
producir una planta con niveles incrementados de un producto de un
gen de la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo lipídico.
En particular, se describe un método para
producir una planta con niveles incrementados de un gen de la
síntesis de ácidos grasos o del metabolismo lipídico, transformando
una planta con los cassettes de expresión y vectores de expresión
objeto de la presente solicitud, que comprenden una región
reguladora 5' de oleosina y una secuencia codificadora de un gen de
la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo lipídico.
En otro aspecto, se describe un método para
co-suprimir un gen nativo de la síntesis de ácidos
grasos o del metabolismo lipídico, transformando una planta con los
cassettes de expresión y vectores de expresión objeto de la
presente solicitud, que comprenden una región reguladora 5' de
oleosina y una secuencia codificadora de un gen de la síntesis de
ácidos grasos o del metabolismo lipídico.
Un aspecto adicional describe un método para
disminuir la producción de un gen vegetal nativo tal como un gen de
la síntesis de ácidos grasos o un gen del metabolismo lipídico,
transformando un vegetal con un vector de expresión que contiene
una región reguladora 5' de oleosina enlazada a una secuencia de
ácido nucleico complementaria a un gen vegetal nativo.
También se describen métodos para modular los
niveles de un gen heterólogo tal como un gen de la síntesis de
ácidos grasos o del metabolismo lipídico transformando un vegetal
con los cassettes de expresión y vectores de expresión objeto de la
presente solicitud.
La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica y
la correspondiente secuencia aminoacídica del gen de la
\Delta6-desaturasa de borraja (SEQ ID NO:1). Se
ha recuadrado el motivo de fijación a heme de citocromo b5, y se han
subrayado los motivos ricos en histidina (siglas inglesas HRM) de
fijación a metal, putativos. Se han subrayado con líneas de puntos
los motivos reconocidos por los cebadores (análisis por reacción en
cadena de polimerasa, siglas inglesas PCR), es decir, tgg aaa tgg
aac cat aa; y gag cat cat ttg ttt cc.
La Fig. 2 es un dendrograma que muestra la
similitud de la \Delta6-desaturasa de borraja
respecto a otras desaturasas unidas a membrana. Se comparó la
secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa
de borraja con otras desaturasas conocidas usando Gene Works
(IntelliGenetics). Los valores numéricos se refieren a las
distancias filogenéticas relativas entre los subgrupos
comparados.
La Figura 3A proporciona un perfil de
cromatografía gas-líquido de los ésteres metílicos
de ácidos grasos (siglas inglesas FAMES) derivados de tejido foliar
de un tabaco de tipo natural "Xanthi".
La Figura 3B proporciona un perfil de
cromatografía gas-líquido de los FAMES derivados de
tejido foliar de una planta de tabaco transformada con el cADN de
la \Delta6-desaturasa de borraja bajo control
transcripcional del promotor 35S de CaMV (pAN2). Se indican los
picos correspondientes al linoleato (18:2) de metilo,
\gamma-linolenato (18:3\gamma) de metilo,
\alpha-linolenate (18:3\alpha) de metilo, y
octadecatetraenoato (18:4) de metilo.
La Figura 4 muestra la secuencia nucleotídica y
la correspondiente secuencia aminoacídica del cADN de AtS21 de
oleosina (SEQ ID NO:3).
La Figura 5 es un mapa
ácido-base de la proteína AtS21 predicha, generado
por el programa DNA Strider 1.2.
La Figura 6 es un gráfico
Kyte-Doolittle de la proteína AtS21 predicha,
generado por el programa DNA Strider 1.2.
La Figura 7 es un alineamiento de secuencias de
oleosinas aisladas de Arabidopsis. Se alinearon entre sí
secuencias de oleosina publicadas o depositadas en las bases de
datos EMBL, BCM, NCBI, empleando el programa GeneWorks® 2.3. Se
han recuadrado con rectángulos los restos idénticos. Las siete
secuencias se dividen en tres grupos. El primer grupo incluye AtS21
(SEQ ID NO:5), X91918 (SEQ ID NO:6) y Z29859 (SEQ ID NO:7). El
segundo grupo incluye X62352 (SEQ ID NO:8) y Ato13 (SEQ ID NO:9). El
tercer grupo incluye X91956 (SEQ ID NO:10) y L40954 (SEQ ID
NO:11). Se indican con sombreado las diferencias en los restos de
aminoácidos dentro del mismo grupo. Ato2/Z54164 es idéntica a
AtS21. La secuencia Ato13 (número de entrada Z541654 en la base de
datos EMBL) no se encuentra realmente descrita en la base de datos
EMBL. El número de entrada Z54165 designa a la misma secuencia que
el Z54164, que es Ato12.
La Figura 8A es un análisis tipo Northern del
gen AtS21. Se hibridó una tinción en gel de ARN que contenía 10
microgramos de ARN total extraída de flores (F), hojas (L), raíces
(R), semillas en desarrollo (Se), y vainas de silicua en desarrollo
(Si) de Arabidopsis, con una sonda preparada a partir del
cADN de longitud completa de AtS21.
La Figura 8B es un análisis tipo Southern del
gen AtS21. Se hibridó una tinción en gel de ADN que contenía diez
microgramos de ADN genómico digerido con BamHI (B), EcoRI (E),
HindIII (H), SacI (S), y XbaI (X), con una sonda preparada a partir
del cADN de longitud completa de AtS21.
La Figura 9 es la secuencia nucleotídica del
fragmento SacI del ADN genómico de AtS21 (SEQ ID NO:12). Las
secuencias de promotor e intrón están en mayúsculas. Los fragmentos
correspondientes a las secuencia de cADN de AtS21 están en
minúsculas. Se han sombreado el primer codón ATG y una caja TATA
putativa. Se ha recuadrado la secuencia complementaria al cebador
21P para la amplificación por PCR. Se han subrayado un elemento de
respuesta a ácido abscísico (siglas inglesas ABRE) putativo y dos
repeticiones de 14 pares de bases.
La Figura 10 es un mapa del constructo
"promotor AtS21/GUS" (pAN5).
La Figura 11A muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en la yema floral y hojas de Arabidopsis.
La Figura 11B muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en silicuas de Arabidopsis.
La Figura 11C muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en semillas de Arabidopsis en desarrollo.
Las Figuras 11D a 11J muestran la expresión
génica de AtS21/GUS en embriones de Arabidopsis en
desarrollo.
La Figura 11K muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en la raíz y pelos radiculares de una plántula joven de
Arabidopsis.
La Figura 11L muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en cotiledones y en el ápice caulinar de una plántula de
Arabidopsis con cinco días de edad.
Las Figuras 11M y 11N muestran la expresión
génica de AtS21/GUS en cotiledones y en el ápice caulinar de
plántulas de Arabidopsis con 5-15 días de
edad.
La Figura 12A muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en embriones y endospermio de tabaco.
La Figura 12B muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en semillas de tabaco en germinación.
La Figura 12C muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en una plántula de tabaco con 5 días de edad.
La Figura 12D muestra la expresión génica de
AtS21/GUS en plántulas de tabaco con 5-15 días de
edad.
La Figura 13A es un análisis tipo Northern que
muestra los niveles de mARN de AtS21 en plántulas de
Arabidopsis de tipo natural en desarrollo. En la pista 1 se
aplicó ARN de semillas en desarrollo, en la pista 2 se aplicó ARN
de semillas empapadas durante 24-48 horas, en la
pista 3: plántulas de 3 días; en la pista 4: plántulas de 4 días;
en la pista 5: plántulas de 5 días; en la pista 6: plántulas de 6
días; en la pista 7: plántulas de 9 días; en la pista 8: plántulas
de 12 días; La sonda fue cADN de AtS21 marcado. La exposición tuvo
lugar durante una hora a -80ºC.
La Figura 13B es la misma tinción que en la
Figura 13A, salvo que la exposición tuvo lugar durante 24 horas a
-80ºC.
La Figura 13C es la misma tinción mostrada en
las Figuras 13A y 13B después de arrancar e hibridar a una sonda de
gen de tubulina de Arabidopsis. La banda pequeña en la pista
1 y en la pista 2 es el remanente de la anterior sonda AtS21. La
exposición tuvo lugar durante 48 horas a -80ºC.
La Figura 14 es un gráfico que compara las
actividades de GUS expresadas por los promotores AtS21 y 35S. Las
actividades de GUS expresadas por el promotor AtS21 en semillas en
desarrollo y hojas de Arabidopsis están representadas al
lado de las expresadas por el promotor 35S. En la parte derecha de
la figura se han dibujado las actividades de GUS expresadas por el
promotor AtS21 en semillas secas y hojas de tabaco. La actividad de
GUS en las hojas de tabaco es tan baja que no se ve ninguna columna.
"G-H" significa el estadio de "globular"
a "corazón"; "H-T" significa el estadio de
"corazón" a "torpedo"; "T-C"
significa el estadio de "torpedo" a cotiledón; "Early C"
significa cotiledón temprano; "Late C" significa cotiledón
tardío. En la Tabla 2 se indican las desviaciones típicas.
La Figura 15A es un análisis mediante
transferencia de ARN en gel realizados sobre muestras de 5 \mug de
ARN aislado de hoja, raíz y tejido de embrión de 12 días
post-polinización, de borraja, empleando como sonda
de hibridación cADN de \Delta6-desaturasa de
borraja marcado.
La Figura 15B muestra una gráfica
correspondiente a los resultados del análisis tipo Northern del
experimento mostrado en la Figura 15A.
La Figura 16A es una gráfica que muestra la
acumulación relativa de ARN de legumina en embriones de borraja en
desarrollo, basada en los resultados de la transferencia tipo
Northern.
La Figura 16B es una gráfica que muestra la
acumulación relativa de ARN de oleosina en embriones de borraja en
desarrollo, basada en los resultados de la transferencia tipo
Northern.
La Figura 16C es una gráfica que muestra la
acumulación relativa de ARN de \Delta6-desaturasa
en embriones de borraja en desarrollo, basada en los resultados de
la transferencia tipo Northern.
La Figura 17 es un análisis PCR que demuestra la
presencia del gen de delta 6-desaturasa de borraja
en plantas de colza transformadas. En las pistas 1, 3 y 4 se
aplicaron reacciones PCR llevadas a cabo con ADN de plantas
transformadas con el gen de delta 6-desaturasa de
borraja enlazado a la región reguladora 5' de oleosina; en la pista
2: ADN de plantas transformadas con el gen de delta
6-desaturasa de borraja enlazado a la región
reguladora 5' de albúmina; en las pistas 5 y 6: ADN procedente de
plantas no transformadas; en la pista 7: marcador de peso molecular
("escalera" de 1 kb (1 kb Ladder), Gibco BRL); en la pista 8:
PCR sin ADN plantilla añadido; en la pista 9: testigo con ADN
procedente de Agrobacterium tumefaciens EHA 105 que contiene
el plásmido pAN3 (es decir, el gen de delta
6-desaturasa de borraja enlazado a la región
reguladora 5' de oleosina).
La presente invención proporciona un
"cassette" de expresión que comprende la región reguladora 5'
de oleosina que dirige la expresión específica en la semilla,
consistente en la secuencia nucleotídica que se expone en la SEQ ID
NO:12, enlazada operativamente a al menos un ácido nucleico que
codifica un gen heterólogo de \Delta6-desaturasa.
Dicho cassette de expresión puede ser incorporado en diversos
vectores con replicación autónoma a fin de construir un vector de
expresión.
Se ha hallado, sorprendentemente, que plantas
transformadas con los vectores de expresión de la presente invención
producen niveles de GLA que se aproximan al nivel encontrado en las
escasas especies vegetales que producen naturalmente GLA, tales
como la onagra o prímula (Oenothera biennis).
Tal como se emplea en la presente memoria, el
término "cassette" se refiere a una secuencia nucleotídica
capaz de expresar un gen particular si dicho gen se inserta de
manera que esté enlazado operativamente a una o más regiones
reguladoras presentes en la secuencia nucleotídica. Tal como se
emplea en la presente memoria, la frase "expresión específica en
la semilla" se refiere a la expresión en diversas partes de la
semilla de una planta, tales como el endospermio y el embrión.
Se puede conseguir un ácido nucleico aislado que
codifica una región reguladora 5' de un gen de oleosina de la
manera siguiente. Se aíslan clones genómicos de oleosina
recombinantes mediante el escrutinio de una biblioteca de ADN
genómico vegetal con cADN (o una porción del mismo) que representa
mARN de oleosina. Se han aislado varios cADNs de oleosina
diferentes. Los métodos empleados para aislar dichos cADNs, y las
secuencias nucleotídicas y de aminoácidos correspondientes han sido
publicados en los artículos de Kirik y otros, 1986, Plant Mol.
Biol. 31:413-417; Zou y otros, Plant Mol.
Biol. 31:429-433; Van Rooigen y otros, 1992,
Plant Mol. Biol. 18:1177-1179.
El escrutinio de una biblioteca específica
respecto al tejido, por sustracción virtual, y empleando una sonda
de cADN para reacción en cadena de polimerasa aleatoriamente cebada
(siglas inglesas RP-PCR) constituye otro método
para obtener un cADN de oleosina útil para el escrutinio de una
biblioteca de ADN genómico vegetal. La expresión "escrutinio por
sustracción virtual" se refiere a un método en el cual se
construye una biblioteca de cADN a partir de un tejido diana y se
expone con baja densidad, de manera que se puedan separar fácilmente
los clones individuales de cADN. Estos clones de cADN son
explorados sistemáticamente de manera sustractiva con cantidades
impulsoras (es decir, concentraciones de ADN que impulsan
cinéticamente la reacción de hibridación) de sondas de cADN
preparadas a partir de tejido o tejidos distintos del tejido diana
(es decir, el tejido impulsor). Las placas hibridadas representan
genes que están expresados tanto en el tejido diana como en los
tejidos impulsores; Las placas no hibridadas representan genes que
pueden ser específicos respecto al tejido diana, o bien ser genes
de abundancia escasa que no pueden ser detectados por la sonda de
cADN impulsor. Los cADNs no hibridados son seleccionados como genes
específicos para el tejido diana, putativos, y ulteriormente se
analizan mediante secuenciación en un solo paso e hibridación tipo
Northern.
La PCR aleatoriamente cebada (siglas inglesas
RP-PCR) implica la síntesis de grandes cantidades de
sondas de cADN a partir de una cantidad traza de plantilla de cADN.
El método combina el poder de amplificación de la PCR con la
representación del cebado aleatorio con el fin de amplificar y
marcar simultáneamente cADN de doble cadena en una reacción dentro
de un solo tubo.
Sambrook y otros, 1989, en Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, por ejemplo, o
cualquiera de la miríada de manuales de laboratorio acerca de la
tecnología de ADN recombinante que están ampliamente disponibles,
proporcionan métodos considerados útiles para obtener ADN
recombinante genómico de oleosina. Están disponibles, y son
conocidas por un técnico con pericia ordinaria, multitud de técnicas
para determinar secuencias nucleotídicas. Por ejemplo, se pueden
subclonar fragmentos de restricción que contienen una región
reguladora de oleosina en el sitio de polienlazador de un vector
secuenciador tal como pBluescript (Stratagene). Después se puede
determinar la secuencia de estos subclones pBluescript mediante el
método de dideoxi de doble-cadena (Chen y Seeburg,
1985, DNA 4:165).
La región reguladora de oleosina comprende los
nucleótidos 1-1267 de la Figura 9 (SEQ ID
NO:12).
La región reguladora 5' de la presente invención
se puede obtener mediante la digestión con endonucleasa o
exonucleasa de restricción, de un clon genómico de oleosina. Así,
por ejemplo, la secuencia nucleotídica o de aminoácidos conocida de
la región codificadora de un gen de oleosina aislado (por ejemplo la
Figura 7) se alinea con la secuencia de ácido nucleico o de
aminoácidos deducida de un clon genómico de oleosina aislado y la
secuencia flanqueante 5' (es decir, la secuencia aguas arriba del
codón de inicio traduccional de la región codificadora) del clon
genómico de oleosina aislado localizado.
La región reguladora 5' de oleosina tal como se
expone en la SEQ ID NO:12 (nucleótidos 1-1267 de la
Figura 9) se puede generar a partir de un clon genómico que tiene
una o las dos secuencias o secuencias codificadoras flanqueantes 5'
en exceso mediante deleción mediada por exonucleasa III. Esto se
consigue digiriendo con exonucleasa III (exoIII) un ADN
adecuadamente preparado, y separando porciones alícuotas a
intervalos de tiempo crecientes durante la digestión. Se pueden
secuenciar los fragmentos de ADN cada vez más pequeños resultantes a
fin de determinar el punto final exacto de las deleciones. Existen
varios sistemas comercialmente disponibles que emplean exonucleasa
III (exoIII) para crear tales series de deleción, por ejemplo el
sistema "Erase-A-Base" de
Promega Biotech. Como alternativa, se pueden definir cebadores de
PCR que permitan la amplificación directa de las regiones
reguladoras que son objeto de la presente memoria.
Empleando las mismas metodologías, un técnico
con pericia ordinaria puede generar uno o más fragmentos por
deleción de los nucleótidos 1-1267, tal como se
expone en la SEQ ID NO:12.
La identificación de secuencias reguladoras 5'
de oleosina que dirigen la expresión específica en las semillas y
que comprenden los nucleótidos 1-1267 de la SEQ ID
NO:12, y de modificaciones o fragmentos de deleción de las mismas,
se puede conseguir mediante fusiones transcripcionales de secuencias
específicas con las secuencias codificadoras de un gen heterólogo,
transferencia del gen quimérico a un anfitrión apropiado, y
detección de la expresión del gen heterólogo. El ensayo empleado
para detectar la expresión depende de la naturaleza de la secuencia
heteróloga. Por ejemplo, habitualmente se emplean genes
informadores, ilustrados por la
cloranfenicol-acetiltransferasa y la
\beta-glucuronidasa (GUS), para evaluar la
competencia transcripcional y traduccional de constructos
quiméricos. Existen ensayos estándar para detectar de manera
sensible la enzima informadora en un organismo transgénico. El gen
de la \beta-glucuronidasa (GUS) es útil como
informador de la actividad de promotor en vegetales transgénicos
gracias a la elevada estabilidad de la enzima en las células
vegetales, la carencia de actividad intrínseca de
\beta-glucuronidasa en las plantas superiores, y a
la disponibilidad de un ensayo fluorimétrico cuantitativo y de una
técnica de localización histoquímica. Jefferson y otros (1987, EMBO
J 6:3901) han establecido procedimientos estándar para la detección
bioquímica e histoquímica de actividad de GUS en tejidos vegetales.
Los ensayos bioquímicos se llevan a cabo mezclando lisados de tejido
vegetal con
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido,
un sustrato fluorimétrico para GUS, incubando durante una hora a
37ºC, y midiendo después la fluorescencia de la
4-metil-umbeliferona resultante. La
localización histoquímica de la actividad de GUS se determina
incubando muestras de tejido vegetal en
5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucurónido
(X-Gluc) durante unas 18 horas a 37ºC, y observando
el patrón de tinción de X-Gluc. La construcción de
los mencionados genes quiméricos permite definir secuencias
reguladoras específicas y demuestra que estas secuencias pueden
dirigir la expresión de genes heterólogos de una manera específica
respecto a las semillas.
Otro aspecto de la invención se refiere a
cassettes de expresión y vectores de expresión (también denominados
"genes quiméricos" en la presente memoria) que comprenden una
región reguladora 5' de un gen de oleosina que dirige la expresión
específica en las semillas, enlazado operacionalmente a la secuencia
codificadora de un gen heterólogo de manera tal que el elemento
regulador es capaz de controlar la expresión de un ácido nucleico
que codifica un gen heterólogo de
\Delta6-desaturasa. En caso necesario, en los
constructos quiméricos se incluyen elementos reguladores
adicionales o partes de estos elementos suficientes para provocar
una expresión que tenga como resultado la producción de una
cantidad eficaz del polipéptido codificado por el gen heterólogo.
Los ejemplos de genes del metabolismo lipídico incluyen desaturasas
lipídicas tales como \Delta6-desaturasas,
\Delta12-desaturasas,
\Delta15-desaturasas y otras desaturasas afines
tales como estearoil-ACP desaturasas, proteínas
portadoras de acilo (siglas inglesas ACP), tioesterasas,
acetil-transacilasas, acetil-coA
carboxilasas, ketoacil-sintasas,
malonil-transacilasas, y elongasas. Se han aislado y
caracterizado estos genes del metabolismo lipídico a partir de
diversas especies de bacterias y vegetales. En la bibliografía
publicada se describen sus secuencias nucleotídicas codificadoras y
métodos para aislar dichas secuencias codificadoras, que están
ampliamente disponibles para los especialistas en la técnica.
En particular, los genes de
\Delta6-desaturasa descritos en el documento WO
96/21022 y en la solicitud de patente de de EE.UU., presentada por
el mismo solicitante que la presente, y también pendiente, con el
número de serie 08/366,779, presentada el 30 de diciembre de 1994,
son considerados genes del metabolismo lipídico particularmente
útiles en la práctica de la presente invención.
Los genes quiméricos de la presente invención se
construyen ligando una región reguladora 5' de un ADN genómico de
oleosina tal como se expone en la SEQ ID NO:12, a la secuencia
codificadora de un gen heterólogo. La yuxtaposición de estas
secuencias se puede conseguir de varias maneras. En una realización
preferida, el orden de las secuencias, de 5' a 3', es una región
reguladoras 5' de oleosina (que incluye un promotor), una secuencia
codificadora, y una secuencia de terminación que incluye un sitio
de poliadenilación.
Las técnicas estándar para la construcción de
tales genes quiméricos son bien conocidas por los expertos con
pericia ordinaria en la técnica y se pueden encontrar en referencias
tales como Sambrook y otros (1989). Se dispone de toda una variedad
de estrategias para ligar fragmentos de DNA, cuya elección depende
de la naturaleza de los extremos de los fragmentos de DNA. Un
técnico con pericia ordinaria en la técnica reconocerá que, para
que se exprese el gen heterólogo, el constructo requiere elementos
de promotor y señales para una poliadenilación eficaz del
transcripto. Así, se puede ligar directamente la región reguladora
5' que contiene la secuencia promotora de consenso conocida como
"caja" TATA a una secuencia codificadora heteróloga sin
promotor.
Los fragmentos de restricción o de deleción que
contienen la caja TATA de oleosina se ligan con orientación hacia
adelante a un gen heterólogo sin promotor tal como la secuencia
codificadora de la \beta-glucuronidasa (GUS). Un
especialista en la técnica reconocerá que las regiones reguladoras
5' de oleosina que son objeto de la presente solicitud pueden ser
aportadas por otros medios, por ejemplo la síntesis química o
enzimática. El extremo 3' de una secuencia codificadora heteróloga
está opcionalmente ligado a una secuencia de terminación que
comprende un sitio de poliadenilación, ilustrado por, pero sin
quedar limitado a éstos, el sitio de poliadenilación de la
nopalina-sintasa, o el sitio de poliadenilación 7
del gen del T-ADN de la octopina. Como alternativa,
el sitio de poliadenilación puede ser aportado por el gen
heterólogo.
Se describen además métodos para incrementar los
niveles de genes heterólogos en las semillas de la planta. De
acuerdo con dichos métodos, los cassettes de expresión y vectores de
expresión objeto de la presente solicitud se introducen en un
vegetal con el fin de provocar la expresión de un gen heterólogo.
Por ejemplo, se proporciona un método para producir una planta con
niveles incrementados de un producto de un gen de la síntesis de
ácidos grasos o del metabolismo lipídico, mediante la
transformación de una célula vegetal con un vector de expresión que
comprende una región reguladora 5' de oleosina enlazada
operativamente a un gen de la síntesis de ácidos grasos o del
metabolismo lipídico, y la regeneración de una planta con niveles
incrementados del producto de dicho gen de la síntesis de ácidos
grasos o del metabolismo lipídico.
También se describen métodos para reducir los
niveles de un producto de un gen que es nativo de una planta, que
comprenden transformar una célula vegetal con un vector de expresión
que comprende una región reguladora de oleosina enlazada
operativamente a una secuencia de ácido nucleico que es
complementaria con el gen vegetal nativo. Así, se reducen los
niveles de producto endógeno del gen vegetal nativo a través del
mecanismo conocido como regulación antisentido. Así, por ejemplo,
se reducen los niveles de un producto de un gen de la síntesis de
ácidos grasos o del metabolismo lipídico, transformando una planta
con un vector de expresión que comprende una región reguladora 5'
de oleosina objeto de la presente solicitud enlazada operativamente
a una secuencia de ácido nucleico que es complementaria con una
secuencia de ácido nucleico que codifica un gen de la síntesis de
ácidos grasos o del metabolismo lipídico.
La presente invención describe también un método
para co-suprimir un gen que es nativo de una planta,
el cual comprende transformar una célula vegetal con un vector de
expresión que comprende una región reguladora 5' de oleosina objeto
de la presente solicitud, enlazada operativamente a una secuencia de
ácido nucleico que codifica el gen vegetal nativo. Así, se reducen
los niveles de producto endógeno del gen vegetal nativo a través
del mecanismo conocido como co-supresión. Así, por
ejemplo, se reducen los niveles de un producto de un gen de la
síntesis de ácidos grasos o del metabolismo lipídico, transformando
una planta con un vector de expresión que comprende una región
reguladora 5' de oleosina objeto de la presente solicitud enlazada
operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un
gen de la síntesis de ácidos grasos o del metabolismo lipídico
nativo de la planta. Aunque el mecanismo exacto de la
co-supresión no se entiende por completo, un
especialista en la técnica estará familiarizado con trabajos
publicados que informan de las condiciones experimentales y los
resultados asociados con la co-supresión (Napoli y
otros, 1990, The Plant Cell 2:270-289; Van
der Krol, 1990, The Plant Cell
2:291-299.
Para proporcionar una expresión regulada de los
genes heterólogos, se transforman plantas con las construcciones de
gen quimérico de la invención. Los métodos de transferencia génica
son bien conocidos en la técnica. Se pueden introducir los genes
quiméricos en plantas mediante el procedimiento de
transformación-regeneración del disco foliar según
han descrito Horsch y otros, 1985, Science 227:1229. También
se pueden emplear, y están dentro del alcance de la invención,
otros métodos de transformación tales como el cultivo de
protoplastos (Horsch y otros, 1984, Science 223:496, DeBlock
y otros, 1984, EMBO J. 2:2143, Barton y otros, 1983, Cell
32:1033). En una realización preferida, se transforman plantas
con vectores derivados de Agrobacterium, tales como los
descritos por Klett y otros (1987) Annu. Rev. Plant Physiol.
38:467. Están disponibles otros métodos bien conocidos para
insertar los genes quiméricos de la presente invención en células
vegetales. Tales métodos alternativos incluyen los enfoques
biolísticos (Klein y otros, 1987, Nature 327, 70),
electroporación, absorción del DNA inducida químicamente, y uso de
virus o polen como vectores.
Cuando sea necesario para el método de
transformación, los genes quiméricos de la presente invención se
pueden insertar en un vector de transformación vegetal, por ejemplo
el vector binario descrito por Bevan, M., 1984, Nucleic Acids
Res. 12, 8711-8721. Se pueden obtener derivados
de vectores de transformación vegetales modificando el sistema
natural de transferencia de genes de Agrobacterium
tumefaciens. El sistema natural comprende plásmidos Ti
(inductores de tumores) de gran tamaño que contienen un gran
segmento, conocido como T-ADN, que se transfiere a
las plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región
vir, es responsable de la transferencia del
T-DNA. La región del T-DNA está
flanqueada por repeticiones terminales. En los vectores binarios
modificados, se han eliminado los genes inductores de tumores y se
utilizan las funciones de la región vir para transferir ADN
exógeno flanqueado por las secuencias flanqueantes del
T-ADN. La región T contiene también un marcador que
permite la selección por resistencia a antibióticos, y un sitio
múltiple de clonación para insertar secuencias para ser
transferidas. Tales cepas modificadas por ingeniería genética se
conocen como cepas "desarmadas" de A. tumefaciens, y
permiten la transferencia eficaz de secuencias flanqueadas por la
región T hacia el genoma nuclear de las
plantas.
plantas.
Se inoculan discos foliares esterilizados
superficialmente, y otros tejidos susceptibles, con A.
tumefaciens que contiene el ADN extraño "desarmado", se
cultivan durante varios días, y después se transfieren a medio que
contiene antibióticos. Luego se seleccionan los brotes
transformados, una vez que han echado raíces en un medio que
contiene el antibiótico apropiado, y se trasfieren al suelo. Se
polinizan las plantas transgénicas, y se recogen semillas de estas
plantas y se hacen crecer en medio antibiótico.
Se puede seguir la expresión de un gen
heterólogo o informador en semillas en desarrollo, plántulas jóvenes
y plantas maduras, mediante ensayos inmunológicos, histoquímicos o
de actividad. Tal como se ha descrito en la presente memoria, la
elección de un ensayo para la expresión del gen quimérico depende de
la naturaleza de la región codificadora heteróloga. Por ejemplo, se
puede emplear el análisis tipo Northern para evaluar la
transcripción si se dispone de sondas nucleotídicas apropiadas. Si
se dispone de anticuerpos contra el polipéptido codificado por el
gen heterólogo, se pueden emplear el análisis tipo Western y la
localización inmunohistoquímica para evaluar la producción y
localización del polipéptido. En función del gen heterólogo, se
pueden emplear ensayos bioquímicos apropiados. Por ejemplo, las
acetiltransferasas se detectan midiendo la acetilación de un
sustrato estándar. Se puede determinar la expresión de un gen de
desaturasa lipídica mediante el análisis de los ésteres metílicos
de ácidos grasos (FAMES).
Otro aspecto de la presente invención
proporciona plantas transgénicas o una progenie de estas plantas que
contienen los genes quiméricos de la invención. Se contemplan tanto
plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se transforman
células vegetales con los genes quiméricos mediante cualquiera de
los métodos de transformación vegetal antes descritos. La célula
vegetal transformada, usualmente en forma de un cultivo de callo,
disco foliar, explante o planta completa (por medio del método de
infiltración a vacío de Bechtold y otros, 1993, C.R. Acad. Sci.
Paris, 316:1194-1199) se regenera para dar una
planta transgénica completa mediante métodos bien conocidos para un
especialista en la técnica (por ejemplo Horsch y otros, 1985,
Science 227:1129). En una realización preferida, la planta
transgénica es girasol, algodón, colza, maíz, tabaco,
Arabidopsis, cacahuete o soja. Puesto que la progenie de las
plantas transformadas hereda los genes quiméricos, se utilizan
semillas o esquejes de plantas transformadas para mantener la línea
transgénica.
Los siguientes ejemplos ilustran de forma
adicional la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se aislaron polisomas unidos a membrana a partir
de semillas de borraja 12 días después de la polinización (12 dpp)
empleando el protocolo establecido para guisantes por Larkins y
Davies (1975, Plant Phys. 55: 749-756). Se
extrajo ARN de los polisomas de la manera descrita por Mechler
(1987, Methods in Enzymology 152:241-248,
Academic Press). Se aisló ARN Poli-A^{+} del ARN
polisómico unido a membrana, mediante el empleo de perlas
Oligotex-dT (R) (Qiagen).
\newpage
Se preparó el correspondiente cADN usando el kit
de síntesis de cADN ZAP, de Stratagene. La biblioteca de cADN se
construyó en el vector lambda ZAP II (Stratagene) usando el kit
lambda ZAP II. La biblioteca principal se empaquetó con extracto de
empaquetamiento Gigapack II Gold (Stratagene).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La biblioteca de cADN de borraja amplificado se
traspasó a placas con baja densidad (500 pfu en placas de Petri de
150 mm). Se redujeron (se sustrajeron de los cADNs totales) cADNs de
proteínas de almacenamiento en semillas altamente predominantes
mediante escrutinio con los cADNs correspondientes.
Se generaron sondas de hibridación para cribar
la biblioteca de cADN de borraja mediante el uso de síntesis de ADN
aleatoriamente cebado, tal como ha sido descrito por Ausubel y otros
(1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience, N.Y.) y correspondieron con cADNs de proteínas de
almacenamiento en semillas, expresadas abundantemente y previamente
identificadas. Los nucleótidos no incorporados se retiraron
mediante el uso de una columna de centrifugado G-50
(Boehringer Manheim). La sonda se desnaturalizó para la hibridación
por ebullición en un baño de agua durante 5 minutos, después se
enfrió rápidamente en hielo. Se pre-hibridaron
filtros de nitrocelulosa que portaban bacteriófago recombinante
fijado, a 60ºC y durante 2-4 horas en disolución de
hibridización [4X SET (NaCl 600 mM, Tris-HCl 80 mM,
Na_{2}EDTA 4 mM; pH 7,8), 5X reactivo de Denhardt (albúmina
sérica de bovino al 0,1%, Ficoll al 0,1%, y polivinilpirrolidona al
0,1%), ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml,
poliadenina 50 \mug/ml, y policitidina 10 ug/ml]. Se reemplazó
todo ello con disolución de hibridización fresca a la cual se había
añadido sonda radiactiva desnaturalizada (disolución de
hibridización 2 ng/ml). Se incubaron los filtros a 60ºC, con
agitación, durante una noche. Se lavaron secuencialmente los
filtros en 4X, 2X, y 1X SET (NaCl 150 mM, Tris-HCl
20 mM, Na_{2}EDTA 1 mM; pH 7,8) durante 15 minutos cada vez, a
60ºC. Se dejaron secar al aire los filtros y se expusieron después
a película de rayos X durante 24 horas con pantallas
intensificadoras,
a -80ºC.
a -80ºC.
Se escindieron las placas no hibridantes usando
el protocolo y reactivos de escisión de Stratagene. Se usaron las
colonias bacterianas resultantes para inocular cultivos líquidos y
se secuenciaron bien manualmente o bien mediante un secuenciador
automatizado ABI.
Se secuenció una vez cada uno de los cADN
correspondientes a una placa no hibridante, y se generó una etiqueta
de secuencia generada a partir de 200-300 pares de
bases. Toda la secuenciación se realizó mediante secuenciación en
ciclos (Epicentre). Se generaron más de 300 etiquetas de secuencia
expresada (siglas inglesas ESTs). Se comparó cada una de las
etiquetas de secuencia con la base de datos GenBank empleando el
algoritmo BLAST (Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol.
215:403-410). Se identificaron varios genes del
metabolismo lipídico, entre ellos el de la
\Delta6-desaturasa.
Las búsquedas en base de datos con el clon de
cADN denominado mbp-65, utilizando BLASTX con la
base de datos GenBank, dieron como resultado una coincidencia
significativa con la \Delta6-desaturasa de
Synechocystis ya aislada. Se determinó, sin embargo, que
mbp-65 no era un cADN de longitud completa. Se aisló
un cADN de longitud completa usando el mbp-65 para
escrutar la biblioteca polisómica unida a membrana, de borraja. Se
denominó pAN1 al clon resultante, y se determinó la secuencia del
inserto de cADN de pAN1 mediante el método de secuenciación
cíclica. Se comparó la secuencia de aminoácidos deducida del marco
de lectura abierta (Fig. 1, SEQ ID NO:1) con otras desaturasas
conocidas, empleando el programa de alineación de proteínas
Geneworks (IntelligGenetics). Esta alineación indicó que el inserto
de cADN de pAN1 era el gen de \Delta6-desaturasa
de borraja.
El dendrograma resultante (Figura 2) muestra que
las \Delta^{15}-desaturasas y las
\Delta^{12}-desaturasas comprenden dos grupos.
La secuencia de borraja ahora aislada y la
\Delta^{6}-desaturasa de Synechocystis
aislada con anterioridad (patente de EE.UU. número 5,552,306)
formaban un tercer grupo distinto. Una comparación de los motivos
de aminoácidos comunes a las desaturasas y de los que se cree que
están implicados catalíticamente en la fijación a metal, ilustra la
similitud global de la proteína codificada por el gen de borraja con
respecto a las desaturasas en general y con respecto a la
\Delta^{6}-desaturasa de Synechocystis en
particular (Tabla 1). Al mismo tiempo, la comparación de los
motivos en la Tabla 1 indica diferencias definidas entre esta
proteína y otras desaturasas vegetales. Además, la secuencia de
borraja se distingue también de desaturasas de ácido graso
asociadas a membrana vegetales conocidas, por la presencia de un
motivo de fijación a heme conservado en proteínas de citocromo
b_{5} (Schmidt y otros, 1994, Plant Mol. Biol.
26:631-642) (Figura 1). Así, aunque estos
resultados sugieren claramente que el cADN aislado era un gen de
\Delta^{6}-desaturasa de borraja, se necesitaba
confirmación adicional. Para confirmar la identidad del cADN de
\Delta6-desaturasa de borraja, se clonó el
inserto de cADN de pAN1 en un cassette de expresión para conseguir
una expresión estable. Se preparó el vector pBI121 (Jefferson y
otros, 1987, EMBO J. 6:3901-3907) para
ligación por digestión con BamHI y EcoICR I (un isoesquizómero de
SacI que deja extremos "romos"; disponible de Promega) que
escinde la región codificadora de GUS dejando intactos el promotor
35S y el terminador NOS. El cADN de la
\Delta^{6}-desaturasa de borraja fue escindido
del plásmido recombinante (pAN1) por digestión con BamHI y XhoI. El
extremo XhoI se hizo romo llevando a cabo una reacción de relleno
catalizada por el fragmento de Klenow de la
ADN-polimerasa I. Después se clonó este fragmento
en los sitios BamHI/EcoICR I de pBI121.1, dando como resultado el
plásmido
pAN2.
pAN2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se empleó el plásmido de expresión pAN2 para
transformar tabaco (Nicotiana tabacum cv. xanthi)
mediante Agrobacterium tumefaciens según procedimientos
habituales (Horsch y otros, 1985, Science
227:1229-1231; Bogue y otros, 1990, Mol. Gen
Genet. 221:49-57), con la diferencia de que los
transformantes iniciales se seleccionaron sobre kanamicina 100
ug/ml.
Se congeló en nitrógeno líquido tejido
procedente de plantas transgénicas, y se liofilizó durante una
noche. Se prepararon FAMEs de la manera descrita por Dahmer y otros
(1989) J. Amer. Oil. Chem. Soc. 66: 543-548.
En algunos casos, el disolvente se evaporó de nuevo, y los EMAGs se
resuspendieron en acetato de etilo y se extrajeron una vez con agua
desionizada para retirar cualquier contaminante soluble en agua. Se
analizaron los FAMEs empleando un cromatógrafo
gas-líquido Tracor-560 tal como se
ha descrito con anterioridad (Reddy y otros, 1996, Nature
Biotech. 14:639-642).
Tal como muestra la Figura 3, las hojas de
tabaco transgénico que contienen el cADN de borraja produjeron
tanto GLA como ácido octadecatetraenoico (OTA) (18:4
\Delta6,9,12,15). Por tanto, estos resultados demuestran que el
cADN aislado codifica una \Delta6-desaturasa de
borraja.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se estudió la expresión nativa de
\Delta6-desaturasa mediante análisis tipo Northern
sobre ARN derivado de tejidos de borraja. Se aisló ARN de embriones
de borraja en desarrollo, siguiendo el método de Chang y otros,
1993, Plant Mol. Biol. Rep. 11:113-116. Se
separó electroforéticamente el ARN sobre geles de
formaldehído-agarosa, se transfirió a membranas de
nylon mediante transferencia capilar, y se inmovilizó por
calentamiento a 80ºC durante 30 minutos, siguiendo protocolos
estándar (Brown T., 1996, en Current Protocols in Molecular
Biology, compilado por Auselbel y otros [Greene Publishing y
Wiley-Interscience, Nueva York] páginas
4.9.1-4.9.14.). Se preincubaron los filtros a 42ºC
en una disolución que contenía 50% de formamida desionizada, 5X
reactivo de Denhardt, 5X SSPE (NaCl 900 mM; fosfato sódico 5,0 mM,
pH 7,7; y EDTA 5 mM), SDS al 0,1%, y ADN de esperma de salmón
desnaturalizado, a 200 \mug/ml. Al cabo de dos horas se añadieron
los filtros a una disolución fresca con la misma composición,
añadiendo sonda de hibridación radiactiva desnaturalizada. En este
caso, las sondas utilizadas fueron cADN de legumina de borraja
(Figura 16A), cADN de oleosina de borraja (Fig. 16B), y cADN de
\Delta6-desaturasa de borraja (pAN1, Ejemplo 2)
(Figura 16C). Los cADNs de legumina y de oleosina de borraja fueron
aislados mediante clonación EST y se identificaron por comparación
con la base de datos GenBank empleando el algoritmo BLAST tal como
se ha descrito en el Ejemplo 2. La variación en la carga se
corrigió por normalización a los niveles de mARN de EF1\alpha de
borraja. Se identificó el mARN de EF1\alpha correlacionándolo con
el correspondiente cADN obtenido mediante el análisis EST descrito
en el Ejemplo 2. Se hibridaron los filtros a 42ºC durante
12-20 horas, y después se lavaron de la manera que
se ha descrito antes (salvo que la temperatura era 65ºC), se
secaron al aire, y se expusieron a película de rayos X.
Tal como se muestra en las Figuras 15A y 15B, la
\Delta6-desaturasa se expresa principalmente en la
semilla de borraja. Las semillas de borraja alcanzan la maduración
entre 18 y 20 días después de la polinización (dpp). La expresión
del mARN de \Delta6-desaturasa se produce en todos
los puntos temporales recogidos (8-20 dpp), pero
parece máxima a los 10-16 días después de la
polinización. Este perfil de expresión es similar al observado para
mARNs de oleosina de borraja y de proteína 12S de almacenamiento en
semilla (Figuras 16A, 16B, y 16C).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se aisló el cADN de oleosina (AtS21) mediante
escrutinio por sustracción virtual de una biblioteca de cADN de
semillas en desarrollo de Arabidopsis, empleando una sonda de
cADN para reacción en cadena de la polimerasa aleatoriamente cebada
(RP-PCR), derivada de tejido radicular.
Se cultivaron plantas de Arabidopsis
thaliana Landsberg erecta bajo iluminación continua en
una mezcla de vermiculita y suelo, a temperatura ambiente (22ºC).
Se diseccionaron silicuas 2-5 días después de la
floración, para recoger por separado semillas en desarrollo y
vainas de silicua. También se recogieron inflorescencias que
contenían capullos de flores iniciales y flores totalmente abiertas,
hojas, y silicuas enteras, de uno a tres días después de la
floración. Se obtuvieron raíces de plántulas que habían sido
cultivadas en medio líquido Gamborg B_{5} (GIBCO BRL) durante dos
semanas. Las semillas para el cultivo radicular fueron previamente
esterilizadas con lejía al 50% durante cinco minutos, y se
enjuagaron abundantemente con agua. Se congelaron en nitrógeno
líquido todos los tejidos, y se conservaron a -80ºC hasta su uso. Se
aislaron los ARNs totales siguiendo un protocolo de extracción con
fenol caliente/SDS y precipitación con LiCl (Harris y otros, 1978,
Biochem. 17:3251-3256; Galau y otros, 1981,
J. Biol. Chem. 256:2551-2560). Se aisló ARN
poli A+ utilizando cromatografía en columna oligo dT según los
protocolos del fabricante (PHARMACIA o STRATAGENE) o bien empleando
partículas de látex oligotex-dT (QIAGEN).
Se construyeron bibliotecas de cADN de flor,
silicua de un día, silicua de tres días, hoja, raíz, y semilla en
desarrollo, cada una a partir de 5 \mug de poli A+ RN, utilizando
el kit ZAP de síntesis de cADN (Stratagene). Se clonaron
direccionalmente cADNs en los sitios EcoRI y XhoI de pBluescript
SK(-) en el vector \lambda-ZAPII (Short y otros,
1988, Nucleic Acids Res. 16:7583-7600). Se
identificaron placas con fago no recombinante por el desarrollo de
color azul en placas NZY que contenían X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido)
e IPTG
(isopropil-1-tio-\beta-D-galacto-piranósido).
Los valores no recombinantes de línea de base para las bibliotecas
de cADN de flor, silicua de un día, silicua de tres días, hoja,
raíz, y semilla en desarrollo fueron 2,8%, 2%, 3,3%, 6,5%, 2,5% y
1,9%, respectivamente.
Se escindieron los insertos de cADN de clones
aislados (cADNs sin hibridar) mediante doble digestión con
EcoRI/XhoI, y se purificaron en gel para el marcado para cebado
aleatorio. La mezcla de reacción de Klenow contenía 50 ng de
plantillas de ADN, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 5 mM, DTT 7,5 mM, dCTP, dGTP, y dTTP, cada uno de ellos
50 \muM, cebadores aleatorios de hexámero (Boehringer Mannheim) 10
\muM, 50 \muCi de \alpha-32
P-dATP, 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml (DuPont), y 5
unidades de fragmento de Klenow de ADN-polimerasa I
(New England Biolabs). Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC
durante una hora. Para la precipitación con TCA y el análisis en
gel desnaturalizante alcalino se emplearon alícuotas de mezclas de
reacción diluidas. Las sondas de hibridación fueron marcadas sólo
con ADN-polimerasa de Klenow, y los dNTPs no
incorporados se eliminaron empleando columnas de centrifugado
Sephadex R G-50 (Boehringer Mannheim).
Se sintetizó cADN de doble cadena a partir de
ARN poli A+ aislado de tejido radicular de Arabidopsis,
empleando el sistema de síntesis de cADN (GIBCO BRL) con oligo
dT12-18 como cebadores. Los cADNs más largos de 300
pares de bases fueron enriquecidos mediante cromatografía en columna
Sephacril S-400 (Stratagene). Los cADNs
fraccionados fueron empleados como plantillas para el marcado de
RP-PCR. La reacción contenía
Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, KCl 50 mM, Triton
X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2 mM, 5 unidades de
Taq ADN-polimerasa (PROMEGA), dCTP, cGTP y
dTTP, y diferentes concentraciones de cebadores aleatorios de
hexámero \alpha-32P dATP, 800 mCi/mmol, 10 mCi/ml
(DuPont), y dATP frío, en un volumen final de 25 \mul. Después de
unos 5 minutos iniciales a 95ºC, se llevaron a cabo diversas
reacciones a través de diferentes programas con el fin de optimizar
los condiciones de RP-PCR cADN. Salvo que se
indique otra cosa, se empleó el siguiente programa para la mayoría
de los marcados de sonda RP-PCR cADN: 95ºC/5
minutos, después 40 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 18ºC/1
segundo, rampa hasta 30ºC a un ritmo de 0,1ºC/segundo, 72ºC/1
minuto. Los productos de RP-PCR fueron extraídos
con fenol/cloroformo y se precipitaron con etanol, o bien se
purificaron haciéndolos pasar a través de columnas de centrifugado
Sephadex G-50 (Boehringer Mannheim).
La escisión masiva de bibliotecas de cADN
\lambda-ZAP se llevó a cabo
co-infectando células anfitrionas
XL1-Blue MRF' con fago recombinante procedente de
las bibliotecas y fago auxiliar ExAssist (STRATAGENE). Los
fagémidos escindidos fueron rescatados mediante células SOLR. Se
prepararon ADNs de plásmido mediante el método
mini-preparativo en ebullición (Holmes y otros,
1981, Anal. Biochem. 114:193-197) a partir de
clones aislados al azar. Los insertos de cADN fueron escindidos
mediante doble digestión con EcoRI y XhoI, y se resolvieron sobre
geles de agarosa al 1%. Se desnaturalizaron los ADNs en NaOH 0,5 N y
NaCl 1,5 M durante 45 minutos, se neutralizaron en
Tris-HCl 0,5 M, pH 8,0, y NaCl 1,5 M durante 45
minutos, y después se trasladaron por transferencia a membranas de
nylon (Micron Separations, Inc.) en 10X SSC durante una noche.
Después de prehibridar durante una hora a 65ºC, se añadió sonda
RP-cADN de raíz al mismo tampón de hibridación que
contenía fracción V de albúmina bovina (Sigma) al 1%, EDTA 1 mM,
NaHPO4 0,5 M, pH 7,2, SDS al 7%. Se continuó la hibridación
durante 24 horas a 65ºC. Se lavaron los filtros en albúmina bovina
al 0,5%, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM, pH 7,2, SDS al 5% durante diez
minutos a temperatura ambiente, y 3 x 10 minutos en EDTA 1 mM,
NaHPO4 40 mM, pH 7,2, SDS al 1%, a 65ºC. Se expusieron las
autorradiografías a películas de rayos X (Kodak) durante un período
de dos a cinco días a -80ºC.
La hibridación de las transferencias resultantes
con sondas de RP-PCR de raíz "substrajo
virtualmente" cADNs de semilla compartidos con la población de
mARN de raíz. Los restantes cADNs de semilla, que representaban
cADNs específicos de semilla, putativos, entre ellos los que
codifican oleosinas, fueron secuenciados por el método de
secuenciación cíclica, identificando así a AtS21 como un clon de de
cADN de oleosina.
El cADN de oleosina tiene una longitud de 834
pares de bases, e incluye una cola de poli-A con una
longitud de 18 pares de bases (Fig. 4, SEQ ID NO:2). Tiene una
elevada homología con otros genes de oleosina de Arabidopsis,
así como de otras especies. Recientemente se ha informado de un gen
de oleosina idéntico (Zou y otros, 1996, Plant Mol. Biol.
31:429-433). La proteína predicha tiene 191
aminoácidos de longitud, con un dominio medio altamente hidrófobo
flanqueado por un dominio hidrófilo a cada lado. La existencia de
dos codones de parada "en el marco" aguas arriba, y la
similitud con otros genes de oleosina, indican que este cADN es de
longitud completa. Puesto que hay dos codones de parada "en el
marco" justo aguas arriba del primer ATG, se considera que este
cADN es un cADN de longitud completa (Figura 4, SEQ ID NO:2). La
proteína predicha posee tres dominios característicos, basándose en
la distribución de sus restos de aminoácidos. Tanto el dominio
N-terminal como el C-terminal son
ricos en restos cargados, mientras que el dominio central es
absolutamente hidrófobo (Figura 5). En el dominio central se sitúan
unos 20 restos de leucina, y están dispuestos en forma de
repeticiones, apareciendo una leucina cada 7-10
restos. En el dominio central se acumulan también otros restos de
aminoácidos no polares, haciendo a este dominio absolutamente
hidrófobo (Figura 6).
Exhaustivas búsquedas en diferentes bases de
datos, empleando tanto el cADN de AtS21 como su secuencia proteica
predicha, han identificado oleosinas de zanahoria, maíz, algodón,
colza, Arabidopsis, y otras especies vegetales. La homología
se restringe principalmente al dominio hidrófobo central. Se
encontraron siete secuencias de oleosina de Arabidopsis.
AtS21 representa el mismo gen que Z54164, que posee algunas bases
más en la región sin traducir 5'. Se alinearon una con otra las
siete secuencias de oleosina de Arabidopsis disponibles
hasta la fecha (Figura 7). El resultado sugería que las siete
secuencias se clasifican en tres grupos. El primer grupo incluye
AtS21 (SEQ ID NO:5), X91918 (SEQ ID NO:6), y la secuencia parcial
Z29859 (SEQ ID NO:7). Como X91918 (SEQ ID NO:6) tiene sólo el
último resto distinto de AtS21 (SEQ ID NO:5), y Z29859 (SEQ ID NO:7)
tiene sólo tres restos aminoacídicos distintos de AtS21 (SEQ ID
NO:5), probablemente las tres secuencias representen el mismo gen.
Las dos secuencias del segundo grupo, X62352 (SEQ ID NO:8) y Ato13
(SEQ ID NO:9), son distintas tanto en secuencia como en longitud.
Por tanto, no hay duda de que representan dos genes independientes.
Al igual que en el primer grupo, las dos secuencias del tercer
grupo, X91956 (SEQ ID NO:10) y L40954 (SEQ ID NO:11), tienen
también sólo tres restos divergentes, que pueden deberse a errores
de secuencia. Por tanto, X91956 (SEQ ID NO:10) y L40954 (SEQ ID
NO:11) representan probablemente el mismo gen. Contrariamente a las
demás secuencias de secuencias de oleosina, que han sido predichas a
partir de secuencias de cADN, la X62352 (SEQ ID NO:8) se ha
deducido de una secuencia genómica (Van Rooigen y otros, 1992,
Plant Mol. Biol. 18:1177-1179). En
conclusión, hasta el momento se han identificado cuatro genes
distintos de oleosina de Arabidopsis, y están conservados
sólo en la parte central del dominio hidrófobo.
Para caracterizar el patrón de expresión del gen
AtS21 nativo, se llevó a cabo un análisis tipo Northern tal como se
ha descrito en el Ejemplo 4, salvo por el hecho de que la sonda era
el cADN de AtS21 (inserto pAN1) marcado con
^{32}P-dATP a una actividad específica de 5 x
10^{8} cpm/\mug.
Los resultados indicaron que el gen AtS21 está
expresado con intensidad en las semillas en desarrollo y débilmente
expresado en vainas de silicua (Figura 8A). También se detectó en el
ARN de semillas en desarrollo un transcripto de tamaño mucho mayor,
que podría representar pre-mARN de AtS21 sin
procesar. No se detectó AtS21 en los ARN de flor, hoja, raíz
(Figura 8A), o silicuas de un día. Un análisis tipo Northern
diferente reveló que AtS21 está también expresado con intensidad en
semillas en germinación embebidas (Figuras 13A y 13B)
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Ejemplo
6
Se aislaron clones genómicos mediante el
escrutinio de una biblioteca de ADN genómico de Arabidopsis
empleando como sonda el cADN de longitud completa (AtS21). Mediante
digestión con enzimas de restricción, seguida de hibridación
Southern, empleando como sonda la mitad 5' del cADN escindido por
SacI, se mapearon dos clones genómicos. Se subclonó y se secuenció
un fragmento Sacl de 2 kb (Fig. 9, SEQ ID NO:35). Dos regiones del
clon genómico son idénticas a la secuencia de cADN. Un intrón de
395 pares de bases separa las dos regiones.
El número de copias del gen AtS21 en el genoma
de Arabidopsis se determinó mediante hibridación tipo
Southern con ADN genómico, seguida de digestión con las enzimas
BamHI, EcoRI, HindIII, SacI y XbaI, empleando como sonda el cADN de
longitud completa (Figura 8B). Se detectó una única banda en todas
las pistas, salvo en la de la digestión con SacI, en la que se
detectaron dos bandas. Al tener la sonda de cADN un sitio SacI
interno, estos resultados indicaron que AtS21 es un gen de copia
única en el genoma de Arabidopsis. Puesto que se sabe que el
genoma de Arabidopsis contiene isoformas diferentes de genes de
oleosina, este análisis tipo Southern demuestra también que las
diferentes isoformas de oleosina de Arabidopsis son
divergentes al nivel de secuencia de ADN.
Dos regiones del fragmento de ADN genómico,
separadas por un intrón de 395 pares de bases son idénticas a la
secuencia de cADN de AtS21. Las búsquedas en bases de datos
empleando la secuencia del promotor 5' aguas arriba de la secuencia
de cADN de AtS21 no identificaron ninguna secuencia con homología
significativa. Además, la comparación de la secuencia de promotor
AtS21 con otros promotores de oleosina de Arabidopsis
aislados con anterioridad (Van Rooijen y otros, 1992) reveló una
escasa similitud. La secuencia del promotor AtS21 es rica en bases
A/T, y contiene la cantidad de 44 repeticiones directas, en el
intervalo de 10 pares de bases a 14 pares de bases, estando
permitida una sola discrepancia. En la Figura 9 se han subrayado dos
repeticiones directas, de 14 pares de bases, y un elemento de
respuesta a ABA (siglas inglesas de ácido abscísico) putativo.
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Ejemplo
7
Se amplificó mediante el empleo de PCR el
fragmento promotor de 1267 pares de bases, empezando desde la
primera G aguas arriba del codón ATG del fragmento de ADN genómico,
y se fusionó al gen informador GUS para analizar su actividad. El
fragmento promotor del clon genómico AtS21 se amplificó mediante PCR
empleando el cebador T7: GTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO:13) y el
cebador 21P:GGGGATCCTATACTAAAACTATAGAG
TAAAGG (SEQ ID NO:14) complementario para la región 5' sin traducir aguas arriba del primer codón ATG (Figura 9). Mediante el cebador 21p se introdujo un sitio de clonación BamHI. El fragmento amplificado se clonó en los sitios BamHI y SacI de pBluescript KS (Stratagene). Se secuenciaron los clones individuales con el fin de verificar posibles mutaciones de PCR, así como la orientación de sus insertos. Se digirió con BamHI y HindIII el clon correcto, y se clonó el fragmento de promotor (1,3 kb) en los sitios correspondientes de pBI101.1 (Jefferson, R.A., 1987a, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405; Jefferson y otros, 1987b, EMBO J. 6:3901-3907) aguas arriba del gen GUS. Se denominó pAN5 (Fig. 10) al plásmido resultante. Se introdujo el constructo "promotor AtS21/GUS" (pAN5) tanto en tabaco (por el método de disco de hoja, Horsch y otros, 1985; Bogue y otros, 1990, Mol. Gen. Gen. 221:49-57) y Arabidopsis ecotipo Colombia, mediante infiltración por vacío tal como ha sido descrita por Bechtold y otros (1993), C.R. Acad. Sci. Paris, 316:1194-1199. Se esterilizaron y se seleccionaron en medios que contenían kanamicina 50 \mug/ml y carbenicilina 500 \mug/ml. Ensayo de actividad de GUS: Los patrones de expresión del gen informador GUS se revelaron mediante tinción histoquímica (Jefferson y otros, 1987a, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405). Se tiñeron distintos tejidos en solución de sustrato que contenía ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico (X-Gluc) (Research Organics, Inc.) 2 mg/ml, ferrocianuro potásico 0,5 mM, y ferricianuro potásico 0,5 mM, en tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, a 37ºC durante una noche, y después se deshidrataron sucesivamente en etanol al 20%, 40% y 80% (Jefferson y otros, 1987). Se tomaron fotografías con un microscopio compuesto Axiophot (Zeiss) o un microscopio de disección Olympus SZH10. Los negativos se convirtieron a imágenes digitales utilizando un escáner de negativos Spring/Scan 35LE (Polaroid) y se compilaron mediante Adobe Photoshop^{TM} 3.0.5 y Canvas^{TM} 3.5.
TAAAGG (SEQ ID NO:14) complementario para la región 5' sin traducir aguas arriba del primer codón ATG (Figura 9). Mediante el cebador 21p se introdujo un sitio de clonación BamHI. El fragmento amplificado se clonó en los sitios BamHI y SacI de pBluescript KS (Stratagene). Se secuenciaron los clones individuales con el fin de verificar posibles mutaciones de PCR, así como la orientación de sus insertos. Se digirió con BamHI y HindIII el clon correcto, y se clonó el fragmento de promotor (1,3 kb) en los sitios correspondientes de pBI101.1 (Jefferson, R.A., 1987a, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405; Jefferson y otros, 1987b, EMBO J. 6:3901-3907) aguas arriba del gen GUS. Se denominó pAN5 (Fig. 10) al plásmido resultante. Se introdujo el constructo "promotor AtS21/GUS" (pAN5) tanto en tabaco (por el método de disco de hoja, Horsch y otros, 1985; Bogue y otros, 1990, Mol. Gen. Gen. 221:49-57) y Arabidopsis ecotipo Colombia, mediante infiltración por vacío tal como ha sido descrita por Bechtold y otros (1993), C.R. Acad. Sci. Paris, 316:1194-1199. Se esterilizaron y se seleccionaron en medios que contenían kanamicina 50 \mug/ml y carbenicilina 500 \mug/ml. Ensayo de actividad de GUS: Los patrones de expresión del gen informador GUS se revelaron mediante tinción histoquímica (Jefferson y otros, 1987a, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405). Se tiñeron distintos tejidos en solución de sustrato que contenía ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico (X-Gluc) (Research Organics, Inc.) 2 mg/ml, ferrocianuro potásico 0,5 mM, y ferricianuro potásico 0,5 mM, en tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, a 37ºC durante una noche, y después se deshidrataron sucesivamente en etanol al 20%, 40% y 80% (Jefferson y otros, 1987). Se tomaron fotografías con un microscopio compuesto Axiophot (Zeiss) o un microscopio de disección Olympus SZH10. Los negativos se convirtieron a imágenes digitales utilizando un escáner de negativos Spring/Scan 35LE (Polaroid) y se compilaron mediante Adobe Photoshop^{TM} 3.0.5 y Canvas^{TM} 3.5.
Las actividades de GUS se midieron
cuantitativamente por fluorometría, utilizando 4-MUG
(4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido)
2 mM como sustrato (Jefferson y otros, 1987). Se clasificaron las
semillas de Arabidopsis en desarrollo en función de sus
colores, y se obtuvieron los demás tejidos vegetales y se
conservaron a -80ºC hasta el momento del uso. Los tejidos vegetales
fueron triturados en tampón de extracción que contenía fosfato
sódico 50 mM, pH 7,0, EDTA 10 mM,
\beta-mercaptoetanol 10 mM, Triton
X-100 al 0,1%, y laurilsarcosinato sódico al 0,1%.
Los desechos de los tejidos fueron eliminados centrifugando durante
5 minutos en una microcentrífuga Microfuge. Se dividió en alícuotas
el sobrenadante, se mezcló con sustrato, y se incubó a 37ºC durante
1 hora. Se analizaron tres réplicas de cada muestra. La reacción se
detuvo mediante la adición de 4 volúmenes de carbonato sódico 0,2
M. Se leyó la fluorescencia con un fluorómetro de ADN
TKO-100 Fluorometer (Hoefer Scientific Instruments).
Las concentraciones de proteína de los extractos se determinaron
por el método de Bradford (Bio Rad).
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En Arabidopsis, se detectó actividad de
GUS en semillas verdes y en regiones de los nodos donde las
silicuas, las hojas caulinas y las ramas se unen al tallo de la
inflorescencia (Figuras 11A y 11B). No se detectó actividad de GUS
en ninguna hoja, raíz, flor, vaina de silicua, o en las regiones
internodales del tallo de la inflorescencia. Estudios detallados de
la expresión de GUS en semillas en desarrollo revelaron que el
promotor AtS21 era activo únicamente en semillas verdes en las
cuales los embriones ya se habían desarrollado más allá del estadio
de corazón (Figuras 11C y 11G). Los embriones más jóvenes que
mostraban actividad de GUS detectable mediante tinción histoquímica
se encontraban en el estadio de torpedo temprano. Curiosamente, la
tinción se limitó únicamente a la parte inferior del embrión,
incluyendo el hipocótilo y el radical embriónico. No se detectó
tinción en los cotiledones jóvenes (Figuras 11D y 11E). Los
cotiledones empezaban a teñirse cuando los embriones se encontraban
en el estadio de torpedo tardío o incluso de cotiledón temprano
(Figuras 11F y 11H). Después se teñía el embrión completo, y la
tinción se hacía más intensa a medida que los embriones maduraban
(Figuras 11I y 11J). Se observó también que la expresión del gen
GUS estaba restringida a los embriones. La cubierta de la semilla y
el endospermio joven no se teñían (Figura
11C).
11C).
También se detectó actividad de GUS en plántulas
en desarrollo. Las plántulas jóvenes de 3-5 días de
edad se teñían por todas partes. Aunque algunos pelos radiculares
cercanos al hipocótilo se teñían (Figura 11K), la mayoría de las
estructuras de nueva formación tales como los pelos radiculares, los
primordios radiculares laterales y el ápice caulinar no se teñían
(Figuras 11L y 11N). Después, la tinción quedó restringida a los
cotiledones e hipocótilos cuando crecieron las raíces laterales
desde la raíz embriónica en crecimiento. Desapareció la tinción de
las raíces embriónicas. No se observó tinción de las raíces
laterales de nueva formación, hojas verdaderas ni tricomas de hojas
verdaderas (Figuras 11M y 11N).
Los patrones de expresión de promotor AtS21/GUS
en el tabaco son básicamente los mismos que en Arabidopsis.
Sólo se detectó actividad de GUS en semillas en estadios tardíos y
en diferentes regiones nodales de plantas maduras. En semillas en
germinación, se detectó una intensa tinción en la totalidad de los
embriones cuando sólo había transcurrido una hora después de haber
sido disecadas de las semillas embebidas. También se tiñó el
endospermio maduro, del que carecen las semillas de
Arabidopsis, pero no la envoltura de la semilla (Figura
12A). Los extremos radiculares de algunas plántulas jóvenes de una
línea transgénica no se tiñeron (Figura 12B). Por lo demás, los
patrones de expresión de GUS en plántulas de tabaco en desarrollo
fueron los mismos que en plántulas de Arabidopsis (Figuras
12B, 12C, y 12D). Las estructuras de nueva formación tales como
raíces laterales y hojas verdaderas no se
tiñeron.
tiñeron.
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Puesto que las intensas actividades de promotor
AtS21/GUS observadas tanto en plántulas de Arabidopsis como
en plántulas de tabaco no son consistentes con la expresión
específica en semillas de los genes de oleosina, se llevó a a cabo
un análisis tipo Northern para determinar si estaba presente mARN de
AtS21 en plántulas en desarrollo en donde era tan intensa la
actividad de GUS. Se analizaron mediante hibridación tipo Northern,
empleando cADN de AtS21 como sonda, ARNs preparados a partir de
plántulas en diferentes estadios, desde 24 horas hasta 12 días.
Sorprendentemente, se detectó mARN de AtS21 a un nivel elevado,
comparable con el encontrado en semillas en desarrollo en semillas
embebidas durante 24-48 horas. El nivel de mRNA cayó
dramáticamente cuando emergieron por primera vez plántulas jóvenes,
a las 74 horas (Figuras 13A y 13B). En plántulas de 96 horas y
mayores, no se detectó señal ni con una exposición más larga (Figura
13B). Las cargas de las muestras de ARN se verificaron mediante la
hibridación de la misma transferencia con una sonda de gen de
tubulina (Figura 13C) que había sido aislada e identificada
mediante análisis EST tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Al
ser tan abundante el mARN de AtS21 en las semillas, seguía habiendo
sondas de AtS21 residuales en la transferencia incluso después de
un barrido prolongado. Estos resultados indicaron que el mARN de
AtS21 detectado en semillas embebidas y plántulas muy jóvenes era
el arrastre de mARN de AtS21 desde las semillas secas. Se ha
descrito recientemente que un mARN Ato12 de oleosina (idéntico a
AtS21) es muy abundante en semillas secas (Kirik y otros, 1996,
Plant Mol. Biol. 31(2):413-417.)
Análogamente, las intensas actividades de GUS en las plántulas eran
debidas, con mucha probabilidad, al arrastre de proteína de
\beta-glucuronidasa y a la síntesis de
novo de \beta-glucuronidasa a partir de su
mARN arrastrado del estadio de semilla seca.
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Ejemplo
8
Se compararon las actividades de GUS en semillas
en desarrollo de Arabidopsis transgénico expresadas por el
promotor AtS21, con las expresadas por el promotor 35S en el
constructo pBI221 (Jefferson y otros, EMBO J.
6:3901-3907). Se clasificaron las semillas según
sus colores (Tabla 2). El estadio más temprano iba desde el
globular hasta el estadio de corazón tardío, en el cual las semillas
seguían siendo blancas, pero eran lo suficientemente grandes como
para poder ser disecadas de las silicuas. En este estadio se detectó
actividad de promotor AtS21 a un nivel aproximadamente tres veces
más bajo que el del promotor 35S. La actividad del promotor 35S
permaneció al mismo bajo nivel a lo largo de todo el desarrollo del
embrión. Por el contrario, la actividad del promotor AtS21 aumentó
rápidamente cuando los embriones pasaron el estadio de torpedo, y
alcanzó el máximo nivel (25,25 pmole 4-MU/min
\cdot \mug de proteína) en el estado maduro (Figura
5-8). La actividad máxima del promotor AtS21 es 210
veces superior a su actividad más baja en el estadio desde globular
hasta corazón, y es aproximadamente 100 veces superior a la
actividad del promotor 35S en el mismo estadio (Tabla 2). Los
niveles de actividad del promotor AtS21 son similares a los de otros
promotores de oleosina de Arabidopsis expresados en
Brassica napus (Plant y otros, 1994, Plant mol. Biol.
25:193-205. También se detectó actividad de
promotor AtS21 a nivel de fondo en la hoja. La elevada desviación
típica, superior a la misma media, indicó que sólo se detectaba
actividad de GUS en las hojas de algunas líneas (Tabla 2). Por otra
parte, la actividad de promotor 35S en la hoja era más de 20 veces
mayor que en la semilla. En la Figura 14 se muestra una comparación
en paralelo de actividades entre el promotor AtS21 y el
promotor
35S.
35S.
Aunque la actividad de promotor AtS21 era
aproximadamente 3 veces más baja en la semilla seca de tabaco en la
semilla seca de Arabidopsis, la actividad absoluta de GUS
todavía era superior a la expresada por el promotor 35S en la hoja
de Arabidopsis (Tabla 2). En la hoja de tabaco no se observó
actividad detectable de promotor AtS21 (Figura 14).
La comparación del promotor AtS21 frente al
promotor 35S indicó que este último no es un buen promotor para
expresar genes a niveles elevados en semillas en desarrollo. Por sus
actividades constantemente bajas a lo largo de todo el período de
desarrollo del embrión, el promotor 35S es útil para lograr un
consistente bajo nivel de expresión de genes objetivo. Por el
contrario, el promotor AtS21 es un promotor muy potente que puede
ser empleado para expresar genes en embriones desde el estadio de
corazón, y acumularlos hasta el estadio de semilla seca. El
promotor 35S, aunque no es eficaz, es mejor que el promotor AtS21
para expresar genes en embriones antes del estadio de
corazón.
corazón.
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Ejemplo
9
Para crear un constructo de expresión en el cual
el promotor AtS21 impulsara la expresión del gen de
\Delta6-desaturasa de borraja, se eliminó de pAN5
el fragmento codificador de GUS, mediante digestión con SmaI y
EcoICR I. Después se escindió el inserto de cADN de pAN1 (Ejemplo
2), digiriendo primeramente con XhoI (y rellenando el voladizo
residual, como antes), y después digiriendo con SmaI. Se empleó el
fragmento resultante para reemplazar la porción de pAN5 escindida,
proporcionando finalmente pAN3.
Después de la transformación de tabaco y de
Arabidopsis siguiendo los métodos del Ejemplo 7, se
controlaron los niveles de actividad de
\Delta^{6}-desaturasa determinando los
correspondientes ésteres metílicos de ácido graso de sus productos
de reacción, ácido \gamma-linolénico (GLA) y ácido
octadecatetraenoico (OTA), empleando los métodos mencionados en el
Ejemplo 3. Los niveles de GLA y de OTA (Tabla 3) de las semillas
transgénicas ascendieron hasta 6,7% de ácidos grasos C18 (media =
3,1%) y 2,8% (media = 1,1%), respectivamente. No se detectó GLA ni
OTA en las hojas de estas plantas. En comparación, las plantas
transgénicas con promotor 35 S de
CaMV/\Delta^{6}-desaturasa produjeron niveles de
GLA en las semillas con hasta 3,1% de ácidos grasos C18 (media =
1,3%) y sin OTA detectable en las semillas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se transformó colza, cultivar Westar, con la
cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens que contenía el
plásmido pAN3 (es decir, el gen de
\Delta6-desaturasa de borraja bajo el control del
promotor de oleosina de Arabidopsis - Ejemplo 9).
Se co-cultivaron durante
2-3 días internodos terminales de Westar con cepa
EHA105 de Agrobacterium tumefaciens
(Alt-Moerbe y otros, 1988, Mol. Gen. Genet.
213:1-8; James y otros, 1993, Plant Cell
Reports 12:559-563) inducida, y después se
transfirieron a medio de regeneración (Boulter y otros, 1990,
Plant Science 70:91-99; Fry y otros, 1987,
Plant Cell Reports 6:321-325). Los brotes
regenerados fueron transferidos a medio de crecimiento (Pelletier y
otros, 1983, Mol. Gen. Genet. 191:244-250), y
se realizó un ensayo de reacción en cadena de polimerasa (PCR)
sobre fragmentos de hojas, para evaluar la presencia del gen.
Se aisló ADN de las hojas de acuerdo con el
protocolo de KM Haymes y otros (1996, Plant Molecular Biology
Reporter 14(3):280-284), y se resuspendió
en 100 \mul de agua, sin tratamiento con RNasa. Se utilizaron 5
\mul de extracto para la reacción de PCR, en un volumen final de
50 \mul. La reacción se llevó a cabo en un aparato de ciclos
térmicos Perkin-Elmer 9600 Thermocycler, con los
ciclos siguientes:
- 1 ciclo:
- 95ºC, 5 minutos
- 30 ciclos:
- 95ºC, 45 segundos; 52ºC, 45 segundos; 72ºC, 1 minuto
- 1 ciclo:
- 72ºC, 5 minutos
y los siguientes cebadores
(derivados de las proximidades de las regiones de caja metálica, tal
como se indica en la Figura 1, SEQ.
NO.:1):
5' TGG AAA TGG AAC CAT AA 3'
5' GGA AAC AAA TGA TGC TC 3'
La amplificación del ADN reveló la presencia del
fragmento PCR de 549 pares de bases esperado (Figura 17).
Los brotes positivos fueron transferidos a medio
de crecimiento lineal, y después a medio de enraizamiento (DeBlock
y otros, 1989, Plant Physiol. 91:694-701).
Los brotes con un sistema radicular bien desarrollado fueron
transferidos a un invernadero. Cuando las plantas estuvieron bien
desarrolladas, se cortaron hojas para realizar análisis tipo
Southern y determinar el número de copias del gen.
Se extrajo DNA genómico de acuerdo con el
procedimiento de Bouchez y otros (1996, Plant Molecular Biology
Reporter 14:115-123), se digirió con las enzimas
de restricción Bgl I y/o Cla I, se separó por
electroforesis sobre gel de agarosa (Maniatis y otros, 1982, en
Molecular Cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor/NY), y se preparó para
transferencia a membranas de nylon (Nytran, Schleicher &
Schuell) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se
transfirió el ADN a las membranas durante una noche por efecto
capilar, utilizando 20XSSC (Maniatis y otros, 1982). Después de la
transferencia, se reticularon con UV (Stratagene) las membranas
durante 30 segundos, y se pre-hibridaron durante 1
hora a 65ºC en 15 ml de una solución que contenía 6XSSC, SDS al
0,5%, y 2,25% peso/peso de leche desnatada deshidratada, en viales
de vidrio en una estufa de hibridación (Appligene). Se hibridaron
las membranas durante una noche en la misma solución, que contenía
una sonda de hibridación desnaturalizada, marcada radiactivamente
con ^{32}P a una actividad específica de 10^{8} cpm/\mug por
el método del cebador aleatorio (con el "kit"
Ready-ToGo de Pharmacia). La sonda representa un
fragmento PCR del gen de delta 6-desaturasa de
borraja (obtenido en las condiciones y con los cebadores que se han
indicado antes). Tras la hibridación se lavaron los filtros a 65ºC
en 2XSSC con SDS al 0,1% durante 15 minutos, y en 0.2XSSC con SDS al
0,1% durante 15 minutos. Después se envolvieron las membranas en
Saran-Wrap y se expuso con ellas película Kodak XAR,
empleando una pantalla intensificadora, a -70ºC en una caja opaca.
El tiempo de exposición fue generalmente de 3 días.
Los resultados obtenidos confirmaron la
presencia del gen. De acuerdo con el constructo génico, el número
de bandas en cada pista de ADN digerido con Bgl I o
Cla I representa el número de genes de delta
6-desaturasa presentes en el ADN genómico de la
planta. La digestión con Bgl 1 y Cla 1, conjuntamente,
genera un fragmento de 3435 pares de bases.
Las expresiones "comprende" o "que
comprende" se definen con el significado de especificar la
presencia de las características, valores, pasos o componentes que
se indican, tal como se mencionan en las reivindicaciones, pero no
excluyen la presencia o adición de una o más características,
valores, pasos o componentes distintos, o de grupos de los
mismos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Rhone Poulenc Agro
\hskip3.9cmThomas, Terry L.
\hskip3.9cmLi, Zhongsen
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: AN OLEOSIN 5' REGULATORY REGION FOR THE MODIFICATION {}\hskip4.45cm OF PLANT SEED LIPID COMPOSITION (UNA REGION REGULA- {}\hskip4.45cm DORA 5' DE OLEOSINA PARA MODIFICAR LA COMPOSICION LI {}\hskip4.45cm PIDICA DE SEMILLAS VEGETALES)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 35
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Scully, Scott, Murphy & Presser
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 400 Garden City Plaza
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Garden City
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 11530
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/831,575
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 9 de abril de 1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE LEGAL/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: DiGiglio, Frank S.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31,346
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 10203
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA LAS TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (516) 742-4343
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (516) 742-4366
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1684 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 43..1387
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 135 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 834 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 31..603
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 191 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 191 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 191 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 173 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 199 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 199 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1267 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1941 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Un "cassette" de expresión que comprende
la región reguladora 5' de oleosina que dirige la expresión
específica en la semilla, consistente en la secuencia nucleotídica
que se expone en la SEQ ID NO:12, enlazada operativamente a al
menos un ácido nucleico que codifica un gen heterólogo de
\Delta6-desaturasa.
2. Un vector de expresión que comprende el
cassette de expresión según la reivindicación 1.
3. Una célula que comprende el cassette de
expresión según la reivindicación 1.
4. Una célula que comprende el vector de
expresión según la reivindicación 2.
5. La célula según la reivindicación 3, en donde
dicha célula es una célula bacteriana o una célula vegetal.
6. La célula según la reivindicación 4, en donde
dicha célula es una célula bacteriana o una célula vegetal.
7. Una planta transgénica que comprende el
cassette de expresión según la reivindicación 1.
8. Una planta transgénica que comprende el
vector de expresión según la reivindicación 2.
9. La planta según la reivindicación 7 u 8, en
donde dicha planta es al menos una de una planta de girasol, soja,
maíz, algodón, tabaco, cacahuete, colza o Arabidopsis.
10. Progenie de la planta según la
reivindicación 7 u 8.
11. Semilla de la planta según la reivindicación
7 u 8.
12. Un método para producir una planta con
niveles incrementados de contenido de ácido gamma linolénico (GLA),
que comprende:
- (a)
- transformar una célula vegetal con el vector de expresión según la reivindicación 2; y
- (b)
- regenerar una planta con niveles incrementados de GLA a partir de dicha célula vegetal.
13. El método según la reivindicación 12, en
donde dicho gen de \Delta6-desaturasa es al menos
uno de un gen de \Delta6-desaturasa
cianobacteriano o un gen de \Delta6-desaturasa de
borraja.
14. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 o 13, en donde dicha planta es una planta de
girasol, soja, maíz, tabaco, algodón, cacahuete, colza o
Arabidopsis.
15. Un método para inducir la producción de al
menos uno de ácido gamma-linolénico (GLA) o ácido
octadecatetraenoico (OTA) en una planta deficiente o carente de
GLA, que comprende transformar dicha planta con un vector de
expresión según la reivindicación 2, y regenerar una planta con
niveles incrementados de al menos uno de GLA u OTA.
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|---|---|---|---|---|
| US6307123B1 (en) * | 1998-05-18 | 2001-10-23 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for transgene identification |
| DE69937050T2 (de) * | 1998-06-12 | 2008-05-29 | Calgene Llc, Davis | Polyungesättigte fettsäuren in pflanzen |
| US6864077B1 (en) | 1998-12-03 | 2005-03-08 | Edgar B. Cahoon | Membrane-bound desaturases |
| WO2000032790A2 (en) * | 1998-12-03 | 2000-06-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Membrane-bound desaturases |
| US6825017B1 (en) | 1998-12-07 | 2004-11-30 | Washington State University Research Foundation | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids |
| US8791327B2 (en) | 1998-12-07 | 2014-07-29 | Washington State University Research Foundation | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids |
| US6342657B1 (en) | 1999-05-06 | 2002-01-29 | Rhone-Poulenc Agro | Seed specific promoters |
| AU776447B2 (en) | 1999-06-07 | 2004-09-09 | Basf Plant Science Gmbh | Delta6-acetylenase and delta6-desaturase from ceratodon purpureus |
| DE10030976A1 (de) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Basf Ag | DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren |
| US6784342B1 (en) | 1999-08-04 | 2004-08-31 | The University Of British Columbia | Regulation of embryonic transcription in plants |
| GB9923306D0 (en) | 1999-10-01 | 1999-12-08 | Isis Innovation | Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant |
| NZ518530A (en) | 1999-11-10 | 2004-10-29 | Univ Washington | Compositions and methods for modulation of plant cell division using the revoluta protein |
| AU2001239244B2 (en) | 2000-02-09 | 2006-06-08 | Basf Aktiengesellschaft | Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids |
| EP1294912B1 (en) | 2000-04-07 | 2007-02-21 | BASF Plant Science GmbH | Gtp binding stress-related protein and methods of its use in plants |
| EP1283892A2 (en) * | 2000-05-24 | 2003-02-19 | The University Of British Columbia | Gene regulatory region that promotes early seed-specific transcription |
| FR2815969B1 (fr) | 2000-10-30 | 2004-12-10 | Aventis Cropscience Sa | Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique |
| US7105723B2 (en) | 2001-03-16 | 2006-09-12 | Basf Plant Science Gmbh | Sugar and lipid metabolism regulators in plants |
| GB0107510D0 (en) | 2001-03-26 | 2001-05-16 | Univ Bristol | New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids |
| EP1392104B1 (en) | 2001-06-04 | 2012-08-15 | BASF Plant Science GmbH | Sugar and lipid metabolism regulators in plants ii |
| US7528297B2 (en) | 2001-08-09 | 2009-05-05 | Northwest Plant Breeding Company | Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides |
| EP1414288B1 (en) | 2001-08-10 | 2009-03-25 | BASF Plant Science GmbH | Sugar and lipid metabolism regulators in plants iii |
| US7456335B2 (en) | 2001-09-03 | 2008-11-25 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants |
| CA2459961A1 (en) | 2001-09-05 | 2003-03-13 | Basf Plant Science Gmbh | Protein phosphatase stress-related polypeptides and methods of use in plants |
| EP1451325B1 (en) | 2001-11-09 | 2011-05-18 | BASF Plant Science GmbH | Transcription factor stress-related polypeptides and methods of use in plants |
| GB2385852A (en) | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Rothamsted Ex Station | Delta 6-desaturases from Primulaceae |
| DE10212892A1 (de) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
| CA2484001A1 (en) | 2002-05-08 | 2003-11-20 | Basf Plant Science Gmbh | Methods for increasing oil content in plants |
| GB0212885D0 (en) | 2002-06-05 | 2002-07-17 | Isis Innovation | Therapeutic epitopes and uses thereof |
| CA2492167C (en) | 2002-07-10 | 2015-06-16 | The Department Of Agriculture, Western Australia | Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides |
| ATE546539T1 (de) | 2002-07-26 | 2012-03-15 | Basf Plant Science Gmbh | Revertierung der negativ-selektiven wirkung von negativen markerproteinen als selektionsverfahren |
| EP1534843A4 (en) * | 2002-08-02 | 2007-04-25 | Basf Plant Science Gmbh | SUGAR AND LIPID METABOLISM REGULATORS IN PLANTS IV |
| US20060064784A1 (en) | 2002-08-07 | 2006-03-23 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response |
| FR2844142B1 (fr) | 2002-09-11 | 2007-08-17 | Bayer Cropscience Sa | Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree |
| FR2848570B1 (fr) | 2002-12-12 | 2005-04-01 | Bayer Cropscience Sa | Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant |
| EP2471930A1 (de) | 2002-12-20 | 2012-07-04 | Metanomics GmbH & Co. KGaA | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren |
| BRPI0407514A (pt) | 2003-02-17 | 2006-02-14 | Metanomics Gmbh | método para preparar um organismo não humano, polinucleotìdeo, método para preparar um vetor, vetor, célula hospedeira, polipeptìdeo, anticorpo, ácido polinucléico de anti-sentido, método para preparar uma planta, célula vegetal, tecido vegetal transgênicos, célula de um animal útil, animal útil ou um microorganismo transgênico organismo não humano, microorganismo transgênico, rendimento ou um material de propagação de uma planta ou de um animal útil, biomassa de um microorganismo, método para preparar produtos quìmicos finos, e, uso de polipeptìdeo |
| US7537920B2 (en) | 2003-02-27 | 2009-05-26 | Basf Plant Science Gmbh | Method for the production of polyunsaturated fatty acids |
| WO2004087902A2 (de) | 2003-03-31 | 2004-10-14 | University Of Bristol | Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte fettsäuren |
| US20100285985A1 (en) * | 2003-04-15 | 2010-11-11 | Applied Dna Sciences, Inc. | Methods and Systems for the Generation of Plurality of Security Markers and the Detection Therof |
| EP1641930B1 (en) | 2003-04-15 | 2011-06-29 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress |
| AU2004243416B2 (en) | 2003-05-28 | 2009-06-11 | Basf Se | Wheat plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides |
| BRPI0413118A (pt) | 2003-08-01 | 2006-10-03 | Basf Plant Science Gmbh | construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para a produção de um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, tecido vegetal, material de propagação, material coletado ou uma planta, método para a avaliação de agonistas e antagonistas de uma atividade de um poliptìdeo codificado pela molécula de ácido nucleico, processo para a identificação de um composto que confere produção de produto quìmico fino aumentada em uma planta ou microorganismo, método para a identificação de um produto genético que confere um aumento na produção de produto quìmico fino em uma célula, método para a produção de uma composição agrìcola, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do polipeptìdeo, ou da construção de ácido nucleico, ou do produto genético identificado |
| EP2172536B1 (de) | 2003-08-01 | 2016-05-04 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen |
| CA2534894C (en) | 2003-08-11 | 2020-01-21 | Kweek-En Researchbedrijf Agrico B.V. | Fungus resistant plants and their uses |
| DE602004021001D1 (de) * | 2003-08-21 | 2009-06-18 | Monsanto Technology Llc | Fettsäuredesaturasen aus primula |
| EP2982240B1 (en) | 2003-08-29 | 2019-07-31 | Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria | Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides |
| BRPI0418048A (pt) | 2003-12-23 | 2007-04-17 | Basf Plant Science Gmbh | ácido nucleico de lmp isolado, vetor de expressão, e, métodos para produzir uma planta transgênica e para modular o nìvel de um composto de armazenagem de semente em uma planta |
| CN1930277B (zh) | 2004-02-27 | 2011-02-02 | 巴斯福植物科学有限公司 | 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法 |
| US7777098B2 (en) | 2004-02-27 | 2010-08-17 | Basf Plant Science Gmbh | Method for producing unsaturated ω-3-fatty acids in transgenic organisms |
| US8378186B2 (en) * | 2004-04-16 | 2013-02-19 | Monsanto Technology Llc | Expression of fatty acid desaturases in corn |
| BRPI0510132A (pt) | 2004-04-22 | 2007-10-02 | Commw Scient Ind Res Org | sìntese de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa por células recombinantes |
| US10105437B2 (en) | 2004-04-28 | 2018-10-23 | Btg International Limited | Epitopes related to coeliac disease |
| NZ550600A (en) | 2004-04-28 | 2010-03-26 | Btg Int Ltd | Epitopes related to coeliac disease |
| EP2527362A1 (en) | 2004-06-16 | 2012-11-28 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acid molecules encoding wrinkled1-like polypeptides and methods of use in plants |
| WO2006069610A2 (en) | 2004-07-02 | 2006-07-06 | Metanomics Gmbh | Process for the production of fine chemicals |
| AU2005268943B2 (en) | 2004-07-31 | 2011-04-14 | Metanomics Gmbh | Preparation of organisms with faster growth and/or higher yield |
| AU2005268917B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-05-20 | Basf Plant Science Gmbh | Method for isolation of transcription termination sequences |
| RU2007114780A (ru) | 2004-09-20 | 2008-10-27 | БАСФ ПЛАНТ САЙЕНС ГмбХ (DE) | Гены арабидопсиса, кодирующие белки, участвующие в сахарном и липидном обмене, и способы их применения |
| CN101495507B (zh) | 2004-09-24 | 2013-07-17 | 巴斯福植物科学有限公司 | 编码与非生物性胁迫反应相关的蛋白质的核酸序列和具有增加的环境胁迫抗性的植物细胞和植物 |
| EP1794304B1 (en) | 2004-09-24 | 2013-06-19 | BASF Plant Science GmbH | Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress |
| EP2096177A3 (en) | 2004-12-17 | 2010-01-13 | Metanomics GmbH | Process for the production of lutein |
| WO2006092449A2 (en) | 2005-03-02 | 2006-09-08 | Metanomics Gmbh | Process for the production of fine chemicals |
| EP2573188A2 (en) | 2005-03-02 | 2013-03-27 | Metanomics GmbH | Process for the production of fine chemicals |
| ATE541043T1 (de) | 2005-03-08 | 2012-01-15 | Basf Plant Science Gmbh | Expressionsverstärkende intron-sequenz |
| DE102005013779A1 (de) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen |
| US9085774B2 (en) | 2005-04-19 | 2015-07-21 | Basf Plant Science Gmbh | Methods controlling gene expression |
| BRPI0611879A2 (pt) | 2005-06-17 | 2012-08-28 | Basf Plant Science Gmbh | usos de um ácido nucleico, e de um primeiro ácido nucleico isolado que hibridiza sob condições estringentes para um segundo ácido nucleico, métodos para aumentar a toleráncia de uma planta transgênica contendo o ácido nucleico que codifica o polipeptìdeo relacionado com estresse do tipo lectina de uma proteìna quinase, célula de planta transgênica, planta transgênica, semente, polipeptìdeo, e, seqüência de ácido nucleico |
| US7994399B2 (en) | 2005-06-23 | 2011-08-09 | Basf Plant Science Gmbh | Methods for the production of stably transformed, fertile Zea mays plants |
| EP2189532A1 (en) * | 2005-07-01 | 2010-05-26 | Nestec S.A. | Promoters from coffee |
| AU2006264937B2 (en) | 2005-07-06 | 2011-01-27 | Cropdesign N.V. | Plant yield improvement by Ste20-like gene expression |
| BRPI0613632A2 (pt) | 2005-07-18 | 2009-03-24 | Basf Plant Science Gmbh | planta de cultivo transgênica transformada com um ácido nucleico isolado, planta transgênica transformada com um ácido nucleico isolado, método para produzir uma planta de cultivo transgênica que contém um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptìdeo, semente de planta de cultivo produzida por uma planta de cultivo transgênica, semente de planta produzida pela planta transgênica, ácido nucleico isolado, e, vetor de expressão recombinante que compreende um ácido nucleico isolado |
| WO2007011736A2 (en) | 2005-07-18 | 2007-01-25 | Basf Plant Science Gmbh | Yield increase in plants overexpressing the shsrp genes |
| CA2619383C (en) | 2005-07-29 | 2014-09-16 | Targeted Growth, Inc. | Dominant negative mutant krp protein protection of active cyclin-cdk complex inhibition by wild-type krp |
| WO2007020198A2 (en) | 2005-08-12 | 2007-02-22 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress |
| EP1931788A2 (en) | 2005-09-15 | 2008-06-18 | CropDesign N.V. | Plants having increased yield and method for making the same |
| EP1931789B1 (en) | 2005-09-20 | 2016-05-04 | BASF Plant Science GmbH | Methods for controlling gene expression using ta-siran |
| GB2431158A (en) | 2005-10-13 | 2007-04-18 | Rothamsted Res Ltd | Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid |
| DE102005052551A1 (de) | 2005-11-02 | 2007-05-16 | Rothamsted Res Harpenden | Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae |
| EP1948806A2 (de) | 2005-11-08 | 2008-07-30 | BASF Plant Science GmbH | Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen |
| US8795744B2 (en) | 2005-11-18 | 2014-08-05 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Feedstuffs for aquaculture comprising stearidonic acid |
| US7723574B2 (en) | 2005-11-24 | 2010-05-25 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of Δ5-unsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| EP2314606A1 (en) | 2005-12-09 | 2011-04-27 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acid molecules encoding polypeptides involved in regulation of sugar and lipid metabolism and methods of use VIII |
| CA2632872A1 (en) | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Basf Plant Science Gmbh | Use of stomatin (stm1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
| GB0603160D0 (en) | 2006-02-16 | 2006-03-29 | Rothamsted Res Ltd | Nucleic acid |
| MX2008012252A (es) | 2006-03-24 | 2009-01-14 | Basf Plant Science Gmbh | Proteinas que se relacionan con la respuesta al estres abiotico y homologos. |
| EP2436771B1 (en) | 2006-03-31 | 2015-08-19 | BASF Plant Science GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| CA2644273A1 (en) | 2006-04-05 | 2008-03-27 | Metanomics Gmbh | Process for the production of a fine chemical |
| US10741034B2 (en) | 2006-05-19 | 2020-08-11 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity |
| CN103103198A (zh) | 2006-05-30 | 2013-05-15 | 克罗普迪塞恩股份有限公司 | 具有增强的产量相关性状的伸展蛋白受体样激酶受调节表达的植物和用于产生该植物的方法 |
| EP2029619B1 (en) | 2006-05-31 | 2013-01-09 | Metanomics GmbH | Manipulation of the nitrogen metabolism using ammonium transporter or glucose 6-phosphate deshydrogenases or farnesyl phosphate synthetase (fpp) |
| BRPI0712304A2 (pt) | 2006-06-08 | 2012-01-17 | Basf Plant Science Gmbh | método e processo para melhorar caracterìsticas de crescimento de planta em relação ás plantas de controle correspondentes, planta, parte de planta ou célula de planta, molécula de ácido nucleico isolada, construto de gene, vetor, planta transgênica, e, uso de uma molécula de ácido nucleico ou do construto de gene ou do vetor |
| MX2009001177A (es) | 2006-08-02 | 2009-02-13 | Cropdesign Nv | Plantas con caracteristicas mejoradas y un metodo para producirlas. |
| US9029111B2 (en) | 2006-08-24 | 2015-05-12 | Basf Plant Science Gmbh | Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains |
| BRPI0716075A2 (pt) | 2006-08-29 | 2013-08-06 | Commw Scient Ind Res Org | sÍntese de Ácidos graxos |
| EP2059600B1 (de) | 2006-08-30 | 2014-04-02 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen |
| EP2177605B1 (de) | 2006-10-06 | 2014-12-10 | BASF Plant Science GmbH | Delta-5 Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen nicht-humanen Organismen |
| WO2008043826A1 (de) | 2006-10-12 | 2008-04-17 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen |
| CA2663959A1 (en) | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield |
| WO2008087141A2 (en) | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Basf Plant Science Gmbh | Use of subtilisin (rnr9) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
| EP2121933B1 (en) | 2007-02-06 | 2012-04-18 | BASF Plant Science GmbH | Use of alanine racemase genes to confer nematode resistance to plants |
| CN101605896A (zh) | 2007-02-06 | 2009-12-16 | 巴斯福植物科学有限公司 | 使用rna干扰控制线虫的组合物和方法 |
| ES2383716T3 (es) | 2007-02-08 | 2012-06-25 | Basf Plant Science Gmbh | Composiciones y métodos que utilizan ARN de interferencia de un gen del tipo OPR3 para el control de nemátodos |
| WO2008095970A1 (en) | 2007-02-09 | 2008-08-14 | Basf Plant Science Gmbh | Compositions and methods using rna interference of cdpk-like for control of nematodes |
| WO2008110522A1 (en) | 2007-03-15 | 2008-09-18 | Basf Plant Science Gmbh | Use of nematode chitinase genes to control plant parasitic nematodes |
| CN101652480A (zh) | 2007-03-23 | 2010-02-17 | 巴斯福植物科学有限公司 | 具有提高的胁迫耐受性和产量的转基因植物 |
| EP2492345A3 (en) | 2007-05-04 | 2012-12-12 | BASF Plant Science GmbH | Seed enhancement by combinations of pyruvate kinases |
| US20100162432A1 (en) | 2007-05-22 | 2010-06-24 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-ko |
| MX2009012556A (es) | 2007-05-22 | 2010-02-18 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas con mayor tolerancia y/o resistencia al estres ambiental y mayor produccion de biomasa. |
| CA2687320A1 (en) | 2007-05-29 | 2008-12-04 | Basf Plant Science Gmbh | Transgenic plants with increased stress tolerance and yield |
| EP2520656A3 (en) | 2007-07-13 | 2013-05-01 | BASF Plant Science GmbH | Transgenic plants with increased stress tolerance and yield |
| AR067795A1 (es) | 2007-08-02 | 2009-10-21 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas transgenicas con mayor tolerancia al estres y mayor rendimiento |
| AU2008300579B2 (en) | 2007-09-18 | 2014-11-13 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield |
| EP2193202A2 (en) | 2007-09-21 | 2010-06-09 | BASF Plant Science GmbH | Plants with increased yield |
| EP2220240A2 (en) | 2007-11-27 | 2010-08-25 | BASF Plant Science GmbH | Transgenic plants with increased stress tolerance and yield |
| CN103397021A (zh) * | 2007-12-04 | 2013-11-20 | 陶氏环球技术有限责任公司 | 来自蓖麻植物的种子优选性基因启动子 |
| AU2008337600A1 (en) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters from brassica napus for seed specific gene expression |
| US20110035841A1 (en) | 2007-12-17 | 2011-02-10 | Basf Plant Science Gmbh | Lipid Metabolism Proteins, Combinations of Lipid Metabolism Proteins and Uses Thereof |
| EP2225380A2 (en) | 2007-12-17 | 2010-09-08 | BASF Plant Science GmbH | Lipid metabolism protein and uses thereof i (bzip transcription factor) |
| WO2009077611A2 (en) | 2007-12-19 | 2009-06-25 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield and/or increased tolerance to environmental stress (iy-bm) |
| EP2240587A2 (en) | 2007-12-21 | 2010-10-20 | BASF Plant Science GmbH | Plants with increased yield (ko nue) |
| CN102016048A (zh) | 2008-02-27 | 2011-04-13 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 产量增加的植物 |
| JP2009201435A (ja) * | 2008-02-28 | 2009-09-10 | Toyota Motor Corp | 種子中の油脂量の評価方法及び油脂含量が変化した植物体のスクリーニング方法 |
| EP2283137A4 (en) | 2008-04-25 | 2011-12-14 | Commw Scient Ind Res Org | RECOMBINANT CELLS AND METHOD FOR THE HYDROXYLATION OF FATTY ACIDS |
| EP2285967B1 (en) | 2008-06-03 | 2016-12-21 | BASF Plant Science GmbH | Fatty acid dehydratases and uses thereof |
| AU2009265795B2 (en) | 2008-07-01 | 2014-12-11 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters from Brassica napus for seed specific gene expression |
| AU2009284172A1 (en) | 2008-08-19 | 2010-02-25 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield by increasing or generating one or more activities in a plant or a part thereof |
| DE112009002048T5 (de) | 2008-08-26 | 2012-01-26 | Basf Plant Science Gmbh | Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl |
| BRPI0917371A2 (pt) | 2008-08-27 | 2015-11-17 | Basf Plant Science Gmbh | planta trangênica transformada com um vetor de expressão, semente, vetor de expressão, e, método para produzir uma planta trangênica resistente a nematóides. |
| EP2337853A1 (en) | 2008-09-23 | 2011-06-29 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants with increased yield (lt) |
| EP2350287A2 (en) | 2008-10-23 | 2011-08-03 | BASF Plant Science GmbH | A method for producing a transgenic cell with increased gamma-aminobutyric acid (gaba) content |
| MX2011004270A (es) | 2008-10-23 | 2011-07-13 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas con rendimiento aumentado (nue). |
| CN107858204B (zh) | 2008-11-18 | 2021-10-29 | 联邦科学技术研究组织 | 产生ω-3脂肪酸的酶和方法 |
| DE112009003708T5 (de) | 2008-12-12 | 2012-09-13 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenenOrganismen |
| AU2010247438B2 (en) | 2009-05-13 | 2015-01-29 | Basf Plant Science Company Gmbh | Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production |
| US8993841B2 (en) | 2009-06-08 | 2015-03-31 | Basf Plant Science Company Gmbh | Fatty acid elongation components and uses thereof |
| DE112010002967T5 (de) | 2009-07-17 | 2012-10-11 | Basf Plant Science Company Gmbh | Neue Fettsäuredesaturasen und -elongasen und Anwendungen davon |
| CN102575260A (zh) | 2009-07-23 | 2012-07-11 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增加的产量的植物 |
| JP5168511B2 (ja) * | 2009-08-25 | 2013-03-21 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 種子特異的プロモーターおよびその利用 |
| DE112010003389T5 (de) | 2009-08-25 | 2012-06-14 | Basf Plant Science Company Gmbh | Nematodenresistente transgene Pflanzen |
| WO2011023800A1 (en) | 2009-08-31 | 2011-03-03 | Basf Plant Science Company Gmbh | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing seed-specific gene expression in plants promoting enhanced polyunsaturated fatty acid synthesis |
| CA2780707A1 (en) | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants with increased yield |
| CA2781559C (en) | 2009-11-24 | 2018-09-04 | Basf Plant Science Company Gmbh | Novel fatty acid elongase and uses thereof |
| WO2011064181A1 (en) | 2009-11-24 | 2011-06-03 | Basf Plant Science Company Gmbh | Novel fatty acid desaturase and uses thereof |
| CA2782545A1 (en) | 2009-12-09 | 2011-06-16 | Basf Plant Science Company Gmbh | Methods for increasing the resistance of plants to fungi by silencing the fungal smt1-gene |
| AR079883A1 (es) | 2009-12-23 | 2012-02-29 | Bayer Cropscience Ag | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd |
| UY33139A (es) | 2009-12-23 | 2011-07-29 | Bayer Cropscience Ag | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd |
| ES2659086T3 (es) | 2009-12-23 | 2018-03-13 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD |
| ES2659085T3 (es) | 2009-12-23 | 2018-03-13 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD |
| EP2516631B1 (en) | 2009-12-23 | 2018-02-14 | Bayer Intellectual Property GmbH | Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| CA2788052C (en) | 2010-02-02 | 2020-02-04 | Bayer Cropscience Ag | Soybean transformation using hppd inhibitors as selection agents |
| MX2012009033A (es) | 2010-02-23 | 2012-11-23 | Basf Plant Science Co Gmbh | Plantas transgenicas resistentes a los nematodos. |
| CN109504700A (zh) | 2010-06-09 | 2019-03-22 | 拜尔作物科学公司 | 植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具 |
| AU2011264074B2 (en) | 2010-06-09 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| NO2585603T3 (es) | 2010-06-25 | 2018-05-19 | ||
| US9127288B2 (en) | 2010-06-28 | 2015-09-08 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods of producing lipids |
| JP2013531502A (ja) | 2010-07-08 | 2013-08-08 | バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェー | グルコシノレート輸送タンパク質及びその使用 |
| EP2695936B1 (en) | 2010-10-21 | 2016-04-20 | BASF Plant Science Company GmbH | Novel fatty acid desaturases and uses thereof |
| ES2588802T3 (es) | 2010-11-10 | 2016-11-04 | Bayer Cropscience Ag | Variantes de HPPD y procedimientos de uso |
| BR112013015335A2 (pt) | 2010-12-20 | 2019-09-24 | Basf Plant Science Co Gmbh | plantas transgências resistentes a nematoides |
| WO2012130684A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Bayer Cropscience Ag | Use of n-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| EP2688406B1 (en) | 2011-03-25 | 2015-04-22 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of n-(tetrazol-4-yl)- or n-(triazol-3-yl)arylcarboxamides or their salts for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| WO2013024121A2 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-21 | Basf Plant Science Company Gmbh | Increase of sucrose transporter activity in the seeds of plants |
| BR122014004140B8 (pt) | 2011-08-22 | 2023-03-28 | Bayer Cropscience Ag | Vetor recombinante ou construção recombinante, bem como métodos para obter e produzir uma planta de algodão ou célula vegetal tolerante a um inibidor de hppd, e para cultivar um campo de plantas de algodão |
| PL2764101T3 (pl) | 2011-10-04 | 2017-09-29 | Bayer Intellectual Property Gmbh | RNAi do kontroli grzybów i lęgniowców poprzez hamowanie genu dehydrogenazy sacharopinowej |
| AU2012324003B2 (en) | 2011-12-27 | 2016-05-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Simultaneous gene silencing and supressing gene silencing in the same cell |
| WO2013096991A1 (en) | 2011-12-27 | 2013-07-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof |
| JP6461604B2 (ja) | 2011-12-27 | 2019-01-30 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | 脂質製造のための工程 |
| EP2612918A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-10 | BASF Plant Science Company GmbH | In planta recombination |
| ES2769448T3 (es) | 2012-04-12 | 2020-06-25 | Rothamsted Res Limited | Producción de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de cadena larga |
| ES2636487T3 (es) | 2012-06-15 | 2017-10-05 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en células vegetales |
| EA201590164A1 (ru) | 2012-07-06 | 2015-05-29 | Байер Кропсайенс Нв | Растения brassica с модифицированным составом масла семян |
| EP2870248A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-05-13 | Bayer CropScience NV | Brassica rod1 gene sequences and uses thereof |
| BR112015000058A2 (pt) | 2012-07-06 | 2017-08-08 | Bayer Cropscience Nv | sequências de genes rod1 de soja e usos das mesmas |
| CA2879154A1 (en) | 2012-08-03 | 2014-02-06 | Basf Plant Science Company Gmbh | Novel enzymes, enzyme components and uses thereof |
| WO2014043435A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| US10462994B2 (en) | 2013-01-29 | 2019-11-05 | Basf Plant Science Company Gmbh | Fungal resistant plants expressing HCP7 |
| US10231397B2 (en) | 2013-01-29 | 2019-03-19 | Basf Plant Science Company Gmbh | Fungal resistant plants expressing EIN2 |
| WO2014117990A1 (en) | 2013-01-29 | 2014-08-07 | Basf Plant Science Company Gmbh | Fungal resistant plants expressing hcp6 |
| US9963740B2 (en) | 2013-03-07 | 2018-05-08 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method and device for marking articles |
| US10465204B2 (en) | 2013-03-08 | 2019-11-05 | Basf Plant Science Company Gmbh | Fungal resistant plants expressing MybTF |
| WO2014142647A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Wageningen Universiteit | Fungals strains with improved citric acid and itaconic acid production |
| EP3049517B1 (en) | 2013-09-24 | 2018-04-11 | Bayer CropScience NV | Hetero-transglycosylase and uses thereof |
| CA2926436A1 (en) | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Judith Murrah | Multimode image and spectral reader |
| AU2014369232B2 (en) | 2013-12-17 | 2021-02-18 | Basf Plant Science Company Gmbh | Methods for conversion of the substrate specificity of desaturases |
| EA037817B1 (ru) | 2013-12-18 | 2021-05-25 | Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриэл Рисерч Организэйшн | Экстрагированный растительный липид, содержащий длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты |
| EP3117003B1 (en) | 2014-03-11 | 2019-10-30 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hppd variants and methods of use |
| JP2017512692A (ja) | 2014-03-18 | 2017-05-25 | エーピーディーエヌ（ビー・ヴイ・アイ）・インコーポレイテッド | セキュリティ用途のための暗号化された光学マーカー |
| US10745825B2 (en) | 2014-03-18 | 2020-08-18 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encrypted optical markers for security applications |
| EP3160482A4 (en) | 2014-06-27 | 2018-02-14 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Lipid comprising docosapentaenoic acid |
| CA2954203C (en) | 2014-07-07 | 2023-12-05 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Processes for producing industrial products from plant lipids |
| CN115094081A (zh) | 2014-11-14 | 2022-09-23 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 增加种子油中生育酚含量的材料和方法 |
| WO2016128470A1 (en) | 2015-02-11 | 2016-08-18 | Basf Se | Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases |
| US10597674B2 (en) | 2015-09-11 | 2020-03-24 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | HPPD variants and methods of use |
| CA3005466A1 (en) | 2015-11-18 | 2017-05-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Rice grain with thickened aleurone |
| DE102016204033A1 (de) | 2016-03-11 | 2017-09-14 | Universität Rostock | Maßnahmen und Methoden zur Schadtierbekämpfung |
| DE102016204700A1 (de) | 2016-03-22 | 2017-09-28 | Universität Rostock | Rekombinante Herstellung von Subfatin |
| US10519605B2 (en) | 2016-04-11 | 2019-12-31 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method of marking cellulosic products |
| WO2017184727A1 (en) | 2016-04-21 | 2017-10-26 | Bayer Cropscience Lp | Tal-effector mediated herbicide tolerance |
| WO2017205665A1 (en) | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Cargill, Incorporated | Engineered nucleases to generate deletion mutants in plants |
| EP3269816A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-17 | Kws Saat Se | Development of fungal resistant crops by higs (host-induced gene silencing) mediated inhibition of gpi-anchored cell wall protein synthesis |
| US10995371B2 (en) | 2016-10-13 | 2021-05-04 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Composition and method of DNA marking elastomeric material |
| US11091772B2 (en) | 2016-11-23 | 2021-08-17 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | AXMI669 and AXMI991 toxin genes and methods for their use |
| KR20190095411A (ko) | 2016-12-22 | 2019-08-14 | 바스프 아그리컬쳐럴 솔루션즈 시드 유에스 엘엘씨 | 선충 해충의 방제를 위한 ｃｒｙ１４의 용도 |
| US11286498B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-03-29 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Use of BP005 for the control of plant pathogens |
| UY37571A (es) | 2017-01-18 | 2018-08-31 | Bayer Cropscience Lp | Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso |
| US10920274B2 (en) | 2017-02-21 | 2021-02-16 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Nucleic acid coated submicron particles for authentication |
| WO2018165091A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| WO2019083808A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE AGAINST HPPD INHIBITORS BY REGULATION OF PUTATIVE REDUCED 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE REDUCES IN SOYBEANS |
| WO2019083810A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS |
| US20220064657A1 (en) | 2019-01-04 | 2022-03-03 | Cargill, Incorporated | Engineered nucleases to generate mutations in plants |
| CA3129494A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Cargill, Incorporated | Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8916213D0 (en) * | 1989-07-14 | 1989-08-31 | Ici Plc | Dna constructs,cells and plants derived therefrom |
| WO1993020216A1 (en) * | 1991-02-22 | 1993-10-14 | University Technologies International, Inc. | Oil-body protein cis-elements as regulatory signals |
| PH31293A (en) * | 1991-10-10 | 1998-07-06 | Rhone Poulenc Agrochimie | Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage. |
| US5614393A (en) * | 1991-10-10 | 1997-03-25 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| AU675923B2 (en) * | 1991-12-04 | 1997-02-27 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Fatty acid desaturase genes from plants |
| US5850022A (en) * | 1992-10-30 | 1998-12-15 | Calgene, Inc. | Production of myristate in plant cells |
| WO1994011516A1 (en) * | 1992-11-17 | 1994-05-26 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants |
| WO1994018337A1 (en) * | 1993-02-05 | 1994-08-18 | Monsanto Company | Altered linolenic and linoleic acid content in plants |
| DK0778896T3 (en) * | 1994-08-31 | 2015-04-07 | Du Pont | Nucleotide OF RAPE AND SOYA BEAN palmitoyl-ACP THIOESTERASEGENER AND USE THEREOF IN REGULATION OF FATTY ACID CONTENT oils FROM soybean and RAPS PLANTS |
-
1997
- 1997-04-09 US US08/831,575 patent/US5977436A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
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