CN112575017A - 重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究 - Google Patents

重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究 Download PDF

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Abstract

发明名称重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究摘要本发明公开了重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究的研究成果，探讨了重组蛋白在液体保存状态下温度对其稳定性影响的问题。通过分子克隆技术，将鼠Tet3基因克隆至原核表达载体pET28a(+)上，成功构建重组质粒pET28a‑Tet3；再对重组蛋白表达条件进行优化，分离纯化出目的蛋白Tet3；对纯化出的目的蛋白Tet3稳定性进行分析，主要选取3个温度条件即常温、4℃和37℃，分别保存60天来分析Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性。本发明能表达纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白，并验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度，为公司产品在运输过程中的最佳保存条件提供一个好的理论依据。

Description

重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究
技术领域
本发明涉及分子生物学与蛋白质组学领域，具体的是说重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究。
技术背景
DNA的胞嘧啶(C)5-甲基化是一种重要的表观修饰，它参与基因调节、基因组印记、X-染色体失活、重复序列抑制和癌症发生等过程。5-甲基胞嘧啶(5mC)可被TET(ten-eleventranslocation)蛋白家族进一步转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，该过程是DNA去甲基化的1个必要阶段。5hmC可在活性转录基因起始位点和Polycomb抑制基因启动子延伸区域富集。TET蛋白包括3个成员TET1、TET2和TET3，均属于α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶，其催化涉及氧化过程。小鼠Tet1在胚胎干细胞发育中拥有双重作用，即促进全能因子的转录，又参与发育调节因子的抑制。人TET蛋白的破坏与造血系统肿瘤相关，如在骨髓增生性疾病/肿瘤存在频繁的TET2基因突变。TET蛋白和5hmC的研究为DNA甲基化/去甲基化及其生物学功能提供了新的视点。
原核表达系统（大肠杆菌表达系统）是基因表达技术中发展最早，应用最广泛的经典表达系统，近几十年，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善，被科研及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。与其它表达系统相比，具有目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强，成本相对低等特点。
亲和层析是利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法。亲和层析是目前生产上应用最为广泛的分离纯化蛋白的方法之一，表达载体pET28a(+)上带有6HIS标签，可以应用镍纯化树脂分离纯化目的蛋白。通过选取3个温度条件来摸索重组鼠Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性，对产品在运输过程中能否保持其稳定性提供很好的参考，也为公司重组蛋白产品在运输过程中的最佳保存条件提供理论依据。
发明内容
本发明的目的是能表达纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白，并验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度，为公司产品在运输过程中的最佳保存条件提供一个好的理论依据。
技术方案包括以下步骤：
（1）人工合成鼠Tet3基因，Tet3和pET28a(+)经BamHl和Xhol 双酶切后连接，构建重组质粒pET28a-Tet3。
（2）然后用CaCl2法将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，构建工程菌。
（3）构建好的工程菌用IPTG诱导表达，并从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白可溶性表达进行优化。
（4）用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。
（5）探讨温度对重组鼠Tet3蛋白稳定性的影响。
所述步骤（1）中，查阅NCBI数据库中鼠Tet3基因转录本，人工合成鼠Tet3基因，然后将pET28a(+)和Tet3基因经BamHl、Xhol双酶切，通过连接转化构建pET28a-Tet3。
所述步骤（2）中，将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，目的是为了筛选目的基因最适合的表达宿主。
所述步骤（3）中，分别从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白的可溶性表达进行优化，诱导温度分别采用了16℃、25℃、30℃、37℃，IPTG浓度分别采用了0.1mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM。收集不同诱导条件下的细菌，超声破碎后分别取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测目标蛋白可溶性表达情况。
镍柱纯化蛋白原理是：组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响。组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体上的镍离子带正电对组氨酸有亲和作用。高浓度的咪唑可以竞争性地与镍柱结合，从而使组氨酸与镍柱脱附，达到分离纯化目的蛋白的作用。
所述步骤（5）中，选取了三个温度条件即常温、4℃和37℃，分别保存60天，挑取其中的24个样本电泳检测来分析Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性。
经实验证实，经过对重组蛋白表达条件进行优化，能表达纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白；且探索并验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度和时间。
本发明先通过查阅NCBI数据库中鼠Tet3基因转录本，将目标蛋白基因克隆至表达载体上；通过对目标蛋白的表达条件进行一系列优化，最终得到一组最优条件：诱导温度为16℃，IPTG浓度为0.6mM，诱导时间为12h。经大体积发酵后能纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白。选择3个温度条件验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度，为公司产品在运输过程中的最佳保存条件提供一个好的理论依据。
附图说明
图1为以PUC57-Tet3为模板，通过PCR扩增出的鼠Tet3基因部分编码区片段，1%琼脂糖凝胶电泳图。
图2为构建的重组表达质粒pET28a-Tet3示意图。
图3为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同IPTG浓度诱导后的SDS-PAGE电泳图。
注：泳道1、2、3、4、5分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mM IPTG，0.5mM IPTG，0.8mM IPTG。
图4为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌C41(DE3)经不同IPTG浓度诱导后的SDS-PAGE电泳图。
注：泳道1、2、3、4、5分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mM IPTG，0.5mM IPTG，0.8mM IPTG。
图5为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同温度诱导后，超声破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。
注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表蛋白质Marker，未诱导，16℃上清，16℃沉淀，25℃上清，25℃沉淀，30℃上清，30℃沉淀，37℃上清，37℃沉淀。
图6为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同浓度IPTG诱导后，超声破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。
注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mM上清，0.1mM沉淀，0.4mM上清，0.4mM沉淀，0.6mM上清，0.6mM沉淀，0.8mM上清，0.8mM沉淀。
图7为融合蛋白Tet3的纯化示意图。
注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别代表蛋白质Marker，穿透液，20mM咪唑，40mM咪唑，60mM咪唑，100mM咪唑，300mM咪唑，500mM咪唑。
图8、图9、图10为不同温度保存条件下，液态重组鼠Tet3蛋白稳定性SDS-PAGE电泳检测结果。
注：图8表示在常温条件下保存60天液态重组鼠Tet3蛋白稳定性SDS-PAGE电泳检测结果；图9表示在4℃条件下保存60天液态重组鼠Tet3蛋白稳定性SDS-PAGE电泳检测结果；图10表示在37℃条件下保存60天液态重组鼠Tet3蛋白稳定性SDS-PAGE电泳检测结果。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步的阐述，但是不作为本发明内容的限制。
实施案例1 重组质粒pET28a-Tet3的构建。
1.Tet3基因的获取。
根据Genbank已经收录的基因（NCBI收录号：AK044758）应用Primer Premier5.0软件设计一对引物，并在上游引物和下游引物5'端添加BamHl和Xhol限制性酶切位点。设计引物如下：
上游引物（P1）：5'CAGCAGGATCCAACAGGTGCCACCCAACAAG3'
下游引物（P2）：5'AGTATCTCGAGGATCCATCTGCTGTAAGGGC3'
利用PUC57-Tet3为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：
PUC57-Tet3 1µl
P1 1µl
P2 1µl
dNTP 4µl
10×PCR buffer 5µl
H2O 37.5µl
Taq聚合酶 0.5µl
Total Volume 50µl
加入各组分后混合均匀，PCR反应按以下反应条件进行：94℃预热2min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，30个循环后72℃再延伸10min，4℃保存。取3µl PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳检测（如图1）。
2.表达载体pET28a-Tet3的构建。
用碱裂解法提取质粒pET28a，然后将载体和Tet3基因扩增产物同时做BamHl和Xhol双酶切，低熔点琼脂糖胶回收载体片段。将目的片段和载体片段16℃过夜连接，连接后转化E.coli DH5α，用PCR菌落法筛选重组子，成功构建表达载体pET28a-Tet3（如图2）。
用CaCl2法将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，构建工程菌。重组质粒pET28a-Tet3转化Rosetta(DE3)和C41(DE3)细胞步骤如下：
1）取100µl Rosetta(DE3)或C41(DE3)感受态细胞于EP管中，在冰浴中加入10µl水溶性质粒pET28a-Tet3，充分混匀后在冰上放置30min。
2）在42℃水浴中热击90s，迅速置于冰上2min。
3）向EP管中加入800µl LB液体培养基（不含氨苄），37℃ 180r振荡45min。
4）取上述菌液30µl和70µl分别涂布于含卡那霉素和氯霉素或含卡那霉素的LB固体平板，正面放置0.5h，37℃倒置过夜培养。
实施例2 重组质粒pET28a-Tet3的诱导表达及其表达条件的优化。
1.重组质粒pET28a-Tet3的诱导表达。
分别挑取Rosetta（pET28a-Tet3）和C41（pET28a-Tet3）单菌落接种于10ml含相应抗生素的LB液体培养基，37℃ 180r/min过夜培养。
分别取1ml过夜培养的菌液接种于两个100ml LB液体培养基中，37℃180r振荡培养2.5h，加入IPTG（终浓度分别为0.1、0.5、0.8mmol/L）诱导表达3h。将菌体放入离心管中4000r离心5min，收集菌体后用蒸馏水洗涤两次，20ml PBS缓冲液重悬菌体，取20µl加入5µl5倍蛋白上样缓冲液沸水中煮10min，12000r离心10min后SDS-PAGE电泳检测（如图3和图4）。
2.表达条件的优化。
影响原核表达的主要因素有温度、IPTG浓度、诱导表达时间，所以实验从这三个方面优化表达条件。分别从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白的可溶性表达进行优化，诱导温度分别采用了16℃、25℃、30℃、37℃，IPTG浓度分别采用了0.1mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM。收集不同诱导条件下的细菌，超声破碎后分别取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测目标蛋白可溶性表达情况（如图5和图6）。
实施例3 重组蛋白Tet3的纯化。
重组蛋白Tet3的纯化。
通过对目标蛋白的表达条件进行一系列优化，最终得到一组最优条件：诱导温度为16℃，IPTG浓度为0.6mM，诱导时间为12h。采用融合蛋白表达最优条件，大量表达重组蛋白。
诱导表达后的菌体用PBS重悬后，冰浴中超声波破碎，12000r离心10min取上清，用滤器过滤，将上清放于预先处理过的Ni-NTA柱中，冰浴中振荡1h，收集穿透液。分别用20mM、40mM、60mM、100mM、300mM和500mM 咪唑洗脱缓冲液洗Ni-NTA柱，并收集洗脱液。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果（如图7）。
实施例4 探讨温度对重组鼠Tet3蛋白稳定性的影响。
将纯化好的重组鼠Tet3蛋白取样，选取了三个温度条件即常温（如图8）、4℃（如图9）和37℃（如图10），分别保存60天，挑取其中的24个样本电泳检测来分析Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性。SDS-PAGE电泳检测样本结果。

Claims (5)

1.鼠Tet3蛋白克隆至原核表达载体pET28a(+)，其特征在于，包括下述步骤：
（1）人工合成鼠Tet3基因，Tet3和pET28a(+)经BamHl和Xhol 双酶切后连接，构建重组质粒pET28a-Tet3；
（2）然后用CaCl2法将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，构建工程菌。
2.如权利要求书1所述的鼠Tet3蛋白克隆至原核表达载体pET28a(+)过程，其特征在于，所述步骤（1）中，查阅NCBI数据库中鼠Tet3基因转录本，人工合成鼠Tet3基因，然后将pET28a(+)和Tet3基因经BamHl、Xhol双酶切，通过连接转化构建pET28a-Tet3。
3.如权利要求书1所述的鼠Tet3蛋白克隆至原核表达载体pET28a(+)过程，其特征在于，所述步骤（2）中，将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，目的是为了筛选目的基因最适合的表达宿主。
4.重组鼠Tet3蛋白表达条件的优化，其特征在于构建好的工程菌用IPTG诱导表达，并从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白表达进行优化。
5.探讨温度对重组鼠Tet3蛋白稳定性的影响，其特征在于，在本发明中选取了三个温度条件即常温、4℃和37℃，分别保存60天，挑取其中的24个样本电泳检测来分析Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性。
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