CN111004814A - 一种敏感的砷离子全细胞生物传感器的构建及砷离子浓度检测方法 - Google Patents

一种敏感的砷离子全细胞生物传感器的构建及砷离子浓度检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种敏感的砷离子全细胞生物传感器的构建及砷离子浓度检测方法。传感器检测质粒和报告质粒是重组的，由砷特异性蛋白调控启动子Pars、砷特异性结合蛋白ArsR基因与自反馈调控蛋白基因luxR组成的检测质粒；自反馈启动子PluxRI以及红色荧光蛋白mCherry基因、自反馈调控蛋白基因luxR组成的报告质粒。通过引入基于变体LuxR蛋白的正反馈放大系统作为调节元件，将传感器灵敏度提高20倍至0.1μM，特异性信号比值提高1.5～7.5倍。所述的砷离子生物传感器以大肠杆菌E.coli DH5α为宿主细胞，对砷离子检测具有高灵敏度与特异性，不受其他金属离子的干扰，具有广泛适应性。

Description

一种敏感的砷离子全细胞生物传感器的构建及砷离子浓度检 测方法
技术领域
本发明涉及一种可检测砷离子As(Ⅲ)含量的敏感型全细胞生物传感器的构建与使用，用于对水样中砷离子进行定量分析。特别是涉及一种敏感的砷离子全细胞生物传感器的构建及砷离子浓度检测方法。
背景技术
砷(As)是一种类金属元素，兼具金属与非金属的物化性质。它作为最常见的环境毒物之一，以不同形态的化合物广泛存在于水、土壤、空气以及食物中，被美国环保组织列为头等有害物质。
环境中的砷化物主要以亚砷酸盐As(Ⅲ)和砷酸盐As(V)两种形式存在，在这两种形式中，亚砷酸盐As(Ⅲ)的毒性是砷酸盐As(V)的20-60倍，被列为第一类致癌物质。摄入砷污染的水会严重危害人类健康，导致各种疾病的发生，如皮肤癌、肾脏和脑损伤等。世界卫生组织官员公布，全球至少有5000多万人口正面临地方性砷中毒的威胁，其中大多数为亚洲国家，而中国正是受砷中毒最为严重的国家之一。含砷、铅、镉等化合物的工业应用生产废水排放到水生生态系统中，导致其在环境中的毒性日益增加，这成为我们面临的一个严重问题。因此，有效的监控是至关重要的，也是非常具有挑战性的。这就需要一种快速和经济有效的系统，可以对水中的砷离子As(Ⅲ)进行检测和风险评估。
全细胞微生物传感器(Whole-cell biosensor)是一种便捷、快速、低成本的环境金属检测工具，它采用基因工程技术对活体微生物进行改造，使其能够对重金属污染物进行定量分析，主要包括检测元件和报告元件，检测元件是能够响应目标物质的部分，对于重金属离子全细胞生物传感器来说，检测元件包括可以与重金属离子特异性结合的转录调控蛋白基因以及控制其表达的启动子，报告元件一般选择一种便于检测的蛋白，如荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白TFP、红色荧光蛋白mCherry等，或荧光素等。当环境中存在重金属离子，重组质粒中的转录调控蛋白被重金属离子特异性激活，与特异性启动子绑定或者脱落，激活或者抑制启动子的启动，进而调控下游报告元件的表达量的变化，产生可检测的信号，并且信号强度与环境中存在的重金属的浓度密切相关。转录调控蛋白对砷离子As(Ⅲ)的绑定与识别能力是生物传感器的检测限的关键，同时报告元件的信号输出能力决定着微生物传感器的灵敏度。全细胞生物传感器已成为砷离子As(Ⅲ)检测的重要工具，同时对于砷离子As(Ⅲ)污染修复提供有效帮助。
目前，特异性不佳、灵敏度不高一直是限制重金属微生物传感器应用的瓶颈问题。为了解决这个问题，可以通过与放大器耦联来优化全细胞生物传感器基因电路，放大荧光响应信号，进而获得高灵敏度、高特异性的生物传感器。正反馈作为基因环路的一种重要调控机制，可由特定基因与目的基因相互作用，构成对目的基因表达放大调控的基因亚网络。
本研究将正反馈基因环路与放大器设计一起结合使用，选用变体LuxR蛋白作为正反馈系统的调节蛋白，与生物传感器设计的电路基础上进行结合，形成基因级联效应器，直接或间接的提升自身电路表达的产量，同时对电路诱导物质的敏感性更强。因此，通过添加正反馈放大系统来实现生物传感器灵敏度与特异性的提高，以弥补传统的砷离子生物传感器在检测上的不足。
发明内容
本发明的目的是通过对砷离子生物传感器进行设计，提供一种对砷离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器的构建方法，它克服原有生物传感器灵敏度低、特异性差的不足。
本发明的第二个目的是提供一种对砷离子As(Ⅲ)敏感的全细胞生物传感器通过荧光检测对砷离子浓度进行测定的方法；所述的全细胞是指转化有砷离子As(Ⅲ)检测的检测质粒、报告质粒、具有生命代谢活性的重组细菌。传感器检测质粒和报告质粒是重组的，包括一个由砷特异性蛋白调控启动子Pars(SEQ ID No.1)、砷特异性结合蛋白ArsR基因(SEQ ID No.2)与自反馈调控蛋白基因luxR(SEQ ID No.5)组成的检测质粒；自反馈启动子PluxRI(SEQ ID No.3)以及调控表达的红色荧光蛋白mCherry基因(SEQ ID No.4)、自反馈调控蛋白基因luxR(SEQ ID No.5)组成的报告质粒。此发明所用的宿主菌为大肠杆菌DH5α。
本发明的技术方案如下：
一种敏感的砷离子全细胞生物传感器构建方法；具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。
所述的传感器构建方法；包括如下步骤：
(1)砷离子As(Ⅲ)诱导的检测报告质粒的构建：是一个由砷特异性蛋白调控启动子Pars (SEQ ID No.1)和砷特异性结合蛋白ArsR基因(SEQ ID No.2)与自反馈调控蛋白基因 luxR(SEQ ID No.5)为核心元件组成的检测质粒pCDF-As-luxR以及自反馈启动子PluxRI(SEQ ID No.3)、红色荧光蛋白mCherry基因(SEQ ID No.4)、自反馈调控蛋白LuxR 基因(SEQ ID No.5)组成的报告质粒pGN68-mCherry；
(2)利用大肠杆菌E.coli DH5α作为宿主，将重组载体pCDF-As-luxR以及质粒pGN68-mCherry共转化，得到对砷离子As(Ⅲ)敏感性的目标全细胞生物传感器底盘细胞。
利用本发明的敏感的砷离子全细胞生物传感器对砷离子As(Ⅲ)浓度检测方法，以已知的砷离子As(Ⅲ)浓度诱导产生的荧光信号强度制作标准曲线，建立砷离子As(Ⅲ)与荧光蛋白表达量之间的关系；利用传感器对砷离子As(Ⅲ)的检测方法，以E.coli DH5α为宿主菌，从而对环境中的砷离子As(Ⅲ)进行定量。
所述的对砷离子As(Ⅲ)浓度检测方法，包括如下步骤：
(1)试管种子液培养：将目标全细胞生物传感器底盘细胞按照0.5-2％接种量接种在LB 培养基于试管中，37℃，220rpm，过夜培养12-16h，得到种子培养液；
(2)加砷As(Ⅲ)培养：取种子培养液按照0.5-2％接种量，转接到含有2-5mL无抗性的 LB培养基的试管中，分别向不同的试管中加入砷离子As(Ⅲ)，使每个试管中砷离子As(Ⅲ) 终浓度分别为0～200μM，每种砷离子As(Ⅲ)浓度设置至少3个平行样，并置于37℃，220rpm培养8h，取样检测；
(3)对砷离子As(Ⅲ)全细胞生物传感器的荧光检测：取200μl菌液于干净的酶标板中，于酶标仪中测定600nm波长下的吸光度以及相应的荧光信号强度；绿色荧光测量条件为：激发波长480nm，发射波长520nm，红色荧光测量条件为：激发波长580nm，激发波长610nm；
(4)以E.coli DH5α为宿主菌，通过构建的砷离子全细胞生物传感器测定已知浓度为 0-200μM的砷离子As(Ⅲ)，利用已知的砷离子As(Ⅲ)浓度与相对应的荧光强度的关系制作标准曲线，对实验数据进行拟合得到拟合方程，拟合度R2因子≥0.95；通过测定环境中的未知浓度砷离子As(Ⅲ)的荧光强度，利用拟合方程，计算出环境中的砷离子As(Ⅲ) 的浓度。
在本发明中，检测元件为砷特异性蛋白调控启动子Pars(SEQ ID No.1)和砷特异性结合蛋白ArsR基因(SEQ ID No.2)，报告元件为红色荧光蛋白mCherry基因(SEQ ID No.4)。
本发明的优点：
本发明构建的可检测砷离子As(Ⅲ)浓度的全细胞生物传感器，以E.coli DH5α为宿主菌，通过荧光强度与砷离子As(Ⅲ)浓度的关系制作标准曲线，从而对环境中的砷离子As(Ⅲ)进行定量。本发明将正反馈基因环路与放大器设计一起结合使用，选用变体LuxR 蛋白作为正反馈系统的调节蛋白，与生物传感器设计的电路基础上进行结合，形成基因级联效应器。
如附图2所示，当环境中存在砷离子As(Ⅲ)时，砷特异性结合蛋白ArsR与As(Ⅲ)的亲和力较高，导致蛋白二聚体结构构象发生改变并从启动子Pars的结合区上面脱离，启动子得以激活使得转录发生，启动下游自反馈调控蛋白LuxR的表达，LuxR蛋白作为一种转录激活因子，诱导自反馈启动子PluxRI转录表达下游红色荧光蛋白mCherry与自反馈调控蛋白LuxR，通过自反馈调控蛋白LuxR的表达，反过来激活自反馈启动子PluxRI，使红色荧光蛋白mCherry与自反馈调控蛋白LuxR表达量增加，从而形成一个正反馈循环。本发明可通过正反馈放大系统结合生物传感器设计的基因电路，放大荧光响应信号，提高灵敏度和特异性，实现对环境中的砷离子As(Ⅲ)进行高敏感定量检测。
本发明利用ars操纵子中的砷结合蛋白ArsR及其特异性启动子Pars作为检测元件，红色荧光蛋白基因mcherry作为报告元件，构建了可以对砷离子As(Ⅲ)进行检测的生物传感器细胞。通过引入基于变体LuxR蛋白的正反馈放大系统作为调节元件，将传感器灵敏度提高20倍至0.1μM，特异性信号比值提高1.5～7.5倍。所述的砷离子生物传感器以大肠杆菌E.coli DH5α为宿主细胞，对砷离子检测具有高灵敏度与特异性，不受其他金属离子的干扰，具有广泛适应性。
附图说明
图1是全细胞生物传感器的质粒构建图谱。
图2是全细胞生物传感器细胞的工作机理图。
图3是本发明中以红色荧光蛋白基因为报告元件的砷离子As(Ⅲ)正反馈生物传感器 AL在加入不同浓度砷离子As(Ⅲ)，所测得的荧光强度随砷离子浓度变化关系曲线。
图4是本发明中砷离子生物传感器在加入不同浓度、不同种类金属离子，所测得的荧光强度随离子浓度变化关系曲线，即砷离子生物传感器特异性响应图。
图5是本发明中砷离子生物传感器测定已知浓度为0-200μM的砷离子As(Ⅲ)的荧光强度，对已知的砷离子As(Ⅲ)浓度与相对应的荧光强度进行拟合得到拟合方程(拟合度R2因子≥0.95)，即砷离子生物传感器砷离子As(Ⅲ)浓度-荧光响应拟合曲线。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的详细说明：
利用大肠杆菌DH5α基因组中的ars操纵子中的启动子Pars(SEQ ID No.1)和arsR基因(SEQ ID No.2)，大肠杆菌(Escherichia coli)pGN68的带有自反馈功能的启动子PluxRI(SEQ ID No.3)和调控蛋白luxR(SEQ ID No.5)以及红色荧光蛋白基因mcherry (SEQID No.4)，在工程大肠杆菌DH5α中实现了对砷离子As(Ⅲ)检测的全细胞生物传感器的构建。
原始底盘细胞为E.coli DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。
本发明所用pCDFDuet-1、pGN68质粒作为构建砷离子As(Ⅲ)生物传感器的检测与荧光蛋白的表达载体。其中，质粒pCDFDuet-1为商业化质粒，质粒pGN68序列如SEQ ID No.6所示。
LB培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa 压力121℃下灭菌20min。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种可检测砷离子As(Ⅲ)含量的敏感型全细胞生物传感器的构建
1.检测质粒pCDF-As-luxR的构建(附图1所示)
通过PCR扩增得到的砷特异性启动子Pars(SEQ ID No.1)和特异性结合蛋白基因arsR序列(SEQ ID No.2)所示核苷酸，即片段Pars-arsR。在片段Pars-arsR两端分别加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。使用FastDigest内切酶进行酶切，反应体系为：5μL 10*FD buffer，2.5μL BamHⅠ、2.5μL EcoRⅠ、30μL加酶切位点的Pars-arsR片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，2h。使用PCR纯化试剂盒，将50μL酶切产物中，加入250 μL Bingding Buffer溶液，混匀后加入吸附柱中，静置一分钟，10,000xg离心1分钟，弃出流出液。加入650μL Wash Buffer，10,000g离心1分钟，弃出流出液。10,000xg离心 2分钟，去除残留的Wash Buffer。将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30μL Elution Buffer(Elution Buffer提前在65℃水浴锅中预热)，室温静置1分钟，10,000 xg离心1分钟，洗脱酶切后的Pars-arsR片段。同样将pCDFDuet-1质粒用FastDigest内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。将酶切后核苷酸和质粒进行连接反应。反应体系为：1μL 10*T4DNA Ligase Buffer，1μL T4DNA Ligase，6μL 酶切后的核苷酸片段和2μL酶切后质粒。反应条件为：22℃，10min。酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆提质粒，测序验证，得到SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2所示核苷酸连接到表达载体pAs。
将pGN68质粒(SEQ ID No.6)所含自反馈调控蛋白LuxR基因序列(SEQ ID No.5)所示核苷酸，通过PCR扩增方式在两端分别加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。使用 FastDigest内切酶将两个片段分别与表达载体pAs进行双酶切，然后通过DNA连接酶将SEQ ID No.5所示核苷酸分别连接到表达载体pAs上，酶切连接反应体系及反应条件按照表达载体pAs构建方法。酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组载体pCDF-As-luxR，测序验证。
2.报告质粒pGN68-mCherry的构建(附图1所示)
质粒pGN68(SEQ ID No.6)所含自反馈启动子PluxRI，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；质粒pGN68所含自反馈调控蛋白LuxR，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
人工全合成SEQ ID No.4所示红色荧光蛋白基因mcherry并在序列两端加入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点。通过使用FastDigest内切酶对上述片段以及质粒pGN68分别进行酶切，然后以T4 DNA连接酶连接并转化至感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，获得质粒pGN68-mCherry，测序验证。
3.检测质粒pCDF-As-luxR和报告质粒pGN68-mCherry共转化到大肠杆菌底盘菌株E. coli DH5α
重组表达载体转化到大肠杆菌底盘菌株E.coli DH5α中的详细构建步骤如下：
1)、将活化的E.coli DH5α100μL，接种于10ml LB培养基中，37℃，220rpm，培养至OD600为0.6时，转入10ml离心管中，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体；
2)、用5ml预冷的灭过菌的0.1mol/L氯化钙洗涤菌体，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体，重复洗涤两次；
3)、尽量倒尽上清，加入50μL 0.1mol/L氯化钙，50μL 30％甘油重悬菌体，制成E.coli DH5α感受态细胞；
4)、将实施例1中构建的pCDF-As-luxR与质粒pGN68-mCherry质粒各2μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。冰上防止半小时后，热击45s并迅速冰浴2min，加入1mL LB培养基，37℃复苏1h后涂布对应含有链霉素和氯霉素双抗性的平板，过夜培养；
5)、挑选菌落PCR验证的阳性转化子到5ml LB培养基中过夜培养，得到对砷离子As(Ⅲ)敏感性的目标全细胞生物传感器底盘细胞。
实施例2目标全细胞生物传感器对砷离子As(Ⅲ)的检测
1.目标全细胞生物传感器底盘细胞的发酵及砷标准溶液诱导下的荧光检测
将目标全细胞生物传感器底盘细胞按照1％接种量接种在LB培养基于试管中，37℃， 220rpm，过夜培养14h，得到种子培养液。取种子培养液按照1％接种量，转接到含有5mL无抗性的LB培养基试管中，分别向不同的试管中加入砷离子As(Ⅲ)，使每个试管中砷离子As(Ⅲ)终浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200μM，每种砷离子As(Ⅲ)浓度设置3个平行样，并置于37℃，220rpm培养8h。
取样进行吸光度以及荧光信号的检测。吸光度在600nm波长下进行测量，红色荧光测量条件为：激发波长580nm，激发波长610nm。
数据处理：使用公式FIR＝AFU/BFU计算荧光相对值(FIR)，其中FIR样品检测荧光值(AFU)定义为相对荧光值(RFU)除以样品吸光度；将对照检测荧光值(BFU) 定义为E.ColiDH5α细胞(阴性对照)中检测到的相对荧光值(RFU)除以对照吸光度。将对照检测荧光值(BFU)设定为1.0，其他样品归一化至对照检测荧光值(BFU)。
2.实验结果
本发明中以红色荧光蛋白基因为报告元件的砷离子As(Ⅲ)正反馈生物传感器在加入不同浓度砷离子As(Ⅲ)，所测得的荧光强度随砷离子浓度变化关系曲线如图3所示。采用正反馈基因级联方法系统优化砷离子生物传感器可以将灵敏度提高25倍至0.1μM，最低检测限降低了5倍，达到0.1μM，低于世界卫生组织的饮用水中砷含量标准。
本发明中砷离子生物传感器在加入不同浓度、不同种类金属离子，所测得的荧光强度随离子浓度变化关系曲线，即砷离子生物传感器特异性响应图如图4所示。由于输出信号的放大，正反馈生物传感器将生物传感器特异性信号比值提高1.5～7.5倍。
实施例3目标全细胞生物传感器对砷离子As(Ⅲ)的检测
将目标全细胞生物传感器底盘细胞按照2％接种量接种在含LB培养基的试管中，37℃，220rpm，过夜培养12h，得到种子培养液。取种子培养液按照2％接种量，转接到含有5mL无抗性的LB培养基试管中，分别向不同的试管中加入砷离子As(Ⅲ)，使每个试管中砷离子As(Ⅲ)终浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200μM，每种砷离子As(Ⅲ)浓度设置3个平行样，并置于37℃，220rpm培养8h。
其余实验步骤与数据处理与实施例2相同，实验结果也与实施例2相同。
实施例4目标全细胞生物传感器对砷离子As(Ⅲ)的检测
将目标全细胞生物传感器底盘细胞按照0.5％接种量接种在含LB培养基的试管中， 37℃，220rpm，过夜培养16h，得到种子培养液。取种子培养液按照0.5％接种量，转接到含有2mL无抗性的LB培养基试管中，分别向不同的试管中加入砷离子As(Ⅲ)，使每个试管中砷离子As(Ⅲ)终浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、 200μM，每种砷离子As(Ⅲ)浓度设置3个平行样，并置于37℃，220rpm培养8h。其余实验步骤与数据处理与实施例2相同，实验结果也与实施例2相同。
实施例5目标全细胞生物传感器对未知浓度砷离子As(Ⅲ)的检测
1.目标全细胞生物传感器对砷标准溶液与未知浓度砷离子的荧光检测
将目标全细胞生物传感器底盘细胞按照1％接种量接种在LB培养基于试管中，37℃， 220rpm，过夜培养14h，得到种子培养液。取种子培养液按照1％接种量，转接到含有5mL无抗性的LB培养基试管中，分别向不同的试管中加入砷离子As(Ⅲ)，使每个试管中砷离子As(Ⅲ)终浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200μM。取种子培养液按照1％接种量，转接到含有5mL无抗性的LB培养基试管中，向试管中加入未知浓度的砷离子As(Ⅲ)。每种砷离子As(Ⅲ)浓度设置3个平行样，并置于37℃， 220rpm培养8h。
其余实验步骤与数据处理与实施例2相同。
2.实验结果
本发明中通过构建的砷离子全细胞生物传感器测定已知浓度分别为0、0.01、0.05、 0.1、0.5、1、5、10、50、100、200μM的砷离子As(Ⅲ)，利用已知的砷离子As(Ⅲ)浓度与相对应的荧光强度的关系制作标准曲线，对实验数据进行拟合得到拟合方程(拟合度 R2因子≥0.95)，结果如图5所示，得到的荧光相对值(FIRs)与砷离子As(Ⅲ)浓度的函数关系为：y＝-2.1093x3+1.42x2+38.41063x+55.18346，拟合度R2因子达0.9713。通过测定环境中的未知浓度砷离子As(Ⅲ)的荧光强度，利用拟合方程，可计算出环境中的砷离子As(Ⅲ)的浓度。本实例测得未知浓度砷离子As(Ⅲ)的荧光强度FIRs为50.598，根据拟合方程，环境中的砷离子As(Ⅲ)浓度为0.76μM。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
SEQ ID NO.1
CTCCTTTCAAATGAATAGCCAACTCAAAATTCACACCTATTACCTTCCTCTGCACTTACACATTCG TTAAGTCATATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAGACACTACCTGCAACAATCAGGAGC GCAAT SEQ IDNO.2
ATGTCATTTCTGTTACCCATCCAATTGTTCAAAATTCTTGCTGATGAAACCCGTCTGGGCATCGTT TTACTGCTCAGCGAACTGGGAGAGTTATGCGTCTGCGATCTCTGCACTGCTCTCGACCAGTCGC AGCCCAAGATCTCCCGCCACCTGGCATTGCTGCGTGAAAGCGGGCTATTGCTGGACCGCAAGCA AGGTAAGTGGGTTCATTACCGCTTATCACCGCATATTCCAGCATGGGCGGCGAAAATTATTGATG AGGCCTGGCGATGTGAACAGGAAAAGGTTCAGGCGATTGTCCGCAACCTGGCTCGACAAAACT GTTCCGGGGACAGTAAGAACATTTGCAGTTAA SEQ ID NO.3
AGTCCTTTGATTCTAATAAATTGGATTTTTGTCACACTATTGTATCGCTGGGAATACAATTACTTAACATAAGCACCTGTAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGAATAAACGC A SEQ IDNO.4
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTG CACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCC CTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTG GGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATC CCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAG GACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAG GTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAG AGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAA GAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAA CGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCAT GGACGAGCTGTACAAGTAG SEQ ID NO.5
ATGCCTTCTCTAGTTGATAATTATCGAAAAATAAATATAGCAAATAATAAATCAAACAACGATTTA ACCAAAAGAGAAAAAGAATGTTTAGCGTGGGCATGCGAAGGAAAAAGCTCTTGGGATATTTCA AAAATATTAGGCTGCAGTGAGCGTACTGTCACTTTCCATTTAACCAATGTGCAAATGAAACTCAA TACAACAAACCGCTGCCAAAGTATTTCTAAAGCAATTTTAACAGGAGCAATTGATTGCCCATACT TTAAAAATTAA SEQ ID NO.6
GAATTCATACGTATTTAAATCAGGAGTGGAAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTT GTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGG TGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTG TTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTGACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATC ATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATA TTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTG TTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTG GAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACA AAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTG CCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGC TGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAATAAGGATCCAACTAAAGATTAACTTTATA AGGAGGAAAAACATATGCCTTCTCTAGTTGATAATTATCGAAAAATAAATATAGCAAATAATAAAT CAAACAACGATTTAACCAAAAGAGAAAAAGAATGTTTAGCGTGGGCATGCGAAGGAAAAAGCT CTTGGGATATTTCAAAAATATTAGGCTGCAGTGAGCGTACTGTCACTTTCCATTTAACCAATGTGC AAATGAAACTCAATACAACAAACCGCTGCCAAAGTATTTCTAAAGCAATTTTAACAGGAGCAAT TGATTGCCCATACTTTAAAAATTAATAAGCGGCCGCTTAATTAATTAATCTAGAGGCATCAAATAA AACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCT CCTGAGTAGGACAAATCCGCCGCCCTAGACCTAGGGCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCT CACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGA GCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGG CTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACA GGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCT GCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCAC GCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCC CGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACAC GACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTG CTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGC GCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACC ACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTC AAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGG GATTTTGGTCATGACTAGTGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGT TCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAG CTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCT GCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTG TCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCAC GTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATA AACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAG AAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGG AAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACG AAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGC TTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACAT TGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGT ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGT CTCATTTTCGCCAGATATCGACGTCAGTCCTTTGATTCTAATAAATTGGATTTTTGTCACACTATTG TATCGCTGGGAATACAATTACTTAACATAAGCACCTGTAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAA TGGTTTGTTATAGTCGAATAAACGCA。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种敏感的砷离子全细胞生物传感器的构建及砷离子浓度检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcctttcaa atgaatagcc aactcaaaat tcacacctat taccttcctc tgcacttaca 60
cattcgttaa gtcatatatg tttttgactt atccgcttcg aagagagaca ctacctgcaa 120
caatcaggag cgcaat 136
<210> 2
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtcatttc tgttacccat ccaattgttc aaaattcttg ctgatgaaac ccgtctgggc 60
atcgttttac tgctcagcga actgggagag ttatgcgtct gcgatctctg cactgctctc 120
gaccagtcgc agcccaagat ctcccgccac ctggcattgc tgcgtgaaag cgggctattg 180
ctggaccgca agcaaggtaa gtgggttcat taccgcttat caccgcatat tccagcatgg 240
gcggcgaaaa ttattgatga ggcctggcga tgtgaacagg aaaaggttca ggcgattgtc 300
cgcaacctgg ctcgacaaaa ctgttccggg gacagtaaga acatttgcag ttaa 354
<210> 3
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtcctttga ttctaataaa ttggattttt gtcacactat tgtatcgctg ggaatacaat 60
tacttaacat aagcacctgt aggatcgtac aggtttacgc aagaaaatgg tttgttatag 120
tcgaataaac gca 133
<210> 4
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711
<210> 5
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgccttctc tagttgataa ttatcgaaaa ataaatatag caaataataa atcaaacaac 60
gatttaacca aaagagaaaa agaatgttta gcgtgggcat gcgaaggaaa aagctcttgg 120
gatatttcaa aaatattagg ctgcagtgag cgtactgtca ctttccattt aaccaatgtg 180
caaatgaaac tcaatacaac aaaccgctgc caaagtattt ctaaagcaat tttaacagga 240
gcaattgatt gcccatactt taaaaattaa 270
<210> 6
<211> 3062
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcatac gtatttaaat caggagtgga aatgagtaaa ggagaagaac ttttcactgg 60
agttgtccca attcttgttg aattagatgg tgatgttaat gggcacaaat tttctgtcag 120
tggagagggt gaaggtgatg caacatacgg aaaacttacc cttaaattta tttgcactac 180
tggaaaacta cctgttccat ggccaacact tgtcactact ttgacttatg gtgttcaatg 240
cttttcaaga tacccagatc atatgaaacg gcatgacttt ttcaagagtg ccatgcccga 300
aggttatgta caggaaagaa ctatattttt caaagatgac gggaactaca agacacgtgc 360
tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc gagttaaaag gtattgattt 420
taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa attggaatac aactataact cacacaatgt 480
atacatcatg gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagtt aacttcaaaa ttagacacaa 540
cattgaagat ggaagcgttc aactagcaga ccattatcaa caaaatactc caattggcga 600
tggccctgtc cttttaccag acaaccatta cctgtccaca caatctgccc tttcgaaaga 660
tcccaacgaa aagagagacc acatggtcct tcttgagttt gtaacagctg ctgggattac 720
acatggcatg gatgaactat acaaataata aggatccaac taaagattaa ctttataagg 780
aggaaaaaca tatgccttct ctagttgata attatcgaaa aataaatata gcaaataata 840
aatcaaacaa cgatttaacc aaaagagaaa aagaatgttt agcgtgggca tgcgaaggaa 900
aaagctcttg ggatatttca aaaatattag gctgcagtga gcgtactgtc actttccatt 960
taaccaatgt gcaaatgaaa ctcaatacaa caaaccgctg ccaaagtatt tctaaagcaa 1020
ttttaacagg agcaattgat tgcccatact ttaaaaatta ataagcggcc gcttaattaa 1080
ttaatctaga ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 1140
atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccgcc ctagacctag 1200
ggcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 1260
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 1320
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 1380
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 1440
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1500
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 1560
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1620
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1680
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1740
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1800
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1860
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1920
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1980
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg actagtgctt ggattctcac caataaaaaa 2040
cgcccggcgg caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg agttctgagg tcattactgg 2100
atctatcaac aggagtccaa gcgagctcga tatcaaatta cgccccgccc tgccactcat 2160
cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca cagacggcat 2220
gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 2280
tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 2340
aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 2400
aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 2460
aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 2520
tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgaa 2580
attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 2640
gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat 2700
aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata 2760
tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa 2820
atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg 2880
aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccagat atcgacgtca gtcctttgat 2940
tctaataaat tggatttttg tcacactatt gtatcgctgg gaatacaatt acttaacata 3000
agcacctgta ggatcgtaca ggtttacgca agaaaatggt ttgttatagt cgaataaacg 3060
ca 3062

Claims (4)

1.一种敏感的砷离子全细胞生物传感器构建方法；其特征是具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。
2.如权利要求1所述的传感器构建方法；其特征是包括如下步骤：
(1)砷离子As(Ⅲ)诱导的检测报告质粒的构建：是一个由砷特异性蛋白调控启动子Pars(SEQ ID No.1)和砷特异性结合蛋白ArsR基因(SEQ ID No.2)与自反馈调控蛋白基因luxR(SEQ ID No.5)为核心元件组成的检测质粒pCDF-As-luxR以及自反馈启动子PluxRI(SEQ IDNo.3)、红色荧光蛋白mCherry基因(SEQ ID No.4)、自反馈调控蛋白LuxR基因(SEQ IDNo.5)组成的报告质粒pGN68-mCherry；
(2)利用大肠杆菌E.coli DH5α作为宿主，将重组载体pCDF-As-luxR以及质粒pGN68-mCherry共转化，得到对砷离子As(Ⅲ)敏感性的目标全细胞生物传感器底盘细胞。
3.利用权利要求1或2的传感器对砷离子As(Ⅲ)的检测方法，其特征在于，以已知的砷离子As(Ⅲ)浓度诱导产生的荧光信号强度制作标准曲线，建立砷离子As(Ⅲ)与荧光蛋白表达量之间的关系；利用传感器对砷离子As(Ⅲ)的检测方法，以E.coli DH5α为宿主菌，从而对环境中的砷离子As(Ⅲ)进行定量。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)试管种子液培养：将目标全细胞生物传感器底盘细胞按照0.5-2％接种量接种在LB培养基于试管中，37℃，220rpm，过夜培养12-16h，得到种子培养液；
(2)加砷As(Ⅲ)培养：取种子培养液按照0.5-2％接种量，转接到含有2-5mL无抗性的LB培养基的试管中，分别向不同的试管中加入砷离子As(Ⅲ)，使每个试管中砷离子As(Ⅲ)终浓度分别为0-200μM，每种砷离子As(Ⅲ)浓度设置至少3个平行样，并置于37℃，220rpm培养8h，取样检测；
(3)对砷离子As(Ⅲ)全细胞生物传感器的荧光检测：取200μl菌液于干净的酶标板中，于酶标仪中测定600nm波长下的吸光度以及相应的荧光信号强度；绿色荧光测量条件为：激发波长480nm，发射波长520nm，红色荧光测量条件为：激发波长580nm，激发波长610nm；
(4)以E.coli DH5α为宿主菌，通过构建的砷离子全细胞生物传感器测定已知浓度为0-200μM的砷离子As(Ⅲ)，利用已知的砷离子As(Ⅲ)浓度与相对应的荧光强度的关系制作标准曲线，对实验数据进行拟合得到拟合方程，拟合度R2因子≥0.95；通过测定环境中的未知浓度砷离子As(Ⅲ)的荧光强度，利用拟合方程，计算出环境中的砷离子As(Ⅲ)的浓度。
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