CN102786587A

CN102786587A - 一种提高植物种子脂肪酸含量的转录因子及其应用

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Publication number: CN102786587A
Application number: CN2012102065887A
Authority: CN
Inventors: 华金平; 刘正杰; 张园; 赵鹏; 赵清翠; 李玉华; 王玉美
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2032-06-18
Also published as: CN102786587B

Abstract

本发明公开了一种与提高植物种子脂肪酸含量相关的转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的转录因子是如下（a）或（b）：（a）羧基端至少含有序列表中序列2的第221-438位氨基酸序列，并且从序列2的第221位开始，按照序列2的氨基酸序列方向序列2的氨基端延长，得到长度为218至438个氨基酸的任意一个蛋白片段；所述蛋白片段具有转录活性；（b）将（a）所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有转录活性或与提高植物种子脂肪酸含量相关的由（a）所限定的氨基酸序列衍生的蛋白质。本发明所提供的转录因子GhWRI 1能够显著提高植物种子的脂肪酸含量，增加种子的千粒重，增大种子细胞大小，具备良好的应用前景。

Description

一种提高植物种子脂肪酸含量的转录因子及其应用

技术领域

本发明涉及一种与提高植物种子脂肪酸含量相关的转录因子及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于棉花的与提高植物种子脂肪酸含量相关的转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物与油料作物。我国常年植棉600万公顷，约产皮棉760万吨、棉籽1300万吨。作为棉花生产的主要副产品，棉籽富含油脂与蛋白（许红霞,杨伟华,王延琴,周大云,匡猛,冯新爱。我国油用棉子质量状况分析。中国棉花,2009,36(7):2-3），剥壳后的棉仁脂肪含量30％～40％，可生产油脂。近年来，随着世界油脂资源和能源资源的日益紧迫，棉籽油等油料作物的生产越来越受到重视，扩大油料作物的种植面积已经成为解决我国油脂资源紧张的重要途径。本着“不与粮食作物争地”的原则，为增加单位种植面积内棉花种子的油脂含量，通过克隆调控植物脂肪酸合成的转录因子，应用遗传转化手段导入棉花受体植株中，从而提高植物的脂肪酸含量，进而增加棉籽仁中的油脂含量，提高油料作物的油脂产量。这对增加我国油脂供应具有重要经济效益与社会效益。

通过利用转录因子调控种子中脂肪酸合成等途径相关的基因表达，从而提高脂肪酸含量与油脂含量的研究越来越受到重视。LEC1编码CCAAT结合因子HAP3亚基的同源物，是植物胚胎发育过程中重要的转录调节因子，Mu等（Mu et al..LEAFYCOTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis.2008,148(2):1042-1054）的研究表明，拟南芥LEC1基因的过表达导致脂肪酸合成基因表达量整体水平的增加，在LEC1过表达的转基因植株中，超过58%已知的参与质体脂肪酸合成途径的酶基因表现出正调控。WRINKLED1（WRI1）转录因子直接调控糖酵解和脂肪酸代谢过程，能提高脂肪酸合成相关基因的整体表达水平，提高脂肪酸和油脂含量（Baud et al..WRINKLED 1specifies the regulatory action of LEAFY COTYLEDON2towards fatty acid metabolism during seed maturation in Arabidopsis,Plant Journal,2007,50(5):825-838）。在拟南芥中过表达Bnwri1使种子的含油量增加了10%-40%，进一步分析发现转基因拟南芥幼胚的细胞体积变大而非数量变多（Liu et al..Increasing seedmass and oil content in transgenic Arabidopsis by the overexpression of wri1-like gene fromBrassica napus.Plant Physiology and Biochemistry，2010,48:9-15）。但是，目前还没有关于调控棉花脂肪酸含量的转录因子的研究。

在国内有关调节脂肪酸含量或成份的专利技术报道中，禹山林等（花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法，申请号：200810002795.4）公开了花生籽粒中脂肪酸脱饱和反应过程中花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码蛋白质，该基因的表达可以提高花生中不饱和脂肪酸的含量，并且还能增加花生的抗寒性。目前尚未见有棉花转录因子调控脂肪酸含量或成份的具体技术发表。

发明内容

本发明的目的是提供一种与提高植物种子脂肪酸含量相关的蛋白及其编码基因与应用，该蛋白具有转录因子功能。

本发明所提供的蛋白质，来源于棉花（Gossypium hirsutum L.），名称为GhWRI1,是如下（a）或（b）：

（a）羧基端至少含有序列表中序列2的第221-438位氨基酸序列，并且从序列2的第221位开始，按照序列2的氨基酸序列方向向序列2的氨基端延长，得到长度为218至438个氨基酸的任意一个蛋白片段；所述蛋白片段具有转录活性。

（b）将（a）所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有转录活性或与提高植物种子脂肪酸含量相关的由（a）所限定的氨基酸序列衍生的蛋白质。

在本发明的中，所述蛋白质具体为如下（c）或（d）：

（c）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）由序列表中序列2的第221-438位氨基酸序列组成的蛋白质。

序列表中序列2由438个氨基酸组成。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在由序列表中序列2或序列2的第221-438位的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明中，所述核酸分子是编码所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）或2）或3）：

1）3′端至少含有序列表中序列3的第685-1341位的核苷酸序列，并且从序列3的第685位开始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的5′端延长，和/或从序列3的第685位开始，按照序列3的核苷酸序列向序列3的3′端延长，得到长度为657至1341bp的任意一个DNA片段；

2）3′端至少含有序列表中序列1的第661-1317位核苷酸序列，并且从序列1的第661位开始，按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为657至1317bp的任意一个DNA片段；

3）与1）或2）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且与提高植物种子脂肪酸含量相关的DNA片段。

更为具体的，所述基因是如下4）-8）中的任一种：

4）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

5）序列表中序列1所示的DNA分子；

6）序列表中序列1的第661-1317位所示的DNA分子；

7）序列表中序列3所示的DNA分子；

8）序列表中序列3的第25-1383位所示的DNA分子。

序列3由1539个核苷酸组成，其中第25-1341位为编码序列，即序列表中序列1，由1317个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质；其中，序列1的第661-1317位核苷酸对应序列2的第221-438位氨基酸。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体或酵母表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述酵母表达载体如pGBT9等。所述植物表达载体或所述酵母表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述核酸分子（基因）构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为如下（1）或（2）：

（1）P_ADH1启动子；

（2）35S启动子，如CaMV 35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体可为如下（1）或（2）：

（1）在pGBT9载体（P_ADH1启动子）的多克隆位点处插入所述基因（得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为EcoR I和BamHI。

（2）在p2301M载体（CaMV 35S启动子）的多克隆位点处插入所述基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为BamH I和Spe I。

p2301M载体经由pCAMBIA2301载体（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品目录号：Biovec-07）的多克隆位点Hind Ⅲ与EcoR I之间插入带有多克隆位点的表达盒改造而成，具体步骤如下：将pCAMBIA2301以Hind Ⅲ与EcoR I双酶切，与以相同酶酶切的带有多克隆位点的表达盒连接，获得p2301M载体。所插入的带有多克隆位点的表达盒的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述基因的重组酵母；所述酵母具体可为酵母菌株Y187。

所述蛋白质，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）-a6）中任一的应用也属于本发明的保护范围：

a1）调控植物种子脂肪酸含量；

a2）调控植物种子千粒重；

a3）调控植物种子细胞大小；

a4）选育种子脂肪酸含量高的植物品种；

a5）选育种子千粒重增加的植物品种；

a6）选育种子细胞大小增大的植物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控植物种子脂肪酸含量具体为提高植物种子脂肪酸含量；所述调控植物种子千粒重具体为增加植物种子千粒重；所述调控植物种子细胞大小具体为增大植物种子细胞大小。

所述选育种子脂肪酸含量高的植物品种的方法，所述选育种子千粒重增加的植物品种的方法，以及所述选育种子细胞大小增大的植物品种的方法，均可包括将所述蛋白质表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

该方法可包括将编码所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，满足如下b1）-b3）中的至少一种：

b1）种子脂肪酸含量提高；

b2）种子千粒重增加；

b3）种子细胞大小增大。

所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述蛋白质的基因是所述基因是如下1）或2）或3）：

更为具体的，所述基因是如下4）-8）中的任一种：

4）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

5）序列表中序列1所示的DNA分子；

6）序列表中序列1的第661-1317位所示的DNA分子；

7）序列表中序列3所示的DNA分子；

8）序列表中序列3的第25-1383位所示的DNA分子。

所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体（植物表达载体）导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。

所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物，所述双子叶植株如拟南芥。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为Col型拟南芥。

所述蛋白质在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明从棉花中得到的转录因子GhWRI1能够显著提高植物种子的脂肪酸含量，增加种子的千粒重，增大种子细胞大小，该转录因子具备良好的应用前景。

附图说明

图1为GhWRI1基因（含ORF）的扩增。其中，泳道1为D2000DNA Ldder分子量标准；泳道1和泳道2为GhWRI1基因（含ORF）的PCR扩增结果。

图2为GhWRI1蛋白β-半乳糖苷酶活性的定性检测。其中，A为三种酵母载体简图，a-e分别为pGBT9、pGBT9-GhWRI1、pGBT9-GhWRI1-N、pGBT9-WRI1-C、pGBT9-WER；B为酵母滤纸显色情况，转化载体a-e同上，“左”表示酵母菌落在SD/-Trp缺陷型培养基上生长情况，“右”表示酵母菌落在滤纸上显色情况，1-3表示3个单菌落。

图3为GhWRI1蛋白β-半乳糖苷酶活性的定量检测。其中，pGBT9-WRI即表示pGBT-GhWRI1，pGBT9-WRI-N即表示pGBT-GhWRI1-N，pGBT9-WRI-C即表示pGBT-GhWRI1-C。

图4为不同含油量棉花品种GhWRI1基因表达量分析。

图5为重组表达载体p2301M-WRI1酶切鉴定。其中，泳道M为D15000DNA plusladder分子量标准；泳道1为重组表达载体p2301M-WRI1的双酶切产物。

图6为重组表达载体p2301M-WRI1转化农杆菌菌落PCR阳性克隆鉴定。其中，泳道M为D2000DNALadder分子量标准；泳道1-6为六个阳性单克隆菌落的PCR检测结果。

图7为T₁代拟南芥抗性植株阳性转化子PCR鉴定。其中，泳道M为D2000DNALadder分子量标准；泳道1为阳性对照（重组表达载体p2301M-WRI1）；泳道2为阴性对照（未转基因的野生型拟南芥植株）；泳道3-7为7个阳性转GhWRI1基因植株的PCR检测结果。

图8为拟南芥转基因株系T₃代种子千粒重分析结果。其中，WT表示未转基因的野生型拟南芥对照；W1-7、W1-10、W2-1、W2-8和W3-3是五个T₃代转GhWRI1基因拟南芥株系。

图9为扫描电镜下观察转GhWRI1基因拟南芥种子细胞大小。其中，a为扫描电镜下观察转GhWRI1基因拟南芥种子细胞图片；b为转GhWRI1基因拟南芥种子细胞大小的定量分析。

图10为T₃代纯合转GhWRI1基因株系的生长表型。

图11为拟南芥转GhWRI1基因株系T₃代种子脂肪酸含量分析结果。其中，Col表示未转基因的野生型拟南芥植株对照；W1-7、W1-10、W2-1、W2-8和W3-3分别表示5个T₃代转GhWRI1基因拟南芥株系。*表示在0.05水平上与Col组差异显著。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、棉花转录因子GhWRI1的编码基因GhWRI1的获得

1、总RNA提取：选用陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种Coker201（武秀明，刘传亮,张朝军,李付广。棉花体细胞胚胎发生的研究进展。植物学通报，2008,25(4):469-475）为实验材料，取开花后20天的幼胚材料，速冻于液氮中，应用CTAB法（参考文献：刘洋，何心尧，马红波，吴泳历，杨佑明。用CTAB-PVP法提取棉花各组织总RNA的研究。中国农业大学学报，2006，11(1):53-56）提取RNA。

2、利用Promaga的RT-PCR反应体系将步骤1提取的RNA反转录合成cDNA。

3、RT-PCR扩增：

根据NCBI数据库中棉花的EST信息拼接成contig，设计如下引物1和引物2：

引物1：5'-ATGAAGAGGTCACCGAGTTGT-3'（序列3的第25-45位）

引物2：5'-CTCCGAATTATCAGAAACTCT-3'（序列3的第1361-1381位的反向互补序列）

以步骤2获得的陆地棉品种Coker201的cDNA为模版，用引物1和引物2进行PCR扩增。反应体系：2.5μl 10×PCR缓冲液（含MgCl₂），各0.5μl引物1和引物2（10μM），4μl 2.5mM dNTPs，1μl cDNA样品，0.25μl LA酶（TaKaRa），16.25μl双蒸水。反应程序：94℃3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃10min。

经上述PCR反应扩增出大小约为1357bp的目的条带（图1）。将PCR产物回收后与pMD18-T载体（TaKaRa）连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，送样测序。结果表明，该PCR产物中含有序列表中序列1所示的DNA片段，将该DNA片段所在基因命名为GhWRI1基因。整个序列1即为GhWRI1基因的编码区序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质，命名为GhWRI1蛋白。

4、RACE扩增获得GhWRI1基因cDNA的3'端序列：按照Invitrogen Gene Racer Kit说明进行3′RACE。用设计的GhWRI1基因3'RACE特异引物Wri3GSP1：5'-CTGCATGGATTCCGGATTGACATC-3'（序列1的第1014-1037位，序列3的第1038-1061位）与Wri3NGSP1：5'-GCGTGATGGATGATGATGTGATTGG-3'（序列1的第1175-1199位，序列3的第1199-1223位）和试剂盒对应的引物进行如下两次PCR：

第一次PCR反应（Wri3GSP1和试剂盒所提供的引物序列GeneRacer 3’primer：3’-GCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG-5’）：94℃ 3min；94℃ 30s，70℃~60℃（Touch Down，前10个循环退火温度每个循环下降1℃，后25个循环退火温度均为60℃）30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。第二次巢式PCR反应（Wri3NGSP1和试剂盒所提供的引物序列GeneRacer 3’nested primer：3’-GTGACAGTACGGCAATGCATCGC-5’）：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃1min，35个循环；72℃ 10min。通过上述两次PCR扩增得到cDNA的3'端序列，并送样测序，测序结果显示所得3'端序列为序列表中序列3的第1038-1539位。

5、GhWRI1基因全长获得与分析：经在线Cap3拼接软件（http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php）将步骤3获得的GhWRI1基因的编码区序列（序列1）与步骤4获得的GhWRI1基因cDNA的3'端序列拼接，再将拼接序列与NCBI上EST数据库比对，经电子拼接获得该基因的全长获得该基因的全长，该基因全长序列为1539bp（序列3），其中第25-1341位为GhWRI1基因的编码序列（序列1），序列3也编码序列表中序列2所示的GhWRI1蛋白。以ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）分析该蛋白的理化性质，发现该蛋白的分子量为49.429KD，蛋白理论等电点为5.55。应用SMART软件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析GhWRI1氨基酸序列的保守功能域，发现GhWRI1蛋白N端的第78-150位和第180-244位含有2个AP2保守结构功能域。应用在线软件预测（www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）预测其亚细胞定位方式，发现GhWRI1蛋白定位于细胞核。

实施例2、GhWRI1转录因子的转录激活功能分析

本实施例以pGBT9（孟红岩，杜雄明，张春义等.棉花转录因子基因GhMS3的克隆及其启动子功能的鉴定.中国农业科学，2010，43（17））为原始载体，构建如下三种表达载体（图2中A）：（1）含有GhWRI1基因的CDS全长（序列1，简称GhWRI1-CDS）的重组表达载体pGBT-GhWRI1；（2）含有GhWRI1基因的N端（序列1的第1-654位核苷酸，简称GhWRI1-N）的重组表达载体pGBT-GhWRI1-N；（3）含有GhWRI1基因的C端（序列1的第661-1317位核苷酸，简称GhWRI1-C）的重组表达载体pGBT-GhWRI1-C。从而对GhWRI1转录因子的转录激活功能进行分析。

一、重组表达载体的构建

以实施例1获得的GhWRI1基因的编码区序列（序列1）为模板，用如下引物扩增得到含有相应酶切位点的GhWRI1-CDS、GhWRI1-N和GhWRI1-C片段；用相应的限制性内切酶双酶切对应的PCR产物，将酶切后的产物与经过同样双酶切的pGBT9载体的骨架片段连接。对连接产物进行转化、摇菌、挑取质粒，送样测序。经测序表明含有GhWRI1-CDS、GhWRI1-N和GhWRI1-C片段的重组质粒即分别为重组表达载体pGBT-GhWRI1、pGBT-GhWRI1-N和pGBT-GhWRI1-C。

扩增GhWRI1-CDS的引物序列如下：

CDS-up：GGAATTCATGAAGAGGTCACCGAGTTGT（下划线部分为EcoRI的识别序列，其后的序列为序列1的第1-21位）

CDS-down：CGGGATCCAACAGAGTAGTTACAAGAAACC（下划线部分为BamHI的识别序列，其后的序列为序列1的第1293-1314位）

扩增GhWRI1-N的引物序列如下：

N-up：GGAATTCATGAAGAGGTCACCGAGTTGT（下划线部分为EcoRI的识别序列，其后的序列为序列1的第1-21位）

N-down：CGGGATCCTGCTGCTTCCTCTTGTGTAT（下划线部分为BamHI的识别序列，其后的序列为序列1的第635-654位的反向互补序列）

扩增GhWRI1-C的引物序列如下：

C-up：GGAATTCTATGATATGGCAGCTTTGGA（下划线部分为EcoR I的识别序列，其后的序列为序列1的第661-680位）

C-down：CGGGATCCAACAGAGTAGTTACAAGAAACC（下划线部分为BamHI的识别序列，其后的序列为序列1的第1293-1314位）

二、Whatman滤纸显色检测步骤一各重组表达载体的转录激活功能

采用热激法将步骤一构建的三个重组表达载体分别转化到酵母菌株Y187（孟红岩，杜雄明，张春义等.棉花转录因子基因GhMS3的克隆及其启动子功能的鉴定.中国农业科学，2010，43（17））的感受态细胞，将转化后的酵母菌株分为两组，分别于SD/-Trp培养基（北京泛基诺(FunGenome)科技有限公司，产品目录号：YGM003A-2）和SD/-Trp/-His培养基（北京泛基诺(FunGenome)科技有限公司，产品目录号：YGM003A-17）28℃培养2-3天。由于Y187为Trp和His双缺陷型菌株，而pGBT9载体含有Trp编码基因，所以转化以上载体的酵母菌能够在SD/-Trp培养基上生长，但不能在SD/-Trp/-His培养基上正常生长。各挑取3个在SD/-Trp培养基上生长的酵母单菌落，按Clontech系统操作流程在Whatman滤纸上进行β-半乳糖苷酶活性的定性检测（参考文献：孟红岩.棉花MYB转录因子GhMS3生物学功能的初步研究.北京，中国农业科学院，硕士学位论文，pp:16）。然后，以ONPG（onitrophenyl-β-D-galactopyranoside）为底物，进行β-半乳糖苷酶活性的定量检测（参考文献：孟红岩.棉花MYB转录因子GhMS3生物学功能的初步研究.北京，中国农业科学院，硕士学位论文，pp:16-17）。同时设置pGBT9载体作为阴性对照；设置pGBT9-WER载体（孟红岩，杜雄明，张春义等.棉花转录因子基因GhMS3的克隆及其启动子功能的鉴定.中国农业科学，2010，43（17））作为阳性对照。

用Whatman滤纸进行β-半乳糖苷酶活性的定性检测的结果如图2所示，pGBT-GhWRI1-N和作为阴性对照的pGBT9载体一样，不能显色；而pGBT-GhWRI1-C、pGBT-GhWRI1和作为阳性对照的pGBT9-WER载体一样，都能使滤纸显色。

以ONPG（onitrophenyl-β-D-galactopyranoside）为底物进行β-半乳糖苷酶活性的定量检测的结果如图3所示，pGBT-GhWRI1-N几乎检测不到β-半乳糖苷酶活性，而pGBT-GhWRI1-C的β-半乳糖苷酶活性远高于pGBT-GhWRI1。这一结果说明转录激活区域位于GhWRI1蛋白的C端。

实施例3、GhWRI1基因的表达分析

提取不同含油量的陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种09F9083,09F9077,09F9077,09E1021和09E1022（各品种均从河北冀丰种业有限公司购得；种仁含油量以公众已知的索氏提取法测定，测定结果如表1）开花后20天幼胚的RNA，经Promaga的RT-PCR反应体系反转录合成cDNA，针对GhWRI1基因设计引物5'-GGCATAGATGGACTGGGAGAT-3'（序列1的第251-271位）和5'-GCTGCTGCTTCCTCTTGTGT-3'（序列1的第637-656位的反向互补序列），以Ghactin为内参基因，设计引物5'-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3'和5'-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3'，采用半定量RT-PCR分析GhWRI1基因在含油量材料中的表达。

结果如图4所示，GhWRI1基因的表达量与棉花品种的含油量成正比。这在一定程度上表明可以通过过量表达GhWRI1基因来调控植物中的含油量。

实施例4、转GhWRI1基因拟南芥的获得及其功能验证

MS筛选培养基：在基本MS培养液中加入终浓度为10g/L的蔗糖，终浓度为7.6g/L的琼脂粉，终浓度为50mg/L的卡那霉素。其中，MS培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

表1MS基本培养液的溶质

大量元素	培养基中浓度（g·L^-1）
		NH₄NO₃	1.65
KNO₃	1.9
		KH₂PO₄	0.17
MgSO₄.7H₂O	0.37
		CaCl₂	0.44

微量元素	培养基中浓度（mg·L^-1）
		FeSO₄·7H₂O	27.8
Na₂EDTA	37.3
		MnSO₄·4H₂O	22.3
ZnSO₄·4H₂O	8.6
		H₃BO₃	6.2
KI	0.83
		Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
CuSO₄·5H₂O	0.025
		CoCl₂·6H₂O	0.025
有机成分	培养基中浓度（mg·L^-1）
		甘氨酸	2.0
盐酸硫胺素	0.1
		盐酸吡哆素	0.5
烟酸VB5	0.5
		肌醇	100

一、重组表达载体p2301M-WRI1的构建

以实施例1获得的GhWRI1基因的全序列（序列3）为模板，用引物GhWRI1-Bam和GhWRI1-Spe扩增得到含有BamH I和Spe I酶切位点的GhWRI1基因片段；用限制性内切酶BamH I和Spe I双酶切对应的PCR产物，将酶切后的GhWRI1基因片段与经过同样双酶切的p2301M载体（p2301M载体的构建过程见下文）的骨架片段连接。对连接产物进行转化、摇菌、挑取质粒，BamH I和Spe I双酶切酶切鉴定。将经酶切鉴定表明含有大小约为1377bp的目的条带（图5）的重组质粒送样测序。将经测序表明含有序列表中序列1所示的GhWRI1基因的重组质粒命名为重组表达载体p2301M-WRI1。

GhWRI1-Bam：5'-CGGGATCCCGATGAAGAGGTCACCGAGTTGT-3'（下划线处为BamH I的识别序列，该序列的后21位为序列3的第25-45位）

GhWRI1-Spe：5'-GGACTAGTCCCTCCGAATTATCAGAAACTCT-3'（下划线处为Spe I的识别序列，该序列为序列3的第1361-1383位的反向互补序列）

二、转GhWRI1基因拟南芥的获得

1、重组表达载体p2301M-WRI1转化拟南芥

将上述步骤一获得的重组表达载体p2301M-WRI1经热激法转化至农杆菌EHA105（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品货号Biovector008-5），挑取单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆。所用引物为步骤一所述的GhWRI1-Bam和GhWRI1-Spe，阳性克隆会扩增得到大小为1377bp的目的条带（图6）

将经上述鉴定表明含有重组表达载体p2301M-WRI1的农杆菌命名为EHA105/p2301M-WRI1；将转入p2301M空载体的农杆菌命名为EHA105/p2301M。

采用“浸花法”（高建强，梁华，赵军.植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展.中国农学通报，2010,26(16):22-25）将农杆菌EHA105/p2301M-WRI1和EHA105/p2301M分别转化至Col型拟南芥（Col型拟南芥从Tair网站注册购买，tair登录号：SpeciesVariant:90）中，至成熟收获种子（T₁代）。

2、转GhWRI1基因拟南芥植株的鉴定

将上述步骤1收获的转GhWRI1基因拟南芥植株的种子和转入EHA105/p2301M的拟南芥植株的种子（T₁代）经MS筛选培养基（添加终浓度为50mg/L的Kan）筛选获得抗性植株（T₁代），移栽并种植后，取叶片样品提取DNA作为模板，以引物5'-CACCAACCCTGATCAAT-3′和5'-CATCGCAAGACCGGCAAC-3′进行PCR扩增载体上的抗性标记基因Kan，鉴定阳性植株。

结果如图7所示，转GhWRI1基因抗性植株叶片中均能检测到目的基因Kan的表达（约500bp的目的条带），对于检测阳性的转GhWRI1基因抗性植株，说明GhWRI1基因成功转化至拟南芥。对转入EHA105/p2301M的拟南芥植株的检测结果也为阳性。

三、转GhWRI1基因拟南芥植株表型的鉴定及种子含油状况的检测

1、转GhWRI1基因拟南芥植株表型的鉴定

将经上述步骤二鉴定为阳性的T₁代转GhWRI1基因拟南芥植株或转入EHA105/p2301M的拟南芥植株经两次自交后获得T₃代种子。称量分析不同株系的种子千粒重（随机选取1000粒种子的重量），同时以Col型拟南芥植株种子作为对照。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图8和表2所示，在部分转GhWRI1基因拟南芥株系中，千粒重显著高于野生型拟南芥（WT）。转入空载体p2301M的拟南芥植株的检测结果与未转基因的野生型拟南芥植株（WT）一致，无显著差异。

表2转GhWRI1基因拟南芥植株T₃代种子千粒重分析结果

注：WT表示未转基因的野生型拟南芥对照；W1-7、W1-10、W2-1、W2-8和W3-3是五个T₃代转GhWRI1基因拟南芥株系。

在千粒重显著提高的T₃代转GhWRI1基因拟南芥株系中选取2个（W1-7和W2-1），扫描电镜下观察转GhWRI1基因拟南芥种子细胞大小（图9a）。同时以未转基因的野生型拟南芥植株（Col）种子和转入空载体p2301M的拟南芥植株作为对照。实验重复3次，每次选取3粒种子，每粒种子的细胞随机选取15个视野进行观测，结果取平均值。结果发现，转GhWRI1基因拟南芥植株种子细胞的大小明显大于野生型拟南芥（Col）的种子细胞的大小（图9-b）。转入空载体p2301M的拟南芥植株的检测结果与未转基因的野生型拟南芥植株（Col）一致，无显著差异。

对经上述检测表明千粒重显著提高的T₃代转GhWRI1基因拟南芥株系进行纯合鉴定，具体操作如下：对T₂代植株进行卡那霉素抗性筛选鉴定，抗感比符合3:1的株系作为后续研究材料，对这些材料进行经自交，获得T₃代纯合转基因植株及种子。进一步，对T₃代纯合转GhWRI1基因株系（W1-7和W2-1）或转入EHA105/p2301M的拟南芥植株的生长表型，如根长、叶片颜色及大小进行观察。同时以未转基因的野生型（Col型）拟南芥植株种子作为对照。实验重复三次，每次选取1株进行。

结果如图10所示，与对照相比，转GhWRI1基因株系（W1-7和W2-1）根长及叶片颜色、大小没有显著差异。这一结果说明该基因的表达对受体材料的生长发育无不良影响。

2、转GhWRI1基因拟南芥植株种子脂肪酸含量状况的检测

以气相色谱法测定上述步骤1获得的不同株系T₃代转GhWRI1基因拟南芥植株种子的脂肪酸含量。具体操作方法如下：

取转GhWRI1基因拟南芥植株T₃代种子1000粒，45℃烘干60小时，用研钵研磨成粉末。每个样品称取0.01～0.02g粉末放入15ml的细胞培养管中，用移液管加0.4ml无水甲醇∶氯乙酰（体积比为10∶1）的混合液，0.5ml浓度约为1mg/ml的内标（十九烷酸甲酯，购自百灵威化学技术有限公司，货号：SFA-013N），振荡混匀，80℃水浴2小时。水浴结束后取出，冷却到室温，加0.5ml浓度为7％（7g/100ml）K₂CO₃水溶液中和脂肪酸。吸取上清于样品瓶中，置4℃冰箱待于气相色谱上机。气相色谱条件如下：交联石英毛细管柱，PEG-20M为固定相，氮气为载气，恒流流速1.2ml/min，柱温200℃，检测温度350℃，FID检测器。同时设置转入空载体p2301M的拟南芥植株，以及未转基因的野生型拟南芥植株作为对照。实验重复三次，结果取平均值。

检测结果如图11和表3所示，与未转基因的野生型拟南芥植株（Col）相比，部分转GhWRI1基因拟南芥株系的脂肪酸含量显著提高。转入空载体p2301M的拟南芥植株的检测结果与未转基因的野生型拟南芥植株（Col）一致，无显著差异。

表3转GhWRI1基因拟南芥植株T₃代种子脂肪酸含量检测结果

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种提高植物种子脂肪酸含量的转录因子及其应用

<130>CGGNARI122651

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1317

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutumL.)

<400>1

atgaagaggt caccgagttg ttcttcttct tctaattcat gctttgcatt gccatcacca 60

tcatcatcat cattatcagc atcaccatct tcatcatcat catcatcttc atgtgagaac 120

cctcatgatc aatcagagaa acccaaggct aaaagggcta gaaaacatca aaacactgat 180

aataatgctt gtttgaacaa tgctaacaac aatggcggta gaaggagctc tatttacaga 240

ggagtcacca ggcatagatg gactgggaga tttgaggctc acctttggga caagagttct 300

tggaacaata ttcagaacaa gaaaggaaga caagtttatt taggggctta tgatagtgag 360

gaggcagcgg ctcgaaccta tgatctagcg gctctcaaat attggggggc ggaaacgata 420

ctgaacttcc cgaaagaaag atatgaaaaa gagatggaag aaatgaagaa agtgacaaag 480

gaagagtact tggcgtctct acgacgtcgc agcagtgggt tttctagagg agtttctaag 540

tatcgtgggg tagctaggca tcaccacaat gggaggtggg aagcccgaat tggtcgagtt 600

tttggaaaca aatatctcta tttagggacc tataatacac aagaggaagc agcagcagca 660

tatgatatgg cagctttgga gtataggggg gccaatgccg tgaccaattt cgatattagc 720

cattacattg aacgcttgaa gcagaaagga attttgttag tagatcgaac ggaagaacaa 780

attcccaacc ctgatgaagc tcgacgagta gaatccgaag aaaatggacc acagccgctg 840

caggagcagc aagaacggca ggaaaaacag gaacaagaat tgaaccaaga agaggccgaa 900

aaatctcaac attttcaata catgcaaatg cagcttcctc tatgcattga tagtccgatg 960

acaacaatgg ccggtattga gcctactgat agtaatgaac tagcatggag tttctgcatg 1020

gattccggat tgacatcgtt tttggtcccg gacatccctc tcgatggcac cgctgaattg 1080

ccaaacttgt ttgatcatga tacgggattt gaggataact tcgacttgat attcgacgta 1140

gggccgccta acaaagaaga ggctaatcgg aaatgcgtga tggatgatga tgtgattgga 1200

gtcggtgttt ccatgagcat ggaagacaat aataggaagg agagattgtc atcaccgtct 1260

tcagactctc catgttcatc atcgacaacc tcggtttctt gtaactactc tgtttaa 1317

<210>2

<211>438

<212>PRT

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum L.)

<400>2

Met Lys Arg Ser Pro Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asn Ser Cys Phe Ala

1 5 10 15

Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Ser Cys Glu Asn Pro His Asp Gln Ser Glu Lys Pro

35 40 45

Lys Ala Lys Arg Ala Arg Lys His Gln Asn Thr Asp Asn Asn Ala Cys

50 55 60

Leu Asn Asn Ala Asn Asn Asn Gly Gly Arg Arg Ser Ser Ile Tyr Arg

65 70 75 80

Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Phe Glu Ala His Leu Trp

85 90 95

Asp Lys Ser Ser Trp Asn Asn Ile Gln Asn Lys Lys Gly Arg Gln Val

100 105 110

Tyr Leu Gly Ala Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ala Arg Thr Tyr Asp

115 120 125

Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Ala Glu Thr Ile Leu Asn Phe Pro

130 135 140

Lys Glu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Glu Glu Met Lys Lys Val Thr Lys

145 150 155 160

Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Arg Arg Arg Ser Ser Gly Phe Ser Arg

165 170 175

Gly Val Ser Lys Tyr Arg Gly Val Ala Arg His His His Asn Gly Arg

180 185 190

Trp Glu Ala Arg Ile Gly Arg Val Phe Gly Asn Lys Tyr Leu Tyr Leu

195 200 205

Gly Thr Tyr Asn Thr Gln Glu Glu Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Met Ala

210 215 220

Ala Leu Glu Tyr Arg Gly Ala Asn Ala Val Thr Asn Phe Asp Ile Ser

225 230 235 240

His Tyr Ile Glu Arg Leu Lys Gln Lys Gly Ile Leu Leu Val Asp Arg

245 250 255

Thr Glu Glu Gln Ile Pro Asn Pro Asp Glu Ala Arg Arg Val Glu Ser

260 265 270

Glu Glu Asn Gly Pro Gln Pro Leu Gln Glu Gln Gln Glu Arg Gln Glu

275 280 285

Lys Gln Glu Gln Glu Leu Asn Gln Glu Glu Ala Glu Lys Ser Gln His

290 295 300

Phe Gln Tyr Met Gln Met Gln Leu Pro Leu Cys Ile Asp Ser Pro Met

305 310 315 320

Thr Thr Met Ala Gly Ile Glu Pro Thr Asp Ser Asn Glu Leu Ala Trp

325 330 335

Ser Phe Cys Met Asp Ser Gly Leu Thr Ser Phe Leu Val Pro Asp Ile

340 345 350

Pro Leu Asp Gly Thr Ala Glu Leu Pro Asn Leu Phe Asp His Asp Thr

355 360 365

Gly Phe Glu Asp Asn Phe Asp Leu Ile Phe Asp Val Gly Pro Pro Asn

370 375 380

Lys Glu Glu Ala Asn Arg Lys Cys Val Met Asp Asp Asp Val Ile Gly

385 390 395 400

Val Gly Val Ser Met Ser Met Glu Asp Asn Asn Arg Lys Glu Arg Leu

405 410 415

Ser Ser Pro Ser Ser Asp Ser Pro Cys Ser Ser Ser Thr Thr Ser Val

420 425 430

Ser Cys Asn Tyr Ser Val

435

<210>3

<211>1539

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum L.)

<400>3

ggcacgaggg gggaagaaaa aaaaatgaag aggtcaccga gttgttcttc ttcttctaat 60

tcatgctttg cattgccatc accatcatca tcatcattat cagcatcacc atcttcatca 120

tcatcatcat cttcatgtga gaaccctcat gatcaatcag agaaacccaa ggctaaaagg 180

gctagaaaac atcaaaacac tgataataat gcttgtttga acaatgctaa caacaatggc 240

ggtagaagga gctctattta cagaggagtc accaggcata gatggactgg gagatttgag 300

gctcaccttt gggacaagag ttcttggaac aatattcaga acaagaaagg aagacaagtt 360

tatttagggg cttatgatag tgaggaggca gcggctcgaa cctatgatct agcggctctc 420

aaatattggg gggcggaaac gatactgaac ttcccgaaag aaagatatga aaaagagatg 480

gaagaaatga agaaagtgac aaaggaagag tacttggcgt ctctacgacg tcgcagcagt 540

gggttttcta gaggagtttc taagtatcgt ggggtagcta ggcatcacca caatgggagg 600

tgggaagccc gaattggtcg agtttttgga aacaaatatc tctatttagg gacctataat 660

acacaagagg aagcagcagc agcatatgat atggcagctt tggagtatag gggggccaat 720

gccgtgacca atttcgatat tagccattac attgaacgct tgaagcagaa aggaattttg 780

ttagtagatc gaacggaaga acaaattccc aaccctgatg aagctcgacg agtagaatcc 840

gaagaaaatg gaccacagcc gctgcaggag cagcaagaac ggcaggaaaa acaggaacaa 900

gaattgaacc aagaagaggc cgaaaaatct caacattttc aatacatgca aatgcagctt 960

cctctatgca ttgatagtcc gatgacaaca atggccggta ttgagcctac tgatagtaat 1020

gaactagcat ggagtttctg catggattcc ggattgacat cgtttttggt cccggacatc 1080

cctctcgatg gcaccgctga attgccaaac ttgtttgatc atgatacggg atttgaggat 1140

aacttcgact tgatattcga cgtagggccg cctaacaaag aagaggctaa tcggaaatgc 1200

gtgatggatg atgatgtgat tggagtcggt gtttccatga gcatggaaga caataatagg 1260

aaggagagat tgtcatcacc gtcttcagac tctccatgtt catcatcgac aacctcggtt 1320

tcttgtaact actctgttta atggttgatg tttcgggtta agagtttctg ataattcgga 1380

gggtgttgtg aaaccaaaga tttaaaagat ggatgccaaa gatttaaaat attgttgttt 1440

ttaatccatt ttcttttgtt taataatgca aaaaaaggaa aaaattaaac tgaaaaaagg 1500

aaaagacaaa acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1539

Claims

1.蛋白质，是如下（a）或（b）：

（a）羧基端至少含有序列表中序列2的第221-438位氨基酸序列，并且从序列2的第221位开始，按照序列2的氨基酸序列方向序列2的氨基端延长，得到长度为218至438个氨基酸的任意一个蛋白片段；所述蛋白片段具有转录活性；

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下（c）或（d）：

（c）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1或2所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）或2）或3）

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述基因是如下4）-8）中的任一种：

4）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

5）序列表中序列1所示的DNA分子；

6）序列表中序列1的第661-1317位所示的DNA分子；

7）序列表中序列3所示的DNA分子；

8）序列表中序列3的第25-1383位所示的DNA分子。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7.权利要求1或2所述的蛋白质，或权利要求3-5中任一所述的核酸分子，或权利要求6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）-a6）中任一的应用：

a1）调控植物种子脂肪酸含量；

a2）调控植物种子千粒重；

a3）调控植物种子细胞大小；

a4）选育种子脂肪酸含量高的植物品种；

a5）选育种子千粒重增加的植物品种；

a6）选育种子细胞大小增大的植物品种。

8.一种培育转基因植物的方法，包括将编码权利要求1或2所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，满足如下b1）-b3）中的至少一种：

b1）种子脂肪酸含量提高；

b2）种子千粒重增加；

b3）种子细胞大小增大。

9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

10.权利要求1或2所述蛋白质在作为转录因子中的应用。