CN109456990B - 一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法，该方法利用基因组编辑技术，对叶绿体基因组进行定点剪切，提高外源基因在叶绿体基因组中的重组效率和整合效率，从而提高叶绿体遗传转化效率。

Description

一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，公开了一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法。

背景技术

植物转基因技术多为将外源基因导入至细胞核的基因组中进行表达。但随着研究的深入，这种常规方法的一系列弊端也相继出现。例如，外源基因表达效率低，容易出现基因沉默、失活和位置效应，难以同时操作多个基因的转化，并且外源基因在后代中表达不稳定。更为重要的是，外源基因可随花粉遗传，花粉扩散所带来的转基因环境安全问题引发了人们的担忧。在植物细胞内，DNA遗传物质不仅仅存在于细胞核内，也存在于细胞器中。叶绿体是高等植物或藻类进行光合作用的场所，其基因组具有半自主的自我复制能力。叶绿体遗传转化技术是继常规核转化之后出现的一种新型的转基因途径。与核转化相比，由于叶绿体基因组较小，遗传操作更为简便。该技术的原理是通过同源重组机制将外源基因定点整合到叶绿体基因组中，可有效地避免失活和位置效应等基因沉默难题。叶绿体基因组的原核特性使其可同时表达多个外源基因，高拷贝数为外源基因获得多拷贝提供了平台，母系遗传的特征极大地保障了转基因的坏境安全性，这些都是核转化不具备的优势。目前，双子叶植物的叶绿体转化技术已经非常成熟，成功进行叶绿体转化的高等植物有烟草、马铃薯、番茄、油菜、胡萝卜、棉花、大豆、西兰花、矮牵牛、甘蓝等十几种。而在主要的单子叶植物水稻、小麦中虽有关于叶绿体转化的报道,但都未获得能稳定遗传的同质化植株,其主要原因是外源基因的同源重组率低,因此,提高外源基因的同源重组率是提高叶绿体转化效率的重要途径。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种提高叶绿体遗传转化效率的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法是利用基因组编辑技术，对叶绿体基因组进行定点剪切，通过提高外源基因在植物叶绿体基因组中的重组效率和整合效率，从而提高叶绿体遗传转化效率。

优选地，所述基因组编辑技术包括但不限于为CRISPR/Cas9技术、TALEN技术。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

（1）构建叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体；所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中包含以下六段核苷酸序列：

第一核苷酸序列，其表达的蛋白质可以在第四核苷酸序列表达的单链RNA引导下对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切；

第二核苷酸序列，其为hpt潮霉素抗性基因，用于转化成功的转化子的筛选；

第三核苷酸序列，其表达的蛋白为绿色荧光蛋白，作为标记基因；

第四核苷酸序列，其转录表达产生的单链RNA可以引导第一核苷酸序列表达的蛋白质对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切；

第五核苷酸序列，其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段；

第六核苷酸序列，其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段。

（2）将步骤1所制备的构建体通过共转化转入水稻愈伤组织中，产生水稻叶绿体基因组转基因植株。

更优选地，所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述第三核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第四核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述第五核苷酸序列如SEQ ID NO.5所述；所述第六核苷酸序列SEQ ID NO.6所示。

其中，所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体全序列如SEQ ID NO.19 所示。

所述植物包括但不限于水稻、小麦、玉米、高粱、油菜、藻类。

下面对本发明作进一步说明：

在本发明中，上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第一核苷酸序列为CRISPR/Cas9基因编辑系统中Cas9基因，序列如SEQ ID NO.1所示，实验所使用的基因编辑系统包括但不限于CRISPR/Cas9基因编辑系统。

在本发明中，上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第二核苷酸序列为hpt潮霉素抗性基因，序列如SEQ ID NO.2所示，实验所使用的抗性基因包括但不限于hpt潮霉素抗性基因。

在本发明中，上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第三核苷酸序列为eGFP绿色荧光基因，序列如SEQ ID NO.3所示，实验所使用的标记基因包括但不限于eGFP绿色荧光基因。

在本发明中，上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第四核苷酸序列为CRISPR/Cas9系统中sgRNA片段，序列如SEQ ID NO.4所示，该sgRNA片段所对应的水稻叶绿体基因组敲除位点包括但不限于方法中sgRNA所对应的位点。

在本发明中，上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第五核苷酸序列和第六核苷酸序列为水稻叶绿体基因组定点敲入位点两端相应的同源重组片段，序列如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示，实验所使用的这两个同源重组序列包括但不限于trnA和trnI。

附图说明

图1外源构建体叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体图；

图2叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体酶切验证图；M: 15 kb DNA ladder;1: 质粒pC1304-Cas9; 2:质粒pC1304-Cas9-sgRNA; 3:pC1304-Cas9载体经HindIII和AscI酶切; 4: pC1304-Cas9-sgRNA载体经HindIII和AscI酶切; 5:pC1304-Cas9载体经AflII和NheI酶切; 6:pC1304-Cas9-sgRNA载体经AflII和NheI酶切；

图3叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中荧光蛋白在大肠杆菌中的表达；(A)自然光视野，(B) 蓝光视野；

图4叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中Cas9基因在大肠杆菌中的表达；1:感受态细胞TOP10; 2-3:携带有质粒pC1304-Cas9-sgRNA的TOP10细胞；

图5叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体转化植株的分子鉴定；M: 1kbplusDNA ladder; 1-9: 抗性苗1-9号单株;10:pC1304-Cas9-sgRNA质粒; 11:野生型对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但不因此限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：水稻叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

连接构建含有prrn启动子，T7Leader，Cas9基因，hpt基因，eGFP基因和TpsbA终止子的表达盒并在表达盒两端加入trnI和trnA水稻叶绿体同源重组序列，同时在trnA下游加入含有prrn启动子，sgRNA和TpsbA终止子的表达盒（附图1）。具体步骤如下：

1.1 中间双元载体pC1304的构建

用限制性内切酶NdeⅠ和XbaⅠ双酶切pCTE04载体(含有叶绿体同源片段trnA 、trnI，hpt基因，eGFP基因)，回收约 1580bp 的目的片段；用XbaⅠ和HindⅢ双酶切pCE4载体，回收约3160bp的目的片段；用HindⅢ和XbaⅠ双酶切pCAMBIA1300载体，胶回收大片段；将接头引物PCJ1-F和PCJ1-R退火成接头；将上述得到的四个片段连接，连接产物热激转化大肠杆菌，酶切鉴定后测序，将验证正确的重组子命名为pC1304。

（1）酶切连接：酶切反应底物1μl，酶11μl，酶21μl，buffer1μl，加ddH₂O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱30min。

（2）退火体系：将接头引物F和接头引物R分别稀释到100μM的母液浓度保存，各取1μL加入98μLddH₂O稀释到1μM，90℃的金属浴中放置30s，移至室温冷却完成退火。

（3）连接体系：10×T4 Buffer 1μL，DNA 片段(3 个)各 1μL，PCJ1接头1μL，T4 DNALigase 1μL，4℃过夜连接。

（4）使用引物：

PCJ1：TCGAGTGTTGA（SEQ ID NO.7）

PCJ2：TATCAACAC（SEQ ID NO.8）

1.2 Cas9连到载体pC1304得到pC1304-Cas9载体

用限制性内切酶XbaⅠ和AscI 双酶切pC1304，回收载体片段；用限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切载体psg-Cas9-Os载体(含有Cas9基因，sgRNA 等)，回收Cas9目的片段；T7leader两条引物退火成T7接头引物，PCJ2-F和PCJ2-R两条引物退火成接头引物；将上述四个片段用T4连接酶链接，连接产物热激转化大肠杆菌，酶切鉴定后测序，将验证正确的重组子命名为pC1304-Cas9。

(1)酶切连接：酶切反应底物1μl，酶11μl，酶21μl，buffer1μl，加ddH₂O至 10μl。把配置好的体系置于37℃ 培养箱30min。

（2）退火体系：将接头引物F和接头引物R分别稀释到100μM的母液浓度保存，各取1μL加入98μLddH₂O稀释到1μM，90℃的金属浴中放置30s，移至室温冷却完成退火。

（3）连接体系：10×T4 Buffer 1μL，载体 2μL，T7接头1μL，PCJ2接头1μL，插入片段4μL，T4 DNA Ligase 1μL，4℃过夜连接。

（4）使用引物：

T7-F：CTACCTAGAGGGAGACCACAACGGTTTCCCACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC（SEQ ID NO.9）

T7-R：CATCCATGGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGTGGGAAACCGTTGTGGTCTCCCT（SEQ ID NO.10）

PCJ2-F：GATCGTGTTGG（SEQ ID NO.11）

PCJ2-R：CGCGCCAACA（SEQ ID NO.12）

1.3含有sgRNA表达盒的载体构建

以psgR-Cas9-Os为模板，PCJ3-F和PCJ3-R为引物，用PrimeSTAR GXLDNAPolymerase扩增 sgRNA 片段，电泳检测回收目的片段，然后利用北京全式金生物技术有限公司的克隆载体试剂盒pEASY-Blunt Zero Cloning Kit进行 TA 克隆，将目的片段与pEASY TM -T5载体连接，连接产物热激转化大肠杆菌，酶切鉴定后测序，将验证正确的重组子命名为T-sgRNA。

用限制性内切酶MreⅠ和MluⅠ双酶切pCTE04，去除hpt和eGFP基因，电泳回收载体片段；用限制性内切酶MreⅠ和MluⅠ双酶切T-sgRNA载体，电泳回收目的片段；将回收的两个片段连接，连接产物热激转化大肠杆菌，酶切鉴定后测序，将验证正确的重组子命名为p4-sgRNA。

以p4-sgRNA为模板，以PCJ4-F和PCJ4-R为，用高保真酶 GXL 扩增 prrn+靶位点+sgRNA+TpsbA 表达盒序列，进行TA克隆，连接产物热激转化大肠杆菌，酶切鉴定后测序，将验证正确的重组子命名为pCTE04-sgRNA。

（1）PCR扩增体系：2×buffer 10μl，dNTP（2mM）4μl，上游引物0.5μl，下游引物 0.5μl，模板DNA0.1μl，KOD0.5μl，ddH₂O 4.4μl，PCR程序：95℃ 变性30s，72℃（62℃）复性45s，72℃ 延伸1min。

（2）TA克隆链接体系：目的片段 9μL，pEASY TM-T5载体 1μL，30℃反应30min。

（3）酶切连接：酶切反应底物1μl，酶11μl，酶21μl，buffer1μl，加ddH₂O至 10μl。把配置好的体系置于37℃ 培养箱30min。

（4）连接体系：10×T4 Buffer 1μL，载体 2μL，插入片段 4μL，H₂O 2μL，T4 DNALigase 1μL，4℃过夜连接。

（5）使用引物：

PCJ3-F：CGCCGGCGGGGGCGATGATTTACTTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT（SEQ IDNO.13）

PCJ3-R：ACGCGTAATTGGCGCACGCGCTACGGACTAG（SEQ ID NO.14）

PCJ4-F：CCCAAGCTTCTAAGCCCAATGTGTTTTTTTCTAG（SEQ ID NO.15）

PCJ4-R：CCCAAGCTTTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCC（SEQ ID NO.16）

1.4将sgRNA表达盒连接到pC1304-Cas9载体上

用限制性内切酶HimdIII单酶切pC1304-Cas9，回收载体片段；用限制性内切酶HimdIII单酶切酶切载体pCTE04-sgRNA回收sgRNA表达盒目的片段将上述两个片段用T4连接酶链接，连接产物热激转化大肠杆菌，酶切鉴定后测序（附图2），将验证正确的重组子命名为pC1304-Cas9-sgRNA。

（1）酶切连接：酶切反应底物1μl，酶11μl，酶21μl，buffer1μl，加ddH₂O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱30min。

（2）连接体系：10×T4 Buffer 1μL，载体 2μL，插入片段 4μL，H₂O 2μL，T4 DNALigase 1μL，4℃过夜连接。

1.5pC1304-Cas9-sgRNA中eGFP和Cas9基因的表达情况的验证

将含有pC1304-Cas9-sgRNA的大肠杆菌接种于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃ 200rpm培养14小时。取2 mL菌液12000rpm离心1min，使用双荧光蛋白手电筒观察菌体是否有荧光（附图3）。

使用天根生化科技（北京）有限公司DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒提取蛋白质。提取的蛋白质用BCA蛋白质定量试剂盒（天根）定量后，通过westernblot实验检测Cas9基因蛋白质表达量 (附图4)。

实施例2：水稻叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体在水稻叶绿体转化中的应用

2.1基因枪转化

用基因枪的方法将pC1304-Cas9-sgRNA载体转化水稻TP309幼胚诱导的愈伤组织(2000颗)，转化后的愈伤在潮霉素浓度为50mg/L的筛选培养基上、潮霉素浓度为20mg/L的分化培养基上，多次继代筛选、分化，将长出的幼芽转接到含潮霉素浓度为20mg/L的生根培养基上进行生根，待长到合适的高度后，移置炼苗室炼苗，3~5d后转到温室进行培养。

2.2 转基因植株的分子检测

经过多次筛选、分化后，共得到9株T 0代待检测的转化植株。使用Genmed公司的植物叶绿体DNA提取试剂盒，以叶绿体DNA为模板对T 0代的转基因植株进行 PCR 扩增检测(附图5)。

（1）PCR扩增体系：2×buffer 10μl，dNTP（2mM）4μl，上游引物0.5μl，下游引物 0.5μl，模板DNA 1μl，KOD 0.5μl，ddH₂O 3.5μl，PCR程序：95℃ 变性30s，58℃复性45s，72℃ 延伸3min。

（2）使用引物：

PC9S-F:CGCTAATCTGGACAAAGTGC（SEQ ID NO.17）

PC9S-R:TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT（SEQ ID NO.18）。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4272

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60

gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120

gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 840

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200

ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260

aagaaaaagt aa 4272

<210> 2

<211> 1027

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca 780

cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

aaataga 1027

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 4

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggggcgatga tttacttcac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata 120

gcaagttaaa ataaggctag tccgtagcgc gtgcgccaat t 161

<210> 5

<211> 823

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gctgcgccag ggaaaagaat agaagaagca tctgactctt tcatgcatac tccacttggc 60

tcggggggat atagctcagt tggtagagct ccgctcttgc aattgggtcg ttgcgattac 120

gggttggctg tctaattgtc caggcggtaa tggtagtatc ttgtacctga accggtggct 180

cactttttct aagtaatggg gaagaggact gaaacatgcc actgaaagac tctactgaga 240

caaaaagatg ggctgtcaaa aaggtagagg aggtaggatg ggcagttggt cagatctagt 300

atggatcgta catggacgat agttggagtc ggcggctctc ctaggcttcc ctcatctggg 360

atccctgggg aagaggatca agttggccct tgcgaatagc ttgatgcact atctcccttc 420

aaccctttga gcgaaatgtg gcaaaaggaa ggaaaatcca tggaccgacc ccattatctc 480

caccccgtag gaactacgag atcaccccaa ggacgccttc ggcgtccagg ggtcacggac 540

cgaccataga ccctgttcaa taagtggaac acattagccg tccgctctcc ggttgggcag 600

taagggtcgg agaagggcaa tcactcgttc ttaaaaccag cattcttaag tttaagatca 660

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<210> 6

<211> 1391

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctggagtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ctggaaggtg cggctggatc acctcctttt 60

cagggagagc taatgcttat gcttattggg tattttggtt tgacactgct tcacgcccaa 120

aaagaaggca gctacgtctg agctaaactt ggatatggaa gtcttctttc gtttagggtg 180

aagtaagacc aagctcatga gcttattatc ctaggtcgga acaaattagt tgatagtgat 240

aggatcccct ttttgacgtc cccatgcccc cccccgtgtg gtgtggcggc atggggatgt 300

caaaaggaaa gggatggagt ttttctcgct tttggcgtag caggcctccc aaagggaggc 360

ccgcgcgacg ggctattagc tcagtggtag agcgcgcccc tgataattgc gtcgttgtgc 420

ctgggctgtg agggctctca gccacatgga tagttcaatg tgctcatcag cgcctgaccc 480

gaagatgtgg atcatccaag gcacattagc atggcgtact cctcctgttt gaatcggagt 540

ttgaaaccaa acaaacttct cctcaggagg atagatgggg cgattcaggt gagatcccat 600

gtagatctaa ctttctattc actcgtggga tccgggcggt ccgggggggg cactacggct 660

cctctcttct cgagaatcca tacatccctt atcagtgtat ggagagctat ctctcgagca 720

caggttgagg ttcgtcctca atgggaaaat ggagcaccta acaacgcatc ttcacagacc 780

aagaactacg agatcaccct ttcattctgg ggtgacggag ggatcgtacc attcgagcct 840

ttttttcatg cttttcccgg cggtctggag aaagcagcaa tcaataggac ttccctaatc 900

ctcccttcct gaaaggaaga acgtgaaatt ctttttcctt tccgcaggga ccaggaggtt 960

ggatctagcc ataagaggaa tgcttggtat aaataagcca cttcttggtc ttcgactccc 1020

taagtcacta cgagcgccct cgatcagtgc aatgggatgt ggctatttat ctatctcttg 1080

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ggagggtctc ttaacgcctt cctttttctg cccatcggag ttatttccca aggacttgcc 1200

atggtaaggg ggagaagggg aagaagcaca cttgaagagc gcagtacaac ggagagttgt 1260

atgctgcgtt cgggaaggat gaatcgctcc cgaaaaggag tctattgatt ctctcccaat 1320

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atggcccaga a 1391

<210> 7

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcgagtgttg a 11

<210> 8

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tatcaacac 9

<210> 9

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ctacctagag ggagaccaca acggtttccc actagaaata attttgttta actttaagaa 60

ggagatatac c 71

<210> 10

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

catccatggg tatatctcct tcttaaagtt aaacaaaatt atttctagtg ggaaaccgtt 60

gtggtctccc t 71

<210> 11

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gatcgtgttg g 11

<210> 12

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cgcgccaaca 10

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

acgcgtaatt ggcgcacgcg ctacggacta g 31

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cccaagcttc taagcccaat gtgttttttt ctag 34

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

cccaagcttt tgatccactt ggctacatcc gccc 34

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 17

cgctaatctg gacaaagtgc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tgggtgctca ggtagtggtt 20

<210> 19

<211> 16706

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 60

tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 120

tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgc tagagcagct tgagcttgga 180

tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa actatcagtg tttgacagga tatattggcg 240

ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa 300

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agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag 420

ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg 480

cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac 540

tagaaccgga gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc 600

cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc 660

tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc 720

aggatgcttg accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg 780

gcccgcagca cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc 840

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ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt 1860

gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg 1920

cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg 1980

cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga 2040

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acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 2340

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ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 2460

cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 2520

aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 2580

aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 2640

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aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 2760

gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 2820

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ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga 3060

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tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc 3420

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gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct 3540

gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg 3600

aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag 3660

catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa 3720

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ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca 3840

tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac 3900

ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg 3960

aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc 4020

gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 4080

cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc 4140

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ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 4320

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 4380

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 4440

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 4500

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 4560

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atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 4860

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ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 4980

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 5040

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tcatttttaa atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca 6000

ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata 6060

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agaagctaat tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa 6180

ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac 6240

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ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg 6420

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tatctctcga gcacaggttg aggttcgtcc tcaatgggaa aatggagcac ctaacaacgc 7560

atcttcacag accaagaact acgagatcac cctttcattc tggggtgacg gagggatcgt 7620

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gtcttcgact ccctaagtca ctacgagcgc cctcgatcag tgcaatggga tgtggctatt 7860

tatctatctc ttgactcgaa atgggagcag agcaggtttg aaaaaggatc ttagagtgtc 7920

tagggttggg ccaggagggt ctcttaacgc cttccttttt ctgcccatcg gagttatttc 7980

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agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc 9000

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tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga cggcggagcc agccaggaag 9660

agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg 9720

tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc 9780

cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc 9840

cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccctact 9900

acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg 9960

aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa gggcgcttcc gcccagagct 10020

tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc 10080

acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga 10140

ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca gaaaaaggcc atcgtggacc 10200

tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga 10260

aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc 10320

tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg 10380

aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac actgtttgag gacagagaga 10440

tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc 10500

tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc 10560

gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca 10620

gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt taaagaggac atccagaaag 10680

cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc 10740

ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga 10800

tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc 10860

agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc 10920

tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc 10980

tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca 11040

accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact 11100

ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg gggcaagagc gacaacgtgc 11160

cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg gcagctgctg aacgccaagc 11220

tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac 11280

tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg 11340

tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc 11400

gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc 11460

agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg 11520

ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg 11580

gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gaaatcggca 11640

aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa ctttttcaag accgagatta 11700

ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga gacaaacggc gaaaccgggg 11760

agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc 11820

aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatcc 11880

tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt 11940

acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa 12000

agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa 12060

gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc caagggctac aaagaagtga 12120

aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt cgagctggaa aacggccgga 12180

agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca 12240

aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg 12300

ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca ctacctggac gagatcatcg 12360

agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc 12420

tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga gcaggccgag aatatcatcc 12480

acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca 12540

tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga 12600

gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca gctgggaggc gacaaaaggc 12660

cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gtaaggatcg tgttggcgcg 12720

cccaaggagg aaatcatcat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt 12780

ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct 12840

cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc 12900

gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt 12960

ccggaagtgc ttgacattgg ggagtttagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt 13020

gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctacaaccg 13080

gtcgcggagg ctatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc 13140

ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt 13200

gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc 13260

gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc 13320

gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc 13380

attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc 13440

tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg 13500

gagcttgcag gatcgccacg actccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc 13560

tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac 13620

gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg 13680

gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc 13740

actcgtccga gggcaaagaa atagaggtac caataatttt gtttaacttt aagaaggaga 13800

tatacccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 13860

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 13920

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 13980

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 14040

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 14100

catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 14160

caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 14220

ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 14280

gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 14340

gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 14400

caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 14460

catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 14520

caagtaaacg cgtatcgaag ctccatctac aaatggataa gatcctggcc tagtctatag 14580

gaggttttga aaagaaagga gcaataatca ttttcttgtt ctatcaagag ggtgctattg 14640

ctcctttctt tttttctttt tatttattta ctagtatttt acttacatag acttttttgt 14700

ttacattata gaaaaagaag gagaggttat tttcttgcat ttattcatga ttgagtattc 14760

tattttgatt ttgtatttgt ttaaaattgt agaaatagaa cttgtttctc ttcttgctaa 14820

tgttactata tctttttgat tttttttttc caaaaaaaaa atcaaatttt gacttcttct 14880

tatctcttat ctttgaatat ctcttatctt tgaaataata atatcattga aataagaaag 14940

aagagctata ttcgaacttg aatcttttgt tttctaattt aaataatgta aaaacggaat 15000

gtaagtaggc gagggggcgg atgtagccaa gtggatcaac tgcaggctgc gccagggaaa 15060

agaatagaag aagcatctga ctctttcatg catactccac ttggctcggg gggatatagc 15120

tcagttggta gagctccgct cttgcaattg ggtcgttgcg attacgggtt ggctgtctaa 15180

ttgtccaggc ggtaatggta gtatcttgta cctgaaccgg tggctcactt tttctaagta 15240

atggggaaga ggactgaaac atgccactga aagactctac tgagacaaaa agatgggctg 15300

tcaaaaaggt agaggaggta ggatgggcag ttggtcagat ctagtatgga tcgtacatgg 15360

acgatagttg gagtcggcgg ctctcctagg cttccctcat ctgggatccc tggggaagag 15420

gatcaagttg gcccttgcga atagcttgat gcactatctc ccttcaaccc tttgagcgaa 15480

atgtggcaaa aggaaggaaa atccatggac cgaccccatt atctccaccc cgtaggaact 15540

acgagatcac cccaaggacg ccttcggcgt ccaggggtca cggaccgacc atagaccctg 15600

ttcaataagt ggaacacatt agccgtccgc tctccggttg ggcagtaagg gtcggagaag 15660

ggcaatcact cgttcttaaa accagcattc ttaagtttaa gatcaaagag tcgggcggaa 15720

aaaggggaga gctccccgtt cctggttctc ctgtagctgg attccccgga accacaagaa 15780

tccttagaat gggattccaa ctcagcacct tttgttttga gattttgaga agagttgctc 15840

tttggagagc acagtacgat gaaagttgct aagcccaatg tgtttttttc tagttggatt 15900

tgctcccccg ccgtcgttca atgagaatgg ataagaggct cgtgggattg acgtgagggg 15960

gcagggatgg ctatatttct gggagcgaac tccgggcgaa tacgaagcgc ttggatacac 16020

gccggcgggg gcgatgattt acttcacgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 16080

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 16140

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtagcgcgtg cgccaattac gcgtatcgaa 16200

gctccatcta caaatggata agatcctggc ctagtctata ggaggttttg aaaagaaagg 16260

agcaataatc attttcttgt tctatcaaga gggtgctatt gctcctttct ttttttcttt 16320

ttatttattt actagtattt tacttacata gacttttttg tttacattat agaaaaagaa 16380

ggagaggtta ttttcttgca tttattcatg attgagtatt ctattttgat tttgtatttg 16440

tttaaaattg tagaaataga acttgtttct cttcttgcta atgttactat atctttttga 16500

tttttttttt ccaaaaaaaa aatcaaattt tgacttcttc ttatctctta tctttgaata 16560

tctcttatct ttgaaataat aatatcattg aaataagaaa gaagagctat attcgaactt 16620

gaatcttttg ttttctaatt taaataatgt aaaaacggaa tgtaagtagg cgagggggcg 16680

gatgtagcca agtggatcaa aagctt 16706

Claims (5)

1.一种利用基因组编辑技术提高水稻叶绿体遗传转化效率的方法，其特征在于，所述方法是利用基因组编辑技术，对叶绿体基因组进行定点剪切，通过提高外源基因在水稻叶绿体基因组中的重组效率和整合效率，从而提高叶绿体遗传转化效率；

所述方法具体包括如下步骤：

（1）构建叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体；所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中包含以下六段核苷酸序列：

第一核苷酸序列，其表达的蛋白质可以在第四核苷酸序列表达的单链RNA引导下对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切；

第二核苷酸序列，其为 hpt 潮霉素抗性基因，用于转化成功的转化子的筛选；

第三核苷酸序列，其表达的蛋白为绿色荧光蛋白，作为标记基因；

第四核苷酸序列，其转录表达产生的单链RNA可以引导第一核苷酸序列表达的蛋白质对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切；

第五核苷酸序列，其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段；

第六核苷酸序列，其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段；

（2）将步骤1所制备的构建体通过共转化转入水稻愈伤组织中，产生水稻叶绿体基因组转基因植株；

所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第三核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第四核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第五核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述第六核苷酸序列SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组编辑技术为CRISPR/Cas9技术或TALEN技术。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体全序列如SEQ ID NO.19 所示。

4.一种叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体全序列如SEQ ID NO.19 所示。

5.如权利要求4所述的水稻叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体在水稻叶绿体转化中的应用。

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