JP2015231374A - アミノ糖含有グルカン、その製造法および利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】グルコサミン含有グルカン、その修飾物及び結合体を提供すること【解決手段】本発明のグルコサミン含有グルカンは、分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの2以上の非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが、該分岐状α−1,4グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有グルカンであり、該グルカンの重合度が15以上4?105以下である。本発明のグルコサミン含有グルカンは、分岐状α−1,4グルカンとグルコサミン−1−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることによって提供され得る。【選択図】なし
Description
本発明は、少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つ(好ましくはそれぞれ2以上)のアミノ単糖残基を有するグルカン、その修飾物及び結合体、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。より好ましくは、本発明は、少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つ(好ましくはそれぞれ2以上)のグルコサミン残基を有するグルカン、その修飾物(modified product)及び結合体、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。本発明のグルカン、その修飾物および結合体は、核酸に非共有結合的に結合して核酸の見かけの分子量を増大させる機能を有し得る。
医薬品の薬効成分は、化学合成された安定な低分子量化合物から、タンパク質、抗体、核酸などの血中で分解しやすい不安定な物質へと急激に変化している。そのため、これらの不安定な薬効成分を安定化して薬効成分の血中濃度を長時間高く保つ必要が生じている。また薬物の副作用を低下させるために、薬物を効率よくターゲット組織に送達する必要が高まっている。このような背景の下、いわゆるドラッグデリバリーシステム(DDS)技術が本格的に利用されるようになってきている(非特許文献1〜4)。DDS技術とは、薬効成分を「必要な場所」に「必要な量」を「必要な時間」だけ作用させる、即ち薬物の効果を最大限に発揮させるための理想的な体内動態に制御する技術およびシステムのことをいう。
DDS技術においては、薬効成分の改質材料が重要である。本明細書中で用語「薬効成分の改質材料」とは、薬効成分と共有結合させることにより、あるいは非共有結合的な相互作用を介して、薬効成分を改質する材料をいう。改質材料を利用することにより、薬効成分の種々の特性(例えば、体内動態(例えば、吸収、分布、代謝および排泄)、薬理効果、安定性など)を改質することが出来る。従来、薬効成分の改質材料として使用されている物質にはさまざまなものがあるが、最も汎用されているのが高分子材料である。たとえば合成高分子であるポリエチレングリコール(PEG)およびその誘導体は薬効成分の改質材料として広範囲に利用されている。PEG鎖の末端に薬効成分結合用官能基を有する薬効成分改質材料が多数開発されており、そのような改質材料は実際に医薬品の製造に利用されている。具体的な応用例としてはPEG化インターフェロンα(製品名:ペガシス)が挙げられる。インターフェロンαは分子量が小さく、容易に尿に排泄されるため、血中半減期が短いことが問題であった。しかし、インターフェロンαを分子量4万のPEG鎖に共有結合させて高分子量のインターフェロンα結合体とすることにより、血中半減期を飛躍的に高めることに成功している。このように、高分子材料による、薬効成分又はDDS用ナノ粒子状キャリアの改質には顕著な効果が認められている。
しかし一方で問題点も指摘されている。例えば、生体内での分解性がなく、かつ腎臓糸球体濾過を受けない高分子量の合成高分子を血中に投与すると、その高分子が特定の臓器へ集積するリスク及びその集積に起因する副作用発生のリスクがある。これは、血中に存在する分子量数万以下の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けてすみやかに尿中に排泄されるが、分子量数万以上の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けず、尿への排泄が制限されるためである。そのため、安全に利用できる薬効成分用改質材料が期待されている。
また、PEGをキャリアとして利用する際には、通常PEGは薬効成分に共有結合を介して結合される。共有結合は安定性に優れているが、薬効成分の構造の一部が変化するため、薬効成分の生理活性が変化するという問題がある。また、薬効成分に複数の官能基が存在する場合、PEG鎖の結合位置および結合本数の異なる集団が合成されるという問題がある。このような問題はバイオ医薬品、特にタンパク質性医薬品およびペプチド性医薬品においては致命的な問題となる。同一品質のものを再現性良く生産することが非常に困難であるためである。特定のアミノ酸残基にPEG分子を共有結合させるためには化学的創意工夫が必要とされ、特定のアミノ酸配列が必要とされたり、薬効成分の種類が制限されたりする場合もあるなど、種々の問題がある。
一方、近年はsiRNA、RNAアプタマーなどの、核酸医薬品の開発が進行している。核酸医薬品の成分であるDNAおよびRNAはそれぞれ、DNA分解酵素およびRNA分解酵素により容易に分解されてしまうため、適切なキャリアを用いて、分解を防ぐことが必要となっている。また、低分子量の核酸薬効成分を含む核酸医薬品の場合には、高分子量キャリアを結合させて、血中滞留時間を延ばす必要がある。またこれら核酸用高分子キャリアには、必要に応じてターゲティング機能が付与できることが好ましい。このような問題を解決しうる、安全でかつ核酸結合性を有する高分子キャリアが求められていた。
多糖は、古くから食品原料として使用されているが、近年では環境にやさしい高分子材料として、生体適合性を有する安全な素材として、さらには機能性材料として注目を浴びるようになってきている。天然に存在する多糖は、デンプン、セルロース、およびデキストリンに代表される中性多糖;アルギン酸、およびヒアルロン酸に代表される酸性多糖に分類することができる。一方、塩基性の多糖は天然には存在しない。塩基性の多糖を人工的に製造する方法として、N−アセチルグルコサミンのホモポリマーである天然由来多糖のキチンを化学的に脱アセチル化する方法がある。このような多糖は一般的にキトサンと呼ばれており、産業利用可能な唯一の塩基性多糖である。
キトサンは分子内に多数のアミノ基を有しており、核酸と強く結合して、ポリプレックスと呼ばれる非常に巨大なキトサン:核酸会合体を形成する。このようなポリアニオンとポリカチオンとの結合は非常に強固すぎ、両者の解乖離が困難であるという問題がある。
キトサンは、濃アルカリ溶液中でキチンを煮沸することによりキチン骨格中の2位の炭素上のアセトアミド基を遊離の第一級アミノ基に変換する方法などにより製造される。しかしながらこの方法では、キチン主鎖の切断によりキトサンがより低分子量の分子へと分解され、また完全な脱アセチル化の厳密な制御が困難なため、複数のグルコサミンがN-アセチルグルコサミンとランダムに配列した多糖が製造される。この多糖分子中のグルコサミンの数を厳密に制御することは出来ない。またこの方法ではこの多糖の非還元末端のみを選択的に脱アセチル化して、非還元末端のみにグルコサミンが結合した多糖を製造することもできない。つまり、この方法では、キトサンと核酸との結合の強さおよび解離のしやすさを制御することは出来ない。さらにキチンおよびキトサンは体内で迅速に分解することが出来ない。このため、腎の糸球体濾過での分画サイズ以上の分子量を有するキチンおよびキトサンは、体内に蓄積するリスクがある。このように、唯一のカチオン性多糖であるキトサンは、核酸結合性は有しているものの、核酸医薬品のキャリアとしての利用には限界がある。
自然界には非還元末端にのみアミノ糖残基が結合しているアミノ糖含有グルカンは見出されていない。化学的方法を用いても、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合しているアミノ糖含有グルカンの合成は可能ではなく、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合しているアミノ糖含有グルカンの化学合成は開示されていなかった。また、結合するアミノ糖残基の数を厳密に制御可能な多糖は知られていない。
非特許文献5は、グルコサミン−1−リン酸(GlcN−1−P)が、2−アジド−2−デオキシ−グルコピラノシル−1−リン酸の化学的還元反応により合成可能であること、およびグルコサミン−1−リン酸とマルトオリゴ糖との混合物に馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを作用させることにより、非還元末端にグルコサミン残基を有するマルトオリゴ糖が生成することを開示している。しかしながら、非特許文献5は、同様の方法を高分子量グルカンおよび分岐グルカンに適用することについて開示も示唆もしていない。グルカン分子中のグルコサミン残基の個数が制御できることを開示していない。さらにはグルカン分子中のグルコサミン残基の個数を制御することが、核酸のような負に荷電した物質との結合の強さおよび形態に重要な影響を与えることを、開示も示唆もしていない。非特許文献5には、非還元末端にグルコサミン残基1個を有するグルカンが核酸のような負に荷電した物質に対する結合性を有すること、およびこのグルカンが核酸などの負に荷電した物質の見かけの分子量を増大させる機能を有することは示唆も開示もされていない。さらに、非特許文献5に記載の方法によってグルコサミン含有グルカンを得ると、反応に使用したグルコサミン−1−リン酸と生成物であるグルコサミン含有グルカンとを分離することができない。医薬用材料は不純物の混入を許容しないため、グルコサミン−1−リン酸が除去されていないグルコサミン含有グルカンは、医薬品として利用することができないという決定的な欠点がある。
岡田弘晃、「機能性DDSキャリアの製剤設計」第1章 総論:機能性DDSキャリアを用いた製剤設計による創薬、シーエムシー出版、2008、1−23
横山昌幸、「薬物キャリアに用いられる高分子材料 特集 DDSに利用される高分子化学」、Drug Delivery System 23−6,2008:610−617
Maria Laura Immordinoら、International Journal of Nanomedicine 2006:1(3)297−315
J.Milton HarrisおよびRobert B.Chess,NATURE REVIEWS,DRUG DISCOVERY VOLUME 2,MARCH 2003,214−221
Nawajiら、Carbohydr.Res.2008、343、2692−2696
本発明は、上記問題点の解決を意図するものである。
負に荷電した薬効成分についての安全に利用できる理想的な改質材料は、以下のような特徴を有しているものと考えられる:
(1)生体内で分解され得る高分子材料であること;
(2)医薬品に使用できる程度に安定した品質を備えていること。すなわち、構造が特定でき、毎回同じ品質のものを製造できること;
(3)負に荷電した薬効成分と結合又は相互作用できるアミノ基を分子内の特定の部位に任意の個数備えられる高分子材料であること。
(1)生体内で分解され得る高分子材料であること;
(2)医薬品に使用できる程度に安定した品質を備えていること。すなわち、構造が特定でき、毎回同じ品質のものを製造できること;
(3)負に荷電した薬効成分と結合又は相互作用できるアミノ基を分子内の特定の部位に任意の個数備えられる高分子材料であること。
核酸用の改質材料は、以下の特徴を有していることが好ましいと考えられる:
(4)核酸結合性を有し、核酸の見かけの分子量を増大させる機能を有すること。
(4)核酸結合性を有し、核酸の見かけの分子量を増大させる機能を有すること。
本発明者らは、薬効成分の改質材料として最も優れている高分子物質はグルカン(本明細書においてグルカンとは、α−1,4−グルカン、及びα−1,6−結合により分岐したα−1,4−グルカンをいう)であると考えた。動物及び植物が貯蔵用多糖として体内に蓄積するグリコーゲン又は澱粉はグルカンの一種であることから、ヒトの体内常在成分であり、生体適合性に優れている。さらに、グルカンは、体内のα−アミラーゼによる加水分解を受けて、体内常在成分であるグルコース又はマルトオリゴ糖になる。そのため、グルカンは、最も安全な高分子材料といえる。
グルカンはその構造の設計が比較的容易であることも有利な点である。グルカンの分子量、分岐の程度、環状化などを制御する方法が公知である。グルコース残基がα−1,4−結合のみで結合している完全直鎖状のグルカン、一部のグルコース残基がα−1,6−結合により結合していることにより高頻度に分岐したグルカンなどが入手できる。分岐グルカンにおいては、α−1,6−結合がひとつ増えるたびに、新たな非還元末端がひとつ生ずることになる。α−1,6−結合の数はグルカン分子の合成の際に所望に応じて適切に調節することが可能である。
一方、グルカンを薬効成分の改質材料として利用する上での最大の課題は、薬効成分と結合又は相互作用できる官能基を備えていない点である。グルカン中に多数存在する水酸基に対して、化学反応によりカチオン性又はアニオン性の官能基を導入することは可能である。しかし、このような手法を用いる場合、グルカンに対する官能基の導入位置はランダムであり、同一品質のものを得ることが困難であり、医薬品への利用には好ましくない。
そのため、薬効成分、特に負に荷電した薬効成分について、医薬品への利用に好適な改質材料を提供することが求められる。
上記課題を解決するために、本発明者らは、アミノ糖(例えば、グルコサミン)を高分子量グルカン鎖の非還元末端に特異的に導入することが、極めて理想的なグルカンの改質方法であると考えた。高分子量グルカンの非還元末端にアミノ糖(例えば、グルコサミン)を選択的に導入できれば、導入位置がランダムではないため、同一品質のものを再現性よく製造可能であり、得られる生成物は医薬品への利用に適している。また、アミノ糖を投与することによる毒性の懸念もない。グルコサミンはアミノ基を有する単糖であり、単一成分として、またはコンドロイチン(コンドロイチン硫酸)との混合物として、サプリメントや健康食品として販売されており、安全性への懸念が低いからである。さらに、アミノ糖(例えば、グルコサミン)のアミノ基は、薬効成分との結合に利用可能である。また、アミノ糖(例えば、グルコサミン)は水溶液中で正の電荷を持つ糖残基となる。そのため、アミノ糖残基をグルカン鎖に導入することによって、負に帯電した分子(例えば、水溶液中で負に帯電する薬効成分)と相互作用する特性をグルカン鎖に付与することが可能となる。負に帯電した分子の例としては、核酸が挙げられる。水溶液中で負に帯電する分子に結合し、かつ、体内残留の懸念が無い生分解性キャリアは今まで公知でなかった。そのため、本発明のグルカンは、近年注目されている核酸を用いたバイオDDS技術においては有用なキャリアといえる。
本発明者らは、α−グルカンホスホリラーゼが、本来の基質ではない、アミノ糖−1−リン酸(例えば、グルコサミン−1−リン酸)を基質として利用可能であり、アミノ糖残基をグルカン受容体の非還元末端に転移し得ること、そしてそれにもかかわらず本酵素がその逆反応をほとんど触媒できないことを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。α−グルカンホスホリラーゼは、本来の基質であるグルコース−1−リン酸に作用した場合、グルコース残基をグルカン受容体に転移する反応(グルカン合成反応)と、グルカンの非還元末端グルコースを加リン酸分解しグルコース−1−リン酸を生成する反応(グルカン分解反応)の両方を触媒する酵素である。しかしながら、驚くべきことに、アミノ糖−1−リン酸(例えば、グルコサミン−1−リン酸)を基質とする場合、本酵素はアミノ糖残基をグルカン受容体に転移する反応(グルカン合成反応)を触媒するが、グルカンの非還元末端アミノ糖残基を加リン酸分解してアミノ糖−1−リン酸を生成する反応(グルカン分解反応)をほとんど触媒しない。グルカン分解反応は、結合させたアミノ糖残基を再度遊離させてしまうが、本発明の方法においてα−グルカンホスホリラーゼはグルカン分解反応をほとんど触媒しないことを本発明者らは発見した。すなわち、合成反応の触媒活性が、分解反応の触媒活性に比べて非常に高い。この特徴のため、グルカンに複数の非還元末端がある場合、α−グルカンホスホリラーゼは、グルカンの複数の非還元末端にアミノ糖残基(例えば、グルコサミン残基)を次々と結合させていくことができる。この酵素のこの特徴を利用することにより、本発明のアミノ糖含有グルカンは初めて製造可能となった。特に、多数(例えば、5以上)の非還元末端を有するグルカンを原料として、高頻度(例えば、50%以上)の非還元末端へのアミノ糖残基(例えば、グルコサミン残基)の結合率を有する非還元末端修飾グルカンは、この酵素のこの特徴を利用して初めて得ることができた。
本明細書中においてアミノ糖とは、アミノ基を有する糖であることを意味する。アミノ糖の骨格単糖を構成する糖は単糖(例えば、グルコース)であってもよく、オリゴ糖であってもよい。本明細書中においてオリゴ糖とは2以上10以下の単糖が結合した化合物を意味する。本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて1つの非還元末端に結合するアミノオリゴ糖の重合度は例えば約2以上、約3以上、約4以上、約5以上などであり得、例えば、約10以下、約9以下、約8以下、約7以下、約6以下、約5以下、約4以下、約3以下、約2以下などであり得る。1つの実施形態では、本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて1つの非還元末端に結合するアミノオリゴ糖は、2個の糖(すなわち、二量体)である。本明細書中でアミノ単糖とはアミノ糖の糖骨格が単糖であるものをいう。本明細書中でアミノオリゴ糖とはアミノ基の糖骨格がオリゴ糖であるものをいう。
また、静電的相互作用による結合は直接的に分子同士を結合しないため、この結合体からグルカンが分解されて薬効成分が分離されれば、薬効成分は元の立体構造を再び保持すると考えられる。そのため、静電的相互作用による結合は、薬効成分とキャリアとの理想的な結合様式と考えられる。しかし、静電的相互作用による結合は、塩濃度の影響を受けやすく、生体内では不安定であると予想される。そこで、グルカン分子に結合するアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の位置および数を厳密に制御することによって、核酸との結合の強さおよび会合体の形態を制御することが望ましい。
さらに、本発明者らは、グルカンの1以上の(好ましくは2以上の)非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのグルコサミン残基が結合したグルコサミン含有グルカンが、核酸に非共有結合的に結合し、核酸の見かけの分子量を増大させる機能を有することを見出した。
また、本発明者らは、グルカン分子に結合するグルコサミン残基などのアミノ単糖残基の数をコントロールすることにより、核酸との結合の強さおよび会合体の形態を制御できることを見出した。
本発明者らは、新規なアミノ糖含有グルカンの開発によって、適度な自由度をもつ複数のグルカン鎖の末端のみにアミノ糖残基が結合したグルカンを作出できること、および安定的な静電的相互作用によって薬効成分とキャリアとを結合できることを見出した。
本発明のアミノ糖含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体においては、グルカンの非還元末端のみにアミノ糖残基が結合している。本発明の好ましい実施形態では、アミノ糖残基はグルコサミン残基、ガラクトサミン残基またはマンノサミン残基あるいはそれらの単独または組み合わせのオリゴマー(例えば、二量体)残基であり、最も好ましくはグルコサミン残基である。本発明のグルコサミン含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体においては、グルカンの非還元末端のみにグルコサミン残基が結合している。本発明においては、α−グルカンホスホリラーゼ(EC2.4.1.1)を用いてアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の転移を行っているため、グルカンへのアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の結合はα−1,4結合である。すなわち、グルカンの末端のグルコシル残基の4位の炭素原子と、アミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の1位の炭素原子とが酸素原子を介してα結合している。グルカンへアミノ糖(例えば、グルコサミン)を高収率で直接転移可能な酵素は、本酵素以外には見つかっていない。本発明のアミノ糖含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体はアミノ糖を末端に有するため、水溶液中でグルカン末端が正電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。本アミノ糖含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用が期待される。
グルカンへのアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の導入量は、使用するグルカンの分岐頻度と非還元末端へのアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の導入頻度によりコントロールできる。グルカンへのアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の導入量を多くしたい場合は、分岐頻度の高いグルカンを使用し、かつ非還元末端ヘのアミノ糖(例えば、グルコサミン)の導入頻度を上げることにより、導入量を増加させることができる。グルカンへのアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の導入量を少なくしたい場合は、分岐頻度の低いグルカンを使用したり、非還元末端ヘのアミノ糖(例えば、グルコサミン)の導入頻度を下げたりすることにより、導入量を減少させることができる。グルカンへのアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基の導入量の下限は、グルカン1分子あたり1個のアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基が導入された状態であるが、これは分岐をもたないグルカンの非還元末端に、アミノ糖(例えば、グルコサミン)残基を導入することにより達成できる。さらに、導入位置が末端であるため、グルカンのα−アミラーゼによる分解性にも影響は無いと考えられる。高度に分岐したグルカンの場合、非還元末端はグルカン分子の最外層に分布しているので、導入されたアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基は、アミノ糖(例えば、グルコサミン)残基導入後のグルカン分子の最外層に分布し、薬効成分との相互作用および結合に理想的となる。このように、非還元末端に選択的にアミノ糖(例えば、グルコサミン)残基が結合したグルカンは、薬効成分の優れた改質材料になりうる。
本発明により、例えば以下が提供される:
(項目1)
グルカンの少なくとも1つの非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である、アミノ糖含有グルカン。
(項目2)
前記グルカンが分岐状α−1,4グルカンであり、該分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つ(好ましくは2以上)の非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα-1,4結合している項目1に記載のアミノ糖含有グルカン。すなわち、このアミノ糖含有グルカンは、分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つ(好ましくは2以上)の非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているが、該分岐状α−1,4グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有分岐グルカンであって、該分岐状α−1,4グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、約15以上約4×105以下である、アミノ糖含有分岐グルカンである。
(項目3)
前記分岐状α−1,4グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される項目2に記載のアミノ糖含有グルカン。
(項目4)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
(項目5)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
(項目6)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のアミノ基修飾物であって、該アミノ基への修飾が、前記アミノ単糖残基のアミノ基の一部又は全てへの修飾であり、該アミノ基への修飾が該アミノ基とアミノ基修飾試薬との反応により得られたものであり、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する、アミノ基修飾物。
(項目7)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物の非還元末端修飾物であって、前記グルカンのグルコサミン残基が結合していない非還元末端のうちの少なくとも1つまたは前記グルコサミン残基の4位において標的性分子が結合しており、該標的性分子は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、N−アセチルグルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドからなる群より選択される、非還元末端修飾物。
(項目8)
グルカンとアミノ糖−1−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするアミノ糖含有グルカンの製造方法であって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である製造方法。
(項目9)
α−グルカンホスホリラーゼが、Aquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有しかつアミノ糖を分岐グルカンの非還元末端にα−1,4結合で転移する活性を有する、項目8に記載の方法。
(項目10)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
(項目11)
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目10に記載の医薬品。
(項目12)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
(項目13)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物を含む、DDS用ナノ粒子状キャリア。
(項目14)
前記DDS用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目13に記載のキャリア。
(項目15)
細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、項目1に記載のアミノ糖含有分岐グルカンとから形成された複合体。
(項目16)
前記核酸分子が、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目15に記載の複合体。
(項目17)
項目15または16に記載の複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体。
(項目18)
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびDEAE−デキストランからなる群より選択される少なくとも1種類のカチオン性ポリマーを含む、項目17に記載の複合体。
(項目19)
項目15〜18のいずれか1項に記載の複合体を単離された細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法。
(項目1)
グルカンの少なくとも1つの非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である、アミノ糖含有グルカン。
(項目2)
前記グルカンが分岐状α−1,4グルカンであり、該分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つ(好ましくは2以上)の非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα-1,4結合している項目1に記載のアミノ糖含有グルカン。すなわち、このアミノ糖含有グルカンは、分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つ(好ましくは2以上)の非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているが、該分岐状α−1,4グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有分岐グルカンであって、該分岐状α−1,4グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、約15以上約4×105以下である、アミノ糖含有分岐グルカンである。
(項目3)
前記分岐状α−1,4グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される項目2に記載のアミノ糖含有グルカン。
(項目4)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
(項目5)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
(項目6)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のアミノ基修飾物であって、該アミノ基への修飾が、前記アミノ単糖残基のアミノ基の一部又は全てへの修飾であり、該アミノ基への修飾が該アミノ基とアミノ基修飾試薬との反応により得られたものであり、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する、アミノ基修飾物。
(項目7)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物の非還元末端修飾物であって、前記グルカンのグルコサミン残基が結合していない非還元末端のうちの少なくとも1つまたは前記グルコサミン残基の4位において標的性分子が結合しており、該標的性分子は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、N−アセチルグルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドからなる群より選択される、非還元末端修飾物。
(項目8)
グルカンとアミノ糖−1−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするアミノ糖含有グルカンの製造方法であって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である製造方法。
(項目9)
α−グルカンホスホリラーゼが、Aquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有しかつアミノ糖を分岐グルカンの非還元末端にα−1,4結合で転移する活性を有する、項目8に記載の方法。
(項目10)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
(項目11)
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目10に記載の医薬品。
(項目12)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
(項目13)
項目1〜3のいずれか1項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物を含む、DDS用ナノ粒子状キャリア。
(項目14)
前記DDS用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目13に記載のキャリア。
(項目15)
細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、項目1に記載のアミノ糖含有分岐グルカンとから形成された複合体。
(項目16)
前記核酸分子が、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目15に記載の複合体。
(項目17)
項目15または16に記載の複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体。
(項目18)
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびDEAE−デキストランからなる群より選択される少なくとも1種類のカチオン性ポリマーを含む、項目17に記載の複合体。
(項目19)
項目15〜18のいずれか1項に記載の複合体を単離された細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法。
1つの実施形態では、前記アミノ糖はグルコサミンであり、その場合、本発明は以下の通りである:
(項目1A)
グルカンの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である、グルコサミン含有グルカン。すなわち、このグルコサミン含有グルカンは、分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つ(好ましくは2以上)の非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有分岐グルカンであって、該分岐状α−1,4グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である、グルコサミン含有分岐グルカンである。
(項目2A)
前記グルカンが分岐状α−1,4グルカンであり、該分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン酸残基が結合している項目1Aに記載のグルコサミン含有グルカン。
(項目3A)
前記分岐状α−1,4グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される項目2Aに記載のグルコサミン含有グルカン。
(項目4A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
(項目5A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
(項目6A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のアミノ基修飾物であって、該アミノ基への修飾が、前記グルコサミン残基のアミノ基の一部又は全てへの修飾であり、該アミノ基への修飾が該アミノ基とアミノ基修飾試薬との反応により得られたものであり、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する、アミノ基修飾物。
(項目7A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物の非還元末端修飾物であって、前記グルカンのグルコサミン残基が結合していない非還元末端のうちの少なくとも1つにおいて標的性分子が結合しており、該標的性分子は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、N−アセチルグルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドからなる群より選択される、非還元末端修飾物。
(項目8A)
グルカンとグルコサミン−1−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルコサミン含有グルカンの製造方法であって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である製造方法。
(項目9A)
α−グルカンホスホリラーゼが、Aquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有しかつグルコサミンを分岐グルカンの非還元末端にα−1,4結合で転移する活性を有する、項目8Aに記載の方法。
(項目10A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
(項目11A)
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、DNA、RNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目10Aに記載の医薬品。
(項目12A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物を含む、臨床診断用組成物。
(項目13A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物を含む、DDS用ナノ粒子状キャリア。
(項目14A)
前記DDS用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目13Aに記載のキャリア。
(項目15A)
細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有分岐グルカンとから形成された複合体。
(項目16A)
前記核酸分子が、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目15Aに記載の複合体。
(項目17A)
項目15Aまたは16Aに記載の複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体。
(項目18A)
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびDEAE−デキストランからなる群より選択される少なくとも1種類のカチオン性ポリマーを含む、項目17Aに記載の複合体。
(項目19A)
項目15A〜18Aのいずれか1項に記載の複合体を細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法。
(項目1A)
グルカンの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である、グルコサミン含有グルカン。すなわち、このグルコサミン含有グルカンは、分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つ(好ましくは2以上)の非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有分岐グルカンであって、該分岐状α−1,4グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である、グルコサミン含有分岐グルカンである。
(項目2A)
前記グルカンが分岐状α−1,4グルカンであり、該分岐状α−1,4グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン酸残基が結合している項目1Aに記載のグルコサミン含有グルカン。
(項目3A)
前記分岐状α−1,4グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される項目2Aに記載のグルコサミン含有グルカン。
(項目4A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
(項目5A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
(項目6A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のアミノ基修飾物であって、該アミノ基への修飾が、前記グルコサミン残基のアミノ基の一部又は全てへの修飾であり、該アミノ基への修飾が該アミノ基とアミノ基修飾試薬との反応により得られたものであり、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する、アミノ基修飾物。
(項目7A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物の非還元末端修飾物であって、前記グルカンのグルコサミン残基が結合していない非還元末端のうちの少なくとも1つにおいて標的性分子が結合しており、該標的性分子は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、N−アセチルグルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドからなる群より選択される、非還元末端修飾物。
(項目8A)
グルカンとグルコサミン−1−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルコサミン含有グルカンの製造方法であって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンであり、該グルカンの重合度が約10以上約1×105以下、好ましくは約15以上約4×105以下である製造方法。
(項目9A)
α−グルカンホスホリラーゼが、Aquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有しかつグルコサミンを分岐グルカンの非還元末端にα−1,4結合で転移する活性を有する、項目8Aに記載の方法。
(項目10A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
(項目11A)
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、DNA、RNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目10Aに記載の医薬品。
(項目12A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物を含む、臨床診断用組成物。
(項目13A)
項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物を含む、DDS用ナノ粒子状キャリア。
(項目14A)
前記DDS用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目13Aに記載のキャリア。
(項目15A)
細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、項目1A〜3Aのいずれか1項に記載のグルコサミン含有分岐グルカンとから形成された複合体。
(項目16A)
前記核酸分子が、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択される、項目15Aに記載の複合体。
(項目17A)
項目15Aまたは16Aに記載の複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体。
(項目18A)
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびDEAE−デキストランからなる群より選択される少なくとも1種類のカチオン性ポリマーを含む、項目17Aに記載の複合体。
(項目19A)
項目15A〜18Aのいずれか1項に記載の複合体を細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法。
本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物およびそれらの結合体は、グルカンの非還元末端のみにアミノ糖残基が結合している。本アミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物およびそれらの結合体はアミノ糖を末端に有するため、グルカン末端が水溶液中で正電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。本アミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物およびそれらの結合体は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用が期待される。薬効成分のキャリアとして用いる場合、静電的相互作用による結合のため薬効成分の化学的構造を大きく変質させることが無く、キャリア1分子に対して複数のアミノ糖を非還元末端に結合することができるため薬効成分を安定的に保持することができる特徴がある。
本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物は、血中半減期を非修飾グルカンより高めることが可能であり、なおかつ、最終的には生体内で完全に分解され腎臓より排出されるため、安全性が極めて高い。そのため、薬効成分、臨床診断剤、造影剤およびDDS用ナノ粒子状キャリアの改質材料として有用である。本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物は、酵素反応により構造を制御し得ることから、品質安定性にも優れている。
本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物は、グルカンの非還元末端のみにアミノ糖残基が結合しているため、他の分子と相互作用する部位と分解を抑制する部位とを構造的に分離することができる。さらに、本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物は、天然のグルカンと比較して適度に分解が抑制されており、他の分子との相互作用が強すぎず、グルカン部分の分解に伴って他の分子を適度に遊離させることができることから、他の分子と会合することにより、他の分子に対して適度な分解性を付与することができる。また、本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物およびそれらの結合体は、体内の酵素によって分解されるため、体内に過度に長期間留まって残留性の問題を引き起こすことがない。
本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物を、核酸分子のような負に荷電した物質と会合させた場合、その会合物の分子量を制御することが可能である。DDSにおいて投与物の分子量を調節できることは、安全性、結果の安定性、および、再現性の点から好ましいため、本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物は、優れたDDS用キャリアとして有効に利用できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
(一般技術)
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook,J.et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook,J.et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approac,IRL Press;Adams,R.L.etal.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman&Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques,Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献(例えば、Sambrookら、前出)に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なDNAフラグメント(すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント)が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの1つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントが連結され得る環状二重鎖DNAループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるDNAセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を導き得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。発現ベクターは、好ましくは、目的の構造遺伝子が転写および翻訳されるように目的の構造遺伝子に作動可能に連結されており、さらに必要に応じて宿主細胞内での複製および組換え体の選択に必要な因子を備えた媒体である。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物(例えば、哺乳動物)の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。発現産物(α−グルカンホスホリラーゼまたは薬効成分)の分泌生産が意図される場合は、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドが、目的のタンパク質をコードするDNAの上流に正しいリーディングフレームで結合される。
好ましい発現ベクターとしては、大腸菌中でも発現可能なpTRC99A(ファルマシア製)などが挙げられる。上記発現ベクター内の転写および翻訳に必要な因子に作動可能に連結するために、目的のα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を加工しなければならない場合がある。これらは例えばプロモーターとコード領域との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Bal31、ExoIIIなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはM13などの一本鎖DNAまたはPCRを使用した部位特異的変異の導入が挙げられる。
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pcDNA3(+)、pBluescript−SK(+/−)、pGEM−T、pEF−BOS、pEGFP、pHAT、pUC18、pFT−DESTTM42GATEWAY、pENTRTM/D−TOPO(Invitrogen)などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
本明細書において用いられ得る真核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pECFP(Clontech)、pAcGFP(Clontech),pEYFP(Clontech),pDsRED(Clontech),pTRE(Clontech),pCMV(Clontech),pcDNA(Invitrogen)、pTarget(Promega)などを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「哺乳動物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素(例えば、エンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI部位など)を有するDNA配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。哺乳動物発現ベクターは、好適には、哺乳動物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
上記のような哺乳動物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。哺乳動物発現ベクターの構築には、例えば、pECFP系のベクター、pcDNA系のベクターなどが好適に用いられるが、これらに限定されない。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、DNAがmRNAに転写される際の転写の終結、およびポリA配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、mRNAの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するDNA上の領域をいい、RNAポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長/増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で(例えば、2点以上(例えば、5日目および15日目))の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも1つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からRNAを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物(特定の組織などを含む)は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、宿主細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、宿主細胞中のDNAに組み込まれて存在する。なお、宿主細胞中のDNAとは、染色体のみならず、宿主細胞中に含まれる各種オルガネラ(例えば、ミトコンドリアなど)に含まれるDNAを含む。
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、trpプロモーター(Ptrp)、lacプロモーター(Plac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター(Ptrp x2)、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
本明細書において「複製起点」とは、DNA複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のDNAとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)またはチミジンキナーゼである(米国特許第4,399,216号を参照)。
本明細書において「作動可能に連結された(る)」とは、所望の配列の発現(作動)がある転写翻訳調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサーなど)または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F.A.ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY;Sambrook Jら(1987)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.およびその第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にDNAを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など(例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法など)が挙げられる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Escherichia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属などに属する原核生物細胞、例えば、Escherichia coli XL1−Blue、Escherichia coli XL2−Blue、Escherichia coli DH1が例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法[Methods.Enzymol.,194,182(1990)]、リポフェクション法、スフェロプラスト法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,1929(1978)]、酢酸リチウム法などが挙げられる。
本明細書において遺伝子発現(たとえば、mRNA発現、ポリペプチド発現)の「検出」または「定量」は、例えば、mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはPCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ELISA法またはRIA法などが例示される。アレイ(例えば、DNAアレイ、プロテインアレイ)を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。DNAアレイについては、(秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」)に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat Genet.2002 Dec;32 Suppl:526−32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two−hybridシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社(2002)などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
(1.材料)
(1.1)グルカンおよびグルカンの修飾物
「グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、D−グルコースを構成単位とする多糖である。本発明においては、グルカンとしてα−D−グルカンを使用することが好ましい。α−D−グルカン中のグルコース残基を連結する結合は、主にα−1,4−グルコシド結合からなり、α−1,6−グルコシド結合を含んでもよい。α−1,6−グルコシド結合を含むα−D−グルカンは、分岐構造を有する。分子中に少なくとも1つのα−1,6−グルコシド結合を有するグルカンを分岐状グルカンといい、分子中にまったくα−1,6−グルコシド結合を有さないグルカンを直鎖状グルカンという。本明細書においては、特に断りのない限り、「グルカン」の重量平均分子量は約1×103以上であることが好ましい。本発明で使用される好ましいグルカンは、直鎖状グルカンおよび分岐状グルカンであり、より好ましくは直鎖状α−1,4−グルカン及びα−1,6−結合により分岐したα−1,4−グルカン(分岐状α−1,4グルカンともいう)である。本発明で使用されるグルカンは、α−1,3−結合を含まないことが好ましい。
(1.1)グルカンおよびグルカンの修飾物
「グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、D−グルコースを構成単位とする多糖である。本発明においては、グルカンとしてα−D−グルカンを使用することが好ましい。α−D−グルカン中のグルコース残基を連結する結合は、主にα−1,4−グルコシド結合からなり、α−1,6−グルコシド結合を含んでもよい。α−1,6−グルコシド結合を含むα−D−グルカンは、分岐構造を有する。分子中に少なくとも1つのα−1,6−グルコシド結合を有するグルカンを分岐状グルカンといい、分子中にまったくα−1,6−グルコシド結合を有さないグルカンを直鎖状グルカンという。本明細書においては、特に断りのない限り、「グルカン」の重量平均分子量は約1×103以上であることが好ましい。本発明で使用される好ましいグルカンは、直鎖状グルカンおよび分岐状グルカンであり、より好ましくは直鎖状α−1,4−グルカン及びα−1,6−結合により分岐したα−1,4−グルカン(分岐状α−1,4グルカンともいう)である。本発明で使用されるグルカンは、α−1,3−結合を含まないことが好ましい。
直鎖状α−D−1,4−グルカンとは、D−グルコース単位がα−1,4−グルコシド結合のみで2糖単位以上結合されている多糖をいう。本明細書中では、特に断りのない限り、直鎖状α−D−1,4−グルカンを直鎖状グルカン又は直鎖状α−1,4グルカンという。直鎖状グルカンは、ひとつの非還元末端を有する。本発明に好適に利用される直鎖状グルカンの例としては、アミロースが挙げられる。
本明細書中では用語「アミロース」とは、α−1,4結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子をいう。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。アミロースは、天然の澱粉から抽出した天然アミロースであってもよく、酵素反応によって合成したアミロース(本明細書中では「酵素合成アミロース」ともいう)であってもよい。天然アミロースは、分岐部分を含む場合があるが、酵素合成アミロースは分岐を含まない。さらに、天然アミロースは分散度が大きく分子量にばらつきがあるが、酵素合成アミロース(特に、国際公開第WO02/097107号パンフレットに記載されるSP−GP法によって合成した酵素合成アミロース)は分散度が小さく極めて均一な分子量を有する。そのため、本発明においては、酵素合成アミロースを使用することが好ましい。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約10以上であり、より好ましくは約50以上であり、さらに好ましくは約100以上であり、最も好ましくは約180以上である。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約1×105以下であり、より好ましくは約1×104以下であり、さらに好ましくは約1×103以下であり、最も好ましくは約500以下である。
本明細書中では用語「分岐状α−D−グルカン」とは、D−グルコースがα−1,4−グルコシド結合により連結した直鎖状グルカンが、α−1,4−グルコシド結合以外の結合により分岐しているグルカンをいう。本明細書中では、特に断りのない限り、分岐状α−D−グルカンを分岐状グルカンという。分岐結合は、α−1,6−グルコシド結合、α−1,3−グルコシド結合、またはα−1,2−グルコシド結合のいずれかであるが、最も好ましくはα−1,6−グルコシド結合である。本発明で使用する分岐状α−D−グルカンはα−1,3−グルコシド結合およびα−1,2−グルコシド結合を含まないことが好ましい。分岐状グルカンは、通常、分岐結合の数と同数の非還元末端を有する。α−1,6−グルコシド結合のみを選択的に分解する酵素(例えば、イソアミラーゼ、プルラナーゼなど)で分岐状グルカンを処理すると、直鎖状α−1,4−グルカンの混合物に分解できる。これらを分岐グルカンの単位鎖といい、その重合度を単位鎖長という。
本発明に好適に利用される分岐状グルカンの例としては、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンなどが挙げられる。
本明細書中では用語「デンプン」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。デンプンとしては、通常市販されているデンプンであればどのようなデンプンでも用いられ得る。デンプンに含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、デンプンを産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有するデンプンのほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まないデンプンは、通常の植物からは得られない。デンプンは、天然のデンプン、デンプン分解物および化工デンプンに区分される。
天然のデンプンは、原料により、いも類デンプンおよび穀類デンプンに分けられる。いも類デンプンの例としては、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、甘藷デンプン、くずデンプン、およびわらびデンプンなどが挙げられる。穀類デンプンの例としては、コーンスターチ、小麦デンプン、および米デンプンなどが挙げられる。天然のデンプンは、ハイアミロースデンプン(例えば、ハイアミロースコーンスターチ)またはワキシーデンプンであってもよい。デンプンはまた、可溶性デンプンであってもよい。可溶性デンプンとは、天然のデンプンに種々の処理を施すことにより得られる、水溶性のデンプンをいう。デンプンは、可溶性デンプン、ワキシーデンプンおよびハイアミロースデンプンからなる群から選択され得る。デンプンはまた、化工デンプンであってもよい。
本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約1×103以上であり、より好ましくは約5×103以上であり、さらに好ましくは約1×104以上であり、最も好ましくは約2×104以上である。本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約1×107以下であり、より好ましくは約3×106以下であり、さらに好ましくは約1×106以下であり、最も好ましくは約3×105以下である。
アミロペクチンとは、α−1,4結合によって連結されたグルコース単位に、α−1,6結合でグルコース単位が連結された、分岐状分子である。アミロペクチンは天然のデンプン中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン100%からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約1×103以上であり、より好ましくは約5×103以上であり、さらに好ましくは約1×104以上であり、最も好ましくは約2×104以上である。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約1×107以下であり、より好ましくは約3×106以下であり、さらに好ましくは約1×106以下であり、最も好ましくは約1×105以下である。
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシのスイートコーン種の種子に存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−1,4−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ3単位おきに1本程度の割合で、平均重合度12〜18のグルコースのα−1,4−結合の糖鎖がα−1,6−結合で結合している。また、α−1,6−結合で結合している分枝鎖にも同様にグルコースのα−1,4−結合の糖鎖がα−1,6−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。グリコーゲンは酵素合成することも可能である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約500以上であり、より好ましくは約1×103以上であり、さらに好ましくは約2×103以上であり、最も好ましくは約3×103以上である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約1×107以下であり、より好ましくは約3×106以下であり、さらに好ましくは約1×106以下であり、最も好ましくは約3×105以下である。
デキストリンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、デンプンとマルトースとの中間の複雑さをもつグルカンである。デキストリンは、デンプンを酸、アルカリまたは酵素によって部分的に分解することによって得られる。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約10以上であり、より好ましくは約20以上であり、さらに好ましくは約30以上であり、最も好ましくは約50以上である。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約9×103以下であり、さらに好ましくは約7×103以下であり、最も好ましくは約5×103以下である。
酵素合成分岐グルカンとは、酵素を使用して合成された分岐グルカンをいう。SP−GP法でのアミロースの合成の際に反応液中にブランチングエンザイムを加えることにより、生成物を分岐させることができる。分岐の程度はブランチングエンザイムの添加量によって調節され得る。酵素合成分岐グルカンは、天然の分岐グルカンと比較して均一な構造を有しているため、製薬材料として使用する際に非常に有利である。例えば、本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約10以上であり、より好ましくは約20以上であり、さらに好ましくは約30以上であり、最も好ましくは約500以上である。本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約2×105以下であり、より好ましくは約1×105以下であり、さらに好ましくは約5×104以下であり、最も好ましくは約3×104以下である。
本明細書中では、用語「高度分岐環状グルカン」とは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が50以上であるグルカンをいう。高度分岐環状グルカンは、分子全体として少なくとも2つの非還元末端を有すればよい。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約50以上であり、より好ましくは約60以上であり、さらに好ましくは約100以上である。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約7×103以下であり、さらに好ましくは約5×103以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約10以上であり、より好ましくは約15以上であり、さらに好ましくは約20以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約500以下であり、より好ましくは約300以下であり、さらに好ましくは約100以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約40以上であり、より好ましくは約100以上であり、さらに好ましくは約300以上であり、さらにより好ましくは約500以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約3×103以下であり、より好ましくは約1×103以下であり、さらに好ましくは約500以下であり、さらにより好ましくは約300以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分のα−1,6−グルコシド結合は少なくとも1個あればよく、例えば1個以上、5個以上、10個以上などであり得る;内分岐環状構造部分のα−1,6−グルコシド結合は例えば約200個以下、約50個以下、約30個以下、約15個以下、約10個以下などであり得る。
高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の分岐の数(すなわち、α−1,6−グルコシド結合の数)は、好ましくは約2個以上であり、より好ましくは約3個以上であり、さらに好ましくは約5個以上、特に好ましくは約10個以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の分岐の数(すなわち、α−1,6−グルコシド結合の数)は、好ましくは約5×103個以下であり、より好ましくは約4×103個以下であり、さらに好ましくは約3×103個以下である。
高度分岐環状グルカンは、1種類の重合度のものを単独で用いてもよいし、種々の重合度のものの混合物として用いてもよい。好ましくは、高度分岐環状グルカンの重合度は、最大の重合度のものと最小の重合度のものとの重合度の比が約100以下、より好ましくは約50以下、さらにより好ましくは約10以下である。
高度分岐環状グルカンは、好ましくは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が50から5×103の範囲にあるグルカンであって、ここで、内分岐環状構造部分とはα−1,4−グルコシド結合とα−1,6−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、グルカンである。この外分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、平均で好ましくは約10以上であり、好ましくは約20以下である。高度分岐環状グルカンおよびその製造方法は、特開平8−134104号(特許第3107358号)に詳細に記載されており、その記載に従って製造され得る。高度分岐環状グルカンは、例えば、江崎グリコ株式会社から「クラスターデキストリン」として市販されている。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約50以上であり、より好ましくは約70以上であり、さらに好ましくは約100以上であり、最も好ましくは約150以上である。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約7×103以下であり、さらに好ましくは約5×103以下であり、最も好ましくは約4×103以下である。
特定の実施形態では、分岐状グルカンは、粒子状となりうる。直径約4nm以下の粒子は腎臓から排出され、直径約4nm〜約200nmの粒子は血中を長時間循環し、直径約200nm〜約7μmの粒子は細網内皮系に捕捉され、直径約7μm以上の粒子は毛細血管を閉塞させることが公知である。細網内皮系は肝臓および脾臓に分布する。そのため、分岐グルカンの粒径を制御することにより、本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体の体内での動態を制御することができる。血中に長時間循環させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約4nm以上であり、より好ましくは約10nm以上であり、好ましくは約200nm以下であり、より好ましくは約100nm以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約5×105以上であり、より好ましくは約1×106以上であり、好ましくは約5×107以下であり、より好ましくは約2×107以下である。例えば、直径20〜50nmの粒子はがん細胞に蓄積することが公知であるので、がん細胞に蓄積させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約10nm以上であり、より好ましくは約15nm以上であり、好ましくは約100nm以下であり、より好ましくは約50nm以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約5×105以上であり、より好ましくは約1×106以上であり、好ましくは約2×107以下であり、より好ましくは約5×106以下である。
α−グルカンの分岐の数(すなわち、α−1,6−グルコシド結合の数)は、好ましくは約1個以上であり、より好ましくは約10個以上であり、さらに好ましくは約30個以上である。α−グルカンの分岐の数(すなわち、α−1,6−グルコシド結合の数)は、好ましくは約5×103個以下であり、より好ましくは約3×103個以下であり、さらに好ましくは約1×103個以下である。
本発明で使用される分岐状α−グルカンにおいては、α−1,6−グルコシド結合の数に対するα−1,4−グルコシド結合の数の比(「α−1,6−グルコシド結合の数」:「α−1,4−グルコシド結合の数」)は、好ましくは1:1〜1:1×103であり、より好ましくは1:1.1〜1:500であり、さらに好ましくは1:1.2〜1:100であり、さらに好ましくは1:1.5〜1:50であり、最も好ましくは1:2〜1:20である。この比はまた、場合によっては、1:10〜1:5×103、1:50〜1:1×103、または1:100〜1:500であってもよい。
本発明において分岐状グルカンの分岐頻度の下限は、好ましくは0.2%以上、好ましくは1%以上、より好ましくは2%以上、最も好ましくは5%以上であり、そして、分岐頻度の上限は特にないが、例えば、99%以下、90%以下、85%以下、65%以下、50%以下などであり得る。分岐頻度は、{(α−1,6結合の数)/(グルカン中のα−1,4結合とα−1,6結合の合計)}×100によって計算される。
α−1,6−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で5個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
本発明においては、グルカンの代わりにグルカンの修飾物を使用してもよい。グルカンの修飾物の例としては、化工デンプンおよび上記で説明したグルカンのエステル化物などが挙げられる。グルカンの修飾物はまた、水酸基修飾物または還元末端修飾物であってもよい。また、後述するように、グルカンの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのアミノ単糖残基をα−1,4結合させた後にグルカン部分を修飾してもよい。
化工デンプンは、天然のデンプンに加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせたデンプンである。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工デンプンが入手可能である。化工デンプンの種類には種々ある。このようなデンプンの例は、デンプンの糊化温度以下においてデンプン粒子を酸に浸漬することにより、デンプン分子は切断するが、デンプン粒子は破壊していないデンプンである。
化工デンプン以外のグルカンの修飾物の例としては、非修飾グルカンのアルコール性水酸基のうちの少なくとも1つが修飾されたもの(以下、本明細書中では「グルカンの水酸基修飾物」という)、グルカンの非還元末端のうちの一部が修飾されたもの(以下、本明細書中では「グルカンの非還元末端修飾物」という)およびグルカンの還元末端が修飾されたもの(以下、本明細書中では「グルカンの還元末端修飾物」という)が挙げられる。
水酸基での修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化が挙げられる。水酸基での修飾は、体内の酵素によって除去され得る修飾であることが好ましい。グルカンの水酸基修飾物は、好ましくはアシル化グルカンであり、さらに好ましくはアセチル化グルカンである。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、グルカンの修飾反応の際に任意に設定することができる。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度はDSとして表し、DS1はグルコース残基あたりひとつの修飾基が導入されている状態を意味する。DSは、DS=(修飾基数)/(グルコース残基数)によって計算され得る。非修飾グルコース残基には2位、3位および6位にOH基があるため、理論上、グルコース残基1個あたり最大3個の修飾基を導入し得る。そのため、DSの上限値は通常3である。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、約DS0.01以上であり、より好ましくは約DS0.03以上であり、さらに好ましくは約DS0.05以上であり、特に好ましくは約DS0.07以上であり、最も好ましくは約DS0.1以上である。修飾基の導入頻度は、好ましくは約DS1.5以下であり、より好ましくは約DS1.3以下であり、さらに好ましくは約DS1.1以下であり、特に好ましくは約DS1.0以下であり、最も好ましくは約DS0.9以下である。グルカンを修飾することにより血液内あるいは体内でのグルカンの分解が抑制される。
非還元末端での修飾の例としては、マンノース残基、ガラクトース残基などの標的性分子との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の2.6および3において詳細に説明する。非還元末端修飾物は、好ましくはマンノース残基との結合物又はガラクトース残基との結合物である。
還元末端での修飾の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体及びアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される物質との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の2.6および3において詳細に説明する。
(1.2)アミノ糖
アミノ糖は、少なくとも1つのヒドロキシル基がアミノ基に置換された糖の総称である。アミノ糖中の糖部分は単糖であることが好ましく、六単糖であることが好ましい。糖部分が六単糖の場合、アミノ糖中のアミノ基の数は、1〜4の任意の整数であり得るが、1または2であることが好ましく、1であることが最も好ましい。本発明においては、糖の2位のヒドロキシル基がアミノ基に置換されているアミノ糖が好ましい。代表的なアミノ糖の例としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンが挙げられる。本発明におけるアミノ糖としてはグルコサミンが最も好ましい。複数種類のアミノ糖を混合して使用してもよく、1種類のアミノ糖を使用してもよい。
アミノ糖は、少なくとも1つのヒドロキシル基がアミノ基に置換された糖の総称である。アミノ糖中の糖部分は単糖であることが好ましく、六単糖であることが好ましい。糖部分が六単糖の場合、アミノ糖中のアミノ基の数は、1〜4の任意の整数であり得るが、1または2であることが好ましく、1であることが最も好ましい。本発明においては、糖の2位のヒドロキシル基がアミノ基に置換されているアミノ糖が好ましい。代表的なアミノ糖の例としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンが挙げられる。本発明におけるアミノ糖としてはグルコサミンが最も好ましい。複数種類のアミノ糖を混合して使用してもよく、1種類のアミノ糖を使用してもよい。
(2.アミノ糖含有グルカンの製造法)
(2.1)アミノ糖−1−リン酸
本発明の方法においては、アミノ糖−1−リン酸が使用され得る。好ましくは、グルコサミン−1−リン酸、ガラクトサミン−1−リン酸またはマンノサミン−1−リン酸が使用される。アミノ糖−1−リン酸は、市販のものであってよく、化学的な方法、酵素的な方法、醗酵などの生物学的方法により合成されたものであってもよい。アミノ糖−1−リン酸の製造法は当該分野で公知である。例えば、グルコサミン−1−リン酸の合成方法は、例えば、Nawajiら、Carbohydr.Res.2008、343、2692−2696に開示されている。
(2.1)アミノ糖−1−リン酸
本発明の方法においては、アミノ糖−1−リン酸が使用され得る。好ましくは、グルコサミン−1−リン酸、ガラクトサミン−1−リン酸またはマンノサミン−1−リン酸が使用される。アミノ糖−1−リン酸は、市販のものであってよく、化学的な方法、酵素的な方法、醗酵などの生物学的方法により合成されたものであってもよい。アミノ糖−1−リン酸の製造法は当該分野で公知である。例えば、グルコサミン−1−リン酸の合成方法は、例えば、Nawajiら、Carbohydr.Res.2008、343、2692−2696に開示されている。
アミノ糖−1−リン酸としては、非塩形態のアミノ糖−1−リン酸および塩の形態のアミノ糖−1−リン酸のいずれをも使用し得る。例えば、グルコサミン−1−リン酸としては、非塩形態のグルコサミン−1−リン酸および塩の形態のグルコサミン−1−リン酸のいずれをも使用し得る。例えば、グルコサミン−1−リン酸の金属塩を使用することができ、グルコサミン−1−リン酸のアルカリ金属塩(例えば、グルコサミン−1−リン酸二ナトリウムおよびグルコサミン−1−リン酸二カリウム)を使用することができる。
(2.2)α−グルカンホスホリラーゼ
本明細書において用語「α−グルカンホスホリラーゼ」は、α−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。α−グルカンホスホリラーゼは、EC2.4.1.1に分類される。α−グルカンホスホリラーゼ活性とは、無機リン酸とα−1,4−グルカンとから、グルコース−1−リン酸およびα−1,4−グルカンの部分分解物を作る反応またはその逆反応を触媒する活性をいう。α−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−1,4−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。
本明細書において用語「α−グルカンホスホリラーゼ」は、α−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。α−グルカンホスホリラーゼは、EC2.4.1.1に分類される。α−グルカンホスホリラーゼ活性とは、無機リン酸とα−1,4−グルカンとから、グルコース−1−リン酸およびα−1,4−グルカンの部分分解物を作る反応またはその逆反応を触媒する活性をいう。α−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−1,4−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。
本発明においては、グルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する機能を有する限り、任意のα−グルカンホスホリラーゼが使用され得る。本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、細菌、酵母、動物または植物に由来し得る。本発明のα−グルカンホスホリラーゼは、例えば、馬鈴薯、サツマイモ、ソラマメ(Fava bean)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ホウレンソウ、トウモロコシ、イネ、コムギ、Citrus hybrid cultivar、Aquifex aeolicus、Thermotoga maritima、Thermococcus zilligii、Thermoanaerobacter pseudethanolicusなどに由来し得る。
本発明で使用するα−グルカンホスホリラーゼは、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼであることが好ましい。特定の実施形態では、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼまたはThermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼが使用され得る。
Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号1に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号2の1位〜692位に示す。Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、植物のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約21%〜約24%の配列同一性を有し、Thermus thermophilus由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約34%の配列同一性を有し、そしてThermococcus litoralis由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約38%の配列同一性を有する。Thermotoga maritima由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約38%の配列同一性を有し、Thermococcus zilligii由来のマルトデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約38%の配列同一性を有し、そしてThermoanaerobacter pseudethanolicusに対して約33%の配列同一性を有する。
馬鈴薯由来タイプL α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号3に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号4の15位〜930位に示す。Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号5に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号6の1位〜717位に示す。
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
本明細書において配列(例えば、アミノ酸配列、塩基配列など)の「同一性」とは、2つの配列の間で同一のアミノ酸(塩基配列を比較する場合は塩基)の出現する程度をいう。一般に、2つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら2つの配列を比較することによって決定され得る。
本明細書では配列の同一性は、GENETYX−WIN Ver.4.0(株式会社ゼネティックス)のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致(Matches)、不一致(Mismatches)、ギャップ(Gaps)についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する(参考文献:Takeishi,K.およびGotoh,O.1984.Sequence Relationships among Various 4.5 S RNA Species J.Biochem.92:1173−1177)。
例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号4または配列番号6と同一、すなわち、100%同一であってよい。別の実施形態では、グルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する限り、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも1個(例えば、1又は数個)のアミノ酸の欠失、置換(保存および非保存置換を含む)または挿入からなる群より選択され得る。このような変化は配列番号2、配列番号4または配列番号6のアミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、1残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、酵素の精製を容易にするため、安定性を高めるためなどの理由で配列番号2、配列番号4または配列番号6のアミノ酸配列のいずれかの末端に(好ましくは約20残基以下、より好ましくは約10残基以下、さらに好ましくは約5残基以下の)アミノ酸残基を付加したものであってもよい。
本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号2、配列番号4または配列番号6のアミノ酸配列に対して好ましくは約50%以上、より好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、なおいっそう好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する。本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号2、配列番号4または配列番号6のアミノ酸配列に対して約96%以上、約97%以上、約98%以上または約99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約0.01U/ml以上であり、より好ましくは約0.1U/ml以上であり、特に好ましくは約0.5U/ml以上であり、最も好ましくは約1U/ml以上である。反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約1000U/ml以下であり、より好ましくは約100U/ml以下であり、特に好ましくは約50U/ml以下であり、最も好ましくは約20U/ml以下である。α−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。なお、α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、以下のとおりに定義される:
α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、1分間に1μmolの無機リン酸(Pi)を生成するα−グルカンホスホリラーゼ活性を1単位(U又はUnit)とする。このα−グルカンホスホリラーゼ活性の測定は、G−1−Pから生じた遊離の無機リン酸(Pi)を定量する。200μlの反応液(100mM酢酸緩衝液(pH6.0)中、12.5mM G−1−P、1%デキストリンおよび酵素液を含む)を50℃に15分間インキュベートした後、800μlのモリブデン試薬(15mMモリブデン酸アンモニウム、100mM酢酸亜鉛)を加え、攪拌し反応を停止する。200μlの568mMのアスコルビン酸(pH5.8)を加え、混合し、30℃に15分間インキュベートした後、分光光度計を用いて850nmの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成し、この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。無機リン酸は、リン酸イオンとして定量される。グルコース−1−リン酸の量は定量されない。
α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、1分間に1μmolの無機リン酸(Pi)を生成するα−グルカンホスホリラーゼ活性を1単位(U又はUnit)とする。このα−グルカンホスホリラーゼ活性の測定は、G−1−Pから生じた遊離の無機リン酸(Pi)を定量する。200μlの反応液(100mM酢酸緩衝液(pH6.0)中、12.5mM G−1−P、1%デキストリンおよび酵素液を含む)を50℃に15分間インキュベートした後、800μlのモリブデン試薬(15mMモリブデン酸アンモニウム、100mM酢酸亜鉛)を加え、攪拌し反応を停止する。200μlの568mMのアスコルビン酸(pH5.8)を加え、混合し、30℃に15分間インキュベートした後、分光光度計を用いて850nmの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成し、この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。無機リン酸は、リン酸イオンとして定量される。グルコース−1−リン酸の量は定量されない。
(2.3)α−グルカンホスホリラーゼの製造
本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、α−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。あるいは、本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したα−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物(例えば、細菌、真菌など)から単離してもよい。
本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、α−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。あるいは、本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したα−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物(例えば、細菌、真菌など)から単離してもよい。
好ましい実施形態では、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号1の遺伝子断片を化学合成し、この遺伝子断片を含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターを微生物へ導入して組換え微生物を作製し、この組換え微生物を培養してα−グルカンホスホリラーゼを生産させ、そして生産されたα−グルカンホスホリラーゼを回収することにより生産される。他の生物由来のα−グルカンホスホリラーゼについても同様に生産され得る。遺伝子組換えによる酵素生産方法は、当業者に周知である。本願発明に用いられる宿主微生物には、原核生物および真核生物が含まれ、中温菌が好ましい。特に好ましい微生物としては、例えば大腸菌などが挙げられるが、これに限定されない。
本発明において用いられる配列番号2の1位〜692位、配列番号4の15位〜930位もしくは配列番号6の1位〜717位のアミノ酸配列またはそれにして相同性を有しかつグルコサミン転移活性を有するアミノ酸配列を有するα−グルカンホスホリラーゼ、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドは、従来の遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
(2.4)アミノ糖含有グルカンの製造
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルコサミン−1−リン酸、グルカン、およびグルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する反応を触媒し得るα−グルカンホスホリラーゼ(例えば、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ、またはThermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼ)を含む反応溶液を反応させる工程を含む方法により製造され得る。この方法においてグルカンの代わりにグルカン修飾物を使用することによりアミノ糖含有グルカンの修飾物を製造することができる。以下においては、例示として、グルカンを用いる方法について説明する。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルコサミン−1−リン酸、グルカン、およびグルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する反応を触媒し得るα−グルカンホスホリラーゼ(例えば、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ、またはThermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼ)を含む反応溶液を反応させる工程を含む方法により製造され得る。この方法においてグルカンの代わりにグルカン修飾物を使用することによりアミノ糖含有グルカンの修飾物を製造することができる。以下においては、例示として、グルカンを用いる方法について説明する。
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、アミノ糖−1−リン酸(例えば、グルコサミン−1−リン酸)、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、pHを調整する目的で任意の緩衝剤、及び無機塩類を加えてもよい。この反応溶液には、必要に応じてα−グルカンホスホリラーゼの本来の基質である、グルコース−1−リン酸を添加してもよい。アミノ糖−1−リン酸とグルコース−1−リン酸を共存させた反応の場合、受容体グルカンの非還元末端にグルコース残基を結合させる反応と、アミノ単糖残基を結合させる反応が同時に行われることになる。グルカンの非還元末端にアミノ単糖残基が結合しても、α−グルカンホスホリラーゼはアミノ単糖残基の非還元末端にさらに分子を転移させることができるが、その転移効率はグルコース残基に対して転移させる効率よりも非常に低い。グルカンの非還元末端にグルコース残基が結合すると、α−グルカンホスホリラーゼは得られる分子の非還元末端にさらにグルコース残基またはアミノ単糖残基を転移することができる。そのため、グルコース−1−リン酸が共存するとグルカンの鎖長を効率よく伸ばすことができる。従って、最終的に得られるアミノ糖含有グルカンの構造は、アミノ糖−1−リン酸とグルコース−1−リン酸の添加比率により制御されることになる。この反応溶液には、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、4−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。
反応溶液中でのアミノ糖−1−リン酸の量と、集団としてのグルカンの非還元末端の数との比率を変えることにより、アミノ単糖残基の導入頻度を制御することができる。すなわち、(グルカンの分子数)×(分子内の非還元末端の数に対するアミノ糖−1−リン酸の量)を増やすほど、アミノ単糖残基の導入頻度を高めることができる。酵素添加量または酵素反応時間を調節することにより、アミノ単糖残基の導入頻度を調節することも可能である。
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応温度は代表的には、約30℃〜約90℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの活性の約50%以上、より好ましくは約80%以上の活性が残る温度であることが好ましい。Aquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼは耐熱性酵素であり、その反応至適温度は約80〜90℃である。反応速度の面からは、反応温度がある程度高いことが好ましい。一方、Aquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度の面からは約80〜90℃での反応が可能である。しかし、得られる生成物の安定性、アミノ糖−1−リン酸やグルコース−1−リン酸の安定性などの観点から、反応温度はAquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度よりも少し低いことが好ましい。反応温度は、好ましくは約30℃以上であり、より好ましくは約35℃以上であり、さらに好ましくは約40℃以上である。特定の実施形態では、反応温度は約45℃以上または約50℃以上であってもよい。反応温度は、好ましくは約90℃以下であり、より好ましくは約80℃以下であり、さらに好ましくは約70℃以下である。特定の実施形態では、反応温度は約65℃以下または約60℃以下であってもよい。馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼなどのより反応至適温度の低い酵素を使用する場合、反応温度はAquifex aeolicus VF5由来のα−グルカンホスホリラーゼを使用する場合よりは低く設定されることが好ましい。
反応時間は、反応温度、酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約1時間〜約100時間、より好ましくは約1時間〜約72時間、さらにより好ましくは約2時間〜約36時間、最も好ましくは約2時間〜約24時間である。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約1時間以上、約2時間以上、約5時間以上、約10時間以上、約12時間以上、約24時間以上であってもよい。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約100時間以下、約72時間以下、約60時間以下、約48時間以下、約36時間以下、約24時間以下であってもよい。
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、アミノ糖−1−リン酸、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも1つを反応溶液に追加してもよい。
このようにして、アミノ糖含有グルカンを含有する溶液が生産される。
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、100℃にて10分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたアミノ糖含有グルカンを単離するために処理されてもよい。
反応終了後、アミノ糖含有グルカンを精製してから、またはアミノ糖含有グルカンの精製前に、得られたアミノ糖含有グルカンのグルカン部分のアルコール性水酸基のうちの少なくとも1つを修飾することによりアミノ糖含有グルカンの水酸基修飾物を製造してもよい。アミノ糖含有グルカンを精製してから修飾を行うことが好ましい。修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化およびリン酸化が挙げられる。アシル化が好ましく、アセチル化がより好ましい。アミノ糖含有グルカン又はアミノ糖含有グルカン水酸基修飾物を製造した後に、グルカンの還元末端を修飾することによりアミノ糖含有グルカン又はアミノ糖含有グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物を製造してもよい。さらに、これらのグルカン部分のアミノ糖が結合していない非還元末端を修飾してもよい。グルカンに対するアミノ単糖残基の結合、水酸基の修飾、還元末端の修飾及び非還元末端の一部へのアミノ単糖残基以外の修飾基での修飾は、任意の順序で行われ得る。
(2.5)アミノ糖含有グルカンの精製
<精製方法>
生産されたアミノ糖含有グルカン(又はその修飾物)は、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、無機リン酸、アミノ糖−1−リン酸、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法(T.J.Schochら、J.American Chemical Society,64,2957(1942))および有機溶媒を用いない方法がある。
<精製方法>
生産されたアミノ糖含有グルカン(又はその修飾物)は、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、無機リン酸、アミノ糖−1−リン酸、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法(T.J.Schochら、J.American Chemical Society,64,2957(1942))および有機溶媒を用いない方法がある。
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、n−アミルアルコール、ペンタゾール、n−プロピルアルコール、n−ヘキシルアルコール、2−エチル−1−ブタノール、2−エチル−1−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、n−ブチルアルコール、3−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、d,l−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、sec−ブチルアルコール、2−メチル−1−ブタノール、イソアミルアルコール、tert−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
有機溶媒を用いない精製方法の例としては、アミノ糖含有グルカン生産反応後、水に溶解しているアミノ糖含有グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供して無機リン酸、アミノ糖−1−リン酸、無機塩類を除去する方法がある。
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約1×103〜約1×104、好ましくは約5×103〜約5×104、より好ましくは約1×104〜約3×104の限外濾過膜(ダイセル製UF膜ユニット)が挙げられる。
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
本発明のアミノ糖含有グルカンの製造方法においては、高分子量のグルカンが使用されるため、製造後の分離が容易であるという利点がある。詳細に述べると、アミノ糖含有グルカンの生成反応は反応副産物である無機リン酸の濃度が上昇すると平衡に達するため、反応終了後の反応液中には大量のアミノ糖−1−リン酸が残存する。低分子量のグルカンを使用した場合、得られるアミノ糖含有グルカンおよびアミノ糖−1−リン酸はいずれもカチオン性である。これらは分子量および電荷がほぼ同じであるので、分離が非常に困難である。このため、アミノ糖−1−リン酸を不純物として含有しないアミノ糖含有グルカンを生産できない。しかし、高分子量のグルカンを使用した場合、分子量の違いを利用する生成方法を適用することによりアミノ糖−1−リン酸を不純物として含まないアミノ糖含有グルカンを生産することができた。グルカンとアミノ糖含有グルカンとは電荷の相違を利用してイオンクロマトグラフィーなどによって容易に分離することができる。
(2.6)アミノ糖含有グルカン及びその修飾物及び結合体
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルカンの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているグルカンである。このグルカンの非還元末端に結合したアミノ単糖の末端には、必要に応じてさらに糖などを結合させてもよい。本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて2つ以上のアミノ単糖残基がグルカンの非還元末端に結合している場合には、それらのアミノ単糖が一つの末端に連結して結合した構造になる。例えば、グルカンの一つの末端に一つのアミノ単糖が結合し、そのアミノ単糖の末端にさらに次のアミノ単糖が結合した構造になる。一つの実施形態では、グルカンの末端のそれぞれに一つのみのアミノ単糖が結合する。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルカンの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているグルカンである。このグルカンの非還元末端に結合したアミノ単糖の末端には、必要に応じてさらに糖などを結合させてもよい。本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて2つ以上のアミノ単糖残基がグルカンの非還元末端に結合している場合には、それらのアミノ単糖が一つの末端に連結して結合した構造になる。例えば、グルカンの一つの末端に一つのアミノ単糖が結合し、そのアミノ単糖の末端にさらに次のアミノ単糖が結合した構造になる。一つの実施形態では、グルカンの末端のそれぞれに一つのみのアミノ単糖が結合する。
本発明のアミノ糖含有グルカンにおいては、グルカンの非還元末端のすべてにアミノ単糖(例えばグルコサミン)が結合していてもよく、非還元末端のうちの一部分のみにアミノ単糖が結合していてもよい。すなわち、非還元末端のうちのいくつかが、アミノ単糖が結合しない状態で残っていてもよい。
非還元末端の数を基準とする転化率、すなわち、アミノ単糖を結合させる前にグルカンに存在した非還元末端の数に対する、アミノ単糖と非還元末端との間の結合の数の比率は、0%に極めて近い低い比率(例えば、約1%)から100%まで、アミノ糖含有グルカンの使用される用途などに応じて適宜選択することができる。例えば、少量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、低い転化率を選択すればよく、多量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、高い転化率を選択すればよい。
アミノ糖含有グルカンを製造する際の酵素反応の条件を適宜調整することにより、例えば、その酵素反応の反応時間、基質の濃度などを調整することにより、容易に、選択された転化率を有するアミノ糖含有グルカンを得ることができる。
また、アミノ単糖を結合させる前にグルカンに存在した非還元末端の数に対する、非還元末端に結合したアミノ単糖の総数の比率を、アミノ基の量に関する指標とすることもできる。本明細書中ではこの比率を結合率と記載する。一般に、アミノ糖含有グルカンを分析する際には、上記転化率を測定することよりも、結合率を測定することが容易であるので、結合率に基づいてアミノ糖含有グルカンを設計することは実用的な観点から有利である。
なお、アミノ糖含有グルカンを合成する際の酵素反応の条件によっては、1つの非還元末端に結合したアミノ単糖の末端にさらにアミノ単糖が結合する場合がある。すなわち、1つの非還元末端に2つのアミノ単糖が続けて結合した構造(つまり、2糖が非還元末端に結合した構造)となる場合がある。このような構造の化合物も本発明のアミノ糖含有グルカンとして使用することができる。上記結合率は、このように複数のアミノ単糖が1つの非還元末端に結合することによりアミノ基の量が増えた場合にもそのアミノ基の量を評価できるという利点がある。そのため、上記転化率とは異なり、結合率は、100%を超える値となる場合がある。結合率は、アミノ糖含有グルカンの使用される用途などに応じて適宜選択することができる。例えば、少量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、低い結合率(例えば、約1%〜約2%)を選択すればよく、多量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、高い結合率(例えば、約150%〜約200%)を選択すればよい。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途がDDS用ナノ粒子状キャリアの場合、アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約10%以上であり、より好ましくは約20%以上であり、さらに好ましくは約30%以上であり、最も好ましくは約40%以上である;アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約500%以下であり、より好ましくは約400%以下であり、さらに好ましくは約300%以下であり、最も好ましくは約200%以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途が複合体キャリアの場合、アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約1%以上であり、より好ましくは約5%以上であり、さらに好ましくは約10%以上であり、最も好ましくは約20%以上である;アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約500%以下であり、より好ましくは約400%以下であり、さらに好ましくは約300%以下であり、最も好ましくは約200%以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途がDDS用ナノ粒子状キャリアの場合、グルカン1分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約2以上であり、より好ましくは約5以上であり、さらに好ましくは約10以上であり、最も好ましくは約20以上である;グルカン1分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約5000以下であり、より好ましくは約4000以下であり、さらに好ましくは約3000以下であり、最も好ましくは約2000以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途が複合体キャリアの場合、グルカン1分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約10以上であり、より好ましくは約50以上であり、さらに好ましくは約100以上であり、最も好ましくは約200以上である;グルカン1分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約5000以下であり、より好ましくは約4000以下であり、さらに好ましくは約3000以下であり、最も好ましくは約2000以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンが核酸と複合体を形成する場合、本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸との複合体との結合率は、37℃の0.1M NaCl水溶液中で約50%以上であることが好ましく、約60%以上であることがより好ましく、約70%以上であることがさらに好ましく、37℃の1M NaCl水溶液中で約40%以下であることが好ましく、約30%以下であることがさらに好ましく、約20%以下であることが最も好ましい。結合率は、実施例10に記載の方法によって測定され得る。
本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて、アミノ単糖が結合していない非還元末端には、アミノ糖以外の糖が結合していてもよい。すなわち、非還元末端のうちのいくつかがアミノ単糖と結合し、残りの非還元末端がアミノ糖以外の糖と結合してもよい。
あるいは、非還元末端のうちのいくつかがアミノ単糖と結合し、いくつかがアミノ糖以外の糖と結合し、そして残りの非還元末端には何も結合していない構造にすることも可能である。ここで、複数の非還元末端のうちの、アミノ単糖に結合する末端の数と、アミノ単糖以外の糖に結合する末端の数と、糖に結合しない末端の数とは、自由に選択することが可能である。
本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物をさらに、アミノ糖残基のアミノ基において薬効成分と結合させることにより、結合体を得ることができる。アミノ糖含有グルカンと薬効成分とが結合したものを「アミノ糖含有グルカン薬効成分結合体」といい、アミノ糖含有グルカンの修飾物と薬効成分とが結合したものを「アミノ糖含有グルカン修飾物−薬効成分結合体」という。同様に、アミノ糖がグルコサミンの場合、グルコサミン含有グルカンと薬効成分とが結合したものを「グルコサミン含有グルカン薬効成分物質結合体」といい、グルコサミン含有グルカンの修飾物と薬効成分とが結合したものを「グルコサミン含有グルカン修飾物−薬効成分結合体」という。
アミノ糖含有グルカン修飾物は、水酸基修飾物、非還元末端修飾物または還元末端修飾物であり得る。
水酸基修飾物については上記のとおりである。
非還元末端修飾物について説明する。アミノ糖含有グルカン又はその修飾物のグルカン部分が分岐状α−1,4−グルカンであってアミノ糖残基が結合していない非還元末端が存在する場合、アミノ糖残基が結合していない非還元末端において他の物質と結合させることができる。好ましい実施形態では、アミノ糖残基が結合していない非還元末端に標的性分子を結合させる。本明細書中では、用語「標的性分子」とは、組織ターゲット機能を有する分子をいう。標的性分子の例としては、マンノース、ガラクトース、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドが挙げられる。特にガラクトースは肝実質細胞表面に存在するアシアロ糖タンパクレセプターに認識されるため、有効である。またマンノースはクッパー細胞をはじめとする種々のマクロファージや肝臓の類洞血管内皮細胞上に発現しているマンノースレセプターに認識されるため有効である。マンノースおよびガラクトースは、例えば、マンノース−1−リン酸又はガラクトース−1−リン酸を基質にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることによりアミノ糖含有グルカン又はその修飾物の非還元末端に結合され得る。酵素反応により結合させる場合、マンノースおよびガラクトースはアミノ糖残基が結合していない非還元末端グルコース残基の4位において結合する。マンノースとガラクトースとを任意の比率で組み合わせて、分岐グルカンの複数の非還元末端に結合させることも可能である。1つの実施形態では、非還元末端に結合したアミノ糖残基に対してマンノースまたはガラクトースが結合し得る。
還元末端修飾物について説明する。「アミノ糖含有グルカンの還元末端修飾物」とは、本発明のアミノ糖含有グルカンに存在する還元末端に別の物質を結合させたものをいう。好ましい実施形態では、還元末端において他の物質と結合させる方法は以下の2通りがある。第一は、公知の酵素的、あるいは公知の化学的手法により、他の物質に重合度5×103以上、より好ましくは重合度1×104以上、さらに好ましくは重合度1×105以上のグルカンの還元末端を結合させ、その後本発明の方法を用いてアミノ糖をグルカンの非還元末端に結合させる方法である。第二の方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンの還元末端を、公知の酵素的手法により、他の物質に結合させる方法である。
第一の方法における酵素的に他の物質にグルカンを結合する方法は、例えば、特開平5−276883号公報、特開平07−241181号公報及び国際公開番号WO01/073106に開示されており、これらの方法と同様にして高分子量のグルカンを他の物質に結合することができる。
第一の方法における化学的に他の物質にグルカンを結合する方法は、アミン基を有する物質に対して用いることが出来る。例えばマルトペンタオースとアミン基を有する物質の化学的結合方法には、以下の三種がある:
(A)マルトペンタオースの還元末端アルデヒドとアミン基を有する物質を還元アミノ化により結合する方法;
(B)マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち、アミン基を有する物質と縮合剤により脱水縮合する方法;および
(C)マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち脱水してマルトテトラオシルグルコノラクトンを調製し、これを、アミン基を有する物質と無水溶媒条件で加熱して結合させる方法。(A)(B)(C)の3種の方法は、特願2008−121693に詳細に記載されており、これらの方法と同様にして高分子量のグルカンを他の物質に結合することができる。
(A)マルトペンタオースの還元末端アルデヒドとアミン基を有する物質を還元アミノ化により結合する方法;
(B)マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち、アミン基を有する物質と縮合剤により脱水縮合する方法;および
(C)マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち脱水してマルトテトラオシルグルコノラクトンを調製し、これを、アミン基を有する物質と無水溶媒条件で加熱して結合させる方法。(A)(B)(C)の3種の方法は、特願2008−121693に詳細に記載されており、これらの方法と同様にして高分子量のグルカンを他の物質に結合することができる。
第二の本発明のアミノ糖含有グルカンの還元末端を、酵素的手法により、他の物質に結合させる方法に利用可能な酵素は、糖質及び配糖体にのみ適用可能である。酵素には、ブランチングエンザイム、CGTase、D酵素、アミロマルターゼなどのいわゆるグルカン鎖転移酵素を用いる。これら酵素はアミノ糖含有グルカン中のα−1,4結合を切断し、その非還元末端側のフラグメント(アミノ糖含有フラグメント)を受容体分子(ここでは糖質もしくは配糖体)に転移する。
還元末端に結合させる物質の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体、アミン基含有低分子量物質が挙げられる。
単糖類の例としては、N−アセチルグルコサミン、グルコン酸などの官能基を有する単糖類が挙げられる。非還元性糖質類の例としては、ソルビトール、スクロース、およびトレハロースが挙げられる。生体適合性高分子の例としては、アミロース、デキストリン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、及びペプチドが挙げられる。リポソーム構成成分の例としては、リン脂質、脂肪酸、及び界面活性剤が挙げられる。配糖体の例としては、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、及びステロイド配糖体類が挙げられる。アミノ基含有低分子量物質の例としては、各種アミノ酸、ドデシルアミン、などが挙げられる。
アミノ糖含有グルカン又はその修飾物のアミノ糖残基のアミノ基に別の物質を結合させる実施形態については以下の「3」に詳述する。
(3.アミノ糖含有グルカン及びその修飾物の利用)
本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、グルカンの非還元末端にアミノ糖残基が結合しているため、非還元末端にアミノ基を有しており、その結果、水溶液中でグルカンを正に帯電させることができる。たとえばグルカンの非還元末端に多数のアミノ糖が結合している本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、溶媒のpHを変化させることにより、非還元末端のアミノ糖のアミノ基がNH3+になった状態と、NH2のままの状態とを作り出すことが出来る。非還元末端のアミノ糖残基のアミノ基が解離した状態では、静電反発により、アミノ糖含有グルカン、その修飾物及びそれらの結合体は伸びきった構造となり、非解離の状態ではアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は収縮した状態となると考えられる。このようなpH依存的な多糖ミクロゲルのコンホメーション変化は、医薬品デリバリーへの利用が可能である。
本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、グルカンの非還元末端にアミノ糖残基が結合しているため、非還元末端にアミノ基を有しており、その結果、水溶液中でグルカンを正に帯電させることができる。たとえばグルカンの非還元末端に多数のアミノ糖が結合している本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、溶媒のpHを変化させることにより、非還元末端のアミノ糖のアミノ基がNH3+になった状態と、NH2のままの状態とを作り出すことが出来る。非還元末端のアミノ糖残基のアミノ基が解離した状態では、静電反発により、アミノ糖含有グルカン、その修飾物及びそれらの結合体は伸びきった構造となり、非解離の状態ではアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は収縮した状態となると考えられる。このようなpH依存的な多糖ミクロゲルのコンホメーション変化は、医薬品デリバリーへの利用が可能である。
本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、非還元末端に反応性基であるアミノ基を有する。このためこのアミノ基を介して、別の物質(例えば、薬効成分)にグルカン鎖を直接的にまたは適切なスペーサーを介して間接的に結合させることが出来る。その結果、当該物質の物性を改変したり、当該物質に対して機能を付与したりすることが可能である。ここで言う別の物質とは、低分子量有機化合物、高分子有機化合物、DDS用ナノ粒子状キャリア(高分子ミセル、ウイルス粒子、リポソームなど)、無機物質(例えば、磁性微粒子)のいずれでもかまわない。別の物質は好ましくは薬効成分であり、より好ましくは水溶液中で負に帯電する薬効成分である。たとえば本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、カルボジイミドなどの適当な縮合剤の存在下、カルボキシル基を有する物質と反応させることにより、カルボキシル基を有する物質に容易に結合させることが出来る。カルボキシル基を有する物質がペプチド、タンパク質などの薬効成分の場合、得られる化合物は、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と薬効成分とが直接的に結合した結合体である。あるいは、薬効成分をアミノ糖含有グルカン又はその修飾物にスペーサーを介して結合させることができる。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物のアミノ基に、アミノ基及び薬効成分との結合に利用可能な官能基を有する化合物を結合させることができる。薬効成分などとの結合のためにアミノ基に別の化合物を結合させることを「アミノ基の修飾」という。グルカン鎖の付与による物性の改変効果としては、水溶性の改善、水和層形成による生体親和性の付与などが期待できる。
アミノ基の修飾には、カルボキシル基と別の官能基とを有する修飾試薬を使用することができる。本明細書中では、アミノ糖含有グルカン及びアミノ糖含有グルカン修飾物のアミノ基の修飾に使用されるカルボキシル基を有する物質を「アミノ基修飾試薬」ともいう。アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する。この官能基の例としては、カチオン性官能基、アニオン性官能基、疎水性基、マレイミド基、チオール基及びアルデヒド基が挙げられる。カチオン性官能基の例としては、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリメチルアミノ基、アンモニウム基、ピリジニウム基が挙げられる。カチオン性官能基を有する修飾試薬の例としては、3−アミノ−2,5−ジクロロ安息香酸が挙げられる。アニオン性官能基の例としては、リン酸基、スルホン酸基、カルボキシル基、硫酸基が挙げられる。アニオン性官能基を有する修飾試薬の例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フタル酸およびクエン酸が挙げられる。疎水性基の例としては、ステアリル基、パルミチル基、メチル基、プロピル基、ブチル基等のアルキル基、フェニル基、ベンジル基、トリル基等のアリール基が挙げられる。疎水性基を有する修飾試薬の例としては、ステアリン酸、安息香酸、ケイ皮酸が挙げられる。マレイミド基を有する修飾試薬の例としては、N−(4−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドが挙げられる。チオール基は、メルカプト基とも呼ばれる。チオール基を有する修飾試薬の例としては、チオグリコール酸、メルカプト安息香酸が挙げられる。アルデヒド基の例としては、飽和非環式アルデヒド基、不飽和非環式アルデヒド基、飽和脂環式アルデヒド基、芳香族アルデヒド基が挙げられる。アルデヒド基を有する修飾試薬の例としては、2‐カルボキシベンズアルデヒドが挙げられる。
例えば、カルボキシル基を有する物質がアルギン酸やヒアルロン酸などのウロン酸を含む多糖の場合には、本発明のアミノ糖含有グルカンを主鎖に対し多数グラフト化する(すなわち、結合させる)ことが可能となり、ウロン酸含有多糖の物性を大きく変化させることが出来る。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とウロン酸含有多糖との結合体が形成される。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とウロン酸含有多糖とが直接結合している。特定の実施形態では、本発明のアミノ糖含有グルカンには、ウロン酸残基が結合していない。
また、カルボキシル基を有する物質がリン脂質の場合には、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物が結合したリン脂質を得ることが出来る。このようなリン脂質を、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とリン脂質との結合体ともいう。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とリン脂質とが直接結合している。このようなグルカン結合リン脂質を用いてリポソームを製造することにより、医薬品のデリバリーに利用可能なグルカン鎖結合リポソームを容易に得ることが出来る。
カルボキシル基を有する物質がタンパク質又はペプチドなどのタンパク質性薬効成分の場合には、グルカン鎖が結合したタンパク質又はペプチドなどのタンパク質性薬効成分を得ることが出来る。このようなタンパク質又はペプチドを、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質又はペプチドとの結合体ともいう。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質又はペプチドとが直接結合している。この技術はタンパク性薬効成分(医薬品)の体内動態の改良に利用することが出来る。
カルボキシル基を有する物質が磁性微粒子である場合には、グルカン鎖が結合した磁性微粒子を得ることが出来、これは臨床診断用造影剤として利用できる。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と磁性微粒子との結合体が形成される。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と磁性微粒子とが直接結合している。
カルボキシル基を有する物質が金属配位子(キレート剤)である場合には、グルカン鎖が結合した金属配位子を得ることが出来、これは放射性金属元素を配位することにより、臨床診断用造影剤として利用できる。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と金属配位子との結合体が形成される。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と金属配位子とが直接結合している。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、非還元末端に反応性基であるアミノ基を有する。アミノ基は中性条件下、水溶液中で正電荷を帯びる。一方、このアミノ基を化学的に修飾することにより、アニオン性官能基又は疎水性基を、グルカンの末端に導入することが出来る。一方、本発明のグルカン部分には様々な構造や分子量のグルカンが利用できる。これら技術を組み合わせると、例えば、タンパク質を包み込むことが出来る程度の分子量の分岐グルカンの末端に、カチオン性官能基、アニオン性官能基、疎水性基などをコントロールして導入することが出来る。このような修飾グルカンの末端はフレキシブルに移動することが可能で、タンパク質表面に存在する電荷を帯びた部分と静電的相互作用を、疎水性領域と、疎水性相互作用を行い、結果として本発明のグルカンは、タンパク質と非共有結合によるコンプレックスを形成する。従って、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質、ペプチドなどとを溶液中で混合することにより、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質、ペプチドなどとのコンプレックスを形成することができる。同様に、核酸、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセル、低分子量化合物と効果的に非共有結合的なコンプレックス形成ができるグルカンの末端構造を設計することも出来る。このように、本発明のグルカン及びその末端誘導体は、タンパク質、核酸、低分子量化合物、又はDDS用ナノ粒子状キャリア(例えば、リポソーム、高分子ミセル、ウイルス粒子)と効果的にコンプレックスを形成し、これらの安定化、物性、吸収性、体内動態(例えば、臓器集積性、組織ターゲティング特性、血中滞留性)などに影響を与えることが出来る。このように本発明のグルカンは、医薬品の薬効成分のDDSキャリアとして、またDDS用ナノ粒子状キャリアの改質剤として有効に利用できる。
本発明のアミノ糖含有グルカンを、医薬品の薬効成分の改質材料として利用する場合には、体内での改質材料の分解を制御する必要がある。グルカンが直鎖状α−1,4−グルカンである場合、α−アミラーゼによりすみやかな分解を受け、体内での存在時間が短くなりすぎる場合がある。このような場合、改質材料としての目的を果たすことが出来ない可能性がある。そこで、グルカンを構成するグルコースの水酸基の一部又はすべてを修飾することにより、分解に要する時間をコントロールすることが出来る。このようなアミノ糖含有グルカンの水酸基修飾物は本発明において好ましい。修飾は、エーテル化又はエステル化である。エーテル化は好ましくはハロゲン化アルキルまたはアルコールとのエーテル化である。エーテル化に使用されるハロゲン化アルキルまたはアルコールの炭素原子数は好ましくは1〜10であり、より好ましくは1〜5であり、さらに好ましくは1〜3である。ハロゲン基は好ましくはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり得る。エステル化は好ましくはカルボン酸またはハロゲン化アシルとのエステル化である。エステル化に使用されるカルボン酸またはハロゲン化アシルの炭素原子数は好ましくは1〜10であり、より好ましくは1〜5である。修飾は望ましくはエステル化である。エステル化はより好ましくはアシル化であり、さらに好ましくはアセチル化である。
このように本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体(好ましくはアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体)は、グルカンの構造とその非還元末端の構造が自在に設計でき、これを利用することにより、医薬品の薬効成分の体内動態を自在にコントロールできる。体内で完全に分解可能な構造であり、蓄積による毒性を懸念することなく、安全に利用できる医薬品の薬効成分の改質材料である。
従って、本発明によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物(好ましくはアミノ糖含有グルカン及びその修飾物)と、薬効成分とを含む、医薬品が提供される。本発明の医薬品においては、薬効成分は、好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマー、ならびに、これらの修飾物からなる群より選択される。薬効成分の修飾の例としては、たとえば、官能基の付与(リン酸化、カルボキシル化、アミド化など)が挙げられる。核酸の修飾の例としては、アミノ化、チオール化、ホスホロチオエート化、グリセリル化、およびカチオン性を付与する化学修飾(例えば、アミノ基などのカチオン基の導入)が挙げられる。
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物と、薬効成分との結合体であって、該薬効成分は、前記アミノ糖残基のアミノ基のうちの少なくとも1つと、直接共有結合しているか、又はスペーサーを介して結合している、結合体が提供される。該薬効成分は好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマー、ならびに、これらの修飾物からなる群より選択される。
特定の実施形態によれば、本発明によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物(好ましくはグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物)を含む、臨床診断用組成物が提供される。
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物(好ましくはアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物)を含む、DDS用ナノ粒子状キャリアが提供される。このDDS用ナノ粒子状キャリアは、好ましくは、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される。
本発明によれば、核酸、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセル、および低分子量化合物と効果的に非共有結合的なコンプレックス形成ができるグルカンの末端構造を設計することが出来る。このように、本発明のアミノ基含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物は、タンパク質、核酸、低分子量化合物、又はDDS用ナノ粒子状キャリア(例えば、リポソーム、高分子ミセル、およびウイルス粒子)と効果的にコンプレックスを形成し、これらの安定化、物性、吸収性、体内動態(例えば、臓器集積性、組織ターゲティング特性、血中滞留性)などに影響を与えることが出来る。このように本発明のアミノ基含有グルカンおよびその修飾物は、医薬品の薬効成分のDDSキャリアとして、またDDS用ナノ粒子状キャリアの改質剤として有効に利用できる。
従って、本発明によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物(好ましくはグルコサミン含有グルカン及びその修飾物)と、薬効成分とを含む、医薬品が提供される。本発明の医薬品においては、薬効成分は、好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、DNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマー、ならびに、これらの修飾物からなる群より選択される。
(4.本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体)
本明細書中では、グルカンの少なくとも1つの非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているがグルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないグルカンを「アミノ糖含有グルカン」という。なお、グルカンの1つの末端に2つ以上のアミノ単糖が結合する場合、グルカンの1つの末端に1つのアミノ単糖が結合し、そのアミノ単糖の末端に次のアミノ単糖が結合した構造になる。本明細書中では、グルカンの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルカンを「グルコサミン含有グルカン」という。
本明細書中では、グルカンの少なくとも1つの非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているがグルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないグルカンを「アミノ糖含有グルカン」という。なお、グルカンの1つの末端に2つ以上のアミノ単糖が結合する場合、グルカンの1つの末端に1つのアミノ単糖が結合し、そのアミノ単糖の末端に次のアミノ単糖が結合した構造になる。本明細書中では、グルカンの少なくとも1つの非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルカンを「グルコサミン含有グルカン」という。
本明細書中では、グルカンの特定の非還元末端に対して、それぞれα−1,4結合で連結された2つ以上のアミノ単糖残基からなる糖鎖が結合していて、グルカン中の非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在していない場合も、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合していて、非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないとみなす。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルカンの少なくとも1つの非還元末端のそれぞれに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−1,4グルカンまたは直鎖状α−1,4グルカンである。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、好ましくはグルコサミン含有グルカンであり、より好ましくはグルコサミン含有直鎖状グルカンまたはグルコサミン含有分岐状グルカンである。アミノ糖含有グルカンのグルカン部分が直鎖状グルカンの場合、非還元末端は1つなので、その非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合している。アミノ糖含有グルカンのうちのグルカン部分が分岐状グルカンの場合、非還元末端は2つ以上あるので、そのうちの1つ以上の非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合している。1つの実施形態では、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンは、分岐グルカンの複数の非還元末端のうちの1つ以上の非還元末端に少なくとも1つのグルコサミン残基がα−1,4結合しているが、非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有分岐グルカンである。
本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないことは、例えば、アミノ糖含有グルカンをα−アミラーゼ処理することにより確認することができる。α−アミラーゼはα−1,4グルカンに作用してマルトースとグルコースを生じるが、アミノ糖化されたα−1,4グルカン鎖のアミノ糖とグルコースと間のグリコシド結合は分解できない。そのため、アミノ糖含有グルカンは、α−アミラーゼ処理に抵抗性を示す。非還元末端にアミノ糖残基を含むグルカンはα−アミラーゼ処理することにより、マルトースとグルコースを生じ、かつアミノ糖を含むマルトトリオースが検出されることにより確認することができる。
(4.1)アミノ糖残基が結合した分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体
本発明のアミノ糖含有グルカンに含まれるグルカン部分が分岐状α−1,4グルカンである場合、アミノ糖含有グルカンは、この分岐状α−1,4グルカンが有する複数の非還元末端のうちの少なくとも1つに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合している。本発明によれば、少なくとも1つの非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した分岐状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、少なくとも1つの非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した分岐状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体で結合する物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明のアミノ糖含有グルカンに含まれるグルカン部分が分岐状α−1,4グルカンである場合、アミノ糖含有グルカンは、この分岐状α−1,4グルカンが有する複数の非還元末端のうちの少なくとも1つに少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合している。本発明によれば、少なくとも1つの非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した分岐状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、少なくとも1つの非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した分岐状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体で結合する物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に含まれる分岐状グルカン部分は、好ましくはデンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される。これらの分岐状グルカン部分の好適な範囲については、「(1.1)グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約5×103以上であり、より好ましくは約1×104以上であり、さらに好ましくは約5×104以上である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約1×109以下であり、より好ましくは約3×108以下であり、さらに好ましくは約1×108以下である。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約5×103以上であり、より好ましくは約1×104以上であり、さらに好ましくは約5×104以上である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約1×109以下であり、より好ましくは約3×108以下であり、さらに好ましくは約1×108以下である。
本発明の結合体においては、上記のような好適な分子量のアミノ糖含有分岐状グルカンに対して他の物質(例えば、標的性分子、薬効成分など)が結合していることが好ましい。
本発明においては、アミノ糖含有分岐状グルカン修飾物が好ましい。修飾はアシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約0.1以上であり、さらに好ましくは約0.2以上であり、特に好ましくは約0.3以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約0.1以上であり、さらに好ましくは約0.2以上であり、特に好ましくは約0.3以上である。エーテル化度は、NMRによって計算される。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているアミノ単糖残基の数は、1分子あたり、好ましくは1個以上であり、より好ましくは2個以上であり、さらに好ましくは3個以上である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているアミノ単糖残基の数は、これらに限定されず、例えば、1分子あたり、5個以上、10個以上、15個以上、20個以上、50個以上、100個以上などであってもよい。目的により適切に調整され得る。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているアミノ単糖残基の数の上限は、分岐状グルカン部分の非還元末端の数である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているアミノ単糖残基の数は、例えば、1分子あたり、約1000個以下、約800個以下、約700個以下、約600個以下、約500個以下、約400個以下、約300個以下、約200個以下、約100個以下、約50個以下などであり得る。
特定の実施形態では、本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているアミノ単糖残基の数は、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約10%以上であり、より好ましくは約20%以上であり、特に好ましくは約30%以上であり、例えば、約40%以上、約50%以上または約60%以上であり得る。特定の実施形態では、本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているアミノ単糖残基の数は、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約100%以下であり、より好ましくは約90%以下であり、特に好ましくは約80%以下であり、例えば、約70%以下、約60%以下または約50%以下であり得る。
(4.2)アミノ糖残基が結合した直鎖状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンは、直鎖状グルカン部分の非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合している。直鎖状グルカンは非還元末端を1つしか有さないので、アミノ単糖とグルカンとの反応時に反応液に添加するアミノ単糖の量が少なければ、本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンは、アミノ単糖残基を1つしか含まない。アミノ単糖とグルカンとの反応時に反応液に添加するアミノ単糖の量が多い場合、α−1,4結合で結合した2つ以上のアミノ単糖が直鎖状グルカンの非還元末端に結合する場合もある。本発明によれば、少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した直鎖状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した直鎖状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体においてアミノ糖含有グルカンまたはその修飾物に結合している物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンは、直鎖状グルカン部分の非還元末端に少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合している。直鎖状グルカンは非還元末端を1つしか有さないので、アミノ単糖とグルカンとの反応時に反応液に添加するアミノ単糖の量が少なければ、本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンは、アミノ単糖残基を1つしか含まない。アミノ単糖とグルカンとの反応時に反応液に添加するアミノ単糖の量が多い場合、α−1,4結合で結合した2つ以上のアミノ単糖が直鎖状グルカンの非還元末端に結合する場合もある。本発明によれば、少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した直鎖状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、少なくとも1つのアミノ単糖残基がα−1,4結合した直鎖状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体においてアミノ糖含有グルカンまたはその修飾物に結合している物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカン又はその修飾物に含まれる直鎖状グルカン部分は、好ましくはアミロース(例えば、天然のアミロースまたは酵素合成アミロース)及びそれらの誘導体からなる群より選択される。これらの直鎖状グルカン部分の好適な範囲については、「(1.1)グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの分子量は、例えば約1×103以上であり、好ましくは約1.5×103以上であり、より好ましくは約2×103以上であり、さらに好ましくは約3×103以上である。本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの分子量は、例えば約1×107以下であり、好ましくは約2×105以下であり、より好ましくは約1.5×105以下であり、さらに好ましくは約1×105以下である。
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、例えば約1×103以上であり、好ましくは約1.5×103以上であり、より好ましくは約2×103以上であり、さらに好ましくは約3×103以上である。本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、例えば約1×107以下であり、好ましくは約2×105以下であり、より好ましくは約1.5×105以下であり、さらに好ましくは約1×105以下である。
本発明の結合体においては、上記のような好適な分子量のアミノ糖含有直鎖状グルカンまたはその修飾物に対して他の物質(例えば、標的性分子、薬効成分など)が結合していることが好ましい。
本発明においては、アミノ糖含有直鎖状グルカンの修飾物が好ましい。修飾は、アシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約0.1以上であり、さらに好ましくは約0.2以上であり、特に好ましくは約0.3以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約0.1以上であり、さらに好ましくは約0.2以上であり、特に好ましくは約0.3以上である。エーテル化度は、NMRによって計算される。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカンの例は、例えば以下の式1の構造によって示され得る:
ここでnは1以上の整数である。nは好ましくは約8以上であり、より好ましくは約9以上であり、さらに好ましくは約10以上である。nは好ましくは約1200以下であり、より好ましくは約900以下であり、さらに好ましくは約600以下である。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカンおよびその還元末端修飾物の例は、例えば以下の式2によって示され得る:
ここでnは1以上の整数である。nは好ましくは約8以上であり、より好ましくは約9以上であり、さらに好ましくは約10以上である。nは好ましくは約1200以下であり、より好ましくは約900以下であり、さらに好ましくは約600以下である。Xは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Xは、好ましくは、水素、グルコサミン、N−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。Xが水素の場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンであり、Xが水素以外の物質である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物である。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカン、グルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物およびその還元末端修飾物の例は、例えば以下の式3によって示され得る:
ここでnは1以上の整数である。nは好ましくは約8以上であり、より好ましくは約9以上であり、さらに好ましくは約10以上である。nは好ましくは約1200以下であり、より好ましくは約900以下であり、さらに好ましくは約600以下である。Xは、好ましくは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Xは、より好ましくは、水素、グルコサミン、N−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。ここで、Rは、好ましくは、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群より独立して選択される。Xおよび全てのRが水素の場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンであり;Xが水素であってRがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも1つのRが水素以外の基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり;Xが水素以外の物質であって全てのRが水素である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり;Xが水素以外の物質であってRがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも1つのRが水素以外の基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物である。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカン、グルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物およびそれらのアミノ基修飾物の例は、例えば以下の式4によって示され得る:
ここでnは1以上の整数である。nは好ましくは約8以上であり、より好ましくは約9以上であり、さらに好ましくは約10以上である。nは好ましくは約1200以下であり、より好ましくは約900以下であり、さらに好ましくは約600以下である。Xは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Xは、好ましくは、水素、グルコサミン、N−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。ここで、Rは、好ましくは、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群より独立して選択される。ここで、Yは、好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択される。Xおよび全てのRが水素であってYがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンであり;Xおよび全てのRが水素であってYがアミノ基以外の基(すなわち、アニオン置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基またはスクシンイミド基含有置換基)である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンのアミノ基修飾物であり;Xが水素であってRがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも1つのRが水素以外の基であってYがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり;Xが水素であってRがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも1つのRが水素以外の基であってYがアミノ基以外の基(すなわち、カチオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基またはスクシンイミド基含有置換基)である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンの修飾物の水酸基修飾物のアミノ基修飾物であり;Xが水素以外の物質であって全てのRが水素であってYがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり;Xが水素以外の物質であって全てのRが水素であってYがアミノ基以外の基(すなわち、アニオン性置換基、疎水性置換基またはマレイミド基含有置換基)である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンアミノ基修飾物の還元末端修飾物であり;Xが水素以外の物質であってRがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも1つのRが水素以外の基であってYがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物であり;Xが水素以外の物質であってRが独立して水素または他の基であるがただし少なくとも1つのRが水素以外の基であってYがアミノ基以外の基(すなわち、アニオン性置換基、疎水性置換基またはマレイミド基含有置換基)である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物のアミノ基修飾物である。
本発明のグルコサミン含有グルカンの例は、例えば以下の式5によって示され得る:
ここでmは1以上の整数である。mは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、mは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。R1は独立して、H、式Aの構造を有するグルカン鎖または式Bの構造を有するグルカン鎖である。全てのR1がHの場合、式5に示されるグルカンは直鎖状グルカンである。少なくとも1つのR1が式Aまたは式Bの構造を有する場合、式5に示されるグルカンは分岐状グルカンである。
式Aにおいて、kは1以上の整数である。kは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、kは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式Aにおいて、R2はそれぞれ独立して、H、式Aの構造を有するグルカン鎖または式Bの構造を有するグルカン鎖である。
式Bにおいて、sは1以上の整数である。sは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、sは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式Bにおいて、R3は独立して、H、式Aの構造を有するグルカン鎖または式Bの構造を有するグルカン鎖である。
上記で説明したように、式5において、R1は、式Aの構造を有する基のR2または式Bの構造を有する基のR3の位置において何度か式Aの構造を有する基または式Bの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式Aと式Bで置換された回数の合計は、式5で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは1以上であり、より好ましくは2以上であり、さらに好ましくは3以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約5×103以下であり、より好ましくは約2×103以下であり、さらに好ましくは約1×103以下である。
本発明のグルコサミン含有グルカン又はグルコサミン含有グルカン水酸基修飾物の例は、例えば以下の式6によって示され得る:
ここでmは1以上の整数である。mは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、mは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。R1は独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式6Aの構造を有するグルカン鎖または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式6Aにおいて、kは1以上の整数である。kは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、kは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式6Aにおいて、R2はそれぞれ独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式6Aの構造を有するグルカン鎖または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式6Bにおいて、sは1以上の整数である。sは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、sは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式6Bにおいて、R3は独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基、式6Aの構造を有するグルカン鎖または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式6、式6Aおよび式6Bにおいて、R4は、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基からなる群から独立して選択される。
本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物およびそれらの還元末端修飾物の例は、例えば以下の式7によって示され得る:
ここでmは1以上の整数である。mは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、mは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。R1は独立して、H、式6Aの構造を有するグルカン鎖または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。式6Aおよび式6Bについては、上記式6についての定義と同様である。
式7、式6Aおよび式6Bにおいて、R4は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式7において、Xは、好ましくは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミノ基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される。Xは、より好ましくは、水素、グルコサミン、N−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。
式7において、Xは、好ましくは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミノ基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される。Xは、より好ましくは、水素、グルコサミン、N−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。
本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物の例は、例えば以下の式8によって示され得る:
ここでmは1以上の整数である。mは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、mは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。R1は独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式6Aの構造を有するグルカン鎖、式8Aの構造を有するグルカン鎖、または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式6Aにおいて、kは1以上の整数である。kは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、kは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式6Aにおいて、R2はそれぞれ独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式6Aの構造を有するグルカン鎖、式8Aの構造を有するグルカン鎖、または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式8Aにおいて、pは1以上の整数である。pは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、pは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式8Aにおいて、R5は独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式6Aの構造を有するグルカン鎖、式8Aの構造を有するグルカン鎖、または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式6Bにおいて、sは1以上の整数である。sは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、sは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式6Bにおいて、R3はそれぞれ独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式6Aの構造を有するグルカン鎖、式8Aの構造を有するグルカン鎖、または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式8、式6A、式8A、および式6Bにおいて、R4は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式8において、Xは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択され、
式8において、Yは、アミノ基または薬効成分との結合のために導入される置換基であり、好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択され、そして式8Aにおいて、Yは、薬効成分との結合のために導入される置換基であり、好ましくは、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択され、Yは、アミノ基修飾試薬との反応により得られ、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する。
式8において、Xは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択され、
式8において、Yは、アミノ基または薬効成分との結合のために導入される置換基であり、好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択され、そして式8Aにおいて、Yは、薬効成分との結合のために導入される置換基であり、好ましくは、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択され、Yは、アミノ基修飾試薬との反応により得られ、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する。
上記で説明したように、式8において、R1は、式6Aの構造を有する基のR2、または式6Bの構造を有する基のR3または式8Aの構造を有する基のR5の位置において何度か式6Aの構造を有する基または式6Bの構造を有する基または式8Aの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式6Aの基、式6Bの基または式8Aの基で置換された回数の合計は、式8で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約2以上であり、より好ましくは約5以上であり、さらに好ましくは約10以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約5000以下であり、より好ましくは約3000以下であり、さらに好ましくは約2000以下である。
特定の実施形態の本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物は、例えば以下の式9の構造を有し得る:
ここでqは0または1以上の整数である。1つの実施形態では、qは例えば、0、1、2、3、4、または5であり得る。qは好ましくは0、1または2であり、より好ましくは0または1である。rは1以上の整数である。rは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、rは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。R1は独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式9Aの構造を有するグルカン鎖、式8Aの構造を有するグルカン鎖、または式6Bの構造を有するグルカン鎖である。
式9Aにおいて、tは0または1以上の整数である。1つの実施形態では、tは例えば、0、1、2、3、4、または5であり得る。tは好ましくは0、1または2であり、より好ましくは0または1である。uは1以上の整数である。uは好ましくは8以上であり、より好ましくは9以上であり、さらに好ましくは10以上であり、uは好ましくは約1×104以下であり、より好ましくは約1000以下であり、さらに好ましくは約700以下である。式9Aにおいて、R6はそれぞれ独立して、H、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基または式9Aの構造を有するグルカン鎖である。
式9において、Xは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される。
式9及び式9Aにおいて、R4は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式9及び式9Aにおいて、Yは、OH、NH2または薬効成分との結合のために導入される置換基であるが、但し少なくとも1つのYがNH2または薬効成分との結合のために導入される置換基である。Yは好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択される。Yは、アミノ基修飾試薬との反応により得られ、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する。
式9及び式9Aにおいて、Yは、OH、NH2または薬効成分との結合のために導入される置換基であるが、但し少なくとも1つのYがNH2または薬効成分との結合のために導入される置換基である。Yは好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択される。Yは、アミノ基修飾試薬との反応により得られ、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも1つのカルボキシル基および少なくとも1つの別の官能基を有する。
上記で説明したように、式9において、R1は、式9Aの構造を有する基のR6の位置において何度か式9Aの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式9Aの基で置換された回数の合計は、式9で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約2以上であり、より好ましくは約5以上であり、さらに好ましくは約10以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約5000以下であり、より好ましくは約3000以下であり、さらに好ましくは約2000以下である。
本発明のグルコサミン含有グルカンの修飾例と修飾の目的を以下の表1にまとめる。表中の構造は一例である。
表1では、非還元末端に1つのグルコサミン残基が結合した場合を例示している。本明細書中の他の箇所でも説明したとおり、2個以上のグルコサミン残基が1,4−結合したオリゴグルコサミン残基が非還元末端に結合してもよい。また、グルコサミン残基の4位にグルコース残基、マンノース残基、ガラクトース残基、またはそれらから構成されたオリゴ糖残基などが結合してもよい。
1つの実施形態では、本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物またはそれらの非還元末端修飾物を含む、医薬品結合用組成物が提供される。本発明の医薬品結合用組成物中では、これらの物質の純度が非常に高く、これらの物質の合成に使用された物質をほとんど含まない。例えば、本発明の医薬品結合用組成物中のグルコサミン−1−リン酸の含有量は約10重量%以下であり、より好ましくは約1重量%以下であり、さらに好ましくは約0.1重量%以下である。他の合成材料についても同様に、それぞれの含有量が約10重量%以下であることが好ましく約1重量%以下であることがより好ましく、約0.1重量%以下であることが最も好ましい。
(医薬の製造)
本発明のグルコサミン含有分岐グルカン、水酸基修飾物、還元末端修飾物、アミノ基修飾物または非還元末端修飾物が薬物を含まない場合、これらはDDSのキャリアとして好適に利用され得る。例えば、本発明のグルコサミン含有分岐グルカン、水酸基修飾物、還元末端修飾物およびアミノ基修飾物(これらをまとめて本発明のキャリアという)と負に荷電した薬物とを水溶液中で混合することにより、本発明のキャリアと負に荷電した薬物とが静電的に結合して複合体を形成する。この複合体は、分子量が適切に調節された医薬として利用され得る。この複合体は、キャリアと負に荷電した薬物との2つの成分から構成されるため、「二成分複合体」ともいう。本明細書中で使用される場合、用語「二成分複合体」とは、広義には、第一の物質または因子と、この物質または因子に特異的に相互作用する第二の物質もしくは因子との複合体をいう。
本発明のグルコサミン含有分岐グルカン、水酸基修飾物、還元末端修飾物、アミノ基修飾物または非還元末端修飾物が薬物を含まない場合、これらはDDSのキャリアとして好適に利用され得る。例えば、本発明のグルコサミン含有分岐グルカン、水酸基修飾物、還元末端修飾物およびアミノ基修飾物(これらをまとめて本発明のキャリアという)と負に荷電した薬物とを水溶液中で混合することにより、本発明のキャリアと負に荷電した薬物とが静電的に結合して複合体を形成する。この複合体は、分子量が適切に調節された医薬として利用され得る。この複合体は、キャリアと負に荷電した薬物との2つの成分から構成されるため、「二成分複合体」ともいう。本明細書中で使用される場合、用語「二成分複合体」とは、広義には、第一の物質または因子と、この物質または因子に特異的に相互作用する第二の物質もしくは因子との複合体をいう。
本発明の結合体において結合物質が薬物である場合、本発明の結合体は医薬として好適に使用され得る。
(アミノ糖含有グルカン、その修飾物又はそれらの結合体と核酸分子との複合体)
本発明のアミノ糖含有グルカンは、溶液中で核酸分子(ポリヌクレオチド)と複合体を形成する。この複合体中でのアミノ糖含有グルカンと核酸分子との結合は適度に強く、またアミノ糖の導入割合を制御することによってその結合の強さを調節し得るため、核酸分子を細胞中に導入するために適切に使用され得る。好ましくは、本発明の複合体は、目的の細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、本発明のアミノ糖含有分岐グルカンとから形成された複合体である。より好ましくは、本発明の複合体は、目的の細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンとから形成された複合体である。この遺伝子は、目的の細胞内の適切な場所で(例えば、核内、ミトコンドリア内、細胞質内など)に導入されて発現されることが意図される遺伝子であり得る。この核酸分子は、好ましくはDNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択され得る。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、溶液中で核酸分子(ポリヌクレオチド)と複合体を形成する。この複合体中でのアミノ糖含有グルカンと核酸分子との結合は適度に強く、またアミノ糖の導入割合を制御することによってその結合の強さを調節し得るため、核酸分子を細胞中に導入するために適切に使用され得る。好ましくは、本発明の複合体は、目的の細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、本発明のアミノ糖含有分岐グルカンとから形成された複合体である。より好ましくは、本発明の複合体は、目的の細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンとから形成された複合体である。この遺伝子は、目的の細胞内の適切な場所で(例えば、核内、ミトコンドリア内、細胞質内など)に導入されて発現されることが意図される遺伝子であり得る。この核酸分子は、好ましくはDNA、RNA、siRNA、miRNAおよびRNAアプタマーからなる群より選択され得る。
本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体には、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質が非共有結合的にさらに結合されて、さらなる複合体が形成され得る。
従って、特定の実施形態では、本発明の複合体は、本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体である。このカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびDEAE−デキストランからなる群より選択される少なくとも1種類のカチオン性ポリマーを含み得る。この複合体は、キャリアと核酸分子とカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質との3つの成分から構成されるため、「三成分複合体」ともいう。
本明細書において使用される場合、用語「三成分複合体」とは、広義には、第一の物質または因子と、この物質もしくは因子に特異的に相互作用する第二の物質もしくは因子と、これら第一の物質もしくは因子または第二の物質もしくは因子のいずれかに対して特異的に相互作用する第三の物質もしくは因子との複合体をいう。このような三成分複合体としては、本発明のキャリアと、負に荷電した薬物(例えば、核酸分子)と、正に荷電した物質(例えば、ポリカチオンポリマー)との複合体が挙げられるが、これに限定されない。
(遺伝子送達方法)
本発明の複合体は、遺伝子送達のために有用に使用され得る。本発明の核酸分子送達方法は、本発明の上記アミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体、またはアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体を細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法である。複合体と細胞とは、インビトロでまたはインビボで接触させられるが、好ましくはインビトロで接触させられる。
本発明の複合体は、遺伝子送達のために有用に使用され得る。本発明の核酸分子送達方法は、本発明の上記アミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体、またはアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体を細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法である。複合体と細胞とは、インビトロでまたはインビボで接触させられるが、好ましくはインビトロで接触させられる。
本明細書中で使用される「接触(させる)」とは、細胞を、直接的または間接的のいずれかで、本発明の複合体に対して物理的に近接させることを意味する。複合体は、緩衝液、塩、溶液などの中に存在し得る。インビトロでの接触は、複合体を含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ(例えば、遺伝子チップ)などの中に細胞を置くことにより行われ得る。
本明細書において「複合体」(complex)とは、糖、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、低分子などの分子が複数種非共有連結してできた分子をいう。そのような複合体の例としては、例えば、アミノ糖含有グルカンとポリヌクレオチドとの複合体、アミノ糖含有グルカンとタンパク質との複合体、アミノ糖含有グルカンと核酸分子とカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質との複合体などが挙げられるがそれらに限定されない。
細胞の内部へのポリヌクレオチドのインビトロおよびインビボ送達(トランスフェクション)は、三成分複合体を、トランスフェクトされるべき細胞と接触させることによって行なうことができる。好ましくは、細胞は哺乳類細胞である。インビトロでの三成分複合体と細胞との接触は、例えば以下に記載する限定ではない実施例で説明するように、当業者に知られる様々な方法で行なうことができる。インビボでの三成分複合体と細胞との接触は、好ましくは、複合体を動物(好ましくは哺乳動物)の体内に例えば全身投与または局所投与などで導入することによって行なわれ得る。好ましくは、投与は、特定ポリヌクレオチドによるトランスフェクションを必要とする細胞を持っている哺乳動物(例えばヒト)に、当該ポリヌクレオチドを含む三成分複合体を、その細胞に望ましい量のポリヌクレオチドを送達するのに有効な量で投与することによって行なわれる。そのような所望のポリヌクレオチドを送達するのに有効な三成分複合体の量は、日常的なインビトロ実験によって、および/または当業者に知られる他の方法、例えば臨床試験などによって決定することができる。
(治療方法)
本発明の複合体は、遺伝子治療、薬物治療などに有用に使用され得る。遺伝子治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体、またはアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体を被験体に投与することを包含し、ここで、該核酸分子は、治療用遺伝子を含む、方法である。薬物治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンと薬効成分との複合体を被験体に投与することを包含する。
本発明の複合体は、遺伝子治療、薬物治療などに有用に使用され得る。遺伝子治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体、またはアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体を被験体に投与することを包含し、ここで、該核酸分子は、治療用遺伝子を含む、方法である。薬物治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンと薬効成分との複合体を被験体に投与することを包含する。
目的の疾患の治療に適切な治療用タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸分子もまた、従来の遺伝子工学技術を用いて生産することができる。核酸分子は発現ベクターまたはプラスミドであってよい。発現ベクター、プラスミドおよびそれらに含まれるエレメントについては一般説明を参照のこと。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、実施例に限定されるものではない。実施例において使用したAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼは、以下の製造例1によって調製したAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼである。
(製造例1:Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼの調製)
下記の方法によりAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
下記の方法によりAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
(A)Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の作製
Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列;米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)のGenBank塩基配列データベースのACCESSION番号AE000657の491380−493458番目までの塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列)をコードする塩基配列(GenBank塩基配列データベースのACCESSION番号AE000657の491380−493458番目までの塩基配列)を有する核酸(「α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子」ともいう)を、当業者に周知の方法により、化学的に合成した。このα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の翻訳開始コドン上流にはNdeIサイトを設けた。また、翻訳停止コドン下流にはBamHIサイトを設け、この合成遺伝子をNdeIおよびBamHIで切断し、NdeIおよびBamHIであらかじめ切断したプラスミドpET11c(Novagen社製)に挿入し、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子をもったプラスミドpET−AqGPを作製した。
Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列;米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)のGenBank塩基配列データベースのACCESSION番号AE000657の491380−493458番目までの塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列)をコードする塩基配列(GenBank塩基配列データベースのACCESSION番号AE000657の491380−493458番目までの塩基配列)を有する核酸(「α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子」ともいう)を、当業者に周知の方法により、化学的に合成した。このα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の翻訳開始コドン上流にはNdeIサイトを設けた。また、翻訳停止コドン下流にはBamHIサイトを設け、この合成遺伝子をNdeIおよびBamHIで切断し、NdeIおよびBamHIであらかじめ切断したプラスミドpET11c(Novagen社製)に挿入し、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子をもったプラスミドpET−AqGPを作製した。
(B)Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の大腸菌における発現
このプラスミドpET−AqGPで、大腸菌BL21(DE3)を常法に従って形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を含む液体を、アンピシリン含有LB寒天培地(100μg/mlアンピシリン、Difco製トリプトン1%、Difco製酵母エキス0.5%、NaCl0.5%、寒天1.5%、pH7.3)に独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、37℃で一晩培養した。このアンピシリン含有LB寒天培地で増殖した大腸菌は、導入したプラスミドを保有し、かつ発現することができる形質転換体である。このようにしてα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製できた。
このプラスミドpET−AqGPで、大腸菌BL21(DE3)を常法に従って形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を含む液体を、アンピシリン含有LB寒天培地(100μg/mlアンピシリン、Difco製トリプトン1%、Difco製酵母エキス0.5%、NaCl0.5%、寒天1.5%、pH7.3)に独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、37℃で一晩培養した。このアンピシリン含有LB寒天培地で増殖した大腸菌は、導入したプラスミドを保有し、かつ発現することができる形質転換体である。このようにしてα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製できた。
(C)Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ酵素の調製
上記(B)で作製した、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を、LB培地(50μg/mlアンピシリン、Difco製トリプトン1%、Difco製酵母エキス0.5%、NaCl、0.5%、pH 7.3)に植菌し、37℃で5時間培養した。次いで、最終濃度が0.1mM IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)および1mM塩酸ピリドキシンとなるようにこの培養液にIPTGおよび塩酸ピリドキシンを加え、さらに37℃で24時間培養した。次いで、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、20mMクエン酸緩衝液(pH6.7)で培地成分を洗浄し、除去した。洗浄後の菌体を20mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕し、遠心分離し、その上清を菌体抽出液とした。得られた菌体抽出液を、60℃30分間加熱した。次いで、この菌体抽出液を予め平衡化されたQ−SepharoseFFカラムにロードし、20mMクエン酸緩衝液(pH 6.7)中、0.1Mから0.3MのNaClの濃度勾配で溶出し、GP精製酵素含有活性画分を回収した。
上記(B)で作製した、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を、LB培地(50μg/mlアンピシリン、Difco製トリプトン1%、Difco製酵母エキス0.5%、NaCl、0.5%、pH 7.3)に植菌し、37℃で5時間培養した。次いで、最終濃度が0.1mM IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)および1mM塩酸ピリドキシンとなるようにこの培養液にIPTGおよび塩酸ピリドキシンを加え、さらに37℃で24時間培養した。次いで、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、20mMクエン酸緩衝液(pH6.7)で培地成分を洗浄し、除去した。洗浄後の菌体を20mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕し、遠心分離し、その上清を菌体抽出液とした。得られた菌体抽出液を、60℃30分間加熱した。次いで、この菌体抽出液を予め平衡化されたQ−SepharoseFFカラムにロードし、20mMクエン酸緩衝液(pH 6.7)中、0.1Mから0.3MのNaClの濃度勾配で溶出し、GP精製酵素含有活性画分を回収した。
得られた精製酵素含有活性画分を約1μg使用して、ネイティブPAGE(Native polyacrylamide gel electrophoresis)を行った。その結果、α−グルカンホスホリラーゼを発現する大腸菌から得られた画分では、分子量約150kDaの位置に単一のバンドが認められ、他の場所にはバンドが見られなかった。Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼの分子量は、アミノ酸配列から計算して約75kDaであると推定されるので、このネイティブPAGEの結果、このα−グルカンホスホリラーゼは、ダイマー構造をとっていると考えられる。このようにして、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼが均質に精製されたことが示された。
(製造例2:分岐グルカン(B)の製造)
50gのワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業(株)製)を1000mlの10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し、約100℃に加熱することによりワキシーコーンスターチを糊化させた。約70℃まで冷却した澱粉糊液に特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイムを200,000単位添加して反応液を調製した後、70℃で16時間反応させた。反応液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。次に、濾液をゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA purifer)システム(カラム:GEヘルスケア製 HiPrepTM 26/10 Desalting)を用い脱塩し、低分子量多糖をした。1000mlの濾液を7.5mlのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速10ml/分の2.7分から3.7分までの溶出画分を分取した。1000mlの濾液から得られた溶出画分を合わせ、孔径0.2μmの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン(B)の粉末約35gを得た。分岐グルカンの重量平均分子量は多角度レーザー光散乱光度計(ワイアットテクノロジー社製、DAWN DSP)と示差屈折計(昭和電工(株)製、Shodex RI−71)を備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システム(カラム:昭和電工(株)製、OHPAK SB−806MHQ)を用いて調べた。分岐グルカンの粉末20mgを10mlの100mM硝酸ナトリウム水溶液に溶解し、孔径0.45μmの膜でろ過して濾液を得た。得られた濾液のうちの100μlを上記HPLCシステムに注入した。分岐グルカン(B)の重量平均分子量は約140Kであることが示された。
50gのワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業(株)製)を1000mlの10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し、約100℃に加熱することによりワキシーコーンスターチを糊化させた。約70℃まで冷却した澱粉糊液に特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイムを200,000単位添加して反応液を調製した後、70℃で16時間反応させた。反応液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。次に、濾液をゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA purifer)システム(カラム:GEヘルスケア製 HiPrepTM 26/10 Desalting)を用い脱塩し、低分子量多糖をした。1000mlの濾液を7.5mlのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速10ml/分の2.7分から3.7分までの溶出画分を分取した。1000mlの濾液から得られた溶出画分を合わせ、孔径0.2μmの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン(B)の粉末約35gを得た。分岐グルカンの重量平均分子量は多角度レーザー光散乱光度計(ワイアットテクノロジー社製、DAWN DSP)と示差屈折計(昭和電工(株)製、Shodex RI−71)を備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システム(カラム:昭和電工(株)製、OHPAK SB−806MHQ)を用いて調べた。分岐グルカンの粉末20mgを10mlの100mM硝酸ナトリウム水溶液に溶解し、孔径0.45μmの膜でろ過して濾液を得た。得られた濾液のうちの100μlを上記HPLCシステムに注入した。分岐グルカン(B)の重量平均分子量は約140Kであることが示された。
上述の分岐グルカンにイソアミラーゼを作用させ、還元力を改変パークジョンソン法(Hizukuriら、Starch,Vol.35,pp.348−350(1983))により調べたところ、分岐の単位鎖長は平均約15、分岐数は平均約60であることが示された。
(製造例3:分岐グルカン(P)の製造)
ショ糖150gを1000mlの蒸留水に溶かし孔径0.2μmの膜でろ過することによりショ糖水溶液を調製した。このショ糖水溶液800ml、5%分岐グルカン(B)水溶液(上述の分岐グルカン製造例2で製造した分岐グルカン(B)5%水溶液を孔径0.2μmの膜でろ過することにより調製した)20ml、1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)4ml、国際公開第WO02/097107号パンフレットの実施例2.5に記載されたとおりの方法で調製した組換えStreptococcus mutansスクロースホスホリラーゼ1,800U、本願製造例1で製造したα−グルカンホスホリラーゼ1,200U、および製造例2で使用した特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム600,000Uを混合し、蒸留水で液量を1000mlに調整した後、55℃で24時間反応させた。反応液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで20分間遠心分離し、得られた上清を孔径0.8μmの膜でろ過することにより、濾液を得た。さらに、得られた濾液をゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA purifer)システム(カラム:GEヘルスケア製 HiPrepTM 26/10 Desalting)を用いて脱塩し、低分子量多糖を除去した。1000mlの濾液を7.5mlのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速10ml/分で2.7分から3.7分までの溶出画分を分取した。1000mlの濾液から得られた溶出画分を合わせ、孔径0.2μmの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン(P)約40gを得た。分岐グルカンの製造例2と同様にグルカンの重量平均分子量を調べたところ、分岐グルカン(P)の重量平均分子量は約4,000K(重合度にして約25,000)であることが示された。また、製造例2と同様に還元力を測定した結果、得られた分岐グルカン(P)の分岐の単位鎖長は平均約15、分岐数は平均約1,600であることが示された。さらに分岐グルカン(P)の平均粒径を濃厚系粒径アナライザー(大塚電子製、FPAR‐1000)で測定したところ、平均粒径約37nmであった。
ショ糖150gを1000mlの蒸留水に溶かし孔径0.2μmの膜でろ過することによりショ糖水溶液を調製した。このショ糖水溶液800ml、5%分岐グルカン(B)水溶液(上述の分岐グルカン製造例2で製造した分岐グルカン(B)5%水溶液を孔径0.2μmの膜でろ過することにより調製した)20ml、1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)4ml、国際公開第WO02/097107号パンフレットの実施例2.5に記載されたとおりの方法で調製した組換えStreptococcus mutansスクロースホスホリラーゼ1,800U、本願製造例1で製造したα−グルカンホスホリラーゼ1,200U、および製造例2で使用した特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム600,000Uを混合し、蒸留水で液量を1000mlに調整した後、55℃で24時間反応させた。反応液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで20分間遠心分離し、得られた上清を孔径0.8μmの膜でろ過することにより、濾液を得た。さらに、得られた濾液をゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA purifer)システム(カラム:GEヘルスケア製 HiPrepTM 26/10 Desalting)を用いて脱塩し、低分子量多糖を除去した。1000mlの濾液を7.5mlのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速10ml/分で2.7分から3.7分までの溶出画分を分取した。1000mlの濾液から得られた溶出画分を合わせ、孔径0.2μmの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン(P)約40gを得た。分岐グルカンの製造例2と同様にグルカンの重量平均分子量を調べたところ、分岐グルカン(P)の重量平均分子量は約4,000K(重合度にして約25,000)であることが示された。また、製造例2と同様に還元力を測定した結果、得られた分岐グルカン(P)の分岐の単位鎖長は平均約15、分岐数は平均約1,600であることが示された。さらに分岐グルカン(P)の平均粒径を濃厚系粒径アナライザー(大塚電子製、FPAR‐1000)で測定したところ、平均粒径約37nmであった。
(製造例4:低分子量アミロペクチンの製造)
水中1%ワキシーコーンスターチ懸濁液100mlを超音波破砕機(Ultrasonic Homogenizer、UH−600S)で10分処理した後、10,000rpmで遠心分離し、上清の可溶性画分を回収した。得られた可溶性画分を脱塩カラム(HiPrep Desalting Column,GE社)を用いて部分精製してデンプン画分を得て、このデンプン画分を凍結乾燥することにより粉末を得た。得られた粉末を角度光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフィーで分析したところ、重量平均分子量約6,100kDaの低分子量アミロペクチンが得られたことが確認された。また、製造例2と同様に還元力を測定した結果、得られた低分子量アミロペクチンの分岐の単位鎖長は平均約22、分岐数は平均約1,600であることが示された。
水中1%ワキシーコーンスターチ懸濁液100mlを超音波破砕機(Ultrasonic Homogenizer、UH−600S)で10分処理した後、10,000rpmで遠心分離し、上清の可溶性画分を回収した。得られた可溶性画分を脱塩カラム(HiPrep Desalting Column,GE社)を用いて部分精製してデンプン画分を得て、このデンプン画分を凍結乾燥することにより粉末を得た。得られた粉末を角度光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフィーで分析したところ、重量平均分子量約6,100kDaの低分子量アミロペクチンが得られたことが確認された。また、製造例2と同様に還元力を測定した結果、得られた低分子量アミロペクチンの分岐の単位鎖長は平均約22、分岐数は平均約1,600であることが示された。
(製造例5:アセチル化分岐グルカンの製造)
製造例2で得られた分岐グルカン(B)をジメチルスルホキシドに1.8%(w/v)となるように溶解し、0.2%炭酸ナトリウム、0.055M 酢酸ビニルを添加して、25℃で1時間撹拌を行った。得られた溶液を超純水で2倍に希釈し、ゲルろ過カラム(PD−10)を用いてグルカン画分を回収することにより、アセチル化分岐グルカンを得た。アセチル化度の確認のため、回収画分のうちの300μlに5N 水酸化ナトリウム水溶液を200μl加え、55℃で30分の加熱を行い、脱アセチル化反応を行った。この反応液に1N トリス緩衝液(pH7.0)を300μl加え、さらに5N塩酸を200μl加え中和をした。中和後の溶液をフェノール硫酸法でグルコース定量した。また、遊離酢酸定量キットにて中和後の溶液中の遊離酢酸の定量を行った。これらの結果、アセチル化度が0.43のアセチル化分岐グルカンが得られたことが確認された。
製造例2で得られた分岐グルカン(B)をジメチルスルホキシドに1.8%(w/v)となるように溶解し、0.2%炭酸ナトリウム、0.055M 酢酸ビニルを添加して、25℃で1時間撹拌を行った。得られた溶液を超純水で2倍に希釈し、ゲルろ過カラム(PD−10)を用いてグルカン画分を回収することにより、アセチル化分岐グルカンを得た。アセチル化度の確認のため、回収画分のうちの300μlに5N 水酸化ナトリウム水溶液を200μl加え、55℃で30分の加熱を行い、脱アセチル化反応を行った。この反応液に1N トリス緩衝液(pH7.0)を300μl加え、さらに5N塩酸を200μl加え中和をした。中和後の溶液をフェノール硫酸法でグルコース定量した。また、遊離酢酸定量キットにて中和後の溶液中の遊離酢酸の定量を行った。これらの結果、アセチル化度が0.43のアセチル化分岐グルカンが得られたことが確認された。
(製造例6:組換え馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼの組換え生産)
特表2004−526463に示された下記の方法によりタイプL馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
特表2004−526463に示された下記の方法によりタイプL馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子(Nakanoら、Journal of Biochemistry 106:691−695(1989);配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸配列である配列番号3)の上流および下流にBamHIサイトを設け、この遺伝子をBamHIで切断し、BamHIであらかじめ切断したpET3d(STRATAGENE社製)に組み込み、プラスミドpET−PGP113を得た。このプラスミドでは、α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌TG−1(STRATAGENE社製)に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むLB培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス(ともにDifco社製)、1%塩化ナトリウム、1.5%寒天))を含むプレートにプレーティングして、37℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がα−グルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むLB培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス(ともにDifco社製)、1%塩化ナトリウム)1リットルに接種し、120rpmで振盪させながら37℃で3時間振盪培養した。その後、IPTGを0.1mM、ピリドキシンを1mMになるようにそれぞれこの培地に添加し、22℃でさらに20時間振盪培養した。次いで、この培養液を5,000rpmにて5分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、50mlの0.05%のTritonX−100を含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液50mlを得た。この破砕液中には、4.7U/mgのα−グルカンホスホリラーゼが含まれていた。
この菌体破砕液を、55℃で30分間加熱する。加熱後、8,500rpmにて20分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得る。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Q−Sepharoseに流してα−グルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、200mM塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を300mM塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換え馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。
(製造例7:Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼの調製)
Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の代わりに、Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列(配列番号6)をコードする塩基配列(GenBank塩基配列データベースのACCESSION番号AJ318499に記載される1〜2151番目までの塩基配列、配列番号5)を有する核酸を使用して製造例1と同様にしてα−グルカンホスホリラーゼ液を得た。
Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の代わりに、Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列(配列番号6)をコードする塩基配列(GenBank塩基配列データベースのACCESSION番号AJ318499に記載される1〜2151番目までの塩基配列、配列番号5)を有する核酸を使用して製造例1と同様にしてα−グルカンホスホリラーゼ液を得た。
(実施例1:グルコサミン含有分岐グルカンの製造)
50mMグルコサミン−1−リン酸、100mM クエン酸緩衝液、製造例1で得られたAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)および製造例2で得られた分岐グルカン(B)を含む反応液を55℃で6時間保温し、酵素反応させることにより、酵素反応産物を得た。酵素反応産物の構造を特定するために、製造例2で得られた分岐グルカンの酵素処理物および本実施例1で得られた酵素反応産物の酵素処理物をDIONEX社製HPAEC−PAD装置で分析した結果を図2に示す。図2Aは、全ての分岐を切断するに十分な量(すなわち、過剰量)のイソアミラーゼで分岐グルカンの分岐部分を分解した後に得られた分解産物をHPAEC−PAD装置により分析することによって得られた結果であり、分岐グルカンのグルカン直鎖部分の長さの分布を示す。図2A中のピーク上の数字は、6はマルトヘキサオース、7はマルトヘプタオースを示す。ピーク上に黒丸で示したピークは、左から右に向かってそれぞれグルコース重合度8から14までのマルトオリゴ糖である。図2Bは全ての分岐を切断するに十分な量(すなわち、過剰量)のイソアミラーゼで分岐グルカンの分岐部分を分解した後に過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼ(2000Unit/ml)を用いてさらに分解し、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。α−グルコシダーゼはグルカンを非還元末端からグルコース単位で分解する酵素であるため、分岐グルカンは完全に分解されグルコースのピーク(図2B中Glucoseで示す)が検出された。図2Cは本実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解した後に得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。図2C中の黒丸で示したピークは図2A中の対応する位置の黒丸で示したピークと同一の溶出時間に検出されたピークであるが、それらとは間隔の異なる×で示したピークが検出された。図2Dは本実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解し、過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼでさらに分解した後に、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。黒丸で示されたピーク群は分解されて消失し、その結果、グルコースのピーク(図2D中Glucoseで示す)が出現したが、×で示したピークは消失しなかった。すなわち、×で示したピークに示される部分分解物は、α−グルコシダーゼに対し分解抵抗性を示した。従って、本実施例1において非還元末端にグルコサミン残基が結合した分岐グルカンが得られたことが確認された。図2Eは本実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解し、さらに過剰量のα−グルコシダーゼとα−アミラーゼで同時に分解した後、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。分岐グルカンをα−アミラーゼとα−グルコシダーゼで分解した場合にはα−アミラーゼはα−1,4結合をランダムに加水分解してグルコースとマルトースに分解し、α−グルコシダーゼはマルトースをグルコースにまで分解するため、α−グルコシダーゼとα−グルコシダーゼを分岐グルカンに同時に反応させると分岐グルカンは完全にグルコースまで分解されるが、グルコサミン含有分岐グルカンの場合にはα−アミラーゼとα−グルコシダーゼはグルコサミン−グルコース間の結合を切断することができないために、星印で示したピークとして検出された。このようにして、多数の非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基が結合した構造を有する、本発明のグルコサミン含有分岐グルカン(1つの非還元末端に結合したグルコサミン残基の数を1とした例示的な構造を図1に示す)が製造できたことが確認された。
50mMグルコサミン−1−リン酸、100mM クエン酸緩衝液、製造例1で得られたAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)および製造例2で得られた分岐グルカン(B)を含む反応液を55℃で6時間保温し、酵素反応させることにより、酵素反応産物を得た。酵素反応産物の構造を特定するために、製造例2で得られた分岐グルカンの酵素処理物および本実施例1で得られた酵素反応産物の酵素処理物をDIONEX社製HPAEC−PAD装置で分析した結果を図2に示す。図2Aは、全ての分岐を切断するに十分な量(すなわち、過剰量)のイソアミラーゼで分岐グルカンの分岐部分を分解した後に得られた分解産物をHPAEC−PAD装置により分析することによって得られた結果であり、分岐グルカンのグルカン直鎖部分の長さの分布を示す。図2A中のピーク上の数字は、6はマルトヘキサオース、7はマルトヘプタオースを示す。ピーク上に黒丸で示したピークは、左から右に向かってそれぞれグルコース重合度8から14までのマルトオリゴ糖である。図2Bは全ての分岐を切断するに十分な量(すなわち、過剰量)のイソアミラーゼで分岐グルカンの分岐部分を分解した後に過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼ(2000Unit/ml)を用いてさらに分解し、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。α−グルコシダーゼはグルカンを非還元末端からグルコース単位で分解する酵素であるため、分岐グルカンは完全に分解されグルコースのピーク(図2B中Glucoseで示す)が検出された。図2Cは本実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解した後に得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。図2C中の黒丸で示したピークは図2A中の対応する位置の黒丸で示したピークと同一の溶出時間に検出されたピークであるが、それらとは間隔の異なる×で示したピークが検出された。図2Dは本実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解し、過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼでさらに分解した後に、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。黒丸で示されたピーク群は分解されて消失し、その結果、グルコースのピーク(図2D中Glucoseで示す)が出現したが、×で示したピークは消失しなかった。すなわち、×で示したピークに示される部分分解物は、α−グルコシダーゼに対し分解抵抗性を示した。従って、本実施例1において非還元末端にグルコサミン残基が結合した分岐グルカンが得られたことが確認された。図2Eは本実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解し、さらに過剰量のα−グルコシダーゼとα−アミラーゼで同時に分解した後、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。分岐グルカンをα−アミラーゼとα−グルコシダーゼで分解した場合にはα−アミラーゼはα−1,4結合をランダムに加水分解してグルコースとマルトースに分解し、α−グルコシダーゼはマルトースをグルコースにまで分解するため、α−グルコシダーゼとα−グルコシダーゼを分岐グルカンに同時に反応させると分岐グルカンは完全にグルコースまで分解されるが、グルコサミン含有分岐グルカンの場合にはα−アミラーゼとα−グルコシダーゼはグルコサミン−グルコース間の結合を切断することができないために、星印で示したピークとして検出された。このようにして、多数の非還元末端にそれぞれ少なくとも1つのグルコサミン残基が結合した構造を有する、本発明のグルコサミン含有分岐グルカン(1つの非還元末端に結合したグルコサミン残基の数を1とした例示的な構造を図1に示す)が製造できたことが確認された。
分岐グルカンへのグルコサミン結合率は、反応液の反応液中の遊離の無機リン酸量を定量し、以下の式を用いて算出した:
グルコサミン結合率=(反応液中に生じた無機リン酸数/非還元末端数)×100(%)
(注:非還元末端数=分岐グルカンの分岐数+1)
無機リン酸量は、以下のようにして測定した。まず、試料(無機リン酸を含む水溶液)(200μl)に対し、800μlのモリブデン試薬(15mM モリブデン酸アンモニウム、100mM 酢酸亜鉛)を混合し、続いて200μlの568mMアスコルビン酸水溶液(pH5.0)を加えて攪拌し、反応系を得た。この反応系を、30℃で20分間保持した後、分光光度計を用いて850nmでの吸光度を測定した。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成した。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求めた。その結果、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて、分岐グルカン(B)に対して非還元末端あたり58%のグルコサミンを結合することができたことが確認された。
グルコサミン結合率=(反応液中に生じた無機リン酸数/非還元末端数)×100(%)
(注:非還元末端数=分岐グルカンの分岐数+1)
無機リン酸量は、以下のようにして測定した。まず、試料(無機リン酸を含む水溶液)(200μl)に対し、800μlのモリブデン試薬(15mM モリブデン酸アンモニウム、100mM 酢酸亜鉛)を混合し、続いて200μlの568mMアスコルビン酸水溶液(pH5.0)を加えて攪拌し、反応系を得た。この反応系を、30℃で20分間保持した後、分光光度計を用いて850nmでの吸光度を測定した。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成した。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求めた。その結果、Aquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて、分岐グルカン(B)に対して非還元末端あたり58%のグルコサミンを結合することができたことが確認された。
(実施例2:分岐グルカンを原料として使用したグルコサミン含有グルカンの製造)
製造例1で得られたAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)の代わりに、製造例6で得られた馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)または製造例7で得られたThermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を使用して、実施例1と同様に酵素反応させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造することができた。実施例1と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミン量をもとめた。その結果、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて、分岐グルカン(B)に対して、非還元末端あたり37%のグルコサミン残基を結合することができたことが確認された。
製造例1で得られたAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)の代わりに、製造例6で得られた馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)または製造例7で得られたThermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を使用して、実施例1と同様に酵素反応させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造することができた。実施例1と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミン量をもとめた。その結果、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて、分岐グルカン(B)に対して、非還元末端あたり37%のグルコサミン残基を結合することができたことが確認された。
(実施例3:グルコサミン結合比率の異なる各種グルコサミン含有分岐グルカン(BN)の製造)
製造例2で製造した分岐グルカン、グルコサミン−1−リン酸、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を含む反応液にAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を55℃で4時間または18時間作用させ、グルコサミン結合比率の異なる7種のグルコサミン含有分岐グルカン(BN1からBN7)を製造した。各種グルコサミン含有分岐グルカンの反応条件(分岐グルカン、グルコサミン−1−リン酸濃度および反応時間)、およびグルコサミン結合率を表2に示した。実施例1と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミン量をもとめた。
製造例2で製造した分岐グルカン、グルコサミン−1−リン酸、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を含む反応液にAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を55℃で4時間または18時間作用させ、グルコサミン結合比率の異なる7種のグルコサミン含有分岐グルカン(BN1からBN7)を製造した。各種グルコサミン含有分岐グルカンの反応条件(分岐グルカン、グルコサミン−1−リン酸濃度および反応時間)、およびグルコサミン結合率を表2に示した。実施例1と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミン量をもとめた。
表2に示したように、グルコサミン−1−リン酸の添加濃度を増加させることによりグルコサミン結合率は増加した。また、反応時間を延長することによりグルコサミン結合率は増加した。このように、分岐グルカンに対するグルコサミン−1−リン酸の添加割合と反応時間を変えることで、分岐グルカンの非還元末端への導入量を調節することができた。BN6およびBN7については結合率が100%を超えている。これは、1つの非還元末端に対してグルコサミン残基が2回以上結合し、結果として1つの非還元末端に対して重合度2以上のオリゴグルコサミン残基が結合したことを示す。すなわち、グルコサミン残基が非還元末端に均等に結合したと仮定すると、BN7のグルコサミン含有分岐グルカンにおいては、非還元末端のうち71%には重合度2のオリゴグルコサミン残基が結合しており、残りの29%にはグルコサミン残基が結合していることを示す。このように、非還元末端に1つのグルコサミン残基がα−1,4結合した後に、さらに別のグルコサミン残基がα−1,4結合できることが確認された。
(実施例4:グルコサミン結合比率の異なる各種グルコサミン含有分岐グルカンの製造)
製造例2で製造した分岐グルカン(B)、製造例3で製造した分岐グルカン(P)、製造例4で製造した低分子量アミロペクチン、または製造例5で製造したアセチル化分岐グルカンに対し、グルコサミン−1−リン酸を表3に示す濃度で添加し、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)とAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を加え、55℃で反応させた。反応時間は表3に示すとおりである。その結果、グルコサミン含有分岐グルカン(BN1からBN7、PN1からPN6、AN1、およびAcBN8)を作製することができた。実施例3と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、分岐グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミンの量を求めた。
製造例2で製造した分岐グルカン(B)、製造例3で製造した分岐グルカン(P)、製造例4で製造した低分子量アミロペクチン、または製造例5で製造したアセチル化分岐グルカンに対し、グルコサミン−1−リン酸を表3に示す濃度で添加し、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)とAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を加え、55℃で反応させた。反応時間は表3に示すとおりである。その結果、グルコサミン含有分岐グルカン(BN1からBN7、PN1からPN6、AN1、およびAcBN8)を作製することができた。実施例3と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、分岐グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミンの量を求めた。
表3に示したように、分岐グルカンに対するグルコサミン−1−リン酸の添加割合と反応時間を変えることで、分岐グルカンの非還元末端へのグルコサミン導入量を調節することができた。
(実施例5:グルコサミンとマンノースを結合した各種分岐グルカンの製造)
実施例4で製造したBN7、PN5、AN1の3種のグルコサミン含有分岐グルカン各5mMに対し、5mMのマンノース−1−リン酸、100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)、およびAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を加え、55℃で42時間反応した。その結果、グルコサミン含有分岐グルカンにマンノースを結合した、グルコサミン/マンノース含有分岐グルカンを作製することができた。実施例3と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有分岐グルカンの非還元末端に結合されたマンノース量を求めた。BN7、PN5、AN1に対してそれぞれ非還元末端数の13%、9%、18%のマンノースを導入することができた。この結果、非還元末端にグルコサミン残基とマンノース残基が結合した分岐グルカンを作製することができた。
実施例4で製造したBN7、PN5、AN1の3種のグルコサミン含有分岐グルカン各5mMに対し、5mMのマンノース−1−リン酸、100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)、およびAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を加え、55℃で42時間反応した。その結果、グルコサミン含有分岐グルカンにマンノースを結合した、グルコサミン/マンノース含有分岐グルカンを作製することができた。実施例3と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有分岐グルカンの非還元末端に結合されたマンノース量を求めた。BN7、PN5、AN1に対してそれぞれ非還元末端数の13%、9%、18%のマンノースを導入することができた。この結果、非還元末端にグルコサミン残基とマンノース残基が結合した分岐グルカンを作製することができた。
(実施例1〜5のまとめ)
実施例1〜5において原料として使用したグルカンおよびそれぞれの実施例において得られたグルコサミン含有分岐グルカンについて以下に示す。
実施例1〜5において原料として使用したグルカンおよびそれぞれの実施例において得られたグルコサミン含有分岐グルカンについて以下に示す。
(実施例6:タンパク質の高分子化)
0.2mgのアルブミン(ウシ血清由来)と実施例1で製造したグルコサミン含有分岐グルカン2mgを700μlの0.1M 2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸(2−[N−morpholino]ethane sulfonic acid;MES)緩衝液(pH 5.0)に溶解した。1mgの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を添加し、2時間室温で反応させた後、反応液を水で4分の1に希釈した後PD−10カラム(GE社製)を用いて脱塩した。得られた溶液をSuperose 6 10/300 GLカラム(サイズ分画用カラム、GE社製)を用いたFPLC分析によって分析した。溶離液(50mM リン酸緩衝液(pH7.0)、150mM 塩化ナトリウム)を用い、0.5ml/分で溶出し、生成物をUV(280nm)で検出した。グルコサミン含有グルカンとアルブミンを縮合反応したサンプルの生成物は溶出時間が早く、分子サイズが大きいことが示された。したがって、グルコサミン含有グルカンとタンパク質を脱水縮合し高分子化できることが示された。
0.2mgのアルブミン(ウシ血清由来)と実施例1で製造したグルコサミン含有分岐グルカン2mgを700μlの0.1M 2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸(2−[N−morpholino]ethane sulfonic acid;MES)緩衝液(pH 5.0)に溶解した。1mgの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を添加し、2時間室温で反応させた後、反応液を水で4分の1に希釈した後PD−10カラム(GE社製)を用いて脱塩した。得られた溶液をSuperose 6 10/300 GLカラム(サイズ分画用カラム、GE社製)を用いたFPLC分析によって分析した。溶離液(50mM リン酸緩衝液(pH7.0)、150mM 塩化ナトリウム)を用い、0.5ml/分で溶出し、生成物をUV(280nm)で検出した。グルコサミン含有グルカンとアルブミンを縮合反応したサンプルの生成物は溶出時間が早く、分子サイズが大きいことが示された。したがって、グルコサミン含有グルカンとタンパク質を脱水縮合し高分子化できることが示された。
(実施例7および比較例1:グルコサミン含有分岐グルカンと核酸との複合体形成)
ラムダDNA−HindIII断片0.5μgに対し、各種サンプルをそれぞれ加えて10μl中で5分間室温静置した後、1%アガロースゲル電気泳動を行った。使用したサンプルはそれぞれ以下の通りであった:サンプル1はイオン交換水であり(比較例1−1);サンプル2は製造例2で得られた分岐グルカン0.1mgであり(比較例1−2);サンプル3は製造例2で得られた分岐グルカン0.5mgであり(比較例1−3);サンプル4は実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカン0.1mgであり(実施例7−1);サンプル5は実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカン0.5mgであり(実施例7−2);サンプル6はサンプル4に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミンであり(比較例1−4);サンプル7はサンプル5に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミンであった(比較例1−5)。アガロースゲル電気泳動の結果を図3に示す。図3において、レーン1はサンプル1の結果であり、レーン2はサンプル2の結果であり、レーン3はサンプル3の結果であり、レーン4はサンプル4の結果であり、レーン5はサンプル5の結果であり、レーン6はサンプル6の結果であり、レーン7はサンプル7の結果である。サンプル1、2および3ではバンド(a)が検出されたが、グルコサミン含有分岐グルカンを添加したサンプル4および5ではDNAがアガロースゲル中を移動しなかった(b)。したがって、カチオン化グルコサミン含有グルカンはDNAとの複合体を形成できることがわかった。この結果は図3のレーン4および5から明らかである。一方、グルコサミンを用いた場合は、アガロースゲル電気泳動でDNAの移動度に変化は見られず、グルコサミンはDNAの荷電および分子量を変化させることはできないことが確認された。この結果は図3のレーン6および7から明らかである。
ラムダDNA−HindIII断片0.5μgに対し、各種サンプルをそれぞれ加えて10μl中で5分間室温静置した後、1%アガロースゲル電気泳動を行った。使用したサンプルはそれぞれ以下の通りであった:サンプル1はイオン交換水であり(比較例1−1);サンプル2は製造例2で得られた分岐グルカン0.1mgであり(比較例1−2);サンプル3は製造例2で得られた分岐グルカン0.5mgであり(比較例1−3);サンプル4は実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカン0.1mgであり(実施例7−1);サンプル5は実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカン0.5mgであり(実施例7−2);サンプル6はサンプル4に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミンであり(比較例1−4);サンプル7はサンプル5に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミンであった(比較例1−5)。アガロースゲル電気泳動の結果を図3に示す。図3において、レーン1はサンプル1の結果であり、レーン2はサンプル2の結果であり、レーン3はサンプル3の結果であり、レーン4はサンプル4の結果であり、レーン5はサンプル5の結果であり、レーン6はサンプル6の結果であり、レーン7はサンプル7の結果である。サンプル1、2および3ではバンド(a)が検出されたが、グルコサミン含有分岐グルカンを添加したサンプル4および5ではDNAがアガロースゲル中を移動しなかった(b)。したがって、カチオン化グルコサミン含有グルカンはDNAとの複合体を形成できることがわかった。この結果は図3のレーン4および5から明らかである。一方、グルコサミンを用いた場合は、アガロースゲル電気泳動でDNAの移動度に変化は見られず、グルコサミンはDNAの荷電および分子量を変化させることはできないことが確認された。この結果は図3のレーン6および7から明らかである。
(参考例8:直鎖状グルカンを原料として使用したグルコサミン含有グルカンの製造)
製造例2で得られた分岐グルカンの代わりに、直鎖状グルカン(重量平均分子量約5000)を使用して、実施例1と同様に酵素反応させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造した。実施例1と同様に分析したところ、得られたグルコサミン含有グルカンには、非還元末端に1つのグルコサミン残基が結合していることが確認された。
製造例2で得られた分岐グルカンの代わりに、直鎖状グルカン(重量平均分子量約5000)を使用して、実施例1と同様に酵素反応させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造した。実施例1と同様に分析したところ、得られたグルコサミン含有グルカンには、非還元末端に1つのグルコサミン残基が結合していることが確認された。
(参考例9:グルコサミン含有直鎖状グルカンによる核酸の安定化及び複合体形成)
実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンの代わりに参考例8で得られたグルコサミン含有直鎖状グルカン(重量平均分子量約5000)を使用したこと以外は実施例7に記載の方法と同じ処理を行ない、アガロースゲル電気泳動を行った。DNAの移動度に変化が見られ、分子量増大効果が確認できた。しかし、その分子量増大効果は、実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンと比較するとわずかであった。
実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンの代わりに参考例8で得られたグルコサミン含有直鎖状グルカン(重量平均分子量約5000)を使用したこと以外は実施例7に記載の方法と同じ処理を行ない、アガロースゲル電気泳動を行った。DNAの移動度に変化が見られ、分子量増大効果が確認できた。しかし、その分子量増大効果は、実施例1で得られたグルコサミン含有分岐グルカンと比較するとわずかであった。
(実施例10、比較例2および比較例3:グルコサミン含有分岐グルカンと核酸との結合力の評価)
オリゴdTセルロース(和光純薬)50mgをあらかじめ2M NaCl溶液で洗浄した後、超純水で平衡化した。平衡化されたオリゴdTセルロースを0.1M、0.2M、0.3M、0.5M、1M、2MのNaCl溶液1mlに懸濁し、実施例3または実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカン(BN5、BN6またはPN6)、製造例2で得られた分岐グルカン(B)、参考例8で得られたグルコサミン含有直鎖状グルカン、またはポリリジンの0.2mg/20μLを添加して混合し、混合物を30分間室温で静置した後、3,000rpmで5分間遠心分離した。上清画分に含まれる、オリゴdTセルロースと結合しなかったグルコサミン含有分岐グルカン(または、分岐グルカンもしくは直鎖状グルカン)の量を、フェノール硫酸法によってもとめ、添加したグルコサミン含有グルカン(または、分岐グルカンもしくは直鎖状グルカン)の量(全糖量)に対する結合したカチオン化グルカン量(全糖量)の割合(%)を算出した。結果を図4に示す。BN5よりもカチオン化グルカンのグルコサミン結合量が多いBN6の方が高いNaCl濃度下で結合を保持することが分かった。また、BN6よりも分子量が大きく分岐が多いPN6の方がより高い濃度のNaClでも安定して結合を保つことが分かった。これらの結果から、グルコサミン残基の結合量によって核酸との結合力を制御できることが分かった。
オリゴdTセルロース(和光純薬)50mgをあらかじめ2M NaCl溶液で洗浄した後、超純水で平衡化した。平衡化されたオリゴdTセルロースを0.1M、0.2M、0.3M、0.5M、1M、2MのNaCl溶液1mlに懸濁し、実施例3または実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカン(BN5、BN6またはPN6)、製造例2で得られた分岐グルカン(B)、参考例8で得られたグルコサミン含有直鎖状グルカン、またはポリリジンの0.2mg/20μLを添加して混合し、混合物を30分間室温で静置した後、3,000rpmで5分間遠心分離した。上清画分に含まれる、オリゴdTセルロースと結合しなかったグルコサミン含有分岐グルカン(または、分岐グルカンもしくは直鎖状グルカン)の量を、フェノール硫酸法によってもとめ、添加したグルコサミン含有グルカン(または、分岐グルカンもしくは直鎖状グルカン)の量(全糖量)に対する結合したカチオン化グルカン量(全糖量)の割合(%)を算出した。結果を図4に示す。BN5よりもカチオン化グルカンのグルコサミン結合量が多いBN6の方が高いNaCl濃度下で結合を保持することが分かった。また、BN6よりも分子量が大きく分岐が多いPN6の方がより高い濃度のNaClでも安定して結合を保つことが分かった。これらの結果から、グルコサミン残基の結合量によって核酸との結合力を制御できることが分かった。
上記のように、製造例2で得られた分岐グルカンを用いて、オリゴdTセルロースとの結合力を評価した。図4に示すとおり、分岐グルカンは核酸に対する結合力がほとんど無いことが分かった。
上記のように、ポリリジンを用いて、オリゴdTセルロースとの結合力を評価した。ただし、ポリリジンの定量はProtein Quantification Kit(同仁化学製)を用い、製造業者の指示に従って測定した。図4に示すとおり、ポリリジンとオリゴdTセルロースとの結合力は非常に強く、NaCl濃度を2Mまで上げても両者の結合は分離できなかった。
ポリリジンはカチオン性アミノ酸の重合物なので荷電が非常に強く、核酸と複合体化した場合には強固に結合して分離できない。そのため、ポリリジンと核酸との複合体を医薬品の薬効成分として利用する場合には、その薬効成分の毒性が非常に高いことが予想され、問題である。
グルコサミン含有分岐グルカンの場合、生理的食塩水レベルである0.15M NaClで安定して核酸と結合するが、1M NaClで核酸と分離できる。
一方、ここで使用したグルコサミン含有直鎖状グルカンはBN5のイソアミラーゼ分解物であるが、この直鎖状グルカンは低濃度のNaClの条件では核酸と分離する。特に、この直鎖状グルカンは、生理的食塩水レベルでは、核酸と分離する。すなわち、核酸に対するこの直鎖状グルカンの結合力は、体内で使用するには弱すぎる。この直鎖状グルカンの結果は同時に、グルコサミン含有分岐グルカンが生体内に投与された場合に、生体内のグルカン分解酵素によって分岐グルカンが分解されることによって、生成物と核酸との結合力が低下し、その結果、徐々に核酸を放出させることができることを示している。
核酸とグルコサミン含有グルカンとが安定して結合するNaCl濃度は、好ましくは約0.1M以上約2M以下であり、より好ましくは約0.15M以上約1M以下である。
(実施例11:グルコサミン含有分岐グルカンを用いたマクロファージ細胞株のトランスフェクション実験)
ホタル由来ルシフェラーゼをコードするLUC遺伝子を含むpGL4.51[luc2P/CMV/NEO]Vector(Promega製)を実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカン(PN6)、ポリエチレンイミンまたはポリリジンと水溶液中で混合して室温で15分間静置することにより、このベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体を形成させた。混合比率はN/P比(DNAのリン酸基とグルコサミン含有分岐グルカンとのモル比)を基準とし、PN6についてはN/P比2、10、50または200とし、ポリエチレンイミンおよびポリリジンについてはN/P比200とした。複合体を含む溶液を精製せずに、マクロファージ細胞株RAW264.7(DSファーマバイオメディカルより購入)培養液(ウェルあたりの細胞数4×104/0.1mL/ウェルで播種し、Dulbecco’s Modified Medium(D−MEM)で24時間培養したもの)に添加した。この培養液を37℃、5%CO2雰囲気下で24時間インキュベーションした後に培地を除きReporter Lysis Buffer(Promega製)を加えて細胞を溶解した。全て、製造業者の指示に従って、96穴プレート上で発光反応を行い、ルミノメーター(Berthold社製,Centro LB 960)を用いて、細胞溶解上清中のルシフェラーゼ活性を決定した。
ホタル由来ルシフェラーゼをコードするLUC遺伝子を含むpGL4.51[luc2P/CMV/NEO]Vector(Promega製)を実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカン(PN6)、ポリエチレンイミンまたはポリリジンと水溶液中で混合して室温で15分間静置することにより、このベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体を形成させた。混合比率はN/P比(DNAのリン酸基とグルコサミン含有分岐グルカンとのモル比)を基準とし、PN6についてはN/P比2、10、50または200とし、ポリエチレンイミンおよびポリリジンについてはN/P比200とした。複合体を含む溶液を精製せずに、マクロファージ細胞株RAW264.7(DSファーマバイオメディカルより購入)培養液(ウェルあたりの細胞数4×104/0.1mL/ウェルで播種し、Dulbecco’s Modified Medium(D−MEM)で24時間培養したもの)に添加した。この培養液を37℃、5%CO2雰囲気下で24時間インキュベーションした後に培地を除きReporter Lysis Buffer(Promega製)を加えて細胞を溶解した。全て、製造業者の指示に従って、96穴プレート上で発光反応を行い、ルミノメーター(Berthold社製,Centro LB 960)を用いて、細胞溶解上清中のルシフェラーゼ活性を決定した。
図5に示すとおり、PN6はトランスフェクション機能を示すことが分かり、特に、N/P比が200の時に最も高いトランスフェクション効率を示した。ポリエチレンイミンはN/P比200では効率が顕著に低かった。ポリリジンはN/P比200では効率が顕著に低かった。
(実施例12:グルコサミン含有分岐グルカンを用いたマクロファージ細胞株のトランスフェクションにおける細胞毒性の評価)
実施例11で得られた細胞溶解上清中のタンパク質濃度を、Protein Quantification Kit(同仁化学製)を用いて製造業者の指示に従って測定することにより、トランスフェクションによる細胞量の変化を調べた。タンパク質濃度が低いほど、細胞毒性が強いことを示す。図6に示すとおり、ポリエチレンイミンおよびポリリジンがN/P比200で高い毒性を生じたのに対し、PN6はN/P比50以上でも顕著な毒性は示されなかった。このように、ポリエチレンイミンおよびポリリジンはN/P比200ではトランスフェクション効率が低く毒性も高いために使用することができないが、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンはN/P比が高くても毒性が低く、トランスフェクション効率も高いため、トランスフェクションのキャリアとして非常に有用であることが示された。
実施例11で得られた細胞溶解上清中のタンパク質濃度を、Protein Quantification Kit(同仁化学製)を用いて製造業者の指示に従って測定することにより、トランスフェクションによる細胞量の変化を調べた。タンパク質濃度が低いほど、細胞毒性が強いことを示す。図6に示すとおり、ポリエチレンイミンおよびポリリジンがN/P比200で高い毒性を生じたのに対し、PN6はN/P比50以上でも顕著な毒性は示されなかった。このように、ポリエチレンイミンおよびポリリジンはN/P比200ではトランスフェクション効率が低く毒性も高いために使用することができないが、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンはN/P比が高くても毒性が低く、トランスフェクション効率も高いため、トランスフェクションのキャリアとして非常に有用であることが示された。
(実施例13:グルコサミン含有分岐グルカンとポリエチレンイミンを組み合わせて用いた場合の、マクロファージ細胞株のトランスフェクションにおける相乗効果)
ホタル由来ルシフェラーゼをコードするLUC遺伝子を含むpGL4.51[luc2P/CMV/NEO]Vector(Promega製)を実施例3で得られたグルコサミン含有分岐グルカンBN7と水溶液中で混合して室温で15分間静置することにより、このベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体を形成させた。混合比率はN/P比(DNAのリン酸基とグルコサミン含有分岐グルカンとのモル比)を基準とし、N/P比2、10、50または200とした。その後、この混合物にポリエチレンイミンをN/P比10となるように添加し、その後、室温で15分間静置することにより、ベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体にさらにポリエチレンイミンを複合体化させた。得られた複合体をマクロファージ細胞株RAW264.7(DSファーマバイオメディカルより購入)培養液(ウェルあたりの細胞数4×104/0.1mL/ウェルで播種し、Dulbecco’s Modified Medium(D−MEM)で24時間培養したもの)に添加した。この培養液を37℃、5%CO2雰囲気下で24時間インキュベーションした後に培地を除きReporter Lysis Buffer(Promega製)を加えて細胞を溶解した。全て、製造業者の指示に従って、96穴プレート上で発光反応を行い、ルミノメーター(Berthold社製,Centro LB960)を用いて、細胞溶解上清中のルシフェラーゼ活性を決定した。結果を表4に示す。ポリエチレンイミンあるいはグルコサミン含有分岐グルカン単独の場合と比較して、ポリエチレンイミンとグルコサミン含有分岐グルカンの両者を添加した時の方が、トランスフェクション効率が顕著に高いことが分かった。
ホタル由来ルシフェラーゼをコードするLUC遺伝子を含むpGL4.51[luc2P/CMV/NEO]Vector(Promega製)を実施例3で得られたグルコサミン含有分岐グルカンBN7と水溶液中で混合して室温で15分間静置することにより、このベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体を形成させた。混合比率はN/P比(DNAのリン酸基とグルコサミン含有分岐グルカンとのモル比)を基準とし、N/P比2、10、50または200とした。その後、この混合物にポリエチレンイミンをN/P比10となるように添加し、その後、室温で15分間静置することにより、ベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体にさらにポリエチレンイミンを複合体化させた。得られた複合体をマクロファージ細胞株RAW264.7(DSファーマバイオメディカルより購入)培養液(ウェルあたりの細胞数4×104/0.1mL/ウェルで播種し、Dulbecco’s Modified Medium(D−MEM)で24時間培養したもの)に添加した。この培養液を37℃、5%CO2雰囲気下で24時間インキュベーションした後に培地を除きReporter Lysis Buffer(Promega製)を加えて細胞を溶解した。全て、製造業者の指示に従って、96穴プレート上で発光反応を行い、ルミノメーター(Berthold社製,Centro LB960)を用いて、細胞溶解上清中のルシフェラーゼ活性を決定した。結果を表4に示す。ポリエチレンイミンあるいはグルコサミン含有分岐グルカン単独の場合と比較して、ポリエチレンイミンとグルコサミン含有分岐グルカンの両者を添加した時の方が、トランスフェクション効率が顕著に高いことが分かった。
(実施例14:α−アミラーゼ消化性)
実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカンの各1%溶液を、0.2M 酢酸緩衝液(pH5.5)、1mM 塩化カルシウム、ブタ膵臓由来α−アミラーゼ(26unit/mL)を含む反応液中で作製し、37℃で4時間反応させた。4時間後に反応液の一部を取り、グルコースCII−テストワコーを用いて、製造業者の指示に従ってグルコースを定量した。全糖量をフェノール硫酸法によって求め、消化率(%)={グルコース含量(g)/全糖量(g)}×100を算出した。グルコサミン含有分岐グルカンのα−アミラーゼ消化は31.6%であり、グルコサミン含有アセチル化分岐グルカンのα−アミラーゼ消化率は9.3%であった。よって、グルカンをアセチル化することによって、α−アミラーゼ消化性を抑制させることができた。
実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカンの各1%溶液を、0.2M 酢酸緩衝液(pH5.5)、1mM 塩化カルシウム、ブタ膵臓由来α−アミラーゼ(26unit/mL)を含む反応液中で作製し、37℃で4時間反応させた。4時間後に反応液の一部を取り、グルコースCII−テストワコーを用いて、製造業者の指示に従ってグルコースを定量した。全糖量をフェノール硫酸法によって求め、消化率(%)={グルコース含量(g)/全糖量(g)}×100を算出した。グルコサミン含有分岐グルカンのα−アミラーゼ消化は31.6%であり、グルコサミン含有アセチル化分岐グルカンのα−アミラーゼ消化率は9.3%であった。よって、グルカンをアセチル化することによって、α−アミラーゼ消化性を抑制させることができた。
(実施例15:グルコサミン含有分岐グルカンとアニオン性グルカンによる粒子形成)
実施例4で得られたグルコサミン含有グルカンBN5とアニオン性グルカンを混合し、粒子サイズを調べた。アニオン性グルカンについては、製造例2で製造した分岐グルカン10mMに対し15mMグルクロン酸−1−リン酸を添加し、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)とAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を加え、55℃で18時間反応させることにより、グルクロン酸含有グルカン(アニオン性グルカン)を作製した。分岐グルカンへのグルクロン酸結合率は、実施例3と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより求め、その結果、50%であった。BN5とアニオン性グルカンそれぞれの1%溶液を調製し、各比率で混合し、室温で20分間静置した後、粒子径測定装置(zeta sizer nano, Malvern Instrument製)を用いて測定した。
実施例4で得られたグルコサミン含有グルカンBN5とアニオン性グルカンを混合し、粒子サイズを調べた。アニオン性グルカンについては、製造例2で製造した分岐グルカン10mMに対し15mMグルクロン酸−1−リン酸を添加し、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)とAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を加え、55℃で18時間反応させることにより、グルクロン酸含有グルカン(アニオン性グルカン)を作製した。分岐グルカンへのグルクロン酸結合率は、実施例3と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより求め、その結果、50%であった。BN5とアニオン性グルカンそれぞれの1%溶液を調製し、各比率で混合し、室温で20分間静置した後、粒子径測定装置(zeta sizer nano, Malvern Instrument製)を用いて測定した。
BN5の粒度は20nmであり、アニオン性グルカンの粒度は23nmであった。BN5とアニオン性グルカンとの混合物は複合体粒子を形成した。BN5とアニオン性グルカンとの1:1混合物の粒度は200μmであり、10:1混合物の粒度は53μmであり、そして100:1混合物の粒度は774nmであった。
(実施例16:グルコサミン含有分岐グルカンの蛍光ラベル化)
実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカンBN5またはAcBN8をそれぞれ50mg/mlジメチルスルホキシド溶液に調製した。各グルカン/ジメチルスルホキシド溶液2mlを試験管に入れ、90℃で撹拌した。これに50mg/mlフルオレセインイソチオシアネート(FITC)のジメチルスルホキシド溶液をそれぞれ56μlまたは112μl加え、ピリジン1滴、およびジラウリン酸ジ−n−ブチルすず1滴を滴下して反応液を得た。この反応液を90℃で2時間撹拌した。反応終了後、この反応液にエタノールを20ml加え、3,500rpmで5分遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿にさらにエタノールを加えて洗浄を行い、洗浄後の沈殿を超純水1mlで溶解し、ゲルろ過カラム(PD−10)に1mlのせ、1.5mlの超純水で通液し、その後2mlを超純水で回収し精製を行った。得られたサンプルを凍結乾燥した。得られたサンプルの一部は490nmにおけるUV吸収を測定した。ウラニンを標準物質とし、BN5およびAcBN8のFITC導入量を求めたところ、それぞれの導入率は0.86%、0.82%の、であることが確認できた。(FITC導入率(W/W%)=((FITC標識された分岐グルカンのフルオレセイン濃度)/(FITC標識された分岐グルカンの全糖量))x100)
(実施例17:グルコサミン含有グルカンの還元末端修飾物の製造)
グルコース−1−リン酸6gとマルトシルトレハロース0.5mgを100mlの0.2Mマレイン酸緩衝液(pH6.0)に溶解した溶液に、本願製造例1で製造したAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを150Uと、特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム2,000Uを添加して反応液を調製した後、50℃で攪拌しながら16時間反応を行なった。反応液を加熱することにより酵素を失活させ、ガラスフィルターにて濾過することにより失活酵素を除去した。濾液に2倍量のエタノールを加えてグルカン反応物を沈殿させ、遠心分離した。水:エタノール1:1の溶液300ミリリットルで沈殿を2度洗浄して共存するグルコース−1−Pを取り除き、さらに、エタノールで沈殿を2回洗浄した後、凍結乾燥した。収量1.8gで、分子量110kDaの還元末端修飾分岐グルカンが得られた。
実施例4で得られたグルコサミン含有分岐グルカンBN5またはAcBN8をそれぞれ50mg/mlジメチルスルホキシド溶液に調製した。各グルカン/ジメチルスルホキシド溶液2mlを試験管に入れ、90℃で撹拌した。これに50mg/mlフルオレセインイソチオシアネート(FITC)のジメチルスルホキシド溶液をそれぞれ56μlまたは112μl加え、ピリジン1滴、およびジラウリン酸ジ−n−ブチルすず1滴を滴下して反応液を得た。この反応液を90℃で2時間撹拌した。反応終了後、この反応液にエタノールを20ml加え、3,500rpmで5分遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿にさらにエタノールを加えて洗浄を行い、洗浄後の沈殿を超純水1mlで溶解し、ゲルろ過カラム(PD−10)に1mlのせ、1.5mlの超純水で通液し、その後2mlを超純水で回収し精製を行った。得られたサンプルを凍結乾燥した。得られたサンプルの一部は490nmにおけるUV吸収を測定した。ウラニンを標準物質とし、BN5およびAcBN8のFITC導入量を求めたところ、それぞれの導入率は0.86%、0.82%の、であることが確認できた。(FITC導入率(W/W%)=((FITC標識された分岐グルカンのフルオレセイン濃度)/(FITC標識された分岐グルカンの全糖量))x100)
(実施例17:グルコサミン含有グルカンの還元末端修飾物の製造)
グルコース−1−リン酸6gとマルトシルトレハロース0.5mgを100mlの0.2Mマレイン酸緩衝液(pH6.0)に溶解した溶液に、本願製造例1で製造したAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを150Uと、特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム2,000Uを添加して反応液を調製した後、50℃で攪拌しながら16時間反応を行なった。反応液を加熱することにより酵素を失活させ、ガラスフィルターにて濾過することにより失活酵素を除去した。濾液に2倍量のエタノールを加えてグルカン反応物を沈殿させ、遠心分離した。水:エタノール1:1の溶液300ミリリットルで沈殿を2度洗浄して共存するグルコース−1−Pを取り除き、さらに、エタノールで沈殿を2回洗浄した後、凍結乾燥した。収量1.8gで、分子量110kDaの還元末端修飾分岐グルカンが得られた。
上記還元末端修飾分岐グルカン1.6mg/mL、10mMグルコサミン−1−リン酸、および50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を含む反応液に本願製造例1で製造したAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を55℃で18時間作用させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造することができた。グルコサミン結合率は実施例3と同様の方法で求め、74%であった。このようにして、還元末端が修飾された、グルコサミン含有分岐グルカンが得られた。
(実施例18:還元末端にグルコン酸残基がさらに結合しているグルコサミン含有グルカンの製造)
5%マルトペンタオース(G5)10mlに0.2M I2/MeOH溶液10mlを加え、30℃で攪拌しながら、4%KOH/MeOH溶液4mlを少しずつゆっくり滴下することにより、ヨウ素酸酸化反応させた。ヨウ素の色が消えるまで4%KOH/MeOH溶液をさらに滴下し攪拌しながら1時間反応させた。得られた反応液の体積の3倍量のメタノールを加えることによりG5酸化物を沈殿させ、遠心分離により沈殿物(約0.4g)を回収した。沈殿物は、マルトペンタオースの還元末端グルコース残基がグルコン酸残基に変換したマルトヘキサオシルグルコン酸であった。グルコース−1−リン酸6gとマルトヘキサオシルグルコン酸0.6mgを100mlの0.2Mマレイン酸緩衝液(pH6.0)に溶解した溶液に、本願製造例1で製造したAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを150Uと、特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム2,000Uを添加して反応液を調製した後、50℃で攪拌しながら16時間反応を行なった。溶液を加熱することにより酵素を失活し、ガラスフィルターにて濾過し失活酵素を除去した。濾液に2倍量のエタノールを加えてグルカン反応物を沈殿させ、遠心分離した。水:エタノール1:1の溶液300ミリリットルで沈殿を2度洗浄して共存するグルコース−1−Pを取り除き、さらに、エタノールで2回洗浄した後、凍結乾燥した。収量1.7g、分子量120kDaの還元末端にグルコン酸が結合している分岐グルカンを得た。
5%マルトペンタオース(G5)10mlに0.2M I2/MeOH溶液10mlを加え、30℃で攪拌しながら、4%KOH/MeOH溶液4mlを少しずつゆっくり滴下することにより、ヨウ素酸酸化反応させた。ヨウ素の色が消えるまで4%KOH/MeOH溶液をさらに滴下し攪拌しながら1時間反応させた。得られた反応液の体積の3倍量のメタノールを加えることによりG5酸化物を沈殿させ、遠心分離により沈殿物(約0.4g)を回収した。沈殿物は、マルトペンタオースの還元末端グルコース残基がグルコン酸残基に変換したマルトヘキサオシルグルコン酸であった。グルコース−1−リン酸6gとマルトヘキサオシルグルコン酸0.6mgを100mlの0.2Mマレイン酸緩衝液(pH6.0)に溶解した溶液に、本願製造例1で製造したAquifex aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼを150Uと、特開2000−316581の実施例1に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム2,000Uを添加して反応液を調製した後、50℃で攪拌しながら16時間反応を行なった。溶液を加熱することにより酵素を失活し、ガラスフィルターにて濾過し失活酵素を除去した。濾液に2倍量のエタノールを加えてグルカン反応物を沈殿させ、遠心分離した。水:エタノール1:1の溶液300ミリリットルで沈殿を2度洗浄して共存するグルコース−1−Pを取り除き、さらに、エタノールで2回洗浄した後、凍結乾燥した。収量1.7g、分子量120kDaの還元末端にグルコン酸が結合している分岐グルカンを得た。
上記還元末端修飾分岐グルカン1.6mg/mL、10mMグルコサミン−1−リン酸、および50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を含む反応液にAquifex aeolicus VF 5由来α−グルカンホスホリラーゼ(18Unit/ml)を添加して55℃で18時間作用させることにより、還元末端にグルコン酸残基が結合している分岐グルカンの非還元末端にグルコサミン残基を結合させた。グルコサミン結合率は実施例3と同様の方法で求め、70%であった。このようにして、還元末端が修飾された、グルコサミン含有分岐グルカンが得られた。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明の新規なアミノ糖含有グルカンは、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合している。本アミノ糖含有グルカンはアミノ糖を末端に有するため、グルカン末端が正電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。アミノ糖の導入頻度によって電荷の強さを変えることができる。本アミノ糖含有グルカンは、核酸に非共有結合的に結合し、核酸の見かけの分子量を増大させる。本アミノ糖含有グルカンは食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用できる。
配列番号1:Aquifex Aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号2:Aquifex Aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号3:馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号4:馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号5:Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号6:Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号2:Aquifex Aeolicus VF5由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号3:馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号4:馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号5:Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号6:Thermococcus zilligii AN1由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
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- 明細書または図面に記載の発明。
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