CN111996207A - 一种特异去除砷的载体及其构建方法与应用 - Google Patents

一种特异去除砷的载体及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物法除砷技术领域，具体涉及一种特异去除砷的载体及其构建方法与应用。本发明提供的载体包含砷结合蛋白表达盒，该表达盒包含砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、荧光蛋白基因和砷结合蛋白基因。该载体转入菌体后，转化菌可受砷的诱导将具有砷结合活性的砷结合蛋白在细菌表面高效表达，无需额外添加诱导剂，能特异结合砷，还可根据荧光信号监测砷结合蛋白的表达。本发明提供的特异去除砷的载体为环境中砷污染物的治理提供了新方法，同时，本发明的载体对于利用金属特异诱导启动子和相应金属特异调控蛋白构建具有去除特异金属功能的工程菌提供了一种新的思路、手段和资源，在去除环境中非金属或金属污染方面具有重要意义。

Description

一种特异去除砷的载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物法除砷技术领域，具体涉及一种通过转入宿主菌使宿主菌能够特异去除砷的载体及其构建方法与应用。
背景技术
目前环境污染的修复方法主要有物理化学方法和生物方法，前者是利用物理化学手段将环境中的污染物移除或将其转变为稳定无害物质的方法，后者则是利用生物体或生物体内某些组分的特性将环境中的污染物去除的方法。
利用表达金属结合蛋白的细菌对金属离子的吸附能力能够实现金属离子的去除。目前，关于金属结合蛋白基因工程菌的研究或局限于构建非特异性金属结合基因工程菌(对多种金属离子都具有吸附作用)，或在表达金属结合蛋白时往往需要添加诱导剂，或对金属的结合、吸附能力有限。对多种重金属离子的同时吸附不利于对吸附重金属的回收利用；诱导剂的添加不仅增加了经济成本，而且有些诱导剂(如IPTG)本身也具有一定的毒性；金属的结合能力有限导致金属去除或回收效率较低。
砷及其化合物是常见的环境污染物，环境中的砷和砷化物污染物可通过水、大气和食物等途径进入人体，造成危害。对环境污染物具有特异响应的启动子和能够与环境污染物特异结合的蛋白的发现为构建对污染物有特异吸附作用的工程菌提供了可能性。在此基础上，构建无需特异添加诱导剂即可对砷发挥特异性吸附作用的工程菌具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过转入宿主菌使宿主菌能够特异去除砷的载体，本发明的另一目的是提供该载体的构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明利用基因重组技术将砷结合蛋白基因和细菌表面展示载体蛋白基因克隆至砷诱导启动子的下游，构建了由砷调控可表面表达砷结合蛋白的表达盒；将含有该表达盒的载体转化宿主菌中，构建得到对砷有特异吸附作用的工程菌。当环境中存在砷时，该工程菌不需要添加额外的诱导剂就可以表达砷结合蛋白并特异吸附去除砷。在本发明进一步在砷结合蛋白表达盒中引入荧光蛋白基因，使得能够根据荧光信号监测砷结合蛋白的表达情况。
具体地，本发明提供如下技术方案：
本发明首先提供一种载体，该载体包含金属或非金属结合蛋白表达盒，所述表达盒包含金属诱导启动子或非金属诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、金属结合蛋白基因或非金属结合蛋白基因。
所述金属为镉、锌、铅、铜、镍，所述非金属为砷。
进一步地，本发明提供一种特异去除砷的载体，其包含砷结合蛋白表达盒，所述表达盒包含砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因和砷结合蛋白基因。
以上所述的砷结合蛋白优选来源于大肠杆菌基因组或大肠杆菌R因子R773质粒、荧光假单胞菌MSP3的基因组、铜绿假单胞菌基因组的砷结合蛋白。
优选地，本申请实施例提供了以上所述的砷诱导启动子，分别为实施例中Pars1(包括操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列，共492bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，和Pars2(包括操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列，共451bp)其核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
作为本发明的一种实施方式，所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的另一种实施方式，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为本发明的一种优选实施方式，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。携带该表达盒的载体具有更优的砷结合蛋白表面表达和砷结合活性。且在高砷浓度条件下(例如：砷浓度≥40μmol/L或砷浓度≥160μmol/L)的砷吸附活性更优。
本发明所述的细菌表面展示载体蛋白为选自冰核蛋白、Lpp-OmpA、OmpC中的一种。优选为冰核蛋白(INP)N端结构域。
为便于监测砷结合蛋白的表达情况，本发明所述的表达盒还包含荧光蛋白基因。
优选地，所述表达盒沿5’至3’方向依次包括砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、荧光蛋白基因和砷结合蛋白基因。
本发明的砷结合蛋白表达盒中包含细菌表面展示载体蛋白、荧光蛋白和砷结合蛋白的融合蛋白，融合蛋白中的各蛋白质要发挥正常的功能，均需要有正常的蛋白结构，然而融合蛋白中各蛋白之间的表达和折叠多存在不可预知的相互影响，进而影响融合蛋白中的某个或某几个蛋白的表达量和正确折叠。本发明在构建包含细菌表面展示载体蛋白、荧光蛋白和砷结合蛋白的融合蛋白和表达盒时，发现选择不同的启动子、砷结合蛋白以及细菌表面展示载体蛋白进行组合，得到表达盒的砷结合蛋白的表面表达效果存在较大差异，经过大量的筛选和比对，本发明确定了能够同时保证砷结合蛋白在细菌表面大量、正确表达的表达盒结构和序列。
本发明所述的表达盒优选具有如SEQ ID NO.5～7任一所示的序列。
其中，如SEQ ID NO.5所示序列的第1位至492位为砷诱导启动子系统序列，第599位至1171位为冰核蛋白N端结构域序列，第1178位至1885位为荧光蛋白基因序列，第1892位至2245位为砷结合蛋白序列。如SEQ ID NO.6所示序列的第1位至451位为砷诱导启动子系统序列，第560位至1132位为冰核蛋白N端结构域序列，第1139位至1846位为荧光蛋白基因序列，第1853位至2206位为砷结合蛋白序列。如SEQ ID NO.7所示序列的第1位至492位为砷诱导启动子序列，第599位至1171位为冰核蛋白N端结构域序列，第1178位至1885位为荧光蛋白基因序列，第1892位至2245位为砷结合蛋白序列。
本发明所述的表达盒还可包含位于砷结合蛋白基因下游的转录终止子。所述转录终止子优选为rrnBT1T2。
以上所述的表达盒可插入所述工程菌的基因组中，或插入质粒载体中独立复制和遗传。
以上所述的表达盒插入的质粒载体可为pUC系列载体、pBR322系列载体、pACYC系列载体。
本发明还提供所述特异去除砷的载体的构建方法：将所述表达盒连接入质粒载体中得到。
本发明提供含有所述的载体的工程菌。
本发明还提供所述载体或所述工程菌在去除或回收金属或非金属元素中的应用，或在治理环境污染物中的应用。优选地，发明提供了所述载体或所述工程菌在去除或回收砷中的应用，或在治理环境中砷污染的应用。
本发明的有益效果在于：本发明通过将细菌表面展示载体蛋白-荧光蛋白-砷结合蛋白的融合蛋白基因置于砷诱导启动子下游，构建了由砷调控的可将砷结合蛋白在细菌表面表达且具有荧光特性的砷结合蛋白的表达盒、载体。将本发明的载体转入宿主菌中，不仅能够在不需要额外添加诱导剂的情况下在宿主菌表面高效表达具有砷结合活性的砷结合蛋白，具有特异的砷结合特性，而且可根据荧光信号监测砷结合蛋白的表达。本发明提供的特异去除砷的载体为环境中砷污染物的治理提供了新方法，同时，本发明的载体对于利用金属特异诱导启动子和相应金属特异调控蛋白构建具有去除特异金属功能的工程菌提供了一种新的思路、手段和资源，在去除环境中非金属或金属污染方面具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中As-GP载体的构建方法中，诱导菌和非诱导菌的生长和荧光强度检测结果。
图2为本发明实施例1中As2-GP载体的构建方法中，诱导菌和非诱导菌的生长和荧光强度检测结果。
图3本发明实施例2中As2-ICAR(A21)载体的结构示意图。
图4为本发明实施例3中As1-ICAR(A11)载体的结构示意图。
图5为本发明实施例4中As1-ICAR2(A12)载体的结构示意图。
图6为本发明实施例5中含As1-ICAR(A11)载体不同菌株的生长情况。
图7为本发明实施例5中含As1-ICAR(A11)载体不同菌株的荧光蛋白表达情况。
图8为本发明实施例5中含As2-ICAR(A21)载体不同菌株的生长情况。
图9为本发明实施例5中含As2-ICAR(A21)载体不同菌株的荧光蛋白表达情况。
图10为本发明实施例5中含As1-ICAR2(A12)载体不同菌株的生长情况。
图11为本发明实施例5中含As1-ICAR2(A12)载体不同菌株的荧光蛋白表达情况。
图12为本发明实施例6中不同工程菌的砷去除效果比较结果。
以上图4～图10中，A21-Top10代表含As2-ICAR(A21)载体的大肠杆菌Top10菌株；A21-BL21代表含As2-ICAR(A21)载体的大肠杆菌BL21菌株；A21-DH5α代表含As2-ICAR(A21)载体的大肠杆菌DH5α菌株；其它标注代表的菌株可参考该命名方式确定。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1基础载体的构建
1、pUC-As载体的构建
(1)序列设计：设计一段长度为662bp的DNA序列，该DNA序列中含砷诱导启动子系统(包括操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列)(参照GenBank Accession No.X16045.1设计，该来源的砷诱导启动子本发明中命名为“Pars1”，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；砷特异结合的转录阻遏蛋白命名为“ArsR1”，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、第二调控区序列、核蛋白体结合位点和多克隆酶切位点。
(2)pUC-As载体的构建：采用全基因合成法合成上述662bp的DNA片段(生工生物工程(上海)股份有限公司)并将其克隆至pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的Sac I和Hind III酶切位点之间，最终构建得到pUC-As载体。合成基因序列的准确性和克隆酶切位点的准确性全部经过测序验证。
2、As-BTT载体的构建
本步骤的目的是为了在pUC-As载体上添加转录终止子。
(1)As-BTT载体的构建：以pBV220质粒(可通过市售途径购买获得的载体)为模板PCR扩增长度为472bp的rrnBT1T2片段(该片段含有本发明所需的转录终止子)。采用PremixExTaq试剂(TaKaRa公司)，扩增体系25μL，上游引物序列为5’-AACTGCAGAGCTTCTGTTTTGGCGGATG(PstI)，下游引物序列为5’-ATGCATGCCATGAGCGGATACATATTTGAATG(SphI)。采用琼脂糖凝胶电泳纯化并回收rrnBT1T2片段，TA克隆该片段(
Figure BDA0002634213520000071
19-T载体，TaKaRa公司)，采用PstI和SphI从T载体上双酶切得到rrnBT1T2片段，将其与经PstI和SphI双酶切后的步骤1构建所得的pUC-As载体片段连接(T4 DNA连接酶，TaKaRa公司，按照使用说明书进行操作)。
(2)转化及鉴定：用步骤(1)的连接产物转化E.coli DH 5α，涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL，下同)的LB琼脂板上，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB中(体积5mL)，在37℃下200～250r/分钟过夜培养。取过夜培养菌液提取质粒，测序验证序列的准确性。
3、As-GP载体的构建
为了检验所构建的As-BTT载体的砷诱导表达功能，将荧光蛋白报告基因插入As-BTT载体，通过砷诱导剂的添加观察荧光蛋白的表达，如果荧光蛋白正常表达即菌体呈现出荧光特性则可说明As-BTT载体具有砷诱导表达特性，基于Pars1构建的砷诱导表达系统正确。
(1)线性化载体制备：采用NcoI和PstI双酶切步骤2构建所得的As-BTT载体，凝胶电泳回收纯化目的条带。
(2)目的DNA片段的制备：以sfGFP质粒(上海林渊生物科技有限公司)为模板，扩增sfGFP片段，717bp。采用Pfu DNA聚合酶(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，上游引物序列为:5’-TGTTGTGGATCCAAGAAGGAGATATACCATGGCAATGCGTAAAGGCGAAG-3’(NcoI),下游引物序列为:5’-TCTCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTCTGCAGTCATTTGTACAGTTCATC-3’(PstI)。
(3)构建As-GP载体：冰上配置重组反应体系，总体积20μL，含目的DNA片段和线性化载体共10μL(体积比1：1)及2×重组酶反应液(苏州泓迅生物科技股份有限公司)10μL，50℃反应60分钟，然后冰上冷却。
(4)转化及鉴定：取10μL重组反应液转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(50μg/ml，下同)的LB琼脂板，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB中(氨苄青霉素终浓度50μg/ml，体积5mL)，在37℃下200～250r/分钟过夜培养。取过夜培养菌液提取质粒，测序验证序列的准确性。
(5)荧光蛋白的表达：挑取含有As-GP载体的E.coli DH5α的单克隆菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养OD600值约在0.5-0.8之间时，将菌液分成2份，一份菌液(诱导菌)加入砷终浓度为30μmol/L的砷诱导剂溶液，另一份菌液(非诱导菌)加入灭菌去离子超纯水代替砷诱导剂溶液。以开始加入砷诱导剂的时间为0h，在加入诱导剂培养4h时，分别检测菌液的OD600和荧光强度值，各菌株的生长和荧光强度检测结果分别见图1。由图1中结果可见，诱导菌的荧光强度值远高于非诱导菌，说明As-GP载体具有砷诱导表达特性，其中的砷诱导启动子可以正常发挥作用。
4、As2-GP载体的构建
大肠杆菌基因组中含有与前述序列不同的砷诱导启动子(本发明将来源于E.coliDH5α基因组的砷诱导启动子序列命名为“Pars2”，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，砷特异结合的转录阻遏蛋白命名为“ArsR2”，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，从大肠杆菌E.coli DH5α基因组中克隆了包括操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列在内的Pars2片段，用Pars2片段替代了As-GP载体中砷诱导启动子形成As2-GP载体，通过砷诱导剂的添加观察荧光蛋白的表达，如果荧光蛋白正常表达即菌体呈现出荧光特性则可说明Pars2片段具有砷诱导表达功能，要注意的是Pars2片段中不含有第二调控区序列。
(1)E.coli DH5α基因组的提取：取过夜培养的E.coli DH5α菌液1.5ml，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)(北京普博欣生物科技有限责任公司)提取E.coli DH5α基因组，具体操作见北京普博欣生物科技有限责任公司的使用说明书。
(2)As2-GP载体构建：以提取的DH5α基因组为模板PCR扩增Pars2片段(包括操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列，本发明将该来源于E.coli DH5α基因组的砷诱导启动子序列命名为“Pars2”，砷特异结合的转录阻遏蛋白命名为“ArsR2”)：采用TaKaRa公司的PCR反应预混试剂盒Premix TaqTM(ExTaqTM Version 2.0)，上游引物序列为：5’-AGGAATTCCCGCGGTTACCTTCCTCT GCACTTACAC-3’(EcoRI)，下游引物序列为5’-CGACGGATCCTTAACTGCAAATGTTCTTACTGTCCCC-3’(BamHI)。琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR目的片段，TA克隆该片段(
Figure BDA0002634213520000091
19-T载体，TaKaRa公司)，用EcoRI和BamHI从T载体上双酶切得到Pars2片段，将该片段连入步骤3中构建的As-GP中的EcoRI和-BamHI位点(用EcoRI和-BamHI酶切As-GP载体，回收大片段用于连接)，连接酶采用T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)，按照使用说明书进行操作。
(3)转化及鉴定：取连接液转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(50μg/ml，下同)的LB琼脂板，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB中(氨苄青霉素终浓度50μg/ml，体积5mL)，在37℃下200～250r/分钟过夜培养。取过夜培养菌液提取质粒，经过测序验证序列的准确性。
(4)荧光蛋白的表达：挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养OD600值约在0.5-0.8之间时，将菌液分成2份，一份菌液(诱导菌)加入砷终浓度为30μmol/L的砷诱导剂溶液，另一份菌液(非诱导菌)加入灭菌去离子超纯水代替砷诱导剂溶液。以开始加入砷诱导剂的时间为0h，在加入诱导剂培养4h时，分别检测菌液的OD600和荧光强度值，各菌株的生长和荧光强度检测结果分别见图2。由图2结果可见，诱导菌的荧光强度值远高于非诱导菌，说明As2-GP载体具有砷诱导表达特性，其中的砷诱导启动子可以正常发挥作用。
实施例2砷结合蛋白表达载体As2-ICAR(A21)的构建
本实施例构建As2-ICAR(A21)载体的目的是为了得到由Pars2砷诱导启动子控制砷特异结合蛋白ArsR1表达的表达载体，通过用设计合成的ICAR序列片段替换了As2-GP载体中的核蛋白体结合位点序列-sfGFP序列得到。设计合成的ICAR序列包括了砷诱导启动子Pars2的调控区序列、核蛋白体结合位点序列、冰核蛋白inaK基因的N-端结构域序列、红色荧光蛋白mCherry序列以及砷结合蛋白ArsR1序列，ICAR序列中添加的砷诱导启动子Pars2的调控区序列为As2-ICAR载体中Pars2的第二调控区序列。
实施例1制得的As2-GP载体上包含砷诱导启动子系统、荧光蛋白sfGFP，本实施例在A21构建的过程中切除了荧光蛋白sfGFP序列，同时插入ICAR序列片段，在ICAR序列片段的前端包括一个砷诱导启动子(Pars2)的调控区序列即阻遏位点，增加这个调控区序列是可以更好的控制砷诱导启动子的本底表达。
全基因合成自主设计的长度1761bp的ICAR序列片段(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，其中包括砷诱导启动子Pars2的调控区序列、核蛋白体结合位点序列、冰核蛋白inaK基因的N-端结构域序列、红色荧光蛋白mCherry序列以及砷结合蛋白ArsR1序列，再将ICAR片段克隆至As2-GP载体的BamHI和PstI酶切位点之间，构建得到As2-ICAR载体(图3)。
合成基因序列的准确性和克隆酶切位点的准确性全部经过测序验证。载体A21(As2-ICAR载体)的砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，包含砷诱导启动子(1-451bp)、冰核蛋白N端结构域序列(560-1132bp)、荧光蛋白基因(1139-1846bp)和砷结合蛋白基因(1853-2206bp)、rrBT1T2(2213-2684bp)。
实施例3砷结合蛋白表达载体As1-ICAR(A11)的构建
本实施例构建As1-ICAR(A11)载体的目的是为了得到由Pars1砷诱导启动子控制砷特异结合蛋白ArsR1表达的表达载体，通过利用从As1-GP载体中得到包含完整砷诱导启动子表达系统的Pars1片段替代As2-ICAR(A21)载体中的砷诱导启动表达系统得到。Pars1片段包含相应的操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列、第二调控区序列。
利用SacII和NcoI双酶切As1-GP载体得到包含完整砷诱导启动表达系统的Pars1片段(602bp)，用SacII和NcoI双酶切As2-ICAR载体得到含ICAR片段的大片段(4786bp)，将Pars1片段与含ICAR片段的大片段(4786bp)连接构成As1-ICAR载体(图4)。经过测序验证序列的准确性。载体A11(As1-ICAR)的砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，包含砷诱导启动子系统(1-492bp)、冰核蛋白N端结构域序列(599-1171bp)、荧光蛋白基因(1178-1885bp)和砷结合蛋白基因(1892-2245bp)、rrBT1T2(2252-2723bp)。
实施例4砷结合蛋白表达载体As1-ICAR2(A12)的构建
本实施例构建As1-ICAR2(A12)载体的目的是为了得到由Pars1砷诱导启动子控制砷特异结合蛋白ArsR2表达的表达载体，通过利用ArsR2基因片段替代As1-ICAR(A11)载体中砷诱导表达的ArsR1基因片段得到。
(1)线性化载体制备：采用SalI和PstI双酶切As1-ICAR载体，凝胶电泳回收纯化目的条带。
(2)目的DNA片段的制备：以As2-GP载体为模板，PCR扩增砷结合蛋白ArsR2基因片段。采用Pfu DNA聚合酶(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，上游引物序列为:5’-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGGTCGACATGTCATTTCTGTTACCCATCCAATTG-3’(SalI)，下游引物序列为:5’-CTCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTCTGCAGTTAACTGCAAATGTTCTTACTGTCCCCGGAAC-3’(PstI)。
(3)构建As1-ICAR2载体：冰上配置重组反应体系，总体积20μL，含目的DNA片段和线性化载体共10μL(体积比1：1)及2×重组酶反应液(苏州泓迅生物科技股份有限公司)10μL，50℃反应60分钟，然后冰上冷却。
(4)转化及鉴定：取10μL重组反应液转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(50μg/ml，下同)的LB琼脂板，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB中(氨苄青霉素终浓度50μg/ml，体积5mL)，在37℃下200～250r/分钟过夜培养。取过夜培养菌液提取质粒，得到As1-ICAR2载体(图5)测序验证序列的准确性。载体A12(As1-ICAR2)的砷诱导启动子表达系统的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，包含砷诱导启动子系统(1-492bp)、冰核蛋白N端结构域序列(599-1171bp)、荧光蛋白基因(1178-1885bp)和砷结合蛋白基因(1892-2245bp)、rrBT1T2(2252-2723bp)。
实施例5特异去除砷工程菌的构建及融合蛋白的表达情况检测
将以上实施例构建的A11载体、A21载体和A12载体分别各自转入E.coli Top10、E.coli DH5α、E.coli BL21的感受态细胞中，将已转化的感受态细胞涂布在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。分别挑取单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB培养基中37℃振摇(200rpm)培养过夜，次日早上，以2％比例接种于新的含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃振摇培养至OD600至0.5～0.8时，将各菌液分成2份，一份菌液(诱导菌)加入砷终浓度为150μmol/L的砷诱导剂溶液，另一份菌液(非诱导菌)加入灭菌去离子超纯水代替砷诱导剂溶液。以开始加入砷诱导剂的时间为0h，在加入诱导剂培养6h时，分别检测菌液的OD600和荧光强度值，各菌株的生长和荧光强度检测结果分别如图6、图7、图8、图9、图10和图11所示。
通过对比E.coli Top10、E.coli DH5α、E.coli BL21三种宿主菌分别转化A11载体、A21载体和A12载体构建的基因工程菌在砷诱导条件下的OD600值(该值提示生长情况)及荧光强度值，发现与非诱导菌相比，采用150μM的砷诱导各工程菌时，A11载体、A21载体和A12载体的E.coli Top10、E.coli DH5α菌株的OD600值都呈现明显降低趋势，但是三个载体的E.coli BL21菌株的生长曲线都与非诱导菌差别不大，并且三个载体的E.coli BL21诱导菌株的荧光强度都高于三个载体的E.coli Top10、E.coli DH5α诱导菌株。因此，E.coliBL21菌株比E.coliDH5α菌株和E.coli TOP10菌株更适合作为宿主菌，在后续实验中选用E.coli BL21菌株作为宿主菌构建特异去除砷的基因工程菌。
与其相应的非诱导菌株相比，E.coli Top10、E.coli DH5α、E.coli BL21三种宿主菌分别转化A11、A21和A12载体构建的基因工程菌都表现出了显著提高的荧光特性，说明所构建的融合蛋白在这三种菌株中均可正常表达并发挥正常的荧光特性。此外，由诱导菌株的荧光强度值还可以看出，在携带A21载体的BL21菌株的OD600值低于携带A12载体的BL21菌株的情况下，携带A21载体的BL21菌株的荧光强度值却更高，表明携带A21载体的BL21菌株表达的融合蛋白的荧光特性明显高于A12载体的融合蛋白。
实施例6工程菌去除砷能力的检测
挑取含有A11载体的E.coli BL21(A11-BL21)、含有A21载体的E.coli BL21(A21-BL21)和含有A12载体的E.coli BL21(A12-BL21)单克隆，过夜培养，以2％比例接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，培养工程菌的OD600为0.6-1.0左右时，离心保留菌体，利用不同浓度(10、40、160μmol/L)的含砷溶液重悬菌体并继续在30℃培养1小时，离心，测定上清液中的砷含量。上清液中的砷含量低于培养前溶液中的砷含量即证明工程菌具有吸附去除砷的作用(以不含质粒的BL21空菌以及含有pUC57质粒的BL21菌作为对照)，砷的去除效率通过每克干细胞吸附砷的量来表示，上清液中砷含量采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定。
结果如图12所示，结果表明，与对照菌(不含质粒的BL21空菌以及含有pUC57质粒的BL21菌)相比，A11-BL21和A21-BL21在三个浓度组中砷去除效果均高于对照菌(P<0.05)，A12-BL21菌在10和40μmol/L浓度组的砷去除效果均高于两个对照菌(P<0.05)，但在160μmol/L浓度组与两个对照菌无统计学差异性。
对比A11-BL21、A21-BL21和A12-BL21的砷去除效果可见，A21-BL21除在10μmol/L浓度组与A11-BL21的砷去除效果无统计学差异性外，40和160μmol/L浓度组的砷去除效果均高于A11-BL21菌(P<0.05)；A21-BL21在三个浓度组的砷去除效果都高于A12-BL21菌(P<0.05)。综合以上结果可知，A21-BL21的吸附去除砷的效果明显优于A11-BL21和A12-BL21。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国环境科学研究院 中国科学院动物研究所
<120> 一种特异去除砷的载体及其构建方法与应用
<130> KHP201113791.5
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattccaag ttatctcacc taccttaagg taatagtgtg attaatcata tgcgtttttg 60
gttatgtgtt gtttgactta atatcagagc cgagagatac ttgttttcta caaaggagag 120
ggaaatgttg caactaacac cacttcagtt atttaaaaac ctgtccgatg aaacccgttt 180
gggtatcgtg ttgttgctca gggagatggg agagttgtgc gtgtgtgatc tttgcatggc 240
actggatcaa tcacagccca aaatatcccg tcatctggcg atgctacggg aaagtggaat 300
ccttctggat cgtaaacagg gaaaatgggt tcactaccgc ttatcaccgc atattccttc 360
atgggctgcc cagattattg agcaggcctg gttaagccaa caggacgacg ttcaggtcat 420
cgcacgcaag ctggcttcag ttaactgctc cggtagcagt aaggctgtct gcatctaaaa 480
aatttgcctg aa 492
<210> 2
<211> 451
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaccttcct ctgcacttac acattcgtta agtcatatat gtttttgact tatccgcttc 60
gaagagagac actacctgca acaatcagga gcgcaatatg tcatttctgt tacccatcca 120
attgttcaaa attcttgctg atgaaacccg tctgggcatc gttttactgc tcagcgaact 180
gggagagtta tgcgtctgcg atctctgcac tgctctcgac cagtcgcagc ccaagatctc 240
ccgccacctg gcattgctgc gtgaaagcgg gctattgctg gaccgcaagc aaggtaagtg 300
ggttcattac cgcttatcac cgcatattcc agcatgggcg gcgaaaatta ttgatgaggc 360
ctggcgatgt gaacaggaaa aggttcaggc gattgtccgc aacctggctc gacaaaactg 420
ttccggggac agtaagaaca tttgcagtta a 451
<210> 3
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttgcaac taacaccact tcagttattt aaaaacctgt ccgatgaaac ccgtttgggt 60
atcgtgttgt tgctcaggga gatgggagag ttgtgcgtgt gtgatctttg catggcactg 120
gatcaatcac agcccaaaat atcccgtcat ctggcgatgc tacgggaaag tggaatcctt 180
ctggatcgta aacagggaaa atgggttcac taccgcttat caccgcatat tccttcatgg 240
gctgcccaga ttattgagca ggcctggtta agccaacagg acgacgttca ggtcatcgca 300
cgcaagctgg cttcagttaa ctgctccggt agcagtaagg ctgtctgcat ctaa 354
<210> 4
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtcatttc tgttacccat ccaattgttc aaaattcttg ctgatgaaac ccgtctgggc 60
atcgttttac tgctcagcga actgggagag ttatgcgtct gcgatctctg cactgctctc 120
gaccagtcgc agcccaagat ctcccgccac ctggcattgc tgcgtgaaag cgggctattg 180
ctggaccgca agcaaggtaa gtgggttcat taccgcttat caccgcatat tccagcatgg 240
gcggcgaaaa ttattgatga ggcctggcga tgtgaacagg aaaaggttca ggcgattgtc 300
cgcaacctgg ctcgacaaaa ctgttccggg gacagtaaga acatttgcag ttaa 354
<210> 5
<211> 2723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattccaag ttatctcacc taccttaagg taatagtgtg attaatcata tgcgtttttg 60
gttatgtgtt gtttgactta atatcagagc cgagagatac ttgttttcta caaaggagag 120
ggaaatgttg caactaacac cacttcagtt atttaaaaac ctgtccgatg aaacccgttt 180
gggtatcgtg ttgttgctca gggagatggg agagttgtgc gtgtgtgatc tttgcatggc 240
actggatcaa tcacagccca aaatatcccg tcatctggcg atgctacggg aaagtggaat 300
ccttctggat cgtaaacagg gaaaatgggt tcactaccgc ttatcaccgc atattccttc 360
atgggctgcc cagattattg agcaggcctg gttaagccaa caggacgacg ttcaggtcat 420
cgcacgcaag ctggcttcag ttaactgctc cggtagcagt aaggctgtct gcatctaaaa 480
aatttgcctg aaggatccga attccaagtt atctcaccta ccttaaggta atagtgtgat 540
taatcatatg cgtttttggt tatgtgttgt ggatccaaga aggagatata ccatggcaat 600
gactctcgac aaggcgttgg tgctgcgtac ctgtgcaaat aacatggccg atcactgcgg 660
ccttatatgg cccgcgtccg gcacggtgga atccagatac tggcagtcaa ccaggcggca 720
tgagaatggt ctggtcggtt tactgtgggg cgctggaacc agcgcttttc taagcgtgca 780
cgccgatgct cgatggattg tctgtgaagt tgccgttgca gacatcatca gtctggaaga 840
gccgggaatg gtcaagtttc cacgggccga ggtggttcat gtcggcgaca ggatcagcgc 900
gtcacacttc atttcggcac gtcaggccga ccctgcgtca acgtcaacgt caacgtcaac 960
gtcaacgtta acgccaatgc ctacggccat acccacgccc atgcctgcgg tagcaagtgt 1020
cacgttaccg gtggccgaac aggcccgtca cgaagtgttc gatgtcgcgt cggtcagcgc 1080
ggctgccgcc ccagtaaaca ccctgccggt gacgacgccg cagaatttgc agaccgccac 1140
ttacggcagc acgttgagtg gcgacaatca cctcatgatg gtgagcaagg gcgaggagga 1200
taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg gctccgtgaa 1260
cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc ccctacgagg gcacccagac 1320
cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc 1380
tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt 1440
gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg 1500
cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct ccaggacggc gagttcatct acaaggtgaa 1560
gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga cgatgggctg 1620
ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca 1680
gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag gtcaagacca cctacaaggc 1740
caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac atcaagttgg acatcacctc 1800
ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc gccactccac 1860
cggcggcatg gacgagctgt acaaggtcga catgttgcaa ctaacaccac ttcagttatt 1920
taaaaacctg tccgatgaaa cccgtttggg tatcgtgttg ttgctcaggg agatgggaga 1980
gttgtgcgtg tgtgatcttt gcatggcact ggatcaatca cagcccaaaa tatcccgtca 2040
tctggcgatg ctacgggaaa gtggaatcct tctggatcgt aaacagggaa aatgggttca 2100
ctaccgctta tcaccgcata ttccttcatg ggctgcccag attattgagc aggcctggtt 2160
aagccaacag gacgacgttc aggtcatcgc acgcaagctg gcttcagtta actgctccgg 2220
tagcagtaag gctgtctgca tctaactgca gagcttctgt tttggcggat gagagaagat 2280
tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc 2340
tcccggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg 2400
tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gccaactgcc aggcatcaaa 2460
taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga 2520
acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc 2580
ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg 2640
ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct ttgtttattt ttctaaatac 2700
attcaaatat gtatccgctc atg 2723
<210> 6
<211> 2684
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttaccttcct ctgcacttac acattcgtta agtcatatat gtttttgact tatccgcttc 60
gaagagagac actacctgca acaatcagga gcgcaatatg tcatttctgt tacccatcca 120
attgttcaaa attcttgctg atgaaacccg tctgggcatc gttttactgc tcagcgaact 180
gggagagtta tgcgtctgcg atctctgcac tgctctcgac cagtcgcagc ccaagatctc 240
ccgccacctg gcattgctgc gtgaaagcgg gctattgctg gaccgcaagc aaggtaagtg 300
ggttcattac cgcttatcac cgcatattcc agcatgggcg gcgaaaatta ttgatgaggc 360
ctggcgatgt gaacaggaaa aggttcaggc gattgtccgc aacctggctc gacaaaactg 420
ttccggggac agtaagaaca tttgcagtta aggatcctta ccttcctctg cacttacaca 480
ttcgttaagt catatatgtt tttgacttat ccgcttcgaa gagagacact aggatccaag 540
aaggagatat accatggcaa tgactctcga caaggcgttg gtgctgcgta cctgtgcaaa 600
taacatggcc gatcactgcg gccttatatg gcccgcgtcc ggcacggtgg aatccagata 660
ctggcagtca accaggcggc atgagaatgg tctggtcggt ttactgtggg gcgctggaac 720
cagcgctttt ctaagcgtgc acgccgatgc tcgatggatt gtctgtgaag ttgccgttgc 780
agacatcatc agtctggaag agccgggaat ggtcaagttt ccacgggccg aggtggttca 840
tgtcggcgac aggatcagcg cgtcacactt catttcggca cgtcaggccg accctgcgtc 900
aacgtcaacg tcaacgtcaa cgtcaacgtt aacgccaatg cctacggcca tacccacgcc 960
catgcctgcg gtagcaagtg tcacgttacc ggtggccgaa caggcccgtc acgaagtgtt 1020
cgatgtcgcg tcggtcagcg cggctgccgc cccagtaaac accctgccgg tgacgacgcc 1080
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ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt 1200
gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg 1260
cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggtggcc ccctgccctt 1320
cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc 1380
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<400> 7
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taatcatatg cgtttttggt tatgtgttgt ggatccaaga aggagatata ccatggcaat 600
gactctcgac aaggcgttgg tgctgcgtac ctgtgcaaat aacatggccg atcactgcgg 660
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tgagaatggt ctggtcggtt tactgtgggg cgctggaacc agcgcttttc taagcgtgca 780
cgccgatgct cgatggattg tctgtgaagt tgccgttgca gacatcatca gtctggaaga 840
gccgggaatg gtcaagtttc cacgggccga ggtggttcat gtcggcgaca ggatcagcgc 900
gtcacacttc atttcggcac gtcaggccga ccctgcgtca acgtcaacgt caacgtcaac 960
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ggctgccgcc ccagtaaaca ccctgccggt gacgacgccg cagaatttgc agaccgccac 1140
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taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg gctccgtgaa 1260
cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc ccctacgagg gcacccagac 1320
cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc 1380
tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt 1440
gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg 1500
cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct ccaggacggc gagttcatct acaaggtgaa 1560
gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga cgatgggctg 1620
ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca 1680
gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag gtcaagacca cctacaaggc 1740
caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac atcaagttgg acatcacctc 1800
ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc gccactccac 1860
cggcggcatg gacgagctgt acaaggtcga catgtcattt ctgttaccca tccaattgtt 1920
caaaattctt gctgatgaaa cccgtctggg catcgtttta ctgctcagcg aactgggaga 1980
gttatgcgtc tgcgatctct gcactgctct cgaccagtcg cagcccaaga tctcccgcca 2040
cctggcattg ctgcgtgaaa gcgggctatt gctggaccgc aagcaaggta agtgggttca 2100
ttaccgctta tcaccgcata ttccagcatg ggcggcgaaa attattgatg aggcctggcg 2160
atgtgaacag gaaaaggttc aggcgattgt ccgcaacctg gctcgacaaa actgttccgg 2220
ggacagtaag aacatttgca gttaactgca gagcttctgt tttggcggat gagagaagat 2280
tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc 2340
tcccggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg 2400
tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gccaactgcc aggcatcaaa 2460
taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga 2520
acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc 2580
ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg 2640
ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct ttgtttattt ttctaaatac 2700
attcaaatat gtatccgctc atg 2723
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aactgcagag cttctgtttt ggcggatg 28
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcatgcca tgagcggata catatttgaa tg 32
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgttgtggat ccaagaagga gatataccat ggcaatgcgt aaaggcgaag 50
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctctcatcc gccaaaacag aagctctgca gtcatttgta cagttcatc 49
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggaattccc gcggttacct tcctctgcac ttacac 36
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgacggatcc ttaactgcaa atgttcttac tgtcccc 37
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgacggatcc ttaactgcaa atgttcttac tgtcccc 37
<210> 15
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctctcatccg ccaaaacaga agctctgcag ttaactgcaa atgttcttac tgtccccgga 60
ac 62

Claims (10)

1.一种载体，其特征在于，包含金属或非金属结合蛋白表达盒，所述表达盒包含金属诱导启动子或非金属诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、金属结合蛋白基因或非金属结合蛋白基因；优选所述金属为镉、锌、铅、铜、镍，所述非金属为砷。
2.一种能够特异去除砷的载体，其特征在于，包含砷结合蛋白表达盒，所述表达盒包含砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因和砷结合蛋白基因；所述砷结合蛋白为来源于大肠杆菌基因组或大肠杆菌R因子R773质粒、荧光假单胞菌MSP3的基因组、铜绿假单胞菌基因组的砷结合蛋白；
和/或，所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或者，
所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或者，
所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的载体，其特征在于，所述细菌表面展示载体蛋白为选自冰核蛋白、Lpp-OmpA、OmpC中的一种；
优选为冰核蛋白N端结构域。
5.根据权利要求1～4任一项所述的载体，其特征在于，所述表达盒还包含荧光蛋白基因；
优选地，所述表达盒沿5’至3’方向依次包括砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、荧光蛋白基因和砷结合蛋白基因。
6.根据权利要求1～5任一项所述的载体，其特征在于，所述表达盒具有如SEQ ID NO.5～7任一所示的序列；
优选地，所述表达盒还包含位于砷结合蛋白基因下游的转录终止子。
7.根据权利要求1～6任一项所述的载体，其特征在于，所述载体为含有携带所述表达盒的pUC系列载体、pBR322系列载体、或pACYC系列载体。
8.权利要求1～7任一项所述的载体的构建方法，其特征在于，将所述表达盒连接入质粒载体中得到。
9.含有权利要求1～7任一项所述的载体的工程菌。
10.权利要求1～7任一项所述的载体或权利要求9所述的工程菌的在去除或回收金属或非金属元素中的应用，或在治理环境中金属或非金属元素污染中的应用。
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