PT973920E - Região reguladora 5' de oleoresina para modificar a composição lipídica de sementes de plantas - Google Patents

Description

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Descrição "Região reguladora 5' de oleoresina para modificar a composição lipidica de sementes de plantas"

Antecedentes da Invenção

Tradicionalmente o teor em óleo de sementes tem sido modificado através de reprodução de plantas, A utilização de tecnologia de ADN recombinante para alterar a composição do óleo da semente pode acelerar este processo e nalguns casos alterar os óleos das sementes de um modo que não pode ser conseguido unicamente por reprodução. A composição do óleo de Brassíca foi significativamente alterada modificando a expressão de um número de genes do metabolismo lípídico. Tais manipulações da composição do óleo de sementes têm-se focalizado na alteração da proporção de componentes endógenos de ácidos gordos. Por exemplo, a repressão anti-sentido do gene da A12-dessaturase na semente de colza transgénica resultou num aumento em ácido oleico até cerca de 83%.. Topfer et al. 1995 Science 268:681-686.

Houve algumas tentativas bem sucedidas para modificar a composição do óleo de sementes em plantas transgénicas por introdução de novos genes que permitem a produção de um ácido gordo que as plantas hospedeiras não eram previamente capazes de sintetizar. Van de Loo, et al. (1995 Proc. Natl. Acad. Sei USA 92:6743-6747) foram capazes de introduzir um gene de A12-hidróxilase em tabaco transgéníco, resultando na introdução de um novo ácido gordo, o ácido ricinolénico no seu óleo das sementes. A acumulação reportada foi modesta em plantas que transportam construções em que a transcrição do gene da hidroxilase estava sob o controlo do promotor 35S do virus do mosaico da couve de flor (CaMV) . 2

De forma semelhante, as plantas do tabaco foram submetidas a engenharia genética para produzirem baixos níveis de ácido petroselinico por expressão de uma acil-ACP dessaturase a partir do coentro (Cahoon et al. 1992 Proc. Natl. Acad. Sei USA 89:11184-11188.

Os ácidos gordos de cadeia longa (C18 e maiores), possuem um valor económico significativo como alimentos, tanto do ponto de vista nutricional, como alimentos importantes do ponto de vista médico e como mercadorias industriais (Ohlrogge, J. B. 1994 Plant Physiol. 104:821-826). Ácido linoleico (18:2 Δ9,12) e ácido a-línolénico (18:3 Δ9,12, 15·). são ácidos gordos essenciais encontrados em muitos óleos de sementes. Os níveis destes ácidos gordos foram manipulados em culturas de sementes de oleaginosas, através de reprodução e biotecnologia (Ohlrogge, et al. 1991 Biochim. Biophys. Acta 1082:1-26; Topfer et al. 1995 Science 268:681-686). Além disso, a produção de novos ácidos gõrdos em óleos de sementes pode ser de utilidade considerável tanto na saúde humana como nas aplicações industriais.

Pensa-se que consumos de óleos de plantas ricos em ácido γ-linolénico (GLA) (18:3 Δ6,9,12) aliviam a hipercolesterolémia e outras desordens clinicas relacionadas que correlacionam com a susceptibilidade a doença arterial coronária (Brenner, R.R 1976 Adv. Exp Med. Biol. 83:85-101). Os benefícios terapêuticos do GLA dietético pode resultar do seu papel como precursor da síntese da prostanglandina (Weete, J. D. 1980 em Lipid Biochemistry of Fungi and Other Organisms, eds. Plenum Press, New York, pp. 59-62). O ácido linolénico (18:2) (LA) é transformado em ácido gama linolénico (18:3) (GLA) pela enzima Δβ-dessaturase.

Poucos óleos de sementes contêm GLA apesar dos elevados teores do ácido linolénico precursor. Isto é 3 Λ devido à ausência de actividade de A6-dessaturase na maior parte das plantas. Por exemplo, apenas borragem (Borago officinalis) , primavera da noite (Oenothera biennis) e caril (Ribes nigrum) produzem quantidades significativas de ácido linoleico. Destas três espécies, apenas Oenothera e borragem são cultivadas como fonte comercial de GLA. Seria benéfico se óleos de sementes agronómicas pudessem ser submetidos a engenharia para produzir GLA em quantidades significativas através da introdução de um gene heterólogo da A6-dessaturase. Seria também benéfico se outros produtos de expressão associados com a síntese de ácidos gordos e o metabolismo lipídico poderia ser produzidos em plantas com níveis suficientemente elevados para que a produção comercial de um produto de expressão particular possa ser realizável.

Como foi revelado na WO 96/21022, foi recentemente isolado um gene cianobacteriano .da A6-dessaturase. Expressão deste gene cianobacteriano no tabaco transgénico resultou numa acumulação de GLA significativa, mas de baixo nível. (Reddy et al. 1996 Nature Biotech. 14:639-642). Um pedido de patente de invenção da requerente também pendente US N° 08,366,779 revela um gene da A6-dessaturase isolado a partir da planta de Borago officinalis. e a sua expressão no tabaco sob o controlo do promotor 35S da CaMV. Uma tal expressão resultou num nível significativo, mas baixo de acumulação de GLA e de ácido octadecatetranoico (ODTA ou OTA) nas sementes. Assim, existe a necessidade de um promotor que funcione em plantas e que diriga consistentemente para um nível elevado de expressão de genes do metabolismo dos lípidos em sementes de plantas transgénicas.

As oleoresinas são proteínas abundantes de sementes associadas com a monocamada fosfolipídica da membrana de corpos oleosos. 0 primeiro gene da oleoresina, L3 foi 4 clonado a partir do railho seleccionando os clones, cujos produtos traduzidos in vitro foram reconhecidos por um anticorpo anti-L3 (Vance et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:11275-11279). Posteriormente foram clonadas as diferentes isoformas dos genes da oleoresina de espécies tão diferentes como Brassica, soja, cenoura, pinheiro, e Arabidopsis (Buang, A H. C.,1992, Ann. Reviews Plant Fhys. e Plant Mol. Biol. 43:177-200; Kirik et al., 1996 Plant Mol. Biol. 31:413-417; Van Rooijen et al., 1992 Plant. Mol. Biol. 18:1177-1179; Zou et al., Plant Mol. Biol. 31:429-433). Sequências .de proteína de oleoresina previstas a partir destes genes são altamente conservadas, especialmente a partir do domínio hidrofóbico central. Todas estas oleoresinas possuem a característica de terem três domínios distintos. Um domínio anfipático de 40-60 aminoácidos encontra-se presente no terminal-N; um domínio completamente hidrofóbico de 68-74 aminoácidos encontra-se localizado no centro; e um domínio anfipático de hélice-a de 33-40 aminoácidos encontra-se situado no terminal-C (Huang, A H.C. 1992)·.

Foram ainda descritas sequências reguladoras a partir de um gene de oleoresina que dirige para uma expressão de nivel elevado de genes do metabolismo dos lípidos em plantas transgénicas. De acordo com a presente invenção são descritas construções quiméricas compreendendo uma região reguladora 5'da oleoresina ligada operacionalmente à sequência de codificação para um gene do metabolismo dos lipidos, tal como um gene da Δβ-dessaturase. Plantas transgénicas compreendendo as ditas construções quiméricas produzem niveis de GLA que se aproximam do nivel encontrado naquelas poucas plantas que produzem GLA naturalmente, tal como a primavera da noite (Oenothera biennis). 5

Sumário da Invenção A presente invenção disponíbiliza cassettes de expressão e vectores de expressão compreendendo a região reguladora 5' que dirige a expressão especifica na semente constituída pela sequência nucleótida apresentada na SEQ ID N° 12 ligada operacionalmente a pelo menos um ácido nucleico que codifica para um gene heterólogo da Δ6-dessaturase.

Vectores de transformação de plantas compreendendo as cassettes de expressão e vectores de expressão são também disponibilizados, assim como células de plantas transformadas por estes vectores, e plantas e a sua descendência contendo os vectores.

Num outro aspecto é descrito um processo para produzir uma planta com níveis acrescidos de um produto de uma síntese de ácido gordo ou gene do metabolismo lipídico.

Em particular, é descrito um processo para produzir uma planta com níveis acrescidos de um gene de uma síntese de ácido gordo ou do metabolismo lipídico transformando a planta com as ditas cassettes de . expressão e vectores de expressão que compreende uma região reguladora 5'de oleoresina e uma sequência de codificação para um gene de uma síntese de ácido gordo, ou de metabolismo lipídico.

Num outro aspecto é descrito um processo para co-supressão de um gene da síntese de um ácido gordo nativo, ou do metabolismo lipídico transformando uma planta com as ditas cassettes de expressão e vectores de expressão que compreendem uma região 5' reguladora de oleoresina e uma sequência de codificação para uma síntese de ácido gordo ou gene do metabolismo lipídico.

Ainda outro aspecto descreve um processo para diminuir a produção de- um gene nativo da planta, tal como um gene da síntese de ácido gordo ou gene do metabolismo lipídico 6 transformando a planta com um vector de ' expressão compreendendo uma região reguladora 5' da oleoresina operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico complementar a um gene nativo da planta.

Também são descritos processos de modular os níveis de um gene heterólogo, tal como um gene da síntese de ácido gordo ou do metabolismo lipidico transformando uma planta com as ditas cassettes de expressão e vectores de expressão.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 representa o nucleótido e a sequência de aminoácidos correspondente do gene da A6-dessaturase' da borragem (SEQ ID N° 1) . 0 motivo de ligação ao hemo do citocromo b5 encontra-se encaixilhado e a ligação putativa ao metal, motivos ricos em histidina (HRMs) encontram-se sublinhados. Os motivos reconhecidos pelos iniciadores (análise PCR) encontram-se sublinhados com linhas a tracejado, i.e. tgg aaa tgg aac cat aa; e gag cat cat ttg tttcc. A Fig. 2 é um dendograma que apresenta semelhança entre a Δδ-dessaturase da borragem com outras dessaturases ligadas a membranas. A sequência de aminoácidos da Δβ-dessaturase da borragem foi comparada com outras dessaturases conhecidas utilizando Gene Works (IntelliGenetics). Valores numéricos correlacionam-se com distâncias filogenéticas relativas entre os subgrupos comparados. Ά Fig. 3A apresenta um perfil de cromatografia gás líquido dos ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAMES) derivados do tecido das folhas de um tabaco selvagem do tipo "Xanthi". A Fig. 3B apresenta um perfil de cromatografia gás líquido dos (FAMES) derivados do tecido das folhas de uma planta de 7 tabaco transformada com o cADN da A6-dessaturase da borragem sob o controlo de transcrição do promotor 35S da CaMV (pAN2). São indicados os picos correspondentes ao linoleato de metilo (18:2), γ-linolenato de metilo (18:3γ), α-linolenato de metilo (18:3a), e octadecatetraenoate de metilo (18:4).. A Fig. 4 representa a sequência nucleotidica e a correspondente sequência de aminoácidos da oleoresina do cADN de AtS21 (SEQ ID N°3). A Fig. 5 é uma mapa acídico-base da proteína AtS21 prevista gerada pelo DNA Strider 1,2. A Fig. 6 é uma representação de Kyte-Doolittle da proteína AtS21 prevista gerada pelo DNA Strider 1,2. A Fig. 7 é um alinhamento de sequência da oleoresina isolada da Arabidopsis. As sequências de oleoresinas publicadas ou depositadas nas bases de dados EMBL, BCM, NCBI foram alinhadas umas . com as outras utilizando o GeneWorks®2.3. Os resíduos idênticos estão encaixilhados em rectângulos. As sete sequências caem em três grupos. 0 primeiro grupo inclui AtS21 (SEQ ID N°:5), X91918 (SEQ ID N°6) e Z29859 (SEQ ID N°: 7). 0 segundo grupo inclui X62352 (SEQ ID N°: 8) e Atol3 (SEQ ID N°:9). 0 terceiro grupo inclui X91956 (SEQ ID N°10) e L40954 (SEQ ID N°:ll). As diferenças nos resíduos de aminoácidos do mesmo grupo são indicadas a sombreado. Ato2/Z54164 é idêntico a AtS21. Na realidade a sequência Atol3 (N° de acesso Z541654 na base de dados EMBL) não é revelada na base de dados EMBL. 0 número de acesso Z54165 designa a mesma sequência que Z54164 .que é Atol2. A Fig. 8A é uma análise de Northern do gene AtS21. Um gel de transferência de ARN contendo 10 microgramas de ARN total extraído de folhas de Arabidopsis (F) , folhas (L) , raízes (L), sementes em desenvolvimento (Se) e tegumentos 8 em desenvolvimento de siliqua (Si) foram hibridizados com uma sonda feita de cADN de AtS21 de comprimento completo. A Fig. 8B é uma análise de Southern do gene AtS21. 0m gel de transferência de ADN contendo 10 microgramas de ADN genómico digerido com 'BamHI(B), EcoRI (E) , HindIII (H) , Saci (S) , e Xbal (X) foi hibridizado com uma sonda feita a partir de cADN de AtS21 de comprimento completo. A Fig. 9 é uma sequência nucleótida do fragmento Saci de ADN genómico AtS21 (SEQ ID N°:12). O promotor e as sequências intrão encontram-se em maiúscula. Os fragmentos correspondentes a sequências de cADN de AtS21 encontram-se em minúsculas. O primeiro codão ATG e uma caixa TATA putativa encontram-se a sombreado. A sequência complementar ao iniciador 21P para amplificação por PCR encontra-se encaixilhada. Dm elemento putativo da resposta do ácido abscisico (ABRE) e duas repetições de 14 pb encontram-se sublinhadas. A Fig. 10 é um mapa da construção promotor AtS21 /GUS (pAN5). A Fig. 11A representa a expressão do gene AtS21/GUS na fechadura de Arabidopsis e nas folhas. A Fig. 11B representa a expressão do gene AtS21/GUS na

Arabidopsis siliqua. A Fig. 11C representa a expressão do gene AtS21/GUS nas sementes em desenvolvimento da Arabidopsis.

As, Fig. 11D até 11J representam a expressão do gene AtS21/Gus nos embriões em desenvolvimento da Arabidopsis. A Fig. 11K representa a expressão do gene AtS21/GUS na raiz de Arabidopsis e capilares das raízes de uma plântula nova. A Fig. 11L representa a expressão do gene AtS21/GUS nos cotilédones de Arabidopsis e no rebento apical de uma plântula de cinco dias. 9 A Fig. 11M e 11N representam a expressão do gene AtS21/GUS nos cotilédones de Arabidopsis e nos rebentos apicais de uma plântula de 5-15 dias.· A Fig. 12A representa a expressão do gene AtS21/GUS nos embriões e endosperma do tabaco. A Fig. 12B representa a expressão do gene AtS21/GUS nas sementes de tabaco em germinação. A Fig. 12C representa a expressão do gene AtS21/GUS numa plântula de tabaco com 5 dias. A Fig. 12D representa a expressão do gene AtS21/GUS em plântula de tabaco com 5 a 15 dias.. A Fig. 13A é uma análise de Northern que apresenta níveis de AtS21 mARN em plântulas em desenvolvimento de Arabidopsis do tipo selvagem. A zona 1 foi carregada com ARN de sementes em desenvolvimento, a zona 2 foi carregada com ARN de sementes inibidas durante 24-48 horas, a zona 3: sementes de 3 dias; a zona 4: sementes .de 4 dias; a zona 5: plântulas de 5 dias; a zona 6: plântulas de 6 dias; a zona 7; plântulas de 9 dias; a zona 8: plântulas de 12 dias. A sonda foi marcada com cADN de AtS21. A exposição foi de uma hora a -80°C. A Fig. 13B representa a mesma transferência que a Fig. 13A apenas a exposição foi durante 24 horas a -80°C. A Fig. 13C representa a mesma transferência que as representados nas Figs. 13A e 13B após remoção e hibridízação com uma sonda genética de tubulina de Arabidopsis. A pequena banda em cada uma das zonas 1 e 2 é o que resta da sonda AtS21 anterior. A exposição foi realizada durante 48 horas a -80°C,

A Fig. 14 é um gráfico que compara as actividades GUS expressas pelos promotores AtS21 e 35S. As actividades GUS expressas pelo promotor AtS21 em sementes de Arabidopsis em desenvolvimento e folhas são apresentadas lado a lado com aquelas expressas pelo promotor 35S. As actividades GUS 10 expressas pelo promotor AtS21 nas sementes secas do tabaco e folhas são apresentadas do lado direito da figura. A actividade GUS na folha de tabaco é tão baixa que não aparece nenhuma coluna. "G-H" designa a fase globular até à fase coração; "H-T" designa a fase coração à fase torpedo; "T-C" designa a fase torpedo até à fase de cotilédone; "Early C" é a expressão inglesa para cotilédone prematuro; "Late C” é a expressão inglesa para cotilédone tardio. Os desvios padrões encontram-se listados na Tabela 2. A Fig. 15A é uma análise de transferência em gel efectuada em amostras de 5 pg de ARN isolado da folha de borragem, raiz e tecido de embrião 12 dpp utilizando como sonda de hibridização cADN marcado com Δβ-dessaturase da borragem. A Fig. 15B representa um gráfico correspondente aos resultados da análise de Northern para a experiência apresentada na Fig. 15A. A Fig. 16A é um gráfico que apresenta a acumulação relativa de ARN de legumina em embriões em desenvolvimento da borragem baseadas em resultados da transferência de Northern. A Fig. 16C é um gráfico que apresenta uma acumulação de ARN de Δβ-dessaturase em embriões em desenvolvimento da borragem baseada em resultados da transferência de Northern. A Fig. 17 é uma análise de PCR que mostra a presença do gene delta Δβ-dessaturase da borragem em plantas transformadas da colza. As zonas 1,3 e 4 foram carregadas com reacções PCR efectuadas com ADN de plantas transformadas com o gene delta Δβ-dessaturase da borragem ligado à região 5'reguladora da oleoresina; a zona 2: ADN de planta transformada com o gene da delta Δβ-dessaturase da borragem ligado à região reguladora 5' da albumina; zonas 5 e 6: ADN de plantas não transformadas; zona 7: η marcador de peso molecular (cadeia de 1 kb, Gibco); zona 8: PCR. sem adição de ADN molde; zona 9: controlo com ADN de Agrobacterium tumefaciens EHA 105 contendo o plasmídeo pAN3 (i.e. o gene delta Δβ-dessaturase da borragem ligado à região reguladora 5').

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção disponibiliza uma cassette de expressão que compreende a região reguladora da oleoresina 5' que dirige para a expressão específica na semente constituída pela sequência nucleótidica apresentada na SEQ ID N° 12 ligada operacionalmente a pelo menos um ácido nucleico que codifica para um gene heterólogo da Δ6-dessaturase. Uma tal cassette de expressão pode ser incorporada numa variedade de vectores de replicação autónoma de modo a construir-se um vector de expressão.

Verificou-se surpreendentemente que as plantas transformadas com os vectores de expressão da presente invenção produzem níveis de GLA que se aproximam do nível encontrado naquelas poucas espécies de plantas que produzem GLA naturalmente, tal como a primavera da noite (Oenothera bienais) .

Quando aqui utilizado, o termo "cassette" diz respeito a uma sequência nucleótidica capaz de expressar um gene particular se o dito gene for inserido de modo a estar operacionalmente ligado a uma ou mais regiões reguladoras presentes na sequência nucleótida. O termo "expressão específica nas sementes", quando aqui utilizada refere-se à expressão em várias porções de uma semente da planta, tal como o endosperma e o embrião.

Um ácido nucleico isolado que codifica para uma região reguladora 5' de um gene de oleoresina pode ser fornecido como se segue. Clones genómicos recombinantes da oleoresina 12 são isolados por rastreio de uma biblioteca de ADN genómico de planta com um cADN {ou uma sua porção) representando ARNm de oleoresina. .Foram isolados vários cADNs diferentes de oleoresina. Os métodos utilizados para isolar tais cADNs, assim como os nucleótidos e as sequências correspondentes de aminoácidos foram publicados em Kirik et al. 1986 Plant Mol. Biol.31:413-417; Zou et al. Plant Mol. Biol. 31:429-433; Van Rooigen et al. 1992 Plant Mol. Biol. 18:1177-1179. 0 rastreio por subtracção virtual de uma biblioteca especifica de um tecido utilizando uma sonda de cADN de polimerase iniciada aleatoriamente (RP-PCR- do. inglês random primed polymerase chain (RP-PCR) é um outro método para obter um cADN de oleoresina útil para rastrear uma biblioteca de ADN genómico de planta. . 0 rastreio por subtracção virtual refere-se a um método em que uma biblioteca de cADN é construída a partir de um tecido alvo e apresentada a uma baixa densidade de modo a que clones de cADN individuais possam ser facilmente separados. Estes' clones de cADN são rastreados de forma subtractiva com quantidades condutoras (i.e., concentrações de ADN para conduzir cineticamente a reacção de hibridização) de sondas de cADN feitas de tecido ou tecidos diferentes do tecido alvo (i.e. tecido condutor). As placas hibridizadas representam genes que são expressos tanto nos tecidos alvo e nos tecidos condutores; as placas não hibridizadas representam genes que podem ser específicos do tecido alvo ou genes pouco abundantes que não podem ser detectados pela sonda de cADN condutora. Os cADNs não hibridizados são seleccionados como genes putativos específicos do tecido alvo e ainda analisados por uma sequenciação de uma passagem e hibridização de Northern. PCR iniciada aleatoriamente (RP-PCR) envolve a síntese de grandes quantidades de sondas de cADNs a partir de uma 13 quantidade vestigiária de cADN molde. 0 método combina o poder de amplificação de PCR com uma representação de iniciação aleatória para amplificar simultaneamente e. marcar um cADN de cadeia dupla numa reacção de tubo único. Métodos considerados úteis para obter ADN recombinante genómico de oleoresina são fornecidos em Sambrook et al. 1989, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor , NY, por exemplo, ou qualquer um da míriade de manuais de laboratório sobre tecnologia de ADN recombinante que estão largamente disponíveis. Para determinar as sequências . nucleótidicas encontram-se disponíveis uma multiplicidade de técnicas e são conhecidas pelo vulgar perito no estado da técnica. Por exemplo, fragmentos de restrição contendo uma região reguladora da oleoresina podem ser subclonadas no local do polilinker de um vector de sequenciação, tal como pBluescript (Stratagene). Estes subclones pBluescript podem então ser sequenciados pelo método do didesóxi de dupla cadeia (Chen e Seeburg, 1985, ADN 4:165). A região reguladora da oleoresina compreende os nucleótidos 1-1267 da Fig. 9 (SEQ ID N°:12). A região reguladora 5'da presente invenção pode ser obtida por digestão da endonuclease, ou exonuclease de restrição de um clone genómico de oleoresina. Assim, por exemplo, o nucleótido conhecido, ou sequência de aminoácidos da região codificante de um gene isolado da oleoresina (e.g. Fig. 7) é alinhada com a sequência de ácidos nucleicos, ou a sequência de aminoácidos deduzida de um clone genómico de oleoresina isolado e da sequência flanqueadora 5' (i.e. a sequência a montante do codão de iniciação da tradução da região de codificação) do clone genómico da oleoresina isolado localizado. A região reguladora 5'da oleoresina apresentada na SEQ ID N°:12 (nucleótidos 1-1267 da Fig. 9) pode ser gerado 14 tanto a partir .de um clone genómico possuindo um excesso da sequência flanqueadora 5' como· de uma sequência de codificação, ou ambas através de supressão mediada pela exonuclease III. Isto é conseguido fazendo digerir ADN preparado adequadamente com exonuclease III (exoIII) e removendo aliquotas em intervalos de tempo crescentes durante a digestão. Os fragmentos de ADN sucessivamente mais pequenos resultantes podem ser sequenciados para determinar o ponto final exacto das supressões. Estes são vários sistemas comerciais disponíveis que utilizam a exonuclease III {exoIII) para criar uma tal série de supressões, por ex. Promega Biotech, sistema "Erase-A-Base". Alternativamente, os iniciadores de PCR podem ser definidos para permitir a amplificação directa das ditas regiões reguladoras 5/ .

Utilizando as mesmas metodologias o vulgar perito no estado da técnica pode gerar um ou vários fragmentos de supressão de nucleótiods 1-1267 como apresentado na SEQ ID N°: 12. A identificação das sequências reguladoras 5'da oleoresina que dirigem para a expressão específica na semente, compreendendo os nucleótidos 1-1267 da SEQ ID N°:12 e modificações ou os seus fragmentos de supressão' pode ser conseguida, através de fusões transcricionais de sequências específicas com as sequências de codificação de um gene heterólogo, transferência do gene quimérico para um hospedeiro adequado, e detecção da expressão do gene heterólogo. 0 ensaio utilizado para detectar a expressão depende da natureza da sequência heteróloga. Por exemplo, os genes repórter exemplificados por cloroanfenicol acetil transferase e β-glucuronidase (GUS) são utilizados habitualmente para avaliar a competência transcripcional e de tradução de construções quiméricas. Encontram-se 15 disponíveis ensaios padrão para detectar de forma sensível a enzima repórter num organismo, transgénico. 0 gene da β-gluçuronidase (GUS)é útil como repórter da actividade promotora em plantas transgénicas, devido à elevada estabilidade da enzimas nas células das plantas, a falta de actividade intrínseca da β-glucuronidase nas plantas superiores e disponibilidade de um ensaio fluorimétrico quantitativo e de uma técnica de localização histoquímica. Jefferson et al. {1987 EMBO J 6:3901) estabeleceram procedimentos padrão para a detecção bioquímica e histoquímica da actividade GUS em tecidos de plantas. Os ensaios bioquímicos são efectuados misturando lisados de tecidos de plantas com 4-metilumberiferil-p-D-glucuorónido, um substracto fluorimétrico para GUS, incubando durante uma hora a 37 °C e depois medindo a fluorescência da 4-metil-umbeliferona resultante. A localização histoquímica da actividade GUS é determinada incubando amostras de tecido de plantas em 5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronido (X-Gluc) durante cerca de 18 horas a 37°C e observando o padrão das manchas, de X-Gluc. A construção de tais genes quiméricos permite a definição de sequências reguladoras específicas e demonstra que estas sequências podem dirigir a expressão directa dos genes heterólogos de uma maneira específica na semente..

Um outro aspecto da invenção é direccionado para cassettes de expressão e vectores de expressão (também aqui referidos como "genes quiméricos") compreendendo uma região reguladora 5' de um gene de oleoresina que direcciona para uma expressão especifica da semente operacionalmente ligado à sequência de codificação de um gene heterólogo de tal modo que· o elemento regulador é capaz de controlar a expressão de. um ácido nucleico que codifica para um gene heterólogo de A6-dessaturase. Se necessário, elementos reguladores adicionais, ou .· partes destes elementos 16 suficientes para provocar a expressão resultando na produção de uma quantidade eficaz do polipéptido codificado pelo gene heterólogo são incluídos nas construções quiméricas. Exemplos de genes do metabolismo lipídico incluem dessaturases lipídicas tais como as Δ6-

dessaturases, A12-dessaturases, A15-dessaturases e outras dessaturases relacionadas, tais como as estearoilo-ACP dessaturases, proteínas transportadoras de. acilo (ACPsj , tioesterases, acetil transacilases, . acetil-coA carboxilases, cetoacil-sintases, malonil transacilases·,· e elongases. Tais genes dos metabolismo dos lípidos ' foram isolados e caracterizados a partir de várias bactérias diferentes e espécies' de plantas.. As., suas sequências codificadoras de nucleótidos,.. assim como métodos de isolar tais sequências codificadoras são revelados na literatura publicada e estão largamente disponíveis aos peritos no estado da técnica.

Em particular os genes da A6-dessaturase revelados na WO 96/21022 e no pedido de patente de invenção das requerentes pendente US N° 08/3.66, 779 depositado a 30 de Dezembro de 1994 são contemplados como.genes do metabolismo lipidico particularmente úteis na prática da presente invenção.

Os genes quiméricos da presente invenção são construídos ligando uma região reguladora- 5' de um ADN genómico de oleoresina como apresentado na SEQ ID N°12 com a sequência codificadora de um gene heterólogo. A justaposição destas sequências pode ser realizada de várias maneiras. Numa concretização preferida, a ordem das sequências de 5' a 3' é uma região reguladora 5' de oleoresina (incluindo um promotor), uma sequência codificadora, e uma sequência de terminação que inclui um local de poliadenilação. 17 Técnicas padrão para a construção de tais genes quiméricos são bem conhecidas dos peritos no estado da técnica e podem ser encontradas em referências tais como Sambrook et al. (1989). Encontram-se disponíveis uma variedade de estratégias para ligar fragmentos de ADN, cuja escolha depende da natureza dos fragmentos de ADN terminais. Um perito vulgar no estado da técnica reconhece que para os genes heterólogos serem expressos, a construção necessita de elementos promotores ' e sinais para uma poliadenílação eficiente do transcrito. Neste contexto,. a região 5' reguladora da oleoresina que contém a sequência promotora consenso conhecida como a caixa TATA pode ser ligada directamente a uma sequência de codificação heteróloga sem promotores.

Os fragmentos de restrição ou de supressão que contêm a caixa da oleoresina TATA são ligados numa orientação directa em relação a um gene heterólogo sem promotor, tal como a sequência de codificação da β-glucuronidase (GUS). 0 perito no estado da técnica irá reconhecer que as ditas regiões reguladoras 5' da oleoresina podem ser fornecidas por outros meios, por exemplo por síntese química, ou enzimática. 0 terminal 3' de uma sequência de codificação heteróloga está operacionalmente ligada a uma sequência de terminação compreendendo um local de poliadenílação, exemplificado por, mas não limitado a local de poliadenílação da nopalina sintase, ou o local dé poliadenílação da octopina T-ADN do gene 7. 'Alternativamente, o local de poliadenílação pode ser fornecido pelo gene heterólogo.

Ainda são descritos processos para aumentar os níveis. de genes heterólogos em sementes de plantas. De acordo com estes processos, as ditas cassettes de expressão e vectores de expressão são introduzidos numa planta para efectuarem a expressão de um gene heterólogo. Por exemplo, um método 18 para produzir uma planta com níveis acrescidos de um produto de uma síntese de ácido gordo, ou um gene de metabolismo lipídico é obtido transformando uma célula de planta com um vector de expressão compreendendo uma região reguladora 5' de oleoresina ligada operacionalmente a um gene de uma sintese de ácido gordo, ou. do metabolismo lipidico e que regenera uma planta com níveis acrescidos do produto da dita síntese de ácido gordo, ou gene do metabolismo lipídico. São também descritos métodos para reduzir os níveis de produção de um gene que é nativo em relação a uma planta que compreendem a transformação de uma célula de planta com um vector de expressão compreendendo a dita região reguladora da oleoresina ligada operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico que é complementar ao gene da planta nativa. Desta forma, níveis de produto endógeno do gene nativo da planta são reduzidos através do mecanismo conhecido como regulação anti-sentido. Assim, por exemplo, níveis de um produto de um gene da síntese de ácido gordo, ou de gene de metabolismo lipidico são reduzidos transformando uma planta com um . vector de expressão compreendendo uma dita região reguladora 5' da oleoresina ligada operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene de uma síntese de ácido gordo, ou para um gene do metabolismo lipidico. A presente invenção também descreve um método de co-supressão de um gene que é nativo em relação a uma planta que compreende a transformação de uma célula de planta com um vector de expressão compreendendo uma dita região reguladora 5' de oleoresina operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico que codifica para o gene nativo da planta. Desta maneira, níveis de produto endógeno do gene da planta nativa são reduzidos através do mecanismo 19 conhecido como co-supressão. Assim, por exemplo, níveis de um produto de um gene da síntese de ácido gordo ou gene de metabolismo lipidico são reduzidos transformando uma planta com um vector de expressão compreendendo uma dita região reguladora 5' da oleoresina ligada operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene nativo de síntese de ácido gordo, ou gene do metabolismo lipidico nativo da planta. Apesar do mecanismo exacto da co-suppressão não ser completamente compreendido um perito no estado da técnica encontra-se familiarizado com obras publicadas que reportam as condições experimentais e resultados associados com a co-supressão (Napoli et al. 1990 The Plant Cell 2:270-289; Van der Krol 1990 The Plant Cell 2:291-299.

Para fornecer uma resposta regulada dos genes heterólogos, . as plantas são transformadas com as construções do gene quimérico da invenção. Métodos de transferência genética são bem conhecidos no estado da técnica. Os genes quiméricos podem ser introduzidos nas plantas através do procedimento de transformação-regeneração de disco de folha como descrito por Horsch et al. 1985 Science 227:1229. .Podem ser também utilizados outros métodos de transformação, tal como cultura de protoplasto (florsh et al. 1984 Science 223:496, DeBlock et al. 1984 EMBO J. 2:2143, Barton et al. 1983. Cell 32:1033) e encontram-se no âmbito da invenção. Numa concretização preferida as plantas são transformadas com vectores derivados de Agrobacterium, tais como os descritos em Klett et al. (1987) Annu. Ver. Plant Physiol. 38:467. Outros métodos bem conhecidos estão disponíveis para inserir os genes quiméricos da presente invenção em células de plantas. Tais métodos alternativos incluem estratégias biolísticas (Klein et al. 1987 Nature 327:70), 20 electroporação, recebimento de ADN quimicamente induzido, e utilização de vírus, ou de pólen como vectores.

Quando necessário para o método de transformação, os genes quiméricos da presente invenção podem ser inseridos num vector de transformação da planta, i.e. o vector binário descrito por Bevan, M. 1984 Nucleic Acids Res. 12:8711-8721. Vectores de transformação da planta podem ser obtidos modificando o sistema natural de transferência genética de Agrobacterium tumefaciens. O sistema natural compreende grandes plasmídeos Ti (indutores de tumores) contendo um grande segmento, conhecido como T-ADN, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T-ADN. A região de T-ADN tem como fronteira repetições terminais. Nos vectores binários modificados, os genes indutores de tumores foram suprimidos e as funções da região vir são utilizadas para transferir ADN estranho bordejado pelas sequências de fronteira de T-ADN. A regíão-T também contém um marcador seleccionãvel para a resistência a antibiótico, e um local de clonagem múltiplo para inserir sequências a transferir. Tais estirpes sujeitas a engenharia são conhecidas como estirpes de A. tumefaciens "desarmadas" e permitem a transferência eficiente das sequências bordejadas pela região-T para o genoma nuclear das plantas.

Discos de folhas de superfície esterilizada e outros tecidos susceptíveis são inoculados com A. tumefaciens contendo ADN estranho "desarmado" cultivados durante uma série de dias e depois transferidos para um meio contendo antibiótico. Os rebentos seleccionados foram então seleccionados após enraizamento em meio contendo o antibiótico apropriado e transferidos para o solo. As plantas transgénicas são polinizadas e as sementes destas plantas são colhidas e feitas crescer em meio antibiótico. 21 A expressão de um gene heterólogo ou repórter em sementes em desenvolvimento, plantas novas e plantas maduras podem ser monitorizadas por ensaios imunológicos, histoquímicos ou de actividade. Como aqui discutido, a escolha de um ensaio para a expressão de um gene quimérico depende da natureza da região de codificação heteróloga. Por exemplo, a análise de Northern pode ser utilizada para avaliar a transcrição se se encontrarem disponíveis sondas nucleótidicas adequadas. Se se encontrarem disponíveis anticorpos para os polipéptidos codificados pelo gene heterólogo, a ánálise de Western e localização imunohistoquímica pode ser utilizada para avaliar a produção e localização do polipéptido. Dependendo do gene heterólogo podem ser utilizados ensaios bioquímicos adequados. Por exemplo, as acetiltransferases são detectadas medindo a acetilação de um substracto padrão. A expressão de um gene de uma dessaturase lipidica pode ser ensaiada através da análise.de ésteres metálicos de ácidos gordos (FAMES).

Outro aspecto da presente invenção disponibiliza plantas transgénicas, ou descendência destas plantas contendo os genes quiméricos da invenção. Estão contempladas tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. As células de plantas são transformadas com os genes quiméricos através de quaisquer dos processos de transformação de plantas descritos acima. A célula da planta transformada, geralmente na forma de uma cultura de caule, disco de folha, explante, ou planta completa (através do método de infiltração com vácuo de Bectold et al. 1993 C.R. Acad. Sei. Paris, 316:1194-1199) é regenerada numa planta- transgénica completa, através de métodos bem conhecidos do vulgar perito no estado da técnica (por ex. Horsh et al. 1985 Science 227:1129) . Numa concretização preferida, a planta transgénica é o girassol, algodão, 22 colza, milho, tabaco, Arabidopsis, amendoim, ou soja. Uma vez que a descendências das plantas transformadas herdam os genes quiméricos, as sementes, ou estacas de plantas transformadas são utilizadas para manter. a linha transgénica.

Os exemplos seguintes ilustram ainda a invenção. Exemplo 1

Isolamento de ARN polissomai ligado à membrana e construção da biblioteca de cADN de borragem

Foram isolados polissomas ligados à membrana a partir de sementes de borragem 12 dias após a polinização (12DPP) utilizando o protocolo estabelecido para ervilhas por Larkins e Davies (1975 Plant Phys: 55:749-756). 0 ARN foi extraído a partir dos polissomas como descrito por· Mechler (1987 Methods in Enzymology 152:241-248, Academic Press). ARN Poli-A+ foi isolado a partir do ARN polissomal ligado à membrana utilizando esferas Oligotex.dT™ (Qiagen). 0 cADN correspondente, foi feito utilizando o kit de sintese da Stratagene ZAP. A biblioteca de cADN. foi construída no vector lambda ZAP II (Stratagene) utilizando o kit lambda ZAP II. A biblioteca primária foi empacotada com extracto de empacotamento- Gigapack II Gold (Stratagene).

Exemplo 2

Isolamento de um cADN Δ-6 dessaturase de borragem

Protocolo de hibridização A biblioteca de cADN de borragem amplificada foi colocado numa placa a baixa densidade (500 pfu em placas de 23

Petri de 150 mm) * Foram reduzidos cADNs de proteína de armazenamento da semente muito comuns (subtraídos do total de cADNs) por rastreio com os cADNs correspondentes.

Sondas de hibridização para rastreio da biblioteca de cADN de borragem foram geradas utilizando a síntese de ADN de iniciação aleatória como descrito por Ausubel et al. (1994 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N. Y.) e correspondia aos cADNs anteriormente identificados da proteína de armazenamento na semente abundantemente expressa. Foram removidos nucleótidos não incorporados utilizando uma coluna giratória G-50 (Boehringer Mannheim). A sonda foi desnaturada por hibridização fervendo num banho de água durante 5 minutos, e depois arrefecidas rapidamente em gelo. Filtros de nitrocelulose que transportam bacterió.fago fixo recombinante foram pré-hibridizados a 60 °C durante 2-4 horas numa solução de' hibridização [4X SET (600 mM NaCl, 80 mM de Tris-HCl, 4 mM Na2EDTA; pH 7.8), 5x reagente de Denhardt's (0,1% de albumina de soro de bovino, 0,1 % de Ficoll, e 0,1% de polivinilpírrolidona), 100 μg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado, 50 pg/ml de poliadenina e 10 μρ/ιηΐ de policitidina) , Isto foi substituído com uma solução de hibridização .fresca à qual foi adicionadas uma sonda radioactiva. desnaturada (2 ng/ml de solução de hibridização). Os filtros foram incubados a 60°C com agitação de um dia para o outro. Os filtros foram lavados sequencialmente em 4.x, 2x e lx SET (NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM, Na2EDTAl mM; pH 7,-8) durante 15 minutos cada um a 60°C. Os filtros foram secos ao ar e depois expostos a um filme de raios-X durante 24 horas com écrans intensificadores a -80°C.

Placas não hidrolizantes foram excisadas utilizando um protocolo de excisão da Stratagene e reagentes. As colónias bacterianas resultantes foram utilizadas para inocular 24 culturas líquidas e foram sequenciadas ou manualmente, ou por um sequenciador ABI automatizado.

Sequenciação aleatória de cADNs de uma semente de borragem 12 (DPP) de uma biblioteca polissomal ligada à membrana

Cada cADN correspondente a uma placa não hibridizante foi sequenciado uma vez e foi gerada uma etiqueta de sequência de 200-300 pares de bases. Toda a sequenciação foi efectuada por sequenciação em ciclos (Epicentre). Foram geradas acima de 300 etiquetas de sequências (ESTs)'. Cada etiqueta de sequência foi comparada com a base. de dados GenBank utilizando o algoritmo BLAST (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 215:403-410). Foram identificados vários genes do metabolismo lipidico, incluindo o gene da. Δ6-dessaturase.

Pesquisas a base de dados com o clone de cADN designado mbp-65 utilizando BLASTX com a base de dados GenBank resultou uma correspondência significativa çom a. Δβ-dessaturase da Synechocystis anteriormente isolado. Contudo, foi determinado, que mbp-65 não era um cADN de comprimento completo. Um cADN de comprimento completo foi isolado utilizando mbp-65 para rastrear a biblioteca polissomal ligada à membrana da borragem. O clone resultante foi designado pANl e a inserção de cADN de pANl foi sequenciada pelo método de sequenciação em ciclos. A sequência de aminoácidos deduzida a partir da estrutura de leitura aberta (Fig. 1 SEQ ID N°:l) foi comparada com outras dessaturases desconhecidas utilizando o programa de alinhamento de proteínas Geneworks (IntelligGenetics). Este alinhamento indicou que a inserção de cADN do pANl foi o gene da Δβ-dessaturase da borragem.

0 dendograma resultante (Figura 2) mostra que a Δ15-dessaturase e a A12-dessaturase compreende dois grupos. A 25 nova sequência de borragem isolada e a anteriormente isolada A6-dessaturase da Synechocystis (patente de invenção US N° 5,552,306) formado a partir de um terceiro grupo distinto. A comparação de motivos de aminoácidos comuns a dessaturases e que se pensa estarem envolvidos cataliticamente na ligação a metal ilustra a semelhança global da proteína codificada pelo gene da borragem em relação a dessaturases em geral e à Δδ-dessaturase da Synechocystis em particular (Tabela 1). Simultaneamente a comparação dos motivos na Tabela 1 indica diferenças definidas entre esta proteína e outras dessaturases de plantas. Além disso a sequência da borragem é também distinguida das dessaturases de ácidos gordos conhecidas associadas à membrana das plantas pela presença de um motivo de ligação ao hemo conservado nas proteínas do citocromo b5 (Schmidt et al. 1994 Plant. Mol. Biol. 26:631-642)(Figure 1) . Assim, enquanto que estes resultados sugerem claramente que o cADN isolado era um gene da Δ6-dessaturase da borragem, foi necessária confirmação adicional. Para confirmar a identidade do cADN da Δ6-dessaturase da borragem, a inserção do cADN a partir de pANl foi clonada numa cassette de expressão para uma expressão estável. O vector pBI121 (Jefferson et al. 1987 EMBO J. 6:3901-3907) foi preparado para ligação por digestão com BamHI e EcoICR I (um isoesquisómero de Saci que deixa extremidades rombas; disponível na Promega) que faz a excisão da região que codifica para GUS deixando o promotor 35S e o terminador NOS intactos. 0 cADN da Δ6-dessaturase da borragem foi excisado a partir do plasmídeo recombinante (pANl) por digestão com BamHI e Xhol. O terminal Xhol foi tornado rombo efectuando uma reacção de enchimento catalisada pelo fragmento Klenow da ADN polimerase I. Este fragmento foi então clonado nos locais BamHI/EcoICR I do pBI121.1, resultando no plasmídeo pAN2. 26

Tabela 1

Comparação de motivos de aminoácidos comuns em dessaturases ligadas à membrana

Dessaturase Caixa Caixa Caixa lipídica metálica 1 metálica 2 Borragem Δ6 WIGHDAGH [SEQ. ID. NO: 15) NVGHDANH {SEQ. ID. Na HNAHH (SEQ. ID. NO:2t) FQIEHH (SEQ. ID. NO£9) Synechocystis HNYLHH (SEQ. ID. NO;22) HQVTHH (SEQ. ID. NO30) Δ6 16) Cloroplasto Arab. Δ15 VLGHDCGH (SEQ. ID. Na 17) HRTHH (SEQ. ID. NO:23) HVIHH (SEQ. ID. NO:31) Arroz Δ15 VLGHDCGH'{5EQ. ID. NO: HRTHH (SEQ. ID. NO:23) HVIHH {SEQ. ID. N031) Cloroplasto de Glicina Δ15 VLGHDCGH (SEQ. ID. NO: 17) HRTHH (SEQ. ID. N0:23) HVIHH {SEQ. ID. NO:31) Arab. fad3 (Δ15) VLGHDCGH (SEQ. ID, NO: 17) HRTHH (SEQ. ID.NO:23) HVIHH (SEQ. JD. NO:31) Brassica fad3 (Δ15} . VLGHDCGH (SEQ, ID. NO 17) HRTHH (SEQ. ÍD.N0.-23) HVIHH (SEQ. ID. NO:31) Borragem Δ12 (Pl-81) * VIAHECGH (SEQ. ID. NO: 18) HRRHH (SEQ. ID. NO:24) HVAHH (SEQ. ID. NO:32) Arab. fad2 (Δ12) VIAHECGH (SEQ, ID. NO; 1Θ) HRRHH (SEQ. ID. NO:24) HVAHH (SEQ..ID. NO:32) cloroplasto Arab. Δ12 VIGEDCAH (SEQ. ID. NO: 19) HDRHH (SEQ. ID. NO:25) HIPHH (SEa ID. NO:33). Glicina plastid Δ12 VIQHDCAH (SEQ. ID. N& 19) V1GHDCAE (SEQ. ID. NO: 13) HDRHH (SEQ. ID. NO:25) HIPHH (SEQ. ID. NO:33) Espinafre platidial n-6 HDQHH (SEQ. ID. ΙΜΟ:2β) HIPHH (SEQ. ID. NO:33) Synechocystis Δ12 VVGHDCSH (SEQ. ID. NO: 20) HDHHH (SEQ. ID, NO;27) HIPHH (SEQ. ID. NO;33) Anabaena Δ12 HNHHH (SEQ. ID. NO:28) HVPHH (SEQ. ID. NO:34) VLGHDCGH (SEQ. ID, NO: 17) *P1-81 é um cADN de comprimento completo que foi identificado por análise de EST e apresenta uma elevada semelhança com a dessaturase Δ12 da Arabidopsis (fad2) .

Exemplo 3

Preparação de plantas transgénicas e preparação e análises de ésteres metilicos de ácidos gordos (FAMEs) 0 plasmídeo de expressão pAN2 foi utilizado para transformar o tabaco (Nícotlana tabacumr xanthi) via 27

Agrobacteriium tumefaciens de acordo com procedimentos padrão (Horsch, et al. 1985 Science 227:1229-1231; Bogue et al. 1990 Mol, Gen. Genet, 221:49-57) com excepção de que os transformantes iniciais foram seleccionados em 100 μg/ml de canamicina.

Os tecidos de plantas transgénicas foram congelados em azoto liquido e liofilizados de um dia para o outro· 'FAMEs foram preparados de acordo com o descrito por Dahmer et al. (1989) J. Amer. Oi'1. Chem. Soc. 66:543-548 . Nalguns casos o solvente foi evaporado novamente e os FAMEs foram novamente suspensos em'acetato de etilo e extraídos uma vez com água desionizada para remover quaisquer contaminantes solúveis em água. Os FAMEs foram analisados utilizando um cromatógrafo gás-líquido Tracor-560 como anteriormente descrito por (Reddy et al. 1996 Nature Biotech. 14:639-642}

Como indicado na Fig. 3, folhas de tabaco transgénicas contendo cADN de borragem produzida tanto por GLA e ácido octatetraenoico (OTA) (18:4 Δ6, 9', 12, 15). Estes resultados demonstram assim que o cADN isolado codifica para uma Δ6-dessaturase de borragem.

Exemplo 4

Expressão de Δβ-dessaturase na borragem A expressão nativa de A6-dessaturase foi examinada por análise de Northern do ARN derivado de tecidos da borragem. 0 ARN foi isolado a partir de embriões de borragem em desenvolvimento seguindo o método de Chang et al. 1993 Plant Mol. Biol. Rep. 11:113-116. O ARN foi separado por electroforese em geles de formaldeído-agarose, transferido para membranas de Nylon por transferência capilar, e imobilizado cozendo a 80°C durante 30 minutos seguindo 28 protocolos padrão {Brown T., 1996 em Current Protocols in Molecular Biology, eds. Auselbel, et al [Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque] pág. 4.9. 1-4.9.14). Os filtros foram pré-incubados a 42°C numa solução contendo 50% de formamida desionizada, 5X reagente de Denhardt, 5X SSPE (NaCl 900 mM; fosfato de sódio.5,0 mM, pH 7,7; e EDTA 5 mM) , SDS 0,1%, e 200 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado. Após duas horas, os filtros foram adicionados a uma solução fresca da mesma composição com a adição de sonda de hibridizaçâo radioactiva desnaturada. Neste caso, as sonda utilizadas foram cADN de legumina de borragem (Fig.l6A), cADN de borragem de oleoresina {Fig. 16B), e cADN de Δβ-dessaturase de borragem (pANl, Exemplo 2) (Fig. 16C) . A legumina de borragem e cADNs de oleoresina foram isolados por clonagem de EST e identificada por comparação com a base de dados da GenBank utilizando o algoritmo BLAST como descrito no Exemplo 2. A variação da carga foi corrigida por normalização para níveis de borragem EFla mARN. EFla mARN foi identificado correlacionando o cADN correspondente obtido por análise de EST descrita no Exemplo 2.. Os filtros foram hibridizados a 42°C durante 2-20 horas, depois lavados como descrito acima (com excepção do facto da temperatura ser 65°C), secos ao ar, e expostos a um filme de raios-X.

Como representado nas Fig. ISA e 15B, a Δβ-dessaturase é expressa basicamente na semente de borragem. As sementes de borragem atingem a maturação entre os dias 18-2 0 após polinização (dpp). A expressão de mARN de Δβ-dessaturase ocorre ao longo dos intervalos de; tempo recolhidos (8-20 dpp), mas parece ser máximo de 10-16 dias após polinização. Este perfil de expressão é semelhante ao observado para a oleoresina da borragem e mARNs da proteína 12S de armazenamento na semente (Figs. 16A, 16B, e 16 C). 29

Exemplo 5

Isolamento e caracterização de um novo cADN da oleoresina 0 cADN da oleoresina (AtS21) foi isolado por rastreio de uma biblioteca - de cADN por subtracção virtual de uma semente em desenvolvimento de Arabidopsis utilizando uma sonda de. cADN de reacção em cadeia da polimerase iniciada aleatoriamente (PC-PCR) do tecido da raiz.

Preparação de ARN

Foram cultivadas plantas de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta sob iluminação contínua numa mistura de vermiculite/solo à temperatura ambiente (22°C).. Foram dissecados siliquas 2-5 dias após florescência .para recolher. separadamente sementes em desenvolvimento e tegumentos de siliqua. Foram também colhidos botões de flores iniciais contendo inflorescências e flores completamente abertas, folhas e siliquas completas um ou três dias após florescência. Foram obtidas raízes de plântulas que tinham sido feitas crescer em meio líquido Gamborg Bs (GIBCO BRL) durante duas semanas. As sementes para cultura de raiz foram esterilizadas previamente com 50% de branqueador durante cinco minut.os e lavadas extensivamente com água. Todos os tecidos foram congelado em azoto liquido e armazenados a -80 °C até serem usados. Os ARNs totais foram isolados seguindo um protocolo com uma extracção a quente fenol/SDS e precipitação com LiCl (Harris et al. 1978 Biochem. 17:3251-3256; Galau et al. 1981 J. Biol. Chem. 256:2551-2560). Poly A + ARN foi isolado utilizando cromatografia em coluna oligo dT de acordo com os protocolos dos fabricantes (Pharmacia ou 30

Stratagene) ou utilizando partículas de latex oligotex dT (Qiagen).

Construção de bibliotecas de ADN específicas de tecido

Bibliotecas de cADN de flores, de siliqua de um dia, de siliqua de três dias, de folhas, raízes e sementes em desenvolvimento, cada uma foi construída utilizando 5 μ de poly A+RN utilizando o kit ' de síntese· ZAP cADN (Stratagene). Os cADNs foram clonados direccionalmente nos locais EcoRI e Xhol de pBlbluescript SK(-) no vector χ-ZAPII (Short et al. 1988 Nucleic Açids Res. 16:7583-7600). As placas de fagos não recombinantes foram identificadas pelo desenvolvimento da cor azul em placas NZY contendo X-gal (5'b,romo-4-cloro-3-indoil^-D-galactopiranosido) e IPTG (isopropil-l-tio-p-D-galactopiranosído) . As . bases não recombinantes para as bibliotecas de cADN da flor, siliqua de um dia, siliqua de três dias, folha, raiz e semente em desenvolvimento- foram 2,8%, 2%m 3,3%, 6,5%, 2,5%, e 1,9% respectivamente.

Marcação de ADN por iniciação aleatória

As inserções de cADN de clones isolados (cADNs não hibridizados) foram excisados por dupla digestão por EcoRI/Xhol e purificadas por gel para marcação por iniciação aleatória. A mistura da reacção de Klenow continha 50. ng de moldes de ADN, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, MgC12 5 mM,. DTT 7,5 mM e 50 μΜ de cada dCTP, dGTP, e dTTP, 10 μΜ de iniciadores aleatórios de hexamer (Boehringer Mannheim) , 50 μ<3ί cx-32 P-dATP, 3000 Ci/mmole, lOmCi/ml (DuPont), e 5 unidades de fragmento de Klenow de ADN polimerase (New England Biolabs). As reacções foram 31 efectuadas a 37°C durante uma hora. Foram utilizadas aliquotas das misturas reaccionais diluídas para precipitação de TCA e análise alcalina desnaturante em gel. As sondas de hibridização foram marcadas apenas com ADN de Klenow polimerase e os dNTPs não incorporados foram removidos utilizando colunas giratórias Sephadex R G-50 (Boehringer Mannheim). PCR iniciada aleatoriamente

Foi sintetizado cADN de cadeia dupla a partir de poly A+ ARN isolado a partir de tecido de Arabidopsis utilizando o sistema de síntese de cADN (Gibço BRL) com oligo dT12-18 como inciadores. Os cADNs mais longos do que 300 pb foram enriquecidos por cromatografia Sephacryl S-400 (Stratagene). Os cADNs fraccionados foram utilizados como moldes. para marcação por RP-PCR. A reacção continha Tris HCl ! 10 mM, pH 9,0, KCl 50 mM, Triton X-100.0,1%, 2 mM. MgCl2, 5 unidades de Taq ADN polimerase (PROMEGA), 200 μΜ de dCTP, cGTP, e dTTP e diferentes concentrações de iniciadores aleatórios de . hexamero .. a-32P dATP, 800 mCi/mmole, 10 mCi/ml (DuPont), e dATP frio num volume final de 25 μΐ. Após 5 minutos iniciais a 95°C, foram corridas diferentes reacções com diferentes programas para optimizar as condições do cADN de RP-PCR. A não ser que indicado de outro modo, o programa seguinte foi utilizado para a maior parte das marcações de sonda cADN RP-PCR: 95°C/ 5 minutos, depois 40 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 18°C/ 1 segundo, rampa a 30°C a uma velocidade de 0,l°C/segundo. 72°C/ 1 minuto. Produtos da RP-PCR foram, extraídos com fenol/clorofórmio e precipitados com etanol, ou purificados fazendo passar através colunas giratórias Sephadex G-50 (Boehringer Mannheim). 32

Transferência do clone por subtracção virtual A excisão de massa χ-ΖΑΡ de bibliotecas de cADN foi efectuada por co-infecção de células hospedeiras XLl-Blue MRF com fago recombinante das bibliotecas e do fago auxiliar ExAssist (STRATAGENE). Fagemideos excisados foram recuperados po.r células SOLR. Foram preparados . ADNs de plasmídeo através do método de ebulição mini-prep (Holmes et al. 1981 Anal. Biochem. 114:193-197) a partir de clones isolados aleatoriamente.. ' As inserções de cADN foram excisadas por dupla digestão por EcoRI e Xhol, e resolvidas em geles de 1% de agarose. Os ADNs foram desnaturados em NaOH 0,5 N e NaCl 1,5 m durante 45 minutos, neutralizados em Tris-HCl 0,5 M, pH 8,0, e NaCl 1,5 M durante 45 minutos e depois transferidas para membranas de nylon (Micron Separations, Inc.) em 10X SSC de um dia para o outro. Após uma hora de pré-hibridização a 65°C, uma sonda de raiz RP-cADN foi adicionada ao mesmo tampão de hibridização contendo 1% da fracção V de albumina bovina (Sigma), EDTA 1 mM, NaHPC>4 0,5 M, pH 7,2, SDS 7%. A hibridização continuou durante 24 horas, a 65°C. Os filtros foram lavados em albumina bovina a 0,5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM, pH 7,2, SDS 5% durante 10 minutos à temperatura ambiente, e 3x10 minutos em EDTA 1 mM, NaHPOs a 40 mM, pH 7,2, SDS 1% a 65°C. Autoradiografias foram expostas a filmes de raios X (Kodak) durante 2 a cinco dias a -80°C. A hibridização das transferências resultantes com sondas de RP-PCR de raizes, cADNs de sementes "subtraídas virtualmente" partilhadas com a população de mARN de raiz. Os cADNs de raízes restantes representando cADNs putativos específicos das sementes, incluindo aqueles que codificam para oleoresinas foram sequenciadas pelo método de sequenciação por ciclos identificando deste modo AtS21 como um clone cADN da oleoresina. 33

Análise da sequência de AtS21 0 cADN da oleoresina tem 834 pb de comprimento incluindo uma cauda poly A de 18 pb de comprimento (Fig. 4, SEQ ID N°:2). Possui uma homologia elevada em relação aos outros genes, da oleoresina da Arabidopsis, assim como das outras espécies. Recentemente um gene idêntico de oleoresina foi reportado (Zou, et al., 1996, Plant Mol. Biol. 31:429-433). A proteína .prevista tem de comprimento 191 aminoácidos com um domínio médio altamente hidrofóbico flanqueado por um domínio hidrofílico de cada lado. A existência de dois codões de paragem a montante na estrutura e a semelhança com outros genes de oleoresina·. índica que este cADN é de comprimento completo. Uma vez que existem dois codões de paragem na estrutura a montante mesmo a montante do primeiro ATG, este cADN é considerado como sendo um cADN de comprimento completo (Figura 4, SEQ ID N°: 2). A proteína prevista possui três domínios distintos baseados na distribuição dos seus resíduos de aminoácidos. Tanto os domínios, do terminal N e do terminal C são ricos em resíduos carregados enquanto que o domínio central é completamente hidrofóbico (Figura 5). No domínio central encontram-se localizados 20 resíduos de leucina e dispostos como repetições com uma leucina em cada 7-10 resíduos. Outros resíduos de aminoácidos não polares encontram-se também agrupados no domínio central tornando este domínio absolutamente hidrofóbico (Figura 6).

Pesquisas extensivas de diferentes bases de dados utilizando tanto cADN de AtS21 e a sua sequência prevista identificou oleoresinas da cenoura, milho, algodão, colza, Arabidopsis, e outras espécies de plantas. A homologia encontra-se basicamente restringida ao domínio hidrofóbico central. Foram encontradas sete sequências de oleoresinas 34 de Arabidopsis. AtS21 representa o mesmo gene que Z54164 que tem mais algumas bases na região não traduzida 5' . As sete sequências de Arabidopsis -de oleoresina disponíveis até agora foram alinhadas umas com as outras (Figura 7). 0 resultado sugeriu que as sete sequências caem em três grupos. 0 primeiro grupo inclui AtS21 (SEQ ID N°:5), X91918 (SEQ ID N°:6), e a sequência parcial Z29859 (SEQ ID N°:7).

Uma vez que X91918 (SEQ. ID N°: 6) possui apenas o último resíduo diferente de AtS21 (SEQ ID N°:5}, e uma vez que Z299859 (SEQ ID. N°: 7) possui apenas três resíduos de aminoácidos que são diferentes de AtS21 (SEQ ID N°:5) todas as três sequências representam provavelmente o mesmo gene. As duas sequências do segundo grupo, X62352 (SEQ ID N°:8) e Atol3 (SEQ ID- N°:9), são diferentes tanto em sequência e em comprimento. Assim, não há dúvida que representam dois genes independentes. Tal como no primeiro grupo, as duas sequências do terceiro grupo, X91956 (SEQ ID N°:10) e L40954 (SEQ ID N°:ll) também possuem apenas três resíduos divergentes que podem ser devidos a erros na sequência. Assim, X91956 (SEQ ID N°:10) e L40954 (SEQ ID N° : 11) representam provavelmente o mesmo gene. Ao contrário de todas as outras sequências de oleoresinas que foram previstas a partir das sequências de cADN, X62352 (SEQ ID N°:8) foi deduzida a partir de uma sequência genómica (Van Rooigen et al. 1992 Plant Mol. Biol. 18: 1177-1179). Concluindo, até agora· foram identificados quatro genes diferentes de oleoresina de Arabidopsis e são apenas conservados no meiò do centro hidrofóbico.

Análise de Northern

De modo a caracterizar o padrão de expressão do gene nativo AtS21, foi efectuada uma análise de Northern como descrito no Exemplo 4 com excepção de que a sonda foi cADN 35 de AtS21 (inserção pANl) marcada com 32P-dATP para uma actividade específica de 5 x 108 cpm/μg. .Os resultados indicaram que o gene AtS21 é fortemente expresso em sementes em desenvolvimento e fracamente expresso em tegumentos de siliqua (Figura 8A) . Um transcrito muito maior pode representar AtS21 não processado pré-ARNm, também foi detectado em ARN de sementes em desenvolvimento, AtS21 não foi detectado na. flores, folhas raízes (Figura 8A), ou em ARNs de siliqua de um dia. Uma análise de Northern diferente revelou que AtS21 é também fortemente expresso em sementes em inibição germinativa (Figs. 13A e 13B}.

Exemplo 6

Caracterização dos clones genómicos da oleoresina e isolamento do promotor da oleoresina

Os clones genómicos foram isolados por rastreio de. uma biblioteca de ADN genómico de Arabidopsis utilizando o cADN de comprimento completo (AtS21) como sonda. Foram mapeados dois clones genómicos por digestão com enzima de restrição seguido por hibridização de Southern utilizando a metade 5'do cADN cindido por Saci como sonda. Um fragmento Saci de 2 kb foi subclonado e sequenciado (Fig. 9, SEQ ID N°:35). As duas regiões do clone genómico são idênticas à sequência de cADN. Um intrão de 395 pb separa as duas regiões. 0 número de cópias do gene AtS21 no genoma de Arabidopsis foi determinado por hibridização de Southern de ADN genómico seguíndo-se digestão com as enzimas BamHI, EcoRI, HindIII, Saci e Xbal utilizando o cADN de comprimento completo como sonda (Figura 8B) . Foi detectada uma banda única em todos as zonas, excepto na digestão com Saci em que foram detectadas duas bandas. Uma vez que a 36 sonda cADN possui um local interno Saci, estes resultados indicam que a AtS21 é um simples gene de cópia no genoma de Arabidopsis. Uma vez que é conhecido que o genoma de Arabidopsis contém isoformas diferentes dos genes de oleoresina esta análise de Southern também demonstra que diferentes isoformas de oleoresina de Arabidopsis são divergentes ao nivel da sequência de ADN.

As duas regiões separadas por um intrão de 395 pb do fragmento de ADN genómico são idênticos à sequência do cADN de AtS21. Pesquisas nas bases de dados utilizando a sequência promotora 5'a montante da sequência de cADN.de AtS21 não identificou, qualquer sequência com homologia significativa. Além disso, a comparação da sequência promotora de AtS21 com outro promotor da oleoresina de Arabidopsis isolado anteriormente (Van Rooijen., et al., 1992} revelou pouca semelhança. A sequência promotora, de AtS21 é rica em bases A/T, e' contém 44 repetições directas que vão de 10 pb a 14 pb sendo permitido apenas um desemparelhamento

Duas repetições directas de 14 pb e um elemento de resposta putativo ABA encontram-se sublinhados na Figura 9.

Exemplo 7

Construção da cassette de expressão de Promotor AtS21/6US e padrões de expressão em Arabidopsis transgénica e no tabaco

Construção da cassette de expressão de promotor AtS21/GUS 0 fragmento de promotor de 1267 pb que começa na primeira G a montante do codão ATG do fragmento de ADN genómico foi amplificado utilizando PCR e foi fusionado com o gene repórter GUS para ser analisado, quanto à sua actividade. O fragmento promotor do clone genómico de AtS21 foi 37 amplificado por PCR utilizando o iniciador T7 GTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID N° : 13) e o iniciador 21P GGGGAT C CTATACTAAAACTATAGAGTAAAGG (SEQ ID N° : 14) complementar à região 5'não traduzida a montante do primeiro codão ATG (Figura 9) . Um local de clonagem BamHI foi introduzido pelo iniciador 21P. 0 fragmento amplificado foi clonado nos locais BamHI e Saci de pBluescript KS (Stratagene). Foram sequenciados os clones individuais para avaliar possíveis mutações PCR, assim como orientação das suas inserções. O clone correcto foi digerido com BamHI e HindlII, e o fragmento, do promotor excisado (1,3. kb) foi clonado nos locais correspondentes de pBIlOl.l .(Jefferson, R. A 1987a, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405; Jefferson et al., 1987b, EMBO J. 6:3901-3907) a montante do gene' GOS. O plasmídeo resultante foi designado pAN5 (Fig. 10) . A construção do promotor AtS21/GUS (pAN5) foi introduzida tanto no tabaco (pelo método do disco da folha, Horsc-h et al., 1985; Bogue et al. 1990 Mol. Gen. Gen. 221:49-57) e no ecotipo de Arabidopsis Colombia através de infiltração por vácuo como descrito por Bectold, et al. (1993) C. R. Acad. Sei. Paris, 316:1194-1199. As sémentes foram esterilizadas e seleccionadas em meio contendo 50 μρ/πιΐ de canamicina, 500 μg/ml de carbenicilina.

Ensaio de actividade GUS: padrões de expressão do gene repórter GUS foram revelados por coloração histoquímica (Jefferson, et al.., 1987a, Plant. Mol. Biol. Rep. 5:387-405). Foram corados diferentes tecidos numa solução de substracto contendo . 2 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucurónico (X-Gluc) (Research Organics, Inc.) ferrocianeto de potássio 0,5 mM, e cianeto férrico de potássio 0,5 mM em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0 a 37 °C de um dia para o outro e depois desidratado sucessivamente em 20%, 40% e 80% de etanol (Jefferson et 38 al., 1987). Foram tiradas fotografias utilizando um microscópio composto Axiophot (Zeiss) ou microscópio de dissecação Olympus S2H10. Os slides foram convertidos em imagens digitais utilizando um scanner de slides Spring/Scan 35LE (Polaroid) e compiladas utilizando Adobe Photoshop™ 3.0.5 e Canvas™ 3.5.

As actividades GUS foram medidas quantitativamente medidas por fluorometria utilizando 4-MUG 2 mM (4-metílumbeferil-p-D-glucuronide) como substracto (Jefferson, et al., 1987}. Sementes em desenvolvimento de Arabídopsis foram classificadas de acordo com as suas cores, e outros tecidos de plantas foram recolhidos e mantidos a -80°G até serem utilizados. Os tecidos' de plantas foram moídos em tampão de extracção contendo fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, EDTA 10 mM, β-mercaptoetanol 10 mM, Triton-X-100 0,1%, e lauril sarcósina de sódio. Os detritos dos tecidos foram removidos através de uma centrifugação de 5 minutos numa microcentrifuga. Foram retiradas aliquotas do sobrenadante e misturadas com substracto e incubadas a 37°C durante 1 hora. Foram testadas três réplicas para cada amostra. As reacções foram paradas através da adição de 4 volumes de carbonato de sódio 0,2 Μ. A fluorescência. foi lida utilizando um fluorómetro de ADN TKO-100 (Hoefer Scientific Instruments). Foram determinadas as concentrações de. proteína dos extractos pelo método de Bradford (Bio Rad) .

Padrões de expressão de promotor AtS21/GCJS em Arabídopsis e tabaco transqénicos

Na Arabídopsis, foi detectada actividade GUS em sementes verdes e em regiões nodulares em que siliquas, folhas caulinas e ramos se juntam no caule da inflorescência (Figuras 11A e 11B). Não foi detectada nenhuma actividade GUS em qualquer folha, raiz, ou flor, 39 tegumento de siliqua, ou nas regiões internodulares do caule de inflorescência. Estudos detalhados da expressão GUS nas sementes em desenvolvimento revelaram que o promotor AtS21 era apenas activo em sementes verdes em que os embriões já se tinham desenvolvido para lá da fase coração (Figuras 11C e 11G). Os embriões mais novos apresentando actividade GUS que poderia ser detectada por coloração histoquímica estavam na fase precoce de torpedo. É interessante que a coloração se encontrava apenas restringida à parte inferior do embrião incluindo hipocotilédone e radical embriónico. Não foi detectada coloração nos cotilédones novos (Figuras 11D e 11E) . Os cotilédones começaram a ser corados quando os embriões se encontravam na fase tardia de torpedo, ou mesmo na fase de cotilédone precoce (Figura 11F. e 11H). Mais tarde, os embriões completos estavam corados e a coloração tornou-se mais intensa à medida que os embriões iam . maturando (Figuras 11.1 e 11J) , . É também observado que a expressão genética GUS era restrita aos embriões. 0 tegumento da semente e o endosperma novo não se encontravam corados (Figura 11C). A actividade GUS foi também detectada erri plântulas em desenvolvimento. Plântulas novas de 3-5 dias estavam coradas em todo o lado. Apesar de alguns dos capilares da raiz perto do hipocotiledone estarem corados (Figura 11K) a maior parte das estruturas recentemente formadas, tais como capilares de raízes, primordia laterais da raiz, raízes apicais não foram coradas (Figuras 11L e 11N). Mais tarde a coloração era restrita aos cotilédones e hipocotiledones quando as raízes laterais cresceram a partir da raiz embriónica em enlongação. A coloração em raízes embriónicas desapareceu. Não foi observada coloração em raízes laterais recentemente formadas, nem em folhas verdadeiras nem em tricomas em folhas verdadeiras (Figuras 11M e 11N). 40

Padrões de expressão de promotor AtS21/GUS no tabaco são basicamente as mesmas que em Arabidopsis. A actividade GUS foi apenas detectada em sementes de fase tardia em diferentes regiões nodulares de plantas na maturidade. Nas sementes em germinação uma forte coloração foi detectada através de todo o embrião logo após uma hora após terem sido dissecados de sementes embebidas. 0 endosperma maduro que as sementes de Arabidopsis não possuem, mas não o tegumento da semente encontravam-se também corados (Figura 12A) . As pontas da raiz de algumas plântulas novas de uma linha transgénica não estavam coradas (Figura. 12B). Por outro lado, os padrões de expressão GUS em plântulas em desenvolvimento do tabaco eram as mesmas que em sementes de Arabidopsis (Figuras 12B, 12C, e 12D). Estruturas recentemente formadas, tais como raízes laterais e folhas verdadeiras não estavam coradas. Níveis de mARM de AtS21 em plântulas em desenvolvimento

Uma vez que as fortes actividades observadas de promotor Ats21 /GUS tanto nas plântulas de Arabidopsis e do taba.co não são consistentes com a expressão específica da semente dos genes da oleoresina, a análise de Northern foi efectuada para determinar se mARN de AtS21 estava presente nas sementes em desenvolvimento em que a actividade GUS era muito forte. Os ARNs preparados a partir de plântulas em fases diferentes desde 24 horas a 12 dias foram analisadas por hibridização de Northern utilizando cADN de AtS21 como sonda. Surpreendentemente, mARN de AtS21 foram detectadas a um nível elevado comparado ao das sementes em desenvolvimento 24-48 horas em sementes embebidas. O nivel de mARN ' caiu dramaticamente quando as plântulas novas emergiram pela primeira vez às 74 horas (Figuras 13A e 13B) . Em plântulas com' 96 horas e com mais tempo não foi 41 detectado nenhum sinal, mesmo com uma exposição mais longa (Figura 13 B). As cargas de amostras . de ARN foram verificadas hibridizando a mesma transferência com uma sonda de gene de tubulina (Figura 13C) que foi isolada e identificada por análise de EST como descrito no Exemplo 2. Uma vez- que mARN de AtS21 era tão abundantes em sementes, as sondas de AtS21 residual permaneceram na transferência mesmo após uma remoção extensiva. Estes resultados indicaram que o mARN de AtS21 detectado em sementes embebidas e em plântulas muito novas resultam do arrastamento de mARN de AtS21 de sementes secas. Foi reportado recentemente que um mARN de Atol2 de oleoresina (idêntico a AtS21) é mais abundante em sementes secas (Kirik et al., 1996 Plant. Mol. Biol. 31(2): 413-417). De forma semelhante, actividades GUS em plântulas eram muito provavelmente devidas ao transporte tanto da proteína da β-glucuronidase e da síntese de novo da β-glucuronidase a partir do seu mARN transportado a partir da fase de semente seca.

Exemplo 8

Comparação de actividade entre o promotor de AtS21 e o promotor 35S

As actividades GUS nas sementes em desenvolvimento da Arabidopsls transg.énica expressas pelo promotor AtS21 foram comparadas com ' aquelas expressas pelo promotor 35S na construção pBl221 (Jefferson et al. EMBO J. 6:3901-3907). As sementes forâm classificadas de acordo com as suas cores (Tabela 2). A fase mais precoce foi da fase globular à fase de coração tardia, quando as sementes ainda eram brancas, mas suficientemente largas para serem dissecadas das siliquas. Actividade do promotor AtS21 foi detectada a um 42 nivel cerca de três vezes mais baixo do que a do promotor 35S nesta fase. A actividade do promotor 35S permaneceu no mesmo baixo nivel ao longo de todo o desenvolvimento do embrião. Em contraste, a actividade promotora AtS21 aumentou rapidamente à medida que o embrião passou da fase de torpedo e atingiu o nivel mais elevado de 25,25 pmole 4-UM/min^g de proteína numa fase madura (Figura 5-8) . A actividade do pico do promotor AtS21 é 210 vezes mais elevada do que a sua actividade mais baixa na fase globular até à fase coração, e está perto de 100 vezes mais elevada do que a actividade do promotor 35S na mesma fase (Tabela 2) . Os níveis de actividade do promotor AtS21 são semelhantes aquelas de um outro promotor da oleoresina da Arabidopsis expresso em Brasslca napus (Plant et al. 1994, Plant Mol. Biol. 25:193-205. Actividade do promotor AtS21 foi também detectada a nível de base nas folhas. O elevado desvio padrão, mais elevado do que a própria média indicou que a actividade GUS foi apenas detectada nas folhas de algumas linhas (Tabela 2). Por outro lado, a actividade do promotor 35S na folha era mais -do que 20 vezes mais elevada do que na. semente. As comparações, lado a lado' de actividades entre o promotor AtS21 e o promotor 35S são indicadas na Figura 14.

Apesar da actividade promotora de AtS21 ser cerca de 3 vezes inferior na semente seca de tabaco do que na semente seca de Arabidopsis, á actividade absoluta GUS era ainda mais elevada do que a expressa pelo promotor 35S na folha de Arabidopsis (Tabela 2) . Não foi observada actividade promotora de AtS21 detectável na folha de tabaco (Figura 14) . suas A comparação do promotor AtS21 em relação ao promotor 35S revelou que o último não é um bom promotor para expressar genes em níveis elevados em sementes em desenvolvimento. Devido às suas baixas actividades 43 consistentes ao longo de todo o período de desenvolvimento do embrião, o promotor 35S é útil para uma expressão consistente de baixo nível dos genes alvo. Por outro lado, o promotor AtS21 é um promotor muito forte que pode ser utilizado para expressar genes começando em embriões na fase de coração e acumulando até à fase de semente seca. O promotor 35S apesar de não ser eficiente é melhor do que o promotor AtS21 em expressar genes em embriões antes da fase coração.

Tabela 2

Actividades GUS de construções promotores AtS21 e 35S

/GUS

Fase da cor Branco G-H Branco/ Amarelo H-T Amarelo T-C Verde claro precoce C Verde escuro tardio C Verde acas tanhado AtS21 0,12±0,17 1,35±1,57 6,77+1,25 18,99±3,75 21,85±4,45 25,25+4 35S 0,30+0,06 0,25±0,08 0,29+0,04 0,28+0,03 0,33±0,06 0,26+0,0 AtS21 (em tabaco) Abreviaturas: G fase globular; H fase coração; T, fase de torpedo; C, fase de cotilédone. As actividade GUS encontram-se em pmole os números são a média de cinco linhas independentes com desvios padrão. Foram ensaiadas três repetições para cada linha. Para três repetições da mesma linha com desvios padrão.

Exemplo 9

Expressão do gene da As-dessaturase da borragem sob o controlo do promotor AtS21 e comparação com a expressão sob o controlo do promotor CaMV 35S

Para criar uma construção de expressão com o promotor de AtS21 conduzindo a expressão do gene da Δβ-dessaturase da borragem, o fragmento que codifica para GUS a partir de 44 pAN5 foi removido por digestão com Smal e EcoICR I. A inserção de cADN de pANl (Exemplo 2) foi então excisada por digestão com Xhol (e preenchendo a saliência residual como em cima),· e depois digerindo com Smal. 0 fragmento resultante foi utilizado para substituir a porção excisada de pAN5 para dar pAN3.

Após a transformação do tabaco e da Arabidopsis seguindo os métodos do Exemplo 7, os níveis de actividade da A6-dessaturase foram monitorizados testando os ésteres metílicos dos ácidos gordos correspondentes dos seus produtos de reacção, ácido γ-linolénico (GLA) e ácido octadecatetranoico (OTA) utilizando os métodos referidos no Exemplo 3. Os níveis de GLA e OTA (Tabela 3) das sementes transgénicas foram de 6,7% de ácidos gordos C18 (média=3,1%) e 2,8% (média^l,1%), respectivamente. Não.foi detectado GLA ou OTA nas folhas destas plantas. Em comparação, as plantas transgénicas promotor CaMV 35S/A6-dessaturase produziram níveis de GLA nas sementes que vão até 3,1% de ácidos gordos . C18 (média=l,.3%) e nenhum OTA quantificável em sementes.

Tabela 3

Expressão A6-dessaturase da borragem em plantas transgénicas Promotor Planta Semente Folha GLA* Gama OTA* Gama GLA* Gama OTA* Gama Vírus do mosaico da· couve flor 35S Tabaco 1,3 0,7-3,1 n.d 20 19-22 9,7 8-11 Oleoresina da Arabidopsis Arabidopsis 3,1 0-6,7 1,1 0-2,8 n.d. n.d. * valor médio expresso como percentagem dos ácidos gordos C18 n.d. não detectado 45

Exemplo 10

Transformação da colza com uma cassette de expressão que compreende a região reguladora 5' da oleoresina ligada ao gene da delta 6-dessaturase da borragem A colza, Cv. Westar foi transformada com a estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídeo pAN3 (i.e. o gene da Δβ-dessaturase da borragem sob o controlo do promotor da oleoresina da Arabídopsis -Exemplo 9).

Os internodos terminais de Westar foram co-cultivados durante 2-3 dias com a estirpe induzida de Agrobacterium tumefaciens EHA105 (Alt-Moerbe et al. 1988 Mol. Gen. Genet. 213:1-8; James et al. 1993 Plant Cell Reports 12:559-563), depois foram transferidas para meio de regeneração (Boulter et al. 1990 Plant Science 70:91-99; Fry et al. 1987 Plant Cell Reports 6: 321-325). Os rebentos regenerados foram transferidos para meio de crescimento (Pelletier et al. 1983 Mol. Gen. Menet. 191; 244-250), e um teste da reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi efectuado em fragmentos de folhas para avaliar a presença do gene. 0 ADN foi isolado a partir de folhas de acordo com o protocolo de KM Haymes et al. (1996) Plant Molecular Biology Repórter 14(3):280-284 e novamente suspenso em 100 μΐ de água, sem tratamento com RNase. Foram utilizados 50 μΐ de extracto para a reacção PCR num volume final de 50 μΐ. A reacção foi efectuada num termociclador Perkin-Elmer 9600 com os ciclos seguintes: 1 ciclo: 95°C, 5 minutos 30 ciclos: 95°C, 45 seg.; 52°C, 45 seg. 72°C, 1 minuto 1 ciclo: 72°C, 5 minutos 46 e os seguintes iniciadores (derivados das regiões próximas da caixa metálica, como indicado na Fig. 1, SEQ N°:l): 5'TGG AAA TGG AAC CAT AA 3' 5' GGA AAC AAA TGA TGC TC 3' A amplificação do ADN revelou o fragmento PCR de par de bases esperado 549 (Figura 17).

Os rebentos positivos foram transferidos para o meio de elongação, depois para o meio de enraizamento (DeBlock et al. 1989 Plant Physiol. 91:694-701). Rebentos com um sistema radicalar bem desenvolvido foram transferidos para a estufa. Quando as plantas se encontravam bem desenvolvidas as folhas foram recolhidas para análise de Southern para avaliar o número de cópias do gene.

Foi . extraído o ADN genómico de acordo com o procedimento de Bouchez et al. (1996) Plant Molecular

Biology Repórter 14:115-123, digerido com as enzimas de restrição Bgl I e/ ou Cia I, separado electroforeticamente em gel de agarose (Maniatis et al. 1982, em Molecular Cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor/NY), e preparado para transferência para membranas de nylon (Nytran membrane, Schleicher & Schuell) de acordo com as instruções do fabricante. 0 ADN foi então transferidos para membranas de um dia para o outro por acção capilar utilizando 20XSSC (Maniatis et al. 1982). A seguir à transferência as membranas foram reticuladas por UV (Stratagene) durante 30 segundos e pré-hibridizadas durante 1 hora a 65°C em 15 ml de uma solução contendo 6XSSC, 0,5% de SDS e 2,25% p/p de leite desnatado desidratado em frascos de vidro num forno de hibridização (Appligene). As membranas foram hibridizadas de um dia para o outro na mesma solução contendo uma sonda de hibridização desnaturada marcada radioactivamente com 32P até a uma actividade específica de 47 108 ορη/μς através do método de iniciação aleatória (com o kit Ready-ToGo obtido na Pharmacia). A sonda representa um fragmento de PCR do gene da delta 6-dessaturase da borragem (obtido nas condições e com os iniciadores detalhados acima). Após hibridização os filtros foram lavados a 65°C em 2XSSC, 0,1% de SDS durante 15 minutos e 0,2XSSC, 0,1% SDS durante 15 minutos. As membranas foram então envolvidas em Saran-Wrap e expostas a um filme Kodak XAR utilizando um écran intensificador a -70°C numa cassette à prova.de luz. 0 tempo de exposição foi geralmente de 3 dias.

Os resultados obtidos confirmam a presença do gene. De acordo com a construção do gene, o número de bandas em cada zona de ADK digerido por Bgl 1 ou Cia 1 representa o número de genes de. delta 6-dessaturase presentes no ADN genómico da planta. À digestão com Bgl 1 e Cia 1 em conjunto geram um fragmento de 3435 pb. . 0 termo "compreende" ou "compreendendo" é definido como . especificando a presença das características declaradas, números inteiros, passos, ou componentes referidos - nas reivindicações, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais características diferentes, números inteiros, passos, componentes, ou dos seus-grupos.

Listagem das Sequências (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Rhone Poulenc Agro Thomas, Terry L. Li, Zhongsen

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: REGIÃO REGULADORA 5'. DA OLEORESINA PARA A MODIFICAÇÃO DA COMPOSIÇÃO LIPÍDICA DAS SEMENTES DA PLANTA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 35 48 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Scully, Scott, Murphy & Presser (B) RUA: 400 Garden City Plaza (C )CIDADE: Garden City

(D) ESTADO: NOVA IORQUE

(E) PAÍS: USA (F) ZIP: 11530

(v) FORMA A SER LIDA PELO COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: IBM PC COMPATÍVEL

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/831,575 (B) DATA DO REGISTO: 9 de Abril de 1997 (C) CLASSIFICAÇÃO:

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE O AGENTE DE PROPRIEDADE INDUSTRIAL (A) NOME: DiGiglio, Frank S. (B) NÚMERO DO REGISTO:31,346 (C) REFERÊNCIA/NÚMERQ DE ENDOSSE: 10203 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (516) 742-4343 (B) TELEFAX: (516) 742-4366 (2) INFORMAÇÃO PARA A.SEQUÊNCIA ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1684 pares de bases (B) TIPO: ácidonucleico (C )TIPO DE, CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear 49 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 43..1387 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:l:

ATATCTGCCT ACCCTCCCAA AGAGAGTAGT CATTTTTCAT CA ATG GCT GCT CA A

Met Ala Ala Gin 1

ATC AAG AAA TAC ATT ACC TCA GAT GAA CTC AAG AAC CAC GAT AAA CCC Ile 5 Lys Lys Tyr 115 Thr 10 Ser Asp Glu Leu Lys 15 Asn uis Asp Lys pro 20 GGA GAT CTA TGG ATC TCG ATT CAA GGG AAA GCC TAT GAT GTT TCG GAT Gly Asp Leu Trp. Ile 25 Ser lie Glrí Gly Lys 30 Ala Tyr Asp Val Ser 35 Asp TGG GTG ΑΛΑ GAC CAT CCA GGT GGC AGC TTT CCC TTG AAG AGT CTT GCT Trp Vai Lys Asp 40 His Pro Gly Gly Ser Phe 45 Pro Leu Lys Ser 50 Leu Ala GGT CAA GAG GTA ACT GAT GCA TTT GTT GCA TTC CAT CCT GCC TCT ACA Gly Gin GlU 55 val Thr ASp Ala Phe 60 val Ala Phe His Pro 65 Ala Ser Thr TGG AAG AAT CTT GAT AAG ttt TTC ACT GGG TAT TAT CTT AAA GAT TAC Trp Lys Asn 70 Leu ASp Lys Phe 75 Phe Thr Gly Tyr Tyr ôõ Leu Lys Asp Tyr ΤΟΓ GTT TCT GAG GTT TCT AAA GAT TAT AGG AAG CTT GTG TTT GAG TTT Ser 85 Vai Ser GlU Val Ser 90 Lys Asp Tyr Arg Lys 95 Leu val phe Glu Phe 100 TCT AAA ATG GGT TTG TAT GAC AAA AAA GGT CAT ATT ATG TTT GCA ACT Ser Lys Met Gly Leu 105 Tyr Asp Lys Lys Gly 110 His Ile Met Phe Ala Thr 115 TTG TGC TTT ATA GCA ATG CTG TTT QCT ATG AGT GTT TAT GGG GTT ττα Lsu Cys Phe He 120 Ala Met Leu Phe Ala Met 125 Ser Val Tyr Gly 130 val Leu TTT TGT GAQ GGT GTT TTG GTA CAT TTG TTT TCT GGG TGT TTG ATG GGG Phe Cys Glu 135 Gly Val Leu Val Hls 140 Leu Phe Ser Gly Cys 145 Leu Met Qiy TTT CTT TGG ATT CAG AGT GGT TGG ATT GGA CAT GAT GCT GGG CAT TAT Phe Leu 150 Trp Ile Gin Ser Gly 155 Trp Ile Gly His ASp 160 Ala Gly His Tyr ATG GTA CtTG TCT GAT TCA AGG CTT AAT AAG TTT ATG GGT ATT TTT GCT Met 165 Vai vai Ser A3p Sar 17 0 Ar g Leu Asn Lys Phe 175 Met Gly Ile Phe Ala 180 GCA AAT TGT ctt TCA GGA ATA AGT ATT GGT TGG TGG AAA TGG AAC CAT Ala Λ6Π Cys Leu Ser 185 Gly ile Ser Ile Gly ,190 Trp Trp Lys Trp Asn 195 HàS 50 50 AAT GCA CAT CAC Asn Ala His His 200 CAA TAT ATA CCA Gin Tyr Ile 215 Pro ACC TCT CAT TTC Thr Ser 230 HiS Phe TTC TTT GTA AGT Pha 245 Phe Val Ser GCT AGG CTC AAT Ala, Arg Leu Asn AGA AAT GTG TCC Arg Asn Val Ser 200 tco ATT TGG TAC Ser ile Trp 295 Tyr AGA ATT ATG TTT Arg Ile 310 Met l*he GTT CAG TTC TCC val 325 Gin Phe Ser CCT, AAA GGG ΑΛΤ Pro Lys Gly Asn ATT TCT TGT CCT Ile Ser Cys Prq ATT GCC TGT AAT Ile Ala Cys Aan 360 CAA ATT GAG CAT Gin Ile Glu 375 Hig ΑΛΑ ATC TCG CCC Lys Ile 390 Ser Pro TAC AAT TAT GCA Tyr 405 Asn Tyr Ala AGC CTT GAA TAT ser Leu Glu Tyr 205 TCT TCC AAG TTT Ser Ser Lys Phe TTG ACT TTT GAC Lau Thr Phe Asp 240 ACA TTT TAC. CCT Thr Phe Tyr Pro 255 TCT CTC ATA ATG Ser Leu Ile Met 270 GAA CTC TTG GGA Glu Leu Leu Gly 285 TCT TGT TTG CCT Ser Cys Leu Pro TTC CTT GTT gtg Phe Leu Val Vai 220 TAT GAG AAA AGG Tyr Glu Lys Arg 235 TAT CAA CAT TGG Tyr Gin His Trp 250 ATO TAT GTA CAA fíefc Tyr Vai Gin 265 TAT CGA GCT CAG Tyr Arg Ala Gin CCG TTG CTT GTT Pro Leu Leu Vai 300 GTT ATT GCA AGT Vai Ilfi Ala Ser 315 ΤΤΠ AAC CAC TTC Leu Asn sris Phe 330 AAT TGG TTT GAG Asn Trp Phe Glu 345 CCT TGG ATÇ GAT Pro Trp Met Asp CAT TTG TTT CCC Hía Leu The Pro 380 TAC GTG ATC GAG Tyr Vai rle Glu 395 TCT itc tcc aag Ser Phe Ser Lys 410 TTA TCA GTG ACT Leu Sèr Vai Thr 320 TCT TCA AGT GTT Ssr Ser Ser Vai 335 AAA CAA ACG GAT Lys Gin Thr Asp 350 TGG TTT CAT GGT Trp Phe His Gly 3S5 AAG ATG CCT AGA Lys Mèt Pro Arg· TTA TGC AAG ΑΛΑ Leu cys Lys Lys 400 GCC AAT GAA ATG Ala Asn Glu Mefc 415 GAC CCT GAT TTA Asp Pro Aâp Leu 210 TTT GGT TCA CTC Phe Gly Ser Leu 225 TCT TTA TCA AGA Ser Leu Ser Arg ATT ATG TGT GCT Ile Met Cys Ala 260 TTG TTG ACC AAG Leu Leu Thr Lys 275 .TGC CTA GTG TTC Cys Leu Vai Phe 290 AAT TGG GGT GAA Asn Trp Gly Glu 305 GGA ATG CAA CAA Gly Mat Gin Gin TAT GTT GGA AAG Tyr Vai Gly Lys 340 GGG ACA CTT GAC Gly Thr Leu Asp 355 GGA TTG CAA TTC Gly Leu Gin Phe 370 TGC AAC CTT AGC Cys Asrt Leu Arg 385- CAT AÂT TTG CCT His Asn Leg Pro ACA CTC AGA ACA Thr Leu Arg Thr 420 51

TTS AGG AAC ACA GCA TTG CAG GCT AGQ GAT ATA ACC AAG CCG CTC CCG Leu Arg Asn Thr Ala Leu Gin Ala Arg Asp Ue Thr Lys Pro Leu Prt> 425 430 435 AAG AAT TTG GTA TGG GAA GCT CTT CAC ACT CAT GGT T AAAATTACCC Lys Asn Leu Vai Trp Glu Ala Leu His Thr His Gly 440 44E

TTAGTTCATG TAA.TAATTTG agattatgta. tctcctatgt ttgtgtcttg tcttggttct ACTTGTTGGA GTCATTGCAA CTTGTCTTTT ATGGTTTATT ÃGATGTTTTT TAATATATTT TAGAGGTTTT GCTTTCA.TCT CCATTATTGA TGAATAAGGA GTTGCATATT GTCAATTGTT GTGCTCAATA TCTGATATTT TGGAATGTAC TTTGTACCAC GTGGTTTTCA GTTGAAGCTC ATGTGTACTT CTATAGACTT TGTTTAAATG GTTATGTCAT GTTATTT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N.° 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:· 135 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D). TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:2:

Met Ala Ala Gin Ile Lys Lys Tyr Ile Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn .1 5 10 15 El.is Asp Lys Pro Gly Asp Leu Trp Ile ser Ile Gin Gly Lys Ala Tyr 20 25 30 Asp Vai Ser Asp Trp Vai Ly.s Asp His Pro Gly Gly Ser Phe Pro Leu 35 40 45 Lys Ser Leu Ala Gly Gin Glu Vai Thr Asp Ala Phe Vai Ala Phe His 50 55 60 Pro Ala Ser Thr Trp Lys Asn Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr 65 70 75 00 Deu Lys Asp Tyr Ssr Vai Ser Glu vai Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu 05 . 30 95 v«l Phe Glu Phe Ser Lys Met Gly L‘eu Tyr Asp Lys Lys Gly His Ile 100 105 110 Met Phe Ala Thr Leu cys Phe ile Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Vai 115 120 125 Tyr Gly Vai TjHU Phe Cys Glu 130 135 52 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 834 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: CADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 31..603 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:3:

TTAGCCTTTA CTCTATAGTT TTAGATAGAC ATG GCG AAT GTG GAT CGT GAT CGG

Met Ala Asn Vai Asp Arg Asp Arg 140 CGT GTG CAT GTA GAC CGT ACT GAC A AÃ CGT GTT CAT CAG CCA AAC TAC Arg val 145 His val Asp Arg Thr Asp 150 Lys Arg val His 155 Gin Pro Asn Tyr GAA GAT GAT GTC GGT TTT GGT GGC TAT GGC GGT TAT GGT GCT GGT TCT Glu 160 ASP Asp val. Gly Phe 165 Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr 170 Gly Ala Gly Ser 175 GAT TAT AAG AGT CGC GGC CCC TCC ACT AAC CAA ATC TTG GCA CTT ATA Asp Tyr Lys Ser Arg 180 Gly Pro Ser Thr Asn. Glti 185 lie Leu Ala Leu 190 Ile GCA GGA GTT CCC ATT GGT GGC ACA CTG CTA ACC CTA GCT GGA CTC ACT Ala Gly Val Pro 195 Zle Gly Gly Thr Leu Leu Thr 200 Leu Ala Gly Leu 205 Thr CTA GCC GGT TOS GTG ATC GGC TTG CTA GTC TCC ATA CCC CTC TTC CTC Leu Ala Gly 210 Ser val Ile Gly Leu 215 Leu Val Ser Ile Pro 220 Leu Phe Leu CTC TTC AI3T CCG GTG ATA GTC CCG GCG GCT CTC ACT ATT GGG CTT GCT Leu Phe 225 Ser Pro Val ile val Pro 220 Ala'Ala Leu Thr 235 Ile Gly Leu Ala GTG ACG GGA ATC TTG GCT TCT GGT TTG TTT GGG TTG ACG GGT CTG AGC vai 240 Thr Gly ile Leu Ala 245 Ser Gly Leu Phe Gly 250 Leu Thr Gly Leu Ser 255 TCC GTC TCG TGG CTC CTC AAC TAC CTC CGT GGG ACG AGT GAT ACA GTG Ser Vai Ser Trp Val 260 lgu Asn Tyr Leu Arg Gly Thr 265 Ser Asp Thr 270 Val 53 CCA GAG CAA TTG GAC TAC GCT AAA CGG CGT ATG GCT GAT GCG GTA GGC Pro Glu Gin Leu 275 Asp Tyr Ala Lys Arg 260 Arg Mefc Ala Asp Ala 28S Vai Gly TAT GCT GGT ATG AAG GGa AAA GAG ATG GGT CAG TAT GTG CAA GAT AAG Tyr Ala Gly 290 Mat Lys Gly Lys Glu 295 Wefc Gly Gin Tyr vai 300 Gin ASp Lys GCT CAT GAG GCT CGT GAG ACT GAG TTC ATG ACT GAG ACC CAT GAG CCG Ala His 3 C 5 Glu Ala Arg Glu Thr 310 Glu Phe Meb Thr Glu 315 Thr HiS Glu Pro QGT AAG GCC AGG AGA GGC TCA TAAGCTAACA TAAATTGCGG GAGTCAGTTG Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser 320 325

GAAACGCGAT AAATGTAGTT TTACTTTTAt GTCCCAGTTT CTTTCCTCTT TTAAGAATAT CTTTGTCTAT ATATGTGTTC GTTCGTTTTG TCTTGTÇCAA ATAAAAATCC TTGTTAGTGA AATAAGAAAT GAAATAAATA TGTTTTCTTT TTTGAGATAA CCAGAAATCT CATACTATTT TCTAAAAAAA AAAAAAAAAA A (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 4: ‘ (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 191 aminoádidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:4:· tfet Ala Asn Vai Asp Arg Asp Arg. Arg Vai His Vai Asp Arg Thr Asp 1 5 10 15

Lys Arg Vai His Gin Pro AST1 Tyr Qlu Asp Asp Vai Gly Pite Gly Gly 20 25 30

Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser 35 .40 45

Thr Asn Gin Ile Leu Ala Leu Ile Ala Gly Vai Pro Xle Gly Gly Thr 50 55 60

Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Vai Ile Gly Leu 65 70 75 30

Leu Vai Ser Xle Pro Leu Phe Leu Leu Phe Ser Pro Vai Ile Vai pro 85 90' 93 54

Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Vai Thr Gly Ila Leu Ala Ser Gly 10D 105 110

Leu Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Vai Ser Trp Vai Leu Asn Tyr 115 120 125

Leu Arg Gly Thr Ser Asp Thr Vai Pro Glu Gin. Leu Asp Tyr Ala Lys 130 135 140

Arg Arg Met Ala Asp Ala Vai Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu 1.45 150 155 160

Met Gly Gin Tyr Vai Glii Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu 165 170 175

Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser ISO IBS 190 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: .(A) COMPRIMENTO: 191 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA.: linear (ii> TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:5:

Met Ala Asn Vai Asp Arg Asp Arg Arg Vai His Vai Asp Arg Thr Asp 1 5 10 15

Lys Arg Vai His Gin Pro Asn Tyr Glu Asd Asp Vai Gly Phe Gly Gly 20 25 30

Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser 35 40 45

Thr Asn Gin lie Leu Ala Leu Ile Ala Gly vai· Pro lie Gly Gly Thr 50 55 60 LSU Ile Thr Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Vai Ile Gly Leu 65 70 75 80

Leu Vai Ser Ile Pro Leu Phe 'Leu Ile Phe Ser Pro Vai Ile Vai Pro 85 90 95

Ala Ma Leu Thr ile Gly Leu Ala Vai Thr Gly Ile Leu Ala Ser Gly 100 105 .110

Leu Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Vai Ser Trp Vai Leu Asn Tyr 115 120 125 55

Leu Arg Í3ly Thr .Ser Asp Thr Vai Pro Glu Gin Leu Asp Tyr Ala Lys 130 135 140

Arg Arg Met Ala Asp Ala Vai Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Gla 145 150 155 160

Met Gly Gin Tyr Vai Gin Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu 165 170 175

Phe Met Thr Glu Thr Ris Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser 180 IBS 190 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO.: 191 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:6:

Met 1 Ala Asn Val Asp 5 Arg Asp Arg Arg Val 10 His Val Asp Arg Thr Asp 15 Lys Arg val His 20 Gin Pro Asn Tyr Glu 25 Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly 30 Thr Gly Gly 35 Thr Gly Ala Gly Ser 40 Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser 45 Thr Asn 50 Gin Ile Leu Ala Leu Ile 55 Ala Gly Val pro 80 Ile Gly Gly Thr Leu 65 Ile Thr Leu Ala Gly Leu Thr 70 Leu Ala Gly Ser 75 Val Ile Gly Leu 80 Leu Vai Ser Xle Pro 85 Leu Phe Leu ile Phe 90 Ser Pro val Ile Val Pro 95 Ala Ala Leu Thr 100 Ile Gly Leu Ala val 105 Thr Gly Xle Leu Ala Ser Gly 110 Leu Phe Gly 1.1.5 Leu Thr Gly Leu Ser 120 Ser Val Ser Trp Val 125 Leu Asn Tyr Leu Arg 130 Gly Thr Ser Asp Thr Val 135 Pro Glu Gin Leu 140 Asp Tyr Ala Lys Arg 145 Arg Met Ala Asp Ala Val Gly ISO Tyr Ala Gly Met 155 Lys Gly Lys Glu 160 56

Met Gly Gin Tyr Vai Gin Asp Ly,g Ala His Glu Ala Ara Glu Thr Glu 165 170 175

Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Pro 130 185 190 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 7 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 78 .aminoáçidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:7:

Fhe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Vai Ser Trp Vai Leu'Gin E.au Pro 1 5 10 15

Pro Trp Ala Ser Asp Thr Vai Pro Glu Gin Vai Asp Tyr Ala Lys Arg 20 25 30

Arg Met Ala Asp Ala vai Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu Met 35 40 45

Gly Gin Tyr Vai Gin Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu Phe 50 55 60

Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 173 aminoáçidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples . (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína :xi> DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8: Mel: 1 Ala Asp Thr Ala 5 Arg Gly Thr His His 10 Asp Ile Ile Gly Arg 15 Asp Gin Tyr Fro Mat 20 Met Gly Arg Asp Arg 25 Asp Gin Tyr Gin Met 30 Ser Gly Arg Gly Ser Asp Tyr 35 Ser Lys Ser 40 Arg Gin Ile Ala Lys 45 Ala Ala Thr Ala Vai 50 Thr Ala Gly Gly Ser Leu 55 Leu Vai Leu Ser 60 Ser Leu Thr Leu Vai 65 Gly Thr Vai Leu Ala Leu Thr 70 Vai Ala Thr 75 Pro Leu Leu vai Leu 80 Phe Ser‘ Pro lie Leu 85 Vai Fro Ala Leu Ile 90- Thr vai Ala Leu Leu 95 ile Thr Gly Phe Leu 100 Ser Ser Gly Gly Phe 105 Gly Ile Ala Ala lie 110 Thr Val Phe Ser Trp 115 Xle Tyr Lys Tyr Ala 120 Thr Gly Glu His Pro 125 Gin Gly Ser Asp Lys 130 Leu Asp Ser Ala Arg Met 135 Lys Leu Gly ser Π0 Lys Ala Gin Asp Leu 145 Lys Asp Arg Ala Gin Tyr Tyr 150 Gly Gin Gin 155 His Thr Gly Gly Glu 160 His Asp Arg Asp Arg 165 Thr Arg Gly Gly Gin 170 His Thr Thr (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 141 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:9: 58

Met 1 Ala Asp Gin Thr 5 Arg Thr His His Glu Met ID Ile Ser Arg Asp 15 Ser Thr Gin Glu Ala 20 His Pro Lys Ala Arg 25 Gin Trp Val Lys Ala 30 Ala Thr Ala Vai Thr 35 Ala Gly Gly Ser Leu 40 Leu Val Leu Ser Gin 45 Leu Thr Leu Ala Gly 50 Thr vai Ile Ala Leu 55 Thr Val Ala Thr Pro 60 Leu Leu Val ile Phe S5 Ser Pro Val Leu Val 70 Pro Ala Val Val Thr 75 Val Ala Leu Ile Ile 30 Thr Gly Phe Leu Ãla 85 Ser Gly Gly Phe Gly Ile 90 Ala Ala Ile Thr 95 Ala

Phe Ser Trp Leu Tyr Arg His Trp Thr Gly Ser Gly Ser Asp LyS Ile 100 105 110

Glu Trp Ala Arg Met Lys Vai.Gly Ser Arg vai Gin Asp Thr Lys Tyr 115 120 125

Gly Gin His Tzp Ile Gly Vai Gin His Gin. Gin Vai Ser 130 135 140 [2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 199 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:10: 59

Met 1 Ala Asp Thr His 5 Arg Vai Asp Arg Thr 10 Asp Arg His Phe Gin Phe 15 G.ln Ser Pro Tyr 20 Glu Gly Gly Arg Gly Gin 25 Gly Gin Tyr Glu 30 Gly Asp Arg Gly 1 Tyr 35 Gly Gly Gly Gly Tyr Lys 40 Ser Met Met Pro 45 Glu Ser Gly Pro Ser 50 Ser Thr Gin Vai Leu Ser Leu 55 Leu Ile Gly 60 Vai pro Vai Vai Gly 65 Ser Leu lie Ala Leu Ala Gly Leu 70 Leu Leu Ala 75 Gly Ser Vai Ile 80 Gly Leu Met Vai Ala 85 Leu Pro Leu Phe Leu 90 lie Phe Ser pro Vai Ile 95 Vai Pro Ala Gly 10 D Leu Thr Ile Gly Leu 105 Ala Met Thr Gly Phe 110 Leu Ala Ser Gly Met 115 Phe Gly Leu Thr Gly Leu 12 0 Ser Ser Ile Ser 125 Trp Vai Met Asn Tyr 130 Leu Arg Gly Thr Ala Arg Thr 135 vai pro Glu 140 Gin Leu Glu Tyr Ala 145 Lys Arg Arg Met Ala Asp Ala vai 150 Gly Tyr Ala 155 Gly Gin Lys Gly 160 Lys Glu Met Gly Gin 1S5 His Vai Gin Asn Lys 170 Ala Gin Asp Vai Lys Gin 175

Tyr Asp Ile Ser Lys Pro Ilis Asp Thr Thr Thr Lys Gly His Glu Thr 180 185 190

Gin Gly Gly Thr Thr Ala Ala 195 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 199 aminoáeidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:ll:

I 60

Met 1 Ala Asp Thr Hi'S 5 Arg Vai Asp Arg Thr Asp 10 Arg HiS Phe Gin 15 Phe Gin Ser Pro Tyr 20 Glu Gly Gly Arg Gly 25 Gin Gly Gin Tyr Glu 30 Gly Asp Arg Gly Tyr Gly 35 Gly Gly Gly Tyr Lys 40 Ser Met Met Pro 45 Glu Ser Gly Pr d Ser 50 Ser Thr Gin Vai Leu Ser Leu 55 Leu Ile Gly 6Ò Vai Pro Vai Vai Gly 65 Ser Leu Ile Ma Leu Ala Gly Leu 70 Leu Ile 75 ' Ala Gly Ser vai Ile ao Gly Leu Met Vai Ala 85 Leu Pro Leu Phe Leu Ile 90 Phe Ser Pro Vai 95 ile Vai Pro Ala Ala 100 Leu Thr Ile Gly Leu 105 Ala Met Thr. Gly Phe 110 Leu Ala Ser Gly Met 115 Phe Gly Leu Thr Gly Leu 120 Ser Ser Ile Ser 125 Trp Vai Met ΛΒΠ Tyr 13 0 Leu Arg Gly Thr Arg Arg Thr 135 Vai Pro Glu 140 Gin Leu Glu Tyr Ala 145 Lya Arg Arg Met Ala Asp Ala Vai 150 Gly Tyr 155 Ala Gly Gin Lys Gly 150 Lys Glu Met Gly Gin 165 Hls Vai Gin Asn Lys Ala 170 Gin Asp Vai Lys 175 Gin Tyr Asp r. le Ser 180 Lys Pro Ris Asp Thr 185 Thr Thr Lys Gly Ris 190 Glu Thr

Gin. Gly Arg Thr Thr Ala Ala 195 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA; (A) COMPRIMENTO: 1267 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico . (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:12: 61

GAGCTCGATC ACACAAAGAA aacgtcaaat ggatcatact gggcccattt TGCAGACC AA cagaaagtga gagaGagttg tcctctcott atcaâgtaag agtagaccac CACTAAACCG CCAATAGCTT ATAATCAAAA TAGAAAGGTC TAATAACAGA AACAAATGAA AMGCCTTGT TCCATGGACT GCCTACCCGA ATTGATTGAT TCGACTAGIT TTTCTTCTTC TTTGATTAAG ACCTCCGTAA GAAAAATGGT ACTACTAAAG CCACTCGCTA GCAAMCTAA ACCATTCCAG ACTGTAACTG GACCAATATT TCTAAACTGT AACCAGATCT CAAACATATA AftCTAATTAA Í5AACTATAAC CATTAACCGT AAAAATAAAT TTACTACAGT AAAAAATTAT ACTAATTTCA GCTATGATGG AATTTCAGCT CTTAAGAGTT GTGGAAATCA AGTAAACCTA AAATCCTAAT AATATTCTTC ATCCTTATTT ttgtttcaca tgcatgctgtCCAATCTGTT ATTAGCATTT GAAAGCCTAA AATTCTATAT ACAGTACAAT AAATCTAATT AATTTTGATT ACTAATAAAA TGCTTCATA? ATACTCTTGT ATTTATAAAT CATCCGTTAT CGTTACTATA CCTTTATACA TCATCCTACA rrCATACCTA AGCTAOCAAA gcaaactact aaaagggtcg tcaacgcaag ttatttgcta gttggtgcat actacacacg gctacggcaa CATTAAGTAA C AC ATT A AG A ggtgttttct taatgtagta tggtaattat atttatttca aaacttggat TAGATATAAA GGTACAGGTA GATGAAAAAT ATTTGGTTAG 'CGGGCTGAGÂ TTAAGCGGAT ataggaggca TATATACAGC TGTGAGAAGA AGAGGGATAA ATACAAAÁAQ GGAAGGATGT TTTTGCCGAC AGAGAAAGGT AGATTAAGTA GGCATCGA3A GGAGAGCAAT TGTAAAATGG ATGATTTGTT

TOGTTTTGTA CGGTGGAGAG aagaacgaaa agatgatcag gtaaaaaats aaacttggaa ATCATGCAAA GCCACACCTC TCCCTTCAAC ACAGTCTTAC GTGTCGTCTT CTCTTCACTC CATATCTCCT TTTTATTACC AAGAAATATA TGTCAATCCC ATTTATATGT ACGT*TCTCTT

AGACTTATCT CTATATACCC CCTTTTAATT TGTGTGCTCT TAGCCTTTAC TCTATAGTTT TAGATAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N°: 13: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:13:

GTAATACGÃC TCACTATAGG GC 62 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:14: GGGGATCCTA TACTAAAACT ATAGAGTAAA GG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:15:

Trp Ile Gly His Asp Ala Gly His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:16:

Asn Vai Gly His Asp Ala Asn His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N°: 17 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: amínoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:17:

Vai Leu Gly His Asp Cys Gly His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:18: 64

Vai Ile Ala Hís Glu Cys Gly His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D} TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:19:

Vai Ile Gly His Asp Cys Ala His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:20:

Vai Vai Gly His Asp Cys Gly His 1 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:21

His Asn Ala His His 1 5

(2} INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido {C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:22

His Asn Tyr Leu His His 1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: . {A} COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 66 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:23:

His Arg Thr Hís His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:24:

His Arg Arg His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:25: 67

His Asp Arg His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:26:

His Asp Gin His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:27:

His Asp His His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:28:

His Asn His His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 29 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:29:

Phe Gin Ile Glu His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 30 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 69 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:30:

His Gin Vai Thr His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA:, proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:31:

His Vai Ile His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 70 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:32:

His Vai Ala His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 33: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (±i} TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:33;

His Ile Pro His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:34:

His Vai Pro His His 1 5 71 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1941 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:35:

GAGCTCGATC ACACAAAGAA AACGTCAAAT GGATCATACT GGGCGCATTT TGCAGACCAA GAGAAAGTGA GAGAGAGTTG TCCTCTCGTT ATCAAGTAAC AGTAGACCAC CACTAAACCG CCAATAGCTT ΛΤΜΤΟΑΛΑΛ TÂGAAAGGTC TAATAACAGA AACAAATOAA AAAGCCTTGT TCCATGGACT GCCTACCCGA ATTGATTGAT TCGACTAGTT TTTCTTCTTC TTTGATTAAG ACCTCCGTftA GAAAAATGGT ACTACTAAAG CCACTCGCTA CCAAAACTAA ACCATTCCAG ACTGTAACTG CACCAATATT TCTAAACTGT AACCAOATCT CAAACATATA AACTWVTTAA GAACTATAAC CATTAACCGT AAAAATAAAT TTAGTACAGT ΑΆΑΑΛΑΤΤΑΤ ACTAATTTCA GCTATGATGG AATTTCAGCT CTTAAGAGTT GTGGAAATCA AGTAAACCTA AAATCCTAAT AATATTCTTC ATCCTTATTT TTGTTTCACA TGCATGCTGW CCAATCTGTT ATTMWSCATTT GAAAGCCTAA AATTCTATAT ACAGTACM.T AAATCTAATT AATTTTCATT ftJCTAATAAAA 72

72 CATCCGTTAT GCAAACTACT GCTACGGCAA ATTTATTTCA CGGGTTGAGA .ATACRAAAAG ggagagcaat· AGATGATCAG ACAGTCTTAC TGTCAATCCC tgtgtgctct CGGCGTGTGC GTCGGTTTTG TCCACTAACC CTCTCCAAAC AGTGAAGAAC aattaggatt AACAGATTTT ACTCGATATA ACTGCTAACC ACCCCTCTTC TGTGACGGGA

TCCTTCATAT

TCATCCTACA

TTATTTGCTA

GGTGTTTTCT

OGTACAGGTA

TATATACAGC

AGAGAAAGGT

TGGTTTTGTA

ATCATQCAAA

CATATCTCCT

AGACTTATCT

TAGATAGACA

CGTCTTCATC

GCTGGTTCTG

TAGTTTTTCT

ATTCATTTTA

TTAATTATTT

CTAATTGTTC

ITATCATGGT

GCACTTATAG

CGGTTCGGTG

AGTCCCGGCG TGGGTTiGACe

ATACTCTTGT

TTCATACCTA

GTTGGTGCAT

TAATGTAGTA

GATGAAAAAT

TSTGAGAAGA

agattaagta CGGTGGAGAG GCCACACCTC TTTTATTACC CTATATACCC TGQCGAATGT AGCCAAACTA ATTATAAGAG 'TGTGTTTTCC AACAGAAAGA CCTTTTAGTT ACAAAATGAG GATDCATGCT CAGGAGTCCA ATCGGCTTGG GCTCTCACTA GGTCTGAGCT

ATTTATAAAT

AGCTAGCAAA

ACTACACACG TGGTAATTAl'

&TTTGGTTAG

AGAGGGATAA

GGCATCGAGA

AAGAACGAAA

TCCCTTCAAC

AAGAAATATA

CCTTTTAATT

GGATCGTGAT

CGAAGATGAT

TCGCGGCCCC

TATGATCACG

TAAATAAAAT

CTTAAGTCCT

TAAAGTTTGA

TGTTAGATAA

JTGGTGGCAC

TAGTCTCCAT

TTGGGCTTGC

C

CGTTACTATA

AAAAGGGTCG

CATTAAGTAA

AAACTTGGAT

TTAAGCGGAT

GGAAGGATGT

TGTAAAATGG

GTAAAAAATG

GTGTCGTCTT

ATTTATATGT

TAiGCCTTTAC

ATGTAGACCG gtggctatgg

AAGTATTTTT

TATTTGAAGA

CATAGGAATC

CCTTTAAAAG

TATACACCAC

ATCAATACAT

CTAGCTGGAC

CTCCTCTTCA

ATCTTGGCTT

CCTTTATACA

TCAACGCAAG

CACATTAAGA

TAGATATAAA

ATAGGAGGCA

TTTTGCCGAC

ATGATTTGTT

AAACTTGGAA

CTCTTCACTC

ACGTTCTCTT

TCTATAGTTT

TACTGACAAA

CGGTTATGGT

GTGGTCTCTT

TTTTCTGTAA

GTACGTTÀCG

TTGCAACAAT

T*TGCATATGT

GCAGATCTTG

TCACTCTAGC

GTCCQGTGAT

CTGGTTTGTT

Lisboa, 4 de Agosto de 2008

Claims (15)

1 Reivindicações Λ 1. Cassette de expressão que compreende a região reguladora 5' da oleoresina que dirige a expressão especifica na semente constituída pela sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 12 ligada operacionalmente a pelo menos um ácido nucleico que codifica para um gene hererólogo da Δβ-dessaturase.

2. Vector de expressão que compreende a cassette de expressão de acordo com a reivindicação 1.

3. Célula compreendendo a cassette de expressão de acordo com a reivindicação 1.

4. Célula compreendendo o vector de expressão de acordo com a reivindicação 2.

5. Célula de acordo com a reivindicação 3, em que a dita célula é uma célula bacteríana, ou uma célula de uma planta.

6. Célula de acordo com a reivindicação 4, em que a dita célula é uma célula bacteríana, ou uma célula, de planta.

7. Planta transgéníca compreendendo a cassette de expressão de acordo com a reivindicação 1.

8. Planta transgéníca compreendendo o vector de expressão de acordo com a reivindicação 2.

9. Planta de acordo com a reivindicação 7 ou 8 em que a dita planta é pelo menos girassol, soja, milho, algodão, tabaco, amendoim, colza, ou Arabidopsis. 2

10. Descendência da planta de acordo com a reivindicação 7, ou 8.

11. Semente da planta de acordo com a reivindicação 7 ou 8.

12. Processo para produzir uma planta com niveis acrescidos em teor de ácido gama linolénico (GLA) que compreende: (a) a transformação de uma célula de planta com o vector de expressão de acordo com a reivindicação 2; e (b) regeneração de uma planta com niveis acrescidos de GLA a partir da dita célula da planta

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que o dito gene da Δβ-dessaturase é pelo menos um de um gene da Δβ-dessaturase cianobacteriano, ou um gene de Δβ-dessaturase da borragem.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13 em que a dita planta é girassol, soja, milho, tabaco, algodão, amendoim, semente oleaginosa de colza ou Arabidopsis.

15. Processo de induzir a produção de pelo menos um dos ácidos gama linolénico (GLA), ou ácido octadecatetranoico (OTA) numa planta deficiente ou desprovida de GLA compreendendo a transformação da dita planta com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 2 e a regeneração de uma planta com níveis acrescidos de pelo menos um dos GLA ou OTA. Lisboa, 4 de Agosto de 2008