CN110499312B - 提高酶的可溶性表达的标签及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了提高酶的可溶性表达的标签及方法，设计了可提高酶可溶性表达的标签序列，通过基因工程手段在原酶核苷酸序列C末端上连接融合标签label的核苷酸序列，导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达，可将酶的可溶性表达提高10～20倍左右。
Description
技术领域
本发明属于大肠杆菌蛋白高效表达和基因工程领域，具体涉及提高酶的可溶性表达的标签及方法。
背景技术
大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，在基因工程技术领域成为首选的表达系统，但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体。提高外源蛋白质可溶性表达水平的方法有很多，包括使用弱启动子、降低诱导温度、优化培养基、与分子伴侣共表达等。但是由于表达系统的组件与蛋白质本身的关系暂未研究清，我们往往只能通过不断尝试来提高可溶性表达，耗时较长并且不易得到很好的效果。融合标签的开发和利用不仅方便蛋白质的纯化和检测，而且增强了重组蛋白可溶性表达，产量继稳定性方面也得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种提高酶可溶性表达的标签，从而解决酶可溶性表达低的问题。
所述标签具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供包含上述标签序列的重组表达载体，即含有所述重组表达载体的重组菌。
本发明的又一目的在于提供一种提高酶可溶性表达的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种提高酶可溶性表达的方法，在酶基因的C端连接标签序列，导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达。其中所述标签序列如SEQ ID NO：1所示。
其中，所述重组表达载体的构建方式为：
（1）以原酶的基因为模板，设计引物1和引物2，其中引物2带有接头序列Linker和标签序列label，通过PCR的方法获得C端连有label的原酶基因的PCR产物，命名为N-Linker-label；
（2）将（1）中所得到的PCR产物N-Linker-label和载体进行双酶切反应，获得重组载体。
进一步的，所述载体选用pET30a。
进一步的，所述重组菌选用大肠杆菌BL21(DE3)。
其中，上述发酵培养的培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
本发明设计了一种普适性强的标签，利用基因工程的方法对原酶进行改造，通过C末端连接融合表达标签构建新的重组基因工程菌，以提高原酶的可溶性表达。所述的标签序列可应用于氧化还原酶类，不仅可提高酶的可溶性表达，且具有很好的普适性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是GDH-Linker-label构建过程。
图2是pET30a-GDH-Linker-label构建过程。
图3是改造前后葡萄糖脱氢酶可溶性表达的比较。
图4是改造前后的葡萄糖脱氢酶温度稳定性的比较。
图5是改造前后的葡萄糖脱氢酶pH稳定性的比较。
图6是普适性实验可溶性表达量的比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1
实施例1~实施例4以葡萄糖脱氢酶为例，具体本发明标签在提高酶可溶性表达中的应用方式。
（1）以葡萄糖脱氢酶基因GDH为模板，设计引物1和引物2，其中引物2带有Linker和label，通过PCR的方法获得C端连有融合标签label的葡萄糖脱氢酶基因的PCR产物，命名为GDH-Linker-label。label的序列如SEQ ID NO：1所示，GDH-Linker-label的构建过程如图1所示。
引物1基因序列：
GGAATTCCATATGATGTATCCGGATTTAAAAGG
引物2基因序列：
CCGCTCGAGTTTGGTGGGTTTATATGCATCGACCATAACGATGTGCGCGGAGCCCCCGCCGGAGCCCCCGCCACCGCGGCCTGCTTGGAATG
PCR的体系为：2×Taq Plus master mix （Taq酶预混合溶液）12.5 uL，模板DNA 2uL，引物1 1 uL，引物2 1 uL，ddH2O 8.5 uL。PCR反应进程为：1）95℃预变性5 min；2）94℃预变性30 s；3）55℃退火30 s；4）72℃延伸40s；步骤2）-4）重复30个循环；5）72℃继续延伸30 s，冷却至4℃。胶回收PCR产物。
（2）将（1）中所得到的PCR产物GDH-Linker-label和pET30a进行双酶切反应，获得重组载体pET30a-GDH-Linker-label。pET30a-GDH-Linker-label的构建过程如图2所示。
酶切位点为：Nde Ⅰ(CATATG)、Xho Ⅰ(CTCGAG)
酶切体系为：ddH2O 30 uL，10×M 5 uL，DNA基因12uL，NdeI 1 uL，XhoI 1 uL，37℃反应4小时以上，获得酶切产物1和2。
（3）用T4 DNA连接酶将连接酶切产物1、2，得到重组载体。通过质粒大小（5500左右）判断GDH-Linker-label是否已连接上pET30a。
连接体系为： 10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5 uL，DNA片段8 uL，载体2 uL，T4DNA连接酶1 uL，ddH2O 11.5 uL，16℃过夜反应。
（4）将重组载体pET30a-GHD-Linker-label转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株上，并涂布到含有卡那霉素的LB固体培养基上，过夜培养。分离抗硫酸卡那霉素的转化体，测序鉴定，测序结果表明获得的核苷酸包括GDH-Linker-label，序列如SEQ ID NO：2所示，pET30a-GDH-Linker-label的基因序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例2
改造前后葡萄糖脱氢酶的诱导表达及纯化
在超净台中挑取原葡萄糖脱氢酶菌株（作对照）以及改造后的菌株的单菌落于50mL的液体LB培养基中，加入50 uL的卡那霉素（浓度为100mg/mL），在37℃，200 rpm的条件下震荡培养9-12h，以此为种子液。
按6%（体积比）的接种量接到50 mL新鲜的LB培养基中，并加入50 uL的卡那霉素，在37℃，200 rpm的条件下，震荡培养1h，然后加入50 uL的IPTG（浓度为100mg/mL），在 20℃，200 rpm的条件下诱导14h，收集菌液。
然后5000 rpm离心5min，弃上清，每50mL菌液离心出来的菌泥用1.5mL pH为7.4的PBS缓冲液重悬，超声破碎后，4℃、12000 rpm离心30 min，上清液过镍柱进行纯化。
实施例3
改造前后葡萄糖脱氢酶的可溶性比较
对实施例2获取的2种纯化后的酶液对进行SDS-PAGE 蛋白电泳，如图3所示，从蛋白图上可以直接观察到改造后的葡萄糖脱氢酶的可溶性表达相较于原葡萄糖脱氢酶，明显提高。使用NanoDrop分光光度计测算浓度后，比较可溶性表达量。GDH可溶性表达量为2.2mg/mL，在对其进行标签融合改造后可溶性表达量达到了33mg/mL。
实施例4
改造前后葡萄糖脱氢酶的温度、pH稳定性比较
对实施例2获取的2种纯化后的酶液对进行酶活检测，每个条件平行实验3组，用紫外分光光度计在340nm处检测OD的变化量，换算为酶活，如图4所示。
由图4可知：GDH和GDH-st的温度稳定性都呈现先上升后下降的趋势。在30℃～40℃条件下，GDH和GDH-st均表现出较好的稳定性，特别是GDH-st，在40℃时酶的相对活力反而升高。但随着温度的增加，GDH和GDH-st的温度稳定性均出现快速的下降，表明在低温度条件下，GDH-st较GDH具有较好的稳定性，但在高温度条件下，二者的稳定性均表现不佳。
由图5可知：GDH-st随着pH的升高，相对酶活逐渐增加，当pH大于7.5时，相对酶活基本保持平稳。GDH随着pH的升高，相对酶活先增加后降低，在pH8.0时稳定性相对最佳。表明GDH-st在pH大于7.5的条件下均较稳定，且其在碱性条件下的稳定性优于GDH。
酶活标准反应条件：1mg/mL的酶液，0.01M葡萄糖反应液，0.05M的NAD+，pH为7.4的PBS缓冲液。
实施例5
为了证明该标签及方法的普遍适应性，实验选取了不同性质的酶进行改造，包括荧光素酶、pv08、LeuDH、ZHD101、CPC酰化酶、酰胺水解酶。按照实施例1～4的方法进行改造，载体选用pET30a，重组菌选用大肠杆菌BL21(DE3)，并比较可溶性表达量与酶活，如图6所示。由图6可知，改造后酶可溶性表达均有可观的提升，改造后的荧光素酶的可溶性表达可达26 mg/100mL培养基，相较于未改造的酶，可溶性表达提高约13倍；改造后的pv08的可溶性表达达到了44 mg/100mL培养基，相较于未改造的酶，可溶性表达提高约15.2倍；改造后的LeuDH的可溶性表达达到了26.4 mg/100mL培养基，相较于未改造的酶，可溶性表达提高约16.5倍；改造后的ZHD101的可溶性表达达到了39.6 mg/100mL培养基，相较于未改造的酶，可溶性表达提高约18倍；改造后的CPC酰化酶的可溶性表达达到了23.7mg/100mL培养基，相较于未改造的酶，可溶性表达提高约11.3倍；改造后的酰胺水解酶的可溶性表达达到了24.3 mg/100mL培养基，相较于未改造的酶，可溶性表达提高约13.5倍。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 提高酶的可溶性表达的标签及方法
<130> xb19080502
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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aaacaagatc cgaacgaggt aaaagaagag gtcatcaagg cgggcggtga agctgttgtc 180
gtccaaggag atgtcacgaa agaggaagat gtaaaaaata tcgtgcaaac ggcaattaaa 240
gagttcggca cactcgatat tatgattaat aatgccggtc ttgaaaatcc tgtgccatct 300
cacgaaatgc cgcttaagga ttgggataaa gtcatcggca caaacttaac aggtgccttt 360
ttaggaagcc gtgaagcgat taaatatttc gtagaaaacg atatcaaggg aaatgtcatc 420
aacatgtcca gtgtgcacga agtgattcct tggccgttat ttgttcacta cgcggcaagt 480
aaaggcggga taaagctgat gacagaaaca ttggcgttgg aatacgcgcc gaagggcatt 540
cgcgtgaaca atatcgggcc aggtgcgatc aatacgccaa tcaatgctga aaaatttgct 600
gaccctaaac agaaagcaga tgtagaaagc atgatcccga tgggatatat cggcgaaccg 660
gaggagatcg ccgcagtggc agcctggctt gcttcgaagg aagccagcta cgtcacaggc 720
atcacgttat tcgcggacgg cggcatgaca caatatcctt cattccaagc aggccgcggt 780
taaggcgggg gctccggcgg gggctccgcg cacatcgtta tggtcgatgc atataaaccc 840
accaaa 846
<210> 4
<211> 6081
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgatg tatccggatt taaaaggaaa 180
agtcgtcgct attacaggag ctgcttcagg gctcggaaag gcaatggcca ttcgcttcgg 240
caaggagcag gcaaaagtgg ttatcaacta ttatagtaat aaacaagatc cgaacgaggt 300
aaaagaagag gtcatcaagg cgggcggtga agctgttgtc gtccaaggag atgtcacgaa 360
agaggaagat gtaaaaaata tcgtgcaaac ggcaattaaa gagttcggca cactcgatat 420
tatgattaat aatgccggtc ttgaaaatcc tgtgccatct cacgaaatgc cgcttaagga 480
ttgggataaa gtcatcggca caaacttaac aggtgccttt ttaggaagcc gtgaagcgat 540
taaatatttc gtagaaaacg atatcaaggg aaatgtcatc aacatgtcca gtgtgcacga 600
agtgattcct tggccgttat ttgttcacta cgcggcaagt aaaggcggga taaagctgat 660
gacagaaaca ttggcgttgg aatacgcgcc gaagggcatt cgcgtgaaca atatcgggcc 720
aggtgcgatc aatacgccaa tcaatgctga aaaatttgct gaccctaaac agaaagcaga 780
tgtagaaagc atgatcccga tgggatatat cggcgaaccg gaggagatcg ccgcagtggc 840
agcctggctt gcttcgaagg aagccagcta cgtcacaggc atcacgttat tcgcggacgg 900
cggcatgaca caatatcctt cattccaagc aggccgcggt ggcgggggct ccggcggggg 960
ctccgcgcac atcgttatgg tcgatgcata taaacccacc aaacatatgt atatctcctt 1020
cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg ggaattgtta tccgctcaca attcccctat 1080
agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atcgatctcg atcctctacg ccggacgcat 1140
cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac 1200
cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat 1260
ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct 1320
tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc 1380
gcataaggga gagcgtcgag atcccggaca ccatcgaatg gcgcaaaacc tttcgcggta 1440
tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt 1500
tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc 1560
aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga 1620
attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg 1680
ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc 1740
gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag 1800
cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact 1860
atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt 1920
tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg 1980
gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag 2040
cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca 2100
ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt 2160
ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca 2220
acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg 2280
cggacatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt 2340
taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc 2400
aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa 2460
gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2520
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2580
aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccg ggatctcgac cgatgccctt gagagccttc 2640
aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact 2700
gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc 2760
gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc 2820
ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag 2880
caggccatta tcgccggcat ggcggcccca cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg 2940
aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc accgatacgc 3000
gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg 3060
gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt 3120
atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc tacatctgta 3180
ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg atttttctct ggtcccgccg catccatacc 3240
gccagttgtt taccctcaca acgttccagt aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt 3300
atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag aaatccccct 3360
tacacggagg catcagtgac caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc 3420
agaagccaga cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca 3480
gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt 3540
ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt 3600
ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 3660
tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact 3720
atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat atgcggtgtg aaataccgca 3780
cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 3840
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 3900
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 3960
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 4020
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 4080
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 4140
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 4200
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 4260
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 4320
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 4380
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 4440
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 4500
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 4560
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 4620
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg aacaataaaa ctgtctgctt 4680
acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcta 4740
ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata 4800
atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt 4860
tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac 4920
taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg 4980
atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag 5040
aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc 5100
attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg 5160
cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg 5220
gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt 5280
cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa 5340
taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc 5400
tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 5460
gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 5520
aagaattaat tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 5580
gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaaattg taaacgttaa tattttgtta 5640
aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc 5700
aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg 5760
aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat 5820
cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc 5880
cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag 5940
ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg 6000
gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta 6060
cagggcgcgt cccattcgcc a 6081
Claims (8)
1.一种提高酶可溶性表达的标签，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组表达载体。
3.含有权利要求2所述重组表达载体的重组菌。
4.一种提高酶可溶性表达的方法，其特征在于，在酶基因的C端连接标签序列，导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达；
所述标签序列如SEQ ID NO：1所示；
所述酶为氧化还原酶类。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶包括GDH、LeuDH、ZHD101、PV08、荧光素酶、CPC酰化酶和酰胺水解酶。
6.根据权利要求4-5任一项所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建方式为：
(1)以原酶的基因序列为模板，设计引物1和引物2，其中引物2带有接头序列Linker和标签序列label，通过PCR的方法获得C端连有label的原酶基因的PCR产物，命名为N-Linker-label；
(2)将(1)中所得到的PCR产物N-Linker-label和载体进行双酶切反应，获得重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体选用pET30a。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组菌选用大肠杆菌BL21(DE3)。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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-
2019
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| Title |
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