CN115109792A - 一种基于大肠杆菌的无细胞反应体系及其应用 - Google Patents

一种基于大肠杆菌的无细胞反应体系及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种无细胞反应体系，包括DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细胞提取物为减基因细胞提取物。本申请还公开了多种用于分析检测的无细胞反应体系，其对重金属离子As3+、Hg2+的检测、有机分子群体感应分子AHLs的检测、RNA的检测、苯甲酸的检测以及对金属离子Zn2+的检测都表现出了明显的优势，具有更广泛的用途和发展前景。本申请还公开了无细胞反应体系检测分析物的方法，以及减基因细胞提取物在无细胞反应体系中的应用。

Description

一种基于大肠杆菌的无细胞反应体系及其应用
技术领域
本申请涉及生物反应系统领域，具体涉及一种基于大肠杆菌的无细胞反 应体系及其应用
背景技术
合成生物学可以实现生物体系基于工程目标的人工设计和改造，生产具 有目标生物学功能的蛋白质，促进了生物医药、生物催化、诊断检测等领域 的快速发展。但多数情况下，合成生物学与活细胞联系在一起，膜屏障以及 一些安全因素成为活细胞蛋白工程化设计的巨大阻碍。无细胞反应体系无需 完整的活细胞，通过体外转录翻译过程，可简单，灵活且可控的进行蛋白质 合成，克服了合成生物学所面临的巨大挑战。无细胞反应体系作为新兴的多 学科交叉手段，它引起了极大地关注。
无细胞反应体系以DNA或者mRNA作为模板，依赖于外部添加的供能 物质、反应底物、无机盐、酶等辅助因子，以及合适pH和PEG8000通过对 RNA周围三维空间的限制从而提供的类似于细胞内部的分子拥挤环境，最 终实现转录、翻译的过程。结合当今环境污染和人类疾病频发的局面。一些 环境污染物和疾病、病毒等严重威胁着人类的生存环境和健康。为了更快、 更准确地检测这些危害，低成本、高效率的无细胞反应体系成为迫切的需要。 而基于以上优势，无细胞反应体系在快速检测环境污染物、临床生物医学应 用和疾病病原体检测等方面都取得了显著的成就。
无细胞反应体系的出现修复了传统的基于细胞的转录翻译体系存在的 部分缺陷，如其在响应速度、稳定性及生物安全性等方面相较于细胞体系都 有明显的提升。但无细胞反应体系中，最常见和普遍使用的以大肠杆菌菌株 细胞提取物为基础的体系，因为其复杂性及内容物中非特异性酶类物质的存 在，不可避免地会对外部添加的反应物存在负面效应，并对目标反应存在潜 在的影响和干扰；同时，粗提取物内含的复杂的代谢反应可能会与外加的工 程反应存在物质、能量等方面的竞争关系，造成系统中的转录翻译噪声干扰， 同时产生不必要的能量消耗，导致报告蛋白表达量受限，输出信号强度较差， 从而限制其应用效果。例如RNA输出传感器对金属锌离子进行检测时，传 统的Rosetta2(DE3)提取物中非特异性核酸酶的含量较高，导致转录产生的 RNA迅速被降解，无法与染料结合产生荧光。因此体系产生的荧光信号强 度非常弱，仅在100a.u.左右，对信号检测设备产生了较高的要求，应用受 限。
目前，克服基于细胞粗提取物的体系缺陷的方式之一，就是利用PURE 体系替代粗提取物体系进行胞外的转录翻译活动。PURE体系组分明确可控， 减少了复杂体系对目标反应存在潜在干扰的风险；且该体系不存在非特异性 的酶类物质，避免了外部添加的核酸模板及报告基因表达蛋白质等的损失， 是一种较为理想的研究体系。但PURE体系的高成本是阻碍其在广泛使用的 重要原因。PURE体系涉及大量的纯化组分，虽然目前市场上已有在售的 PURE体系试剂盒，操作也非常便捷，但其价格十分昂贵，如日本Gene Frontier公司的PURE
Figure BDA0003708534890000021
重组的无细胞蛋白质合成试剂盒，其每个无细胞 反应的均价在114.8元人民币左右，成本极高。
发明内容
为了优化基于提取物体系的无细胞反应体系(本文中也称之为无细胞生 物传感器)，本申请使用基于大肠杆菌K-12菌株的两种基因删减分别为11.94％ 和38.12％的减基因组大肠杆菌作为宿主生物为基础来构建无细胞反应体系。
具体的，本申请采用如下技术方案：
1、一种无细胞反应体系，包括DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细 胞提取物为减基因细胞提取物。
2、根据项1所述的反应体系，所述减基因细胞为减基因组大肠杆菌， 优选为对标准大肠杆菌菌株进行大片段基因删减后得到的减基因组菌株，
进一步优选大片段基因删减是指与未删减的标准大肠杆菌菌株全基因 组相比，分别删除了全基因组的11.94％(MGF-01)和38.12％(ME5147)的两种 减基因组大肠杆菌；
进一步优选为对标准大肠杆菌菌株W3110和MG1655进行大片段基因 删减后得到的减基因组菌株。
3、根据项2所述的反应体系，所述减基因组大肠杆菌为大肠杆菌菌株 ME5147或大肠杆菌菌株MGF-01。
4、根据项1-3中任一项所述的反应体系，还包括氨基酸、能量底物、 辅助因子、盐和水中的一种或者两种以上。
5、根据项1-4中任一项所述的反应体系，，所述无细胞反应体系为基 于转录翻译过程的无细胞反应体系或基于转录过程的无细胞反应体系。
6、一种用于检测分析物的无细胞反应体系，其包括：DNA/RNA模板 和细胞提取物，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，
其中，DNA/RNA模板包括转录翻译调控元件和编码报告蛋白的基因， 其中分析物与转录翻译调控元件的相互作用能够启动或激活转录翻译调控 元件从而启动或激活编码报告蛋白的基因转录或表达。
7、根据项6所述的反应体系，
所述分析物为重金属离子，进一步优选为砷离子或汞离子；或者
所述分析物为有机分子群体感应分子，进一步优选为感应分子AHLs； 或者
所述分析物为RNA，进一步优选为病毒RNA或细菌RNA。
8、根据项6所述的反应体系，所述转录翻译调控元件为转录因子或支 点开关，优选，所述转录因子为抑制性转录因子或激活性转录因子。
9、根据项6所述的反应体系，所述分析物为重金属离子，优选为砷离 子或汞离子，所述转录因子为抑制性转录因子。
10、根据项6所述的反应体系，所述分析物为有机分子群体感应分子， 优选为感应分子AHLs，所述转录因子为激活性转录因子。
11、根据项6所述的反应体系，所述分析物为RNA，优选为病毒RNA 或细菌RNA，所述转录因子为支点开关。
12、根据项6-11中任一项所述的反应体系，所述无细胞反应体系为项 1-5中任一项所述的无细胞反应体系。
13、一种利用项6-12中任一项所述无细胞反应体系检测分析物的方法， 其包括：
将待分析样本加入到无细胞反应体系中，
检测所述无细胞反应体系中产生的报告蛋白的产生或产生量来对待分 析样本中的分析物进行定性或定量分析；
所述无细胞反应体系包括：DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细胞提 取物为减基因细胞提取物，其中，DNA/RNA模板包括转录翻译调控元件和 编码报告蛋白的基因，其中分析物与转录翻译调控元件的相互作用能够启动 或激活转录翻译调控元件从而启动或激活编码报告蛋白的基因转录或表达。
14、一种用于检测分析物的无细胞反应体系，其包括：噬菌体/原核生物 RNA聚合酶、DNA/RNA模板和细胞提取物，以及染料分子，所述细胞提取 物为减基因细胞提取物，
其中，DNA/RNA模板包括转录调控元件，其中分析物与转录调控元件 的相互作用能够启动RNA转录过程产生与染料分子结合的适体RNA。
15、根据项14所述的反应体系，所述分析物为金属、芳香化合物或抗 生素，
优选，所述金属为锌离子；
优选，所述芳香族化合物为苯甲酸。
16、根据项14所述的反应体系，所述转录调控元件为转录因子MobR 或SmtB。
17、根据项14所述的反应体系，所述染料分子为三向结二聚花椰菜 (Three-wayjunction dimeric Broccoli,3WJdB)。
18、根据项14所述的反应体系，所述分析物为锌离子，所述染料分子 为转录因子SmtB，所述染料分子为三向结二聚花椰菜(3WJdB)。
19、根据项14所述的反应体系，所述分析物为苯甲酸，述转录调控元 件为转录因子MobR，所述染料分子为三向结二聚花椰菜(Three-way junction dimeric Broccoli,3WJdB)。
20、根据项14-19中任一项所述的反应体系，所述无细胞反应体系为项 1-5中任一项所述的无细胞反应体系。
21、一种利用项14-20中任一项所述无细胞反应体系检测分析物的方法， 其包括：
将待分析样本加入到无细胞反应体系中，
检测所述无细胞反应体系中产生的适体RNA的产生或产生量，与所述 染料分子结合产生的荧光来对待分析样本中的分析物进行定性或定量分析；
所述无细胞反应体包括：噬菌体RNA聚合酶(RNAP)、DNA/RNA模板 和细胞提取物，以及染料分子，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，
其中，DNA/RNA模板包括转录调控元件，其中分析物与转录调控元件 的相互作用能够启动RNA转录过程产生与染料分子结合的适体RNA。
22、减基因细胞提取物在无细胞反应体系中的用途。
发明效果
1.本申请提供的在无细胞反应体系中使用的细胞提取物为减基因组大 肠杆菌ΔW3110、ΔMG1655提取物，相比于其亲本W3110菌株、MG1655 菌株，两种减基因组菌株的蛋白表达量分别约为其亲本的1.27倍和2.07倍， 表明在无细胞反应体系中，本申请使用的减基因组大肠杆菌具有更好的生长 状况、更高的蛋白表达水平和更稳定精确的外部基因复制扩增状态。
2.本申请进一步将减基因组菌株的提取物应用到不同检测原理和针对 不同检测对象的无细胞反应体系中，提供了多种用于分析检测的无细胞反应 体系，其对重金属离子As3+、Hg2+的检测、有机分子群体感应分子AHLs的 检测、RNA的检测、苯甲酸的检测以及对金属离子Zn2+的检测都表现出了 明显的优势，具有更广泛的用途和发展前景。
3.本申请中在无细胞反应体系中使用的减基因组菌株的细胞提取物相 比于亲本大肠杆菌组分更加简单，可以在一定程度上降低其对目标反应的潜 在影响，有希望成为传统大肠杆菌提取物体系的优化替代。本申请中减基因 组菌株在各体系中的尝试为无细胞反应体系的优化提供了新的思路，并结合 转录组学和蛋白组学等分析手段，进一步确认其适用范围和其在无细胞体系 中应用的优势所在。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1ΔW3110菌株与亲本W3110菌株间的SNV/InDel差异分布信息；
图2ΔMG1655菌株与亲本MG1655菌株间的SNV/InDel差异分布信息；
图3无细胞蛋白表达实验流程；
图4五种菌株提取物体系用于sfGFP表达12h后的蛋白产量对比；
图5无细胞生物传感器的工作流程；
图6 As3+检测传感器原理示意图；
图7三种菌株提取物体系用于As3+检测传感器12h后的荧光信号对比；
图8三种菌株提取物体系用于Hg3+检测传感器12h后的荧光信号对比；
图9 AHLs检测传感器原理示意图；
图10五种菌株提取物体系用于AHLs检测传感器12h后的荧光信号对 比；
图11 RNA检测传感器原理示意图；
图12五种菌株提取物体系用于RNA检测传感器12h后的荧光信号对 比；
图13配体诱导激活的RNA输出传感器原理示意图；
图14苯甲酸检测传感器输出荧光强度随时间的关系；
图15 Zn2+检测传感器输出荧光强度随时间的关系。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种 细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术 人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背 离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公 知功能和结构的描述。
本申请提供了一种无细胞反应体系，包括DNA/RNA模板和细胞提取物， 所述细胞提取物为减基因细胞提取物。
所述无细胞反应体系是指利用细胞提取物进行基因转录或翻译的反应 体系，在本申请中，“无细胞反应系统”、“无细胞生物传感器”、“无细 胞转录系统”、“无细胞翻译系统”均属于无细胞反应体系，它们之间可以 互换使用。
所述DNA/RNA模板，是指用来转录或者翻译或者复制的核酸分子，在 本申请的无细胞反应系统中，可以包括DNA模板和细胞提取物，进行转录 或者翻译过程，也可以包括RNA模板和细胞提取物，进行转录和复制过程。
所述细胞提取物是从细胞中提取所需要的物质，在本申请中，是通过对 细胞进行破碎获取细胞提取物，任何可以实现蛋白质表达的细胞体系都可以 用于细胞提取物的制备，例如大肠杆菌、小麦胚芽细胞、酵母、弧菌、醋酸 杆菌等等，在本申请中，所述细胞提取物为减基因细胞提取物。
所述减基因细胞也可称之为减基因组细胞，是指细胞中的部分基因被敲 除，所述减基因细胞提取物是指对用于提取物制备的菌株进行基因敲除，从 基因层面阻碍胞内非特异性核酸酶/蛋白酶的表达，从而获取天然不含非特异 性核酸酶/蛋白酶的细胞提取物。
细胞的减基因组处理删除了胞内的冗余基因，降低了细胞内代谢过程的 复杂程度，基因组的减小也降低了体系DNA复制扩增的压力，因此合理的 减基因组处理一般而言可以提高细胞的生长速度。
在本申请中，所述减基因细胞可以是任何能够实现蛋白质表达的减基因 细胞，例如减基因大肠杆菌、减基因小麦胚芽细胞、减基因酵母、减基因弧 菌、减基因醋酸杆菌等等，在本申请的一个优选的实施方式中，所述减基因 细胞为减基因组大肠杆菌。
在本申请进一步优选的实施方式中，减基因组大肠杆菌为对标准大肠杆 菌菌株进行大片段基因删减后得到的减基因组菌株。
“标准菌株”是由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确 认和保证并可追溯的菌株。本申请中所述标准大肠杆菌菌株是指大肠杆菌 K12品系W3110菌种和MG1655菌种。
所述大片段基因删减是指与未删减的标准大肠杆菌菌株全基因组相比， 分别删除了全基因组的11.94％(MGF-01)和38.12％(ME5147)的两种减基因组 大肠杆菌。
本领域技术人员可以理解能够使用任何标准大肠杆菌的菌株作为减基 因前的目标菌株，且可以采用任何本领域技术人员能够使用的方法来进行大 片段基因删减，以得到减基因组菌株。所述用来基因删减的方法包括但不限 于同源重组(HomologousRecombination,HR)技术、锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶TALEN(Transcription Activation Like Effector Nuclease)技术、规律性间隔的短回文序列重复簇 (Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-Associated Proteins,CRISPR)技术。
在本申请一种优选的实施方式中，所述进行大片段基因删减后得到的减 基因组菌株是指与未删减的标准大肠杆菌菌株全基因组相比，分别删除了全 基因组的11.94％(MGF-01)和38.12％(ME5147)的两种减基因组大肠杆菌。
在本申请进一步优选的实施方式中，所述标准大肠杆菌为标准大肠杆菌 菌株W3110和MG1655。
在本申请进一步优选的实施方式中，所述减基因组大肠杆菌为大肠杆菌 菌株ME5147或大肠杆菌菌株MGF-01。
所述大肠杆菌菌株ME5147来源于日本的National BioResource Project (NBRP)国家生物资源项目，该项目收录了东京城市大学生物科学系 Jun-ichi Kato老师实验室基于大肠杆菌K-12MG1655菌株构建的染色体连续 缺失的大肠杆菌菌株ME5147，基因敲除为38.12％。为了便于区分，本申请 中将其命名为ΔMG1655菌株。
所述大肠杆菌菌株MGF-01是东京城市大学和日本生物前沿实验室 HiroshiMIZOGUCHI和Yoshie SAWANO等人联合构建的，基于大肠杆菌 K-12W3110菌株的基因组减少菌株MGF-01，基因敲除为11.94％。为了便 于区分，本申请中将其命名为ΔW3110菌株。
在一些具体的实施方式中，本申请的无细胞反应体系还包括氨基酸、能 量底物、辅助因子、盐和水中的一种或者两种以上。
所述氨基酸包括但不限于精氨酸(Arg)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、 苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、 甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、天冬酰氨(Asn)、天冬氨酸(Asp)、 甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，丝氨 酸(Ser)、苏氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)；
所述能量来源物质为化学底物，其可被酶促地作用以提供能量来实现期 望的化学反应，通常使用的能量来源允许通过断裂如存在于核苷三磷酸(例 如ATP)中的高能磷酸键来释放能量用于合成，可转变高能磷酸键的任何来 源是特别适合的，通常，ATP、GTP以及其他磷酸盐被认为是用于支持蛋白 合成的等同的能量来源，在本申请中优选为核苷三磷酸混合物(NTP mix) 和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，所述核苷三磷酸混合物包括但不限于亚精胺、 腐胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、ATP、CTP、GTP、UTP、CoA、tRNA和亚 叶酸；
所述辅助因子包括但不限于氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽以及 PEG8000；
所述盐包括但不限于谷氨酸钾、谷氨酸铵和一水合草酸钾。
在一个具体的实施方式中，本申请所提供的无细胞反应体系是基于转录 翻译过程的无细胞反应体系。
在一个具体的实施方式中，本申请所提供的无细胞反应体系是基于转录 过程的无细胞反应体系。
本申请进一步提供了一种用于检测分析物的无细胞反应体系，包括： DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，其中， DNA/RNA模板包括转录翻译调控元件和编码报告蛋白的基因，其中分析物 与转录翻译调控元件的相互作用能够启动或激活转录翻译调控元件从而启 动或激活编码报告蛋白的基因转录或表达。
所述用于检测分析物的无细胞反应体系是进行基因转录或者表达的反 应体系。所述编码报告蛋白基因是编码产生荧光、发光或体系颜色变化的报 告蛋白的基因，识别机制识别到待检测物之后，将下游的报告基因激活并在 无细胞体系中表达，通过监测报告基因所表达蛋白质的荧光、发光或可见的 颜色变化等推算待测物浓度。在一种优选的实施方式中，所述报告蛋白为为 绿色荧光蛋白(sfGFP)。
所述用于检测分析物的无细胞反应体系的一种应用方式是无细胞生物 传感器，(“无细胞生物传感器”与“无细胞反应体系”代表同一种意义， 可以互换使用)，其可以用于各种痕量分析物的快速检测，包括重金属离子， 农药，维生素和一些有机大分子等。在一个具体的实施方式中，所述无细胞 反应体系用于检测重金属离子，包括但不限于砷离子、汞离子、银离子、铜 离子、镍离子、锌离子、钴离子、铅离子等等，在一种优选的实施方式中，所述无细胞反应体系用于检测砷离子或汞离子。其中，无细胞生物传感器对 重金属离子的识别利用了基于转录因子的识别机制。转录因子(TF)是具有 特定结构的蛋白质分子，可与特定基因结合并在特定时间和地点以特定强度 调节基因表达。因此，TF的灵敏度和特异性可用于将传感器设计为识别元 件。ArsR和MerR是抑制性TF，它们与相应的启动子结合并阻止转录过程， 当分析物(配体)存在于无细胞环境中时，可立即获得TF的响应，配体结 合抑制性TF从启动子上的释放可导致阻碍效应消失，报告基因表达。故当 无细胞体系中存在砷离子、汞离子时，这些重金属离子会与ArsR、MerR结 合，产生的复合物将从其相应的启动子脱落，使转录过程得以进行，从而报 告基因sfGFP表达，产生绿色荧光。
在另一个具体的实施方式中，所述无细胞反应体系用于检测有机分子群 体感应分子，进一步优选为感应分子AHLs(革兰氏阴性细菌)。其中，利 用基于转录因子的识别机制，LuxR是转录激活因子。当无细胞反应环境中 存在其同源有机分子时，这些蛋白质与有机分子结合形成的复合物可以激活 转录反应，导致报告基因sfGFP的高表达水平。
在另一个具体的实施方式中，所述无细胞反应体系用于检测RNA，进 一步优选为病毒RNA或细菌RNA。无细胞核酸诊断技术是目前的开发热点， 可以用于检测环境或生物样品中的病原体核酸如病毒RNA等。其中一种检 测目标核酸的识别机制是基于支点开关的。支点开关是一种具有复杂结构的 RNA分子，它的特殊结构可以把核糖体结合位点隔离起来，当目标RNA序 列存在时，就会与开关杂交，改变其结构，以暴露核糖体结合位点，从而促进核糖体与RBS的结合和指示蛋白翻译。
进一步的，如上所述用于分析物检测的无细胞反应体系，还包括氨基酸、 能量底物、辅助因子、盐和水中的一种或者两种以上。
本申请进一步提供了一种使用无细胞反应体系进行检测分析物的方法， 包括，
将待分析样本加入到无细胞反应体系中，所述分析样本可以是重金属离 子，农药，维生素和一些有机大分子等；
检测所述无细胞反应体系中产生的报告蛋白的产生或产生量来对待分 析样本中的分析物进行定性或定量分析；所述报告蛋白可以是产生荧光、发 光或体系颜色变化的任何报告蛋白；
所述无细胞反应体系包括：DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细胞提 取物为减基因细胞提取物，其中，DNA/RNA模板包括转录翻译调控元件和 编码报告蛋白的基因，其中分析物与转录翻译调控元件的相互作用能够启动 或激活转录翻译调控元件从而启动或激活编码报告蛋白的基因转录或表达。
本申请还提供了一种用于检测分析物的无细胞反应体系，本文中也称之 为RNA输出传感器，其包括：噬菌体/原核生物RNA聚合酶、DNA/RNA 模板和细胞提取物，以及染料分子，所述细胞提取物为减基因细胞提取物， 其中，DNA/RNA模板包括转录调控元件，其中分析物与转录调控元件的相 互作用能够启动RNA转录过程产生与染料分子结合的适体RNA。
RNA输出传感器由一个高度加工的噬菌体RNA聚合酶(RNAP)、变构 转录因子aTFs和核酸模板分子组成，它们一起调节RNA适配体的胞外转录 反应。细胞报告基因可以被变构转录因子调节，这些转录因子对特定的化学 污染物作出反应，在缺乏目标分析物时，转录被阻断；分析物诱导适配体 RNA的转录过程发生，转录产生的RNA分子与体系中预先加入的染料分子 相结合，产生荧光信号。改变aTF可以改造细胞系统，使其能够感知包括金 属、芳香化合物和抗生素等一系列污染物。
在一个具体的实施方式中，用于检测分析物的无细胞反应体系用来检测 金属，进一步优选为检测锌离子。在水污染物中，来自于老化的金属设备、 工业废物的排放以及自然资源中的金属离子已经成为一个重要的问题。变构 转录因子SmtB被证实可以感应锌离子，因此使用SmtB和相应的DNA模板， 选取三向结二聚花椰菜(3WJdB)作为报告基因。3WJdBRNA适体在转录 时直接激活其染料配体DFHBI-1T的荧光，产生信号输出，即可实现锌离子检测的RNA输出传感。
在一个具体的实施方式中，用于检测分析物的无细胞反应体系用来检测 芳香族化合物，进一步优选为苯甲酸，其对应转录因子为MobR，选取三向 结二聚花椰菜(Three-way junction dimeric Broccoli,3WJdB)作为报告基因。 3WJdB RNA适体在转录时直接激活其染料配体DFHBI-1T的荧光，产生信 号输出。
进一步的，如上所述用于分析物检测的无细胞反应体系，还包括氨基酸、 能量底物、辅助因子、盐和水中的一种或者两种以上。
本申请进一步提供了一种如上所述的无细胞反应体系进行检测分析物 的方法，其包括：
将待分析样本加入到无细胞反应体系中，所述分析物可以为金属、芳香 化合物或抗生素；
检测所述无细胞反应体系中产生的适体RNA的产生或产生量，与所述 染料分子结合产生的荧光来对待分析样本中的分析物进行定性或定量分析；
所述无细胞反应体包括：噬菌体RNA聚合酶(RNAP)、DNA/RNA模板 和细胞提取物，以及染料分子，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，所述 染料分子可以为三向结二聚花椰菜(3WJdB)；
其中，DNA/RNA模板包括转录调控元件，其中分析物与转录调控元件 的相互作用能够启动RNA转录过程产生与染料分子结合的适体RNA，所述 转录调控元件为转录因子可以为MobR或SmtB。
本申请进一步提供了一种所述减基因细胞提取物在无细胞反应体系中 的用途。例如用于构建无细胞反应体系，构建用于检测的无细胞反应体系等 等。
本申请提供的无细胞反应体系，其用于目标蛋白表达如绿色荧光蛋白表 达时，具有相比于常规无细胞反应体系更好的蛋白产量，常规的无细胞反应 体系中，多采用大肠杆菌细胞提取物，如大肠杆菌Rosetta菌株、亲本W3110 菌株、亲本MG1655菌株，本申请的无细胞反应体系采用减基因的大肠杆菌 细胞提取物，减基因的大肠杆菌一定程度上确实减轻了细胞自身代谢过程的 压力，从而一定程度上有助于目标蛋白的表达，如本申请采用的ΔW3110菌 株的蛋白表达量约为其亲本的2.07倍，ΔMG1655菌株的蛋白表达量约为其 亲本的1.27倍，输出信号强度明显增加。
本申请提供的无细胞反应体系，其用于重金属离子检测时，具有明显的 优势，相比于采用传统的大肠杆菌Rosetta菌株提取物的无细胞反应体系， 本申请的无细胞反应体系对于重金属离子的响应度更高，如检测砷离子时， 其报告蛋白的浓度相比于大肠杆菌Rosetta菌株提取物的无细胞反应体系提 高了2.5倍以上，与亲本W3110菌株提取物的无细胞反应体系相比也提高了 近2倍。当进行汞离子的检测时，相比于传统的大肠杆菌Rosetta菌株提取 物的无细胞反应体系，本申请的无细胞反应体系报告蛋白的浓度也提高了20％。
本申请提供的无细胞反应体系，其用于有机分子群体感应分子检测时， 具有明显的优势，相比于传统大肠杆菌Rosetta2(DE3)体系的无细胞反应体系， 本申请的无细胞反应体系中，减基因组细胞提取物蛋白质的含量和种类均有 所下降，因此体系对于转录激活因子与待测物的结合产生的干扰减小，其报 告蛋白的强度更高，检测的目标物更准确，如检测有机分子群体感应分子 AHLs时，其报告蛋白的浓度相比于传统大肠杆菌Rosetta2(DE3)体系的无细 胞反应体系提高了至少50％，最高可达75％，相比于传统大肠杆菌亲本W3110菌株、亲本MG1655菌株体系的无细胞反应体系提高了一倍多，最高 提高可达2倍以上。
本申请提供的无细胞反应体系，其用于RNA如病毒RNA或者细菌RNA 检测时，具有明显的优势，相较于传统Rosetta2(DE3)提取物，本申请的反应 体系其输出荧光信号提高了2倍以上，最高可达4倍，对RNA检测的准确 性提升非常明显，两种亲本菌株的提取物本身在该反应中也表现出了很显著 的优势，其输出荧光信号可以达到亲本菌株提取物体系的1.39倍。
本申请提供的无细胞反应体系，其作为RNA输出传感器可以应用于多 种物质的检测，响应时间快于基于转录翻译体系的传感系统，而相比于传统 的大肠杆菌Rosetta2(DE3)提取物的RNA输出传感器体系，本申请的RNA 输出传感器对于检测目标的响应速度更快，信号衰减更慢，如进行苯甲酸检 测时，本申请的减基因ΔMG1655菌株细胞提取物体系，其响应速度相比于 亲本MG1655菌株体系提高了10％以上，其输出信号的衰减程度相比于亲本 W3110菌株降低了近50％。
本申请提供的无细胞反应体系作为RNA输出传感器对金属离子检测具 有很好的检测效果，传统的大肠杆菌细胞提取物RNA输出传感器体系例如 亲本W3110菌株和Rosetta2(DE3)体系的检测目标的荧光强度峰值相对于基 底值较小，并不适用于金属离子检测，而本申请的RNA输出传感器其细胞 提取物的基因删减导致转录因子与转录模板DNA之间的结合作用变弱，从 而增强了适配体RNA的转录，更适用于该传感体系对金属离子的检测。例 如对金属锌离子进行检测时，本申请的ΔMG1655菌株生物传感器反应体系 能长期维持较高的荧光信号，荧光强度长时间保持在2000a.u.，而传统的 Rosetta2(DE3)体系仅在100a.u.左右，仅为本申请的无细胞体系的5％左右。 因此，本申请提供了一种高准确度的对金属离子检测的RNA输出传感器。
实施例
主要试剂、溶液和菌株的信息如下，其他未提及的试剂、溶液、培养基 等均为本领域内常用的，在此不再赘述。
1.分子生物学试剂
本申请所涉及分子生物学试剂(盒)如下表1：
表1分子生物学试剂/试剂盒
Figure BDA0003708534890000141
2.菌株
本申请所涉及菌株信息如下表2：
表2实验相关菌株
Figure BDA0003708534890000142
3.缓冲溶液配制
His-Tag蛋白纯化相关缓冲液的配置如下表3和表4所示，
表3 His-Tag结合缓冲液配方(以1L体系为例)
Figure BDA0003708534890000143
Figure BDA0003708534890000151
表4 His-Tag洗脱缓冲液配方(以1L体系为例)
试剂名称 质量/g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 10.74
咪唑 34.04
NaCl 29.22
H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub> pH＝7.4
用去离子水做溶剂，将以上成分充分溶解并完全混合。配置完成后的溶 液需进行抽滤、超声的处理，去除杂质和气泡，4℃保存。
细胞提取物制备相关缓冲液如表5和表6所示，
表5 S30A缓冲液配方(以1L体系为例)
试剂名称 质量/g
谷氨酸镁 5.44
谷氨酸钾 12.195
Tris 6.057
醋酸 pH＝7.7
表6 S30B缓冲液配方(以1L体系为例)
试剂名称 质量/g
谷氨酸镁 5.44
谷氨酸钾 12.195
Tris 6.057
醋酸 pH＝8.2
实施例1基因组分析
本申请将减基因组大肠杆菌ΔW3110、ΔMG1655及其各自亲本W3110 和MG1655菌株培养制样，并交由北京市金唯智生物科技有限公司进行全基 因组测序。
金唯智公司重测序选用的方法为二代测序技术(NGS)。样本的测序分析 首先需要取样100ng的基因组，将其核酸经由超声处理随机分解成为500bp 以下的小片段。获得的片段用End Prep酶的混合物对其进行末端修复，包括 5’端的磷酸化和dA尾部修饰，然后进行T-A连接以在两个末端添加衔接子。 使用VAHTSTM DNA Clean Beads选择大小在470bp左右的衔接子连接的 DNA进行回收。然后使用P5和P7引物通过PCR扩增每个样品，之后通过 DNAClean Beads纯化PCR产物。
二代测序技术通过给底物碱基携带标记(如荧光标记)，使聚合酶链反应 DNA复制过程新添加的碱基可以被捕捉识别，从而最终确定DNA的序列。 最后使用数据处理软件删除衔接子的序列、聚合酶链反应(PCR)引物、N碱 基含量超过10％质量低于20的碱基及重复项等，以对所得数据进行质量优 化，最终完成待测细胞基因组的绘制。本实验中选取的两株减基因组菌株均 来自于大肠杆菌K-12菌株，因此本次基因组重测序选取的参考基因组序列 为NCBI数据库中的野生型大肠杆菌Escherichia coli，ID:167。
1.1与参考基因组的序列比对分析
将亲本W3110菌株、MG1655菌株及其减基因组产物ΔW3110、 ΔMG1655四种菌株的基金组序列与参考基因组序列(NCBI ID:167)进行比对 分析。比对后结果再经校正处理，最终获得碱基数目检测比对结果及测序的 覆盖度等数据结果如表7所示。
表7与参考基因组的比对分析
Figure BDA0003708534890000161
结果显示，与参考基因组(野生型大肠杆菌)相比，亲本W3110菌株和亲 本MG1655菌株被检测到的碱基数分别占参考基因组的99.51％和99.59％， 说明两株亲本菌株的基因组大小与野生型基本一致；减基因组ΔW3110菌株 的基因组覆盖度为87.97％，与亲本W3110菌株对比，说明ΔW3110被人工 删减的基因占比为11.94％(99.51％-87.97％)；同理可以得出，减基因组 ΔMG1655菌株被人工删减的基因占比为38.12％。
由于二代测序技术会将基因组随机分解成为500bp以下的小片段，然后 以小片段为作为测序的单元单位，因此该测序技术无法体现长片段删减(long deletion)对应的位点，被删减片段所涉及的基因及其功能还需要进一步将菌 株基因组测序所得完整序列与参考基因组进行BLAST比对。
1.2突变检测
全基因组测序的内容还包括对参考基因组每个位点的检测，检测位点是 否存在单碱基突变(SNV)或者插入或缺失突变(InDel)。并结合数据库中对基 因信息的注释，将突变信息与基因信息相关联，使用相关软件(Annovar)对检 测到的突变位点进行包括突变引起的氨基酸变化、突变频率等内容的功能注 释。
需要特别强调地是，全基因组测序获得的InDel数据仅是基因组中长度 主要在1-50bp范围内小片段的插入和缺失序列突变，原因在于测序过程中 的单个reads可以直接覆盖的区域有限，只有整个插入或缺失的区域都包含 在一个reads内才能被检测获得。因此InDel的数据只能显示菌株本身天然 的突变情况，该结果并不包含人工的基因组大量连续删减(long deletion)。但 由于基因组天然的突变同样有可能对该菌株细胞提取物的应用产生影响，因 此本申请也对此做出分析。
(1)SNV及InDel情况汇总
亲本W3110菌株、亲本MG1655菌株及其减基因组后的ΔW3110菌株 和ΔMG1655菌株相比于野生型大肠杆菌(NCBI ID:167)全基因组范围内的 SNV和InDel突变情况总体如下表8所示：
表8 SNV/InDel总结统计
Figure BDA0003708534890000171
将减基因组菌株与其亲本基因组的突变情况进行比对，统计二者之间共 有和特有的SNV、InDel情况，结果如图1和图2中的Venn图所示，Venn 图中公共部分表示两样本间的一致突变，即突变所在染色体的编号、突变发 生的位置以及突变类型完全一致。由分析结果可见，亲本W3110菌株相较 于野生型大肠杆菌突变较少，其他三种菌株的突变较多，大多为单碱基突变。 并且由Venn图可以看出，减基因组菌株与其亲本间完全一致的突变较少， 二者之间突变情况的差异也可能导致其用于无细胞反应体系的效果的差异， 因此，我们还需分析四种菌株的突变在基因组功能区的分布情况。
(2)SNV及InDel在基因组功能区的分布
根据大肠杆菌的已知基因，可以将物种的基因组划分为不同的功能单位。 然后依据突变所发生的位置，将每个突变位点进行功能区域分类，并对四个 菌株样本所检测到的突变位点依据功能区进行分类统计。功能区突变位点分 布统计参见下表9所示：
表9 SNV及InDel在基因组功能区的分布
Figure BDA0003708534890000181
(3)外显子功能区突变分析
外显子与转录翻译过程直接相关，因此，本申请还对四种菌株外显子功 能区的突变数据进行分析，找到突变位点所在的基因，及其对应表达的蛋白， 从而分析该位点的基因突变对于该菌株细胞提取物在无细胞反应体系中应 用的影响，通过分析可知，减基因组菌株的基因突变涉及大量转录翻译过程 相关的基因，如编码DNA结合转录双调控因子的基因、编码ATP-Binding 蛋白的基因、编码核酸内切酶的基因等涉及到tRNA运载、氨基酸活化、多 肽链装配以及的蛋白结构组装等多个过程。由此可见，仅菌株单碱基突变和 小片段插入/缺失的突变就会对细胞发挥转录翻译功能的效果产生影响(大量 连续删减的影响需等待BLAST的结果进行分析)。
实施例2减基因组大肠杆菌生长情况探究
将大肠杆菌W3110菌株、大肠菌株MG1655菌株、大肠杆菌ME5147 菌株(即W3110菌株对应的减基因组菌株，后文以ΔW3110代称)、大肠杆菌 MGF-01菌株(即MG1655菌株对应的减基因组菌株，后文以ΔMG1655代称)， 在三种常见的大肠杆菌培养基(LB培养基、M9培养基和TB培养基)中进行 培养，并分别在实验室最常见的两种温度(30℃、37℃)的摇床中进行培养。 每隔2-5h在超净台内取样，用酶标仪测量菌液在600nm处的吸光度数据， 从而反映其细胞生长情况。
2.1菌株培养温度选择
实验室最常见的微生物培养温度为37℃和30℃，且本申请涉及的四种 菌株均属于大肠杆菌，为中温菌，因此本申请仅对比四个菌株在30℃和37℃ 下的生长情况。控制培养基这一变量，对比同一培养基内各菌株在30℃摇床 和37℃摇床的生长曲线，分析对比各菌株的最适培养温度。
通过实验证明，本申请涉及的四个大肠杆菌菌株W3110菌株、ΔW3110 菌株、亲本MG1655菌株、ΔMG1655菌株均可以在37℃摇床培养的条件下 获得更快的生长速度，但30℃条件下的菌株同样可以正常生长繁殖，只是速 度略有减缓。四种菌株对温度的一致偏好说明菌株的减基因组操作没有对菌 株内生长代谢相关酶的最适温度产生影响，相比于30℃时，37℃条件下相关 酶的活性更高。
一般而言，实验室过夜培养微生物的时长在10-12h左右，因此，在本 申请中，最终将四个菌株的培养条件确定为37℃摇床，200rpm转速过夜培 养。
2.2菌株培养基选择
本申请涉及的四种大肠杆菌菌株选用LB、M9、TB三种常见大肠杆菌 培养基进行培养对比。(仅对比前述确认的37℃培养条件下的生长曲线)
通过实验证明，亲本W3110菌株及减基因组ΔW3110菌株在M9培养 基中菌株的迟缓期过长，24h都无法达到较高的细胞密度；在TB培养基中 的迟缓期和对数生长期最短，约12h后即可达到稳定状态；在LB培养基中 菌株的生长速度也较快，但稳定期细胞密度相对于TB培养基较低，因此， 亲本W3110菌株及减基因组ΔW3110菌株的培养条件为LB培养基。
亲本MG1655菌株在LB培养基中可以实现更高的细胞密度，但其迟缓 期较长；而营养成分较单一的M9培养基中，MG1655菌株几乎不生长，因 此，本实施例选取终密度略低于LB培养基，但菌株生长迟缓期更短的TB 培养基作为MG1655的培养基；ΔMG1655菌株TB培养基中迟缓期最短， 且可以在过夜培养(14h左右)实现更高的细胞密度，因此同样选择TB培养基。
实施例3细胞提取物制备和无细胞转录翻译体系配比
3.1细胞提取物制备
将Rosetta菌株、亲本W3110菌株、亲本MG1655菌株、减基因组ΔW3110 菌株和减基因组ΔMG1655菌株五种菌株分别按照以下方法，制备相应的细 胞提取物。
一、相关溶液配制：(2×YTP培养基为本领域内常用，S30A、S30B缓冲 液的配制已在缓冲溶液部分说明，此处不再赘述)
(1)1M DTT溶液：用去离子水溶解154.25g/L DTT，用0.22μm滤头 过滤，置于-20℃冰箱保存。
(2)2M Tris溶液：用去离子水溶解242.28g/L Tris，用0.22μm滤头过 滤，室温保存即可。
二、操作步骤：
(1)接种环蘸取菌液，平板划线，37℃过夜培养。
(2)挑取单菌落于20mL LB培养基中，37℃摇床，200rpm培养，过夜， 即为一级种子液。
(3)一级种子液接于200mL 2×YTP培养基，37℃摇床，200rpm培养 3h，即为二级种子液。
(4)二级种子液接于1L 2×YTP培养基，37℃摇床，200rpm培养；每 隔30min测OD600，以监测细胞生长情况，OD600值在2-3范围内，即可收 菌。
(5)500mL培养物在4℃条件下以5000g离心12min，弃去上清液。
(6)用20mL S30A缓冲液重悬，在4℃条件下以10000rpm离心30min， 弃去上清液，重复一次。
(7)离心后菌体称重，每1g菌体重悬于1mL的S30A缓冲液中，充分 混匀。
(8)用高压破碎仪破碎细胞，具体操作在前述细胞破碎部分已有详述。
(9)每1mL细胞裂解物对应于3μL 1M DTT溶液，按照该比例向细胞 裂解物中加入DTT，用锡纸包覆(避光)置于37℃摇床，200rpm孵育80min。
(10)在4℃条件下以12000g离心30min，收集上清液。
(11)将上清液全部转移至透析袋中，用夹子夹好，置于900mL S30B 缓冲液中，4℃条件下搅拌器上透析样品4h。
(12)收集透析后的细胞提取物，在4℃条件下以12000g离心10min， 收集上清并分装，速冻后-80℃保存。
3.2无细胞转录翻译体系配比
每个无细胞转录翻译反应体系的体积为20μL，常用的无细胞转录翻译 体系配比如下：
表10无细胞转录翻译体系
组分 体积(μL)
1M Mg<sup>2+</sup> 0.2
19AAs 0.8
1M PEP 0.8
NTP mix 0.8
10×salt 2
PEG8000 2.5
T7 RNA聚合酶 0.1
细胞提取物 6
DNA模板 X
H<sub>2</sub>O 6.8-X
一般要求每个无细胞转录翻译体系内加入模板DNA的量为300ng，因 此所需质粒体积X由质粒浓度决定，其中，XμL＝300ng/DNA模板浓度 ng/μL。
实施例4无细胞反应体系表达绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白(sfGFP)可被蓝色波长范围光线激发产生绿色荧光，因此是 一种易被检测的蛋白质，可以通过酶标仪在短时间内实现荧光强度的检测， 从而判断蛋白是否表达及其表达量。无细胞蛋白表达实验流程如图3所示。
按照表10中无细胞体系的各组分与含量，控制无细胞体系的其他变量 一致，我们将编码绿色荧光蛋白的质粒以15ng/μL的浓度加入到分别含有 Rosetta菌株、亲本W3110菌株、亲本MG1655菌株、减基因组ΔW3110菌 株和减基因组ΔMG1655菌株的20μL无细胞体系中30℃过夜(12h)进行转录 翻译，反应结束后用酶标仪测试反应后体系在485nm/535nm处的荧光强度， 结果如图4所示，数据结果表明，两株亲本菌株的提取物应用于绿色荧光蛋白的表达中，蛋白产量低于传统的Rosetta细胞提取物体系，分别约为其蛋 白产量的32％和53％。可能的原因在于两菌株本身的生长代谢相对于 Rosetta2(DE3)菌株较弱，胞内蛋白合成速率较慢，因此在无细胞转录翻译表 达蛋白质的过程中，相同反应时间下对应蛋白产量较低。
但将两株减基因组菌株与其亲本菌株进行对比，我们观察到，基因敲除 后菌株的蛋白产量明显高于其亲本菌株，其中，ΔW3110菌株的蛋白表达量 约为其亲本的2.07倍，ΔMG1655菌株的蛋白表达量约为其亲本的1.27倍。 这说明基因敲除在一定程度上确实减轻了细胞自身代谢过程的压力，从而一 定程度上有助于工程目标的实现。同时，W3110菌株基因敲除后蛋白产量增 值更多也与前述其生长代谢速度增快相关。
实施例5无细胞生物传感器对重金属离子As3+、Hg2+的检测
大多数无细胞生物传感器的设计原理是根据分析物选择合适的识别机 制和报告基因，然后将编码的基因克隆到无细胞表达载体中，然后通过使用 适当的无细胞蛋白质合成体系和编码模板DNA构建成熟的无细胞生物传感 器。无细胞生物传感器的工作流程如图5所示。
本实施例中无细胞生物传感器对重金属离子的识别利用了基于转录因 子的识别机制。转录因子(TF)是具有特定结构的蛋白质分子，可与特定基因 结合并在特定时间和地点以特定强度调节基因表达。因此，TF的灵敏度和 特异性可用于将传感器设计为识别元件。
ArsR和MerR是抑制性TF，它们与相应的启动子结合并阻止转录过程， 当分析物(配体)存在于无细胞环境中时，可立即获得TF的响应，配体结合 抑制性TF从启动子上的释放可导致阻碍效应消失，报告基因表达。故当无 细胞体系中存在砷离子、汞离子时，这些重金属离子会与ArsR、MerR结合， 产生的复合物将从其相应的启动子脱落，使转录过程得以进行，从而报告基 因sfGFP表达，产生绿色荧光。
按照表10中无细胞体系的各组分与含量，控制各体系中质粒浓度和待 测物浓度一致，将Rosetta菌株、亲本W3110菌株、减基因组ΔW3110菌株 提取物应用于两种重金属离子生物传感器，其中，As3+检测传感器原理示意 图如图6所示，Hg2+检测传感器原理同理。实验的结果如图7所示，结果显 示，相同时间亲本W3110菌株用于As3+传感检测的效果相比于Rosetta2(DE3) 菌株更有优势，产生的报告蛋白浓度更高。特别的，对于W3110菌株，基 因删减导致其用于As3+检测的效果更佳。
当用于Hg2+检测时，如图8可知，可以看出W3110菌株缩减基因后检 测效果有所提升，其用于Hg2+检测的效果更佳。
实施例6无细胞生物传感器对有机分子群体感应分子AHLs的检测
类似于金属离子的生物传感，本实施例中AHLs无细胞生物传感器同样 利用了基于转录因子的识别机制，区别在于LuxR是转录激活因子。当无细 胞反应环境中存在其同源有机分子时，这些蛋白质与有机分子结合形成的复 合物可以激活转录反应，导致报告基因sfGFP的高表达水平。
按照表10中无细胞体系的各组分与含量，控制无细胞体系的其他变量 一致，将Rosetta菌株、亲本W3110菌株、亲本MG1655菌株、减基因组 ΔW3110菌株和减基因组ΔMG1655菌株的细胞提取物应用于感应分子AHLs 检测生物传感器，感应分子AHLs检测传感器原理示意图如图9所示，实验 结果如图10所示，结果显示，两种菌株经减基因组操作后传感的输出信号 强度均有所增强，且强于传统Rosetta2(DE3)体系，可能的原因在于减基因组 细胞提取物中蛋白质的含量和种类均有所下降，因此体系对于转录激活因子 与待测物的结合产生的干扰减小，从而促进报告基因的表达。
实施例7无细胞生物传感器对RNA的检测
无细胞核酸诊断技术是目前的开发热点，可以用于检测环境或生物样品 中的病原体核酸如病毒RNA等。其中一种检测目标核酸的识别机制是基于 支点开关的。支点开关是一种具有复杂结构的RNA分子，它的特殊结构可 以把核糖体结合位点隔离起来，当目标RNA序列存在时，就会与开关杂交， 改变其结构，以暴露核糖体结合位点，从而促进核糖体与RBS的结合和指 示蛋白翻译。RNA检测传感器原理示意图如图11所示。
本申请从Addgene购买获取一对支点开关传感相关的质粒(#107360， #107356)。其中Trigger质粒中插入了一段长为63bp的序列作为可以转录产 生待检测目标TriggerRNA的模板；Switch质粒中插入了编码支点开关RNA 和指示蛋白Aqua的基因。因此，当把编码Trigger RNA的质粒加入无细胞 体系后，Switch质粒转录产生的支点开关RNA即可与其特异性杂交，从而 激活青色荧光蛋白Aqua的表达。
按照表10中无细胞体系的各组分与含量，控制无细胞体系的其他变量 一致，将Rosetta菌株、亲本W3110菌株、亲本MG1655菌株、减基因组 ΔW3110菌株和减基因组ΔMG1655菌株的细胞提取物应用于RNA检测生物 传感器，五种菌株的细胞提取物用于该生物传感器中的实验结果如下图12， 实验结果表明，对于本实施例中核酸检测的生物传感器，两种亲本菌株的提 取物本身相较于传统Rosetta2(DE3)提取物存在一定的优势，表达蛋白量均约 为传统提取物体系的3倍。而对于MG1655菌株，其减基因组产物ΔMG1655 菌株在该传感反应中表现出了很显著的优势，其输出荧光信号可以达到亲本 菌株提取物体系的1.39倍，传统Rosetta2(DE3)提取物体系的5.23倍。
减基因组菌株ΔMG1655的细胞提取物在本核酸监测的无细胞生物传感 实验中体现出明显优势，这可能的原因是其高达38.12％的基因删减率导致 了部分会转录产生RNA的基因的缺失，因此提取物在完成相关生命活动时 转录产生的RNA种类减少，对目标序列检测的干扰减小，从而有利于提高 检测限，增强检测的灵敏度。具体原因需根据亲本与见基因组菌株的全基因 组序列BLAST比对分析及菌株的转录组学分析结果进行解释。
实施例8 RNA输出传感器对苯甲酸的检测
RNA输出传感器可以应用于多种物质的检测，其中一类就是药品和个 人护理类产品，比如阿司匹林的制备原料水杨酸、可用于手术中消毒的苯扎 氯铵、以及可用作防腐成分的苯甲酸等。本实施例选取苯甲酸作为目标分析 物，其对应转录因子为MobR，选取三向结二聚花椰菜(3WJdB)作为报告基 因。3WJdB RNA适体在转录时直接激活其染料配体DFHBI-1T的荧光，产 生信号输出。配体诱导激活的RNA输出传感器原理示意图13所示。
按照表10中无细胞体系的各组分与含量，控制无细胞体系的其他变量 一致，将亲本W3110菌株、亲本MG1655菌株、减基因组ΔW3110菌株和 减基因组ΔMG1655菌株四种菌株的提取物应用于该RNA输出传感器，与 传统大肠杆菌Rosetta2(DE3)提取物体系进行对比，实验结果如图14所示， 由结果可见，五种提取物的生物传感器响应时间均在100min以内，明显快 于基于转录翻译体系的传感系统，这正是RNA传感器避免蛋白质工程的优 势所在。
另外，对比五种提取物体系的传感效果：从响应速度来看，三种适用菌 株的效果相差不大，ΔMG1655菌株响应速度快于两株亲本菌株，可能的原 因在于减基因组菌株提取物的RNA和蛋白成分相较于亲本均简单化，因此 体系对于转录因子与待测物之间识别的干扰小，有利于快速检测。从信号衰 减的角度，W3110菌株信号衰减最快，这可能也是提取物中非特异性核酸酶 导致的结果。而减基因组ΔW3110菌株的信号衰减速度始终慢于其他菌株， 在，即使在长达100-250分钟内依然具有明显的优势，因此，减基因组菌株 相对较慢的信号衰减速度有利于输出信号的维持。
实施例9 RNA输出传感器对金属离子Zn2+的检测
在水污染物中，来自于老化的金属设备、工业废物的排放以及自然资源 中的金属离子已经成为一个重要的问题。变构转录因子SmtB被证实可以感 应Zn2+，因此使用SmtB和相应的DNA模板，即可实现Zn2+检测的RNA输 出传感。
按照表10中无细胞体系的各组分与含量，控制无细胞体系的其他变量 一致，将Rosetta菌株、亲本MG1655菌株和减基因组ΔMG1655菌株的细 胞提取物应用于该RNA输出传感器，实验结果如图15，从信号衰减的角度 来看，能产生信号输出的ΔMG1655在该传感体系中能长期维持较高的荧光 信号，这可能是由于MG1655菌株的基因删减导致转录因子与转录模板DNA 之间的结合作用变弱，从而增强了适配体RNA的转录，因此最适用于该传感体系，对金属离子Zn2+的检测。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上 述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导 性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不 脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这 些均属于本申请保护之列。

Claims (10)

1.一种无细胞反应体系，其特征在于，包括DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细胞提取物为减基因细胞提取物。
2.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述减基因细胞为减基因组大肠杆菌，优选为对标准大肠杆菌菌株进行大片段基因删减后得到的减基因组菌株，
进一步优选大片段基因删减是指与未删减的标准大肠杆菌菌株全基因组相比，分别删除了全基因组的11.94％(MGF-01)和38.12％(ME5147)的两种减基因组大肠杆菌；
进一步优选为对标准大肠杆菌菌株W3110和MG1655进行大片段基因删减后得到的减基因组菌株。
3.根据权利要求2所述的反应体系，其特征在于，所述减基因组大肠杆菌为大肠杆菌菌株ME5147或大肠杆菌菌株MGF-01。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的反应体系，其特征在于，还包括氨基酸、能量底物、辅助因子、盐和水中的一种或者两种以上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的反应体系，其特征在于，所述无细胞反应体系为基于转录翻译过程的无细胞反应体系或基于转录过程的无细胞反应体系。
6.一种用于检测分析物的无细胞反应体系，其包括：DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，
其中，DNA/RNA模板包括转录翻译调控元件和编码报告蛋白的基因，其中分析物与转录翻译调控元件的相互作用能够启动或激活转录翻译调控元件从而启动或激活编码报告蛋白的基因转录或表达。
7.一种利用权利要求6所述无细胞反应体系检测分析物的方法，其包括：
将待分析样本加入到无细胞反应体系中，
检测所述无细胞反应体系中产生的报告蛋白的产生或产生量来对待分析样本中的分析物进行定性或定量分析；
所述无细胞反应体系包括：DNA/RNA模板和细胞提取物，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，其中，DNA/RNA模板包括转录翻译调控元件和编码报告蛋白的基因，其中分析物与转录翻译调控元件的相互作用能够启动或激活转录翻译调控元件从而启动或激活编码报告蛋白的基因转录或表达。
8.一种用于检测分析物的无细胞反应体系，其包括：噬菌体/原核生物RNA聚合酶、DNA/RNA模板和细胞提取物，以及染料分子，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，
其中，DNA/RNA模板包括转录调控元件，其中分析物与转录调控元件的相互作用能够启动RNA转录过程产生与染料分子结合的适体RNA。
9.一种利用权利要求8所述无细胞反应体系检测分析物的方法，其包括：
将待分析样本加入到无细胞反应体系中，
检测所述无细胞反应体系中产生的适体RNA的产生或产生量，与所述染料分子结合产生的荧光来对待分析样本中的分析物进行定性或定量分析；
所述无细胞反应体包括：噬菌体RNA聚合酶(RNAP)、DNA/RNA模板和细胞提取物，以及染料分子，所述细胞提取物为减基因细胞提取物，
其中，DNA/RNA模板包括转录调控元件，其中分析物与转录调控元件的相互作用能够启动RNA转录过程产生与染料分子结合的适体RNA。
10.减基因细胞提取物在无细胞反应体系中的用途。
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