PT1395667E - Método para a obtenção de plantas monocotiledoneas compreendendo um gene de interesse sem sequência auxiliar estrangeira - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE PLANTAS MONOCOTILEDÓNEAS COMPREENDENDO UM GENE DE INTERESSE SEM SEQUÊNCIA AUXILIAR ESTRANGEIRA" A presente invenção refere-se a um método para a obtenção de uma planta monocotiledónea compreendendo um gene de interesse sem sequência auxiliar estrangeira. A transgénese vegetal consiste em introduzir numa planta um ou vários genes provenientes de diferentes organismos (bactérias, virus, insectos, plantas), com o fim de lhe fornecer novos caracteres e melhorar certas qualidades agronómicas ou alimentares. A grande diversidade de genes, associada ao desenvolvimento das técnicas de transformação genética clássicas, levou à criação de novas variedades vegetais. Em certos casos, graças à introdução de caracteres que conferem uma resistência a um herbicida, a patogenes ou a diversas tensões, as práticas culturais podem ser facilitadas e os rendimentos aumentados. Noutros casos, podem ser melhorados o valor nutritivo da planta e o teor de certos compostos essenciais. No entanto, a integração de genes num genoma durante um processo de transgénese faz-se com uma frequência muito baixa. É por isso que, na maior parte dos casos, se liga geneticamente aos genes de interesse ou um gene marcador de selecção, que dá uma vantagem selectiva às células transformadas, ou um marcador fenotipico, que permite aos peritos na técnica identificar as células transformadas entre as outras.

Os genes marcadores de selecção, tais como os genes de resistência aos antibióticos ou aos herbicidas, são essenciais para referenciar as circunstâncias da transformação. No entanto, permanecem na planta e, por consequência, podem igualmente ser detectados sob a forma de ADN ou de proteinas em certos produtos derivados, 2 enquanto geralmente não fornecem valor acrescentado à planta transformada obtida. A presença destes genes, e em particular dos genes de resistência aos antibióticos e aos herbicidas, está hoje no centro de numerosos debates sobre os organismos geneticamente modificados (Flavell et al., 1992; Chesson et al., 2000). É, portanto, necessário elaborar sistemas que permitam a eliminação destes genes de selecção, uma vez que os transformantes foram isolados por acção do agente selectivo ou/e por análises moleculares. Foram estudados vários métodos de eliminação mais ou menos complexos, tais como: - a co-transformação, que consiste em introduzir dois ADN-T (ADN de transferência) no organismo, o primeiro com o gene de interesse e o outro com o gene de selecção. Este método é antes utilizado para as espécies com ciclo de reprodução curto. Seleccionam-se, em seguida, na descendência, transformantes que transportam o transgene de interesse, mas tendo perdido o gene de selecção por segregação; - os sistemas que exploram a recombinação em sitios específicos, tais como o sistema cre/lox do bacteriófago PI ou o sistema FLP/FRT da levedura (FliPase-recombinase; Lyzrik et al., 1997), utilizados para as espécies com ciclo de reprodução longo (milho, arbustos). Mas estes sistemas permanecem complexos e pesados; - os sistemas de eliminação, que exploram as propriedades dos genes móveis presentes em numerosos genomas, como os retroelementos e os transposões, e em particular o sistema Ac/Ds do milho, utilizados em numerosas espécies. 3

Os elementos transponíveis, em geral, entre os quais, nomeadamente, o sistema Ac/Ds, podem-se excisar e reinserir no genoma durante o desenvolvimento celular. Estes elementos podem também não encontrar sítio receptor no qual se inserir e são então degradados pelas nucleases. Principalmente utilizados para a clonagem e a etiquetagem de alguns genes com fenótipos de expressão visíveis (Dellaporta et ai., 1988), os transposões podem igualmente servir para mobilizar, excisar e eliminar genes (PCT/US91/04679) .

Um sistema que utiliza o Ac/Ds do milho e que permite a eliminação do gene marcador de selecção no tomate, espécie que não possui elemento Ac ou Ds no estado natural, foi descrito por Yoder et al., (1993).

Mas este sistema, que fez as suas provas em plantas heterólogas de tipo dicotiledóneas (tomate, arabeta, tabaco), parecia até então dificilmente explorável nas monocotiledóneas em particular o milho, espécie na qual o Ac/Ds reside naturalmente. Com efeito, a presença de elementos endógenos torna difícil o controle e a exploração deste sistema. Assim, se o Documento WO 98/58523 sugere que este sistema poderia ser utilizado no milho, ele não exemplifica a realização senão em plantas dicotiledóneas.

No âmbito do presente pedido, os inventores conseguiram realizar um novo processo original de eliminação dos genes marcadores nas monocotiledóneas, nomeadamente no milho, utilizando um sistema de transposões endógeno, como por exemplo, o sistema Ac/Ds. A presente invenção tem, portanto, por objectivo um método para a obtenção de uma planta monocotiledónea transgénica compreendendo um gene de interesse (i) sem sequência auxiliar estrangeira, compreendendo as seguintes fases: 4 a) a transformação de pelo menos uma célula de planta que não possua qualquer transposase activa, com um vector compreendendo duas cassetes de expressão, compreendendo uma uma sequência nucleotídica de interesse (i) , compreendendo a outra uma sequência nucleotídica que codifica para um marcador de selecção (ii) enquadrado pelas sequências mobilizáveis de um transposão, compreendendo a referida cassete de expressão uma sequência nucleotídica de interesse (i) que está fora do elemento transposão; b) a selecção das plantas transformadas com o marcador de selecção (ii); c) o cruzamento de uma planta transformada com uma outra planta pertencente a uma linhagem compreendendo no seu genoma um gene, que codifica para uma transposase activa endógena, e que se encontra no meio de um marcador fenotípico de excisão (iii), para se obter uma F1 ou qualquer outro indivíduo de geração posterior; d) a selecção das células ou dos indivíduos portadores do gene de interesse sem sequência auxiliar estrangeira, a partir da geração Fl; e) a regeneração de plantas a partir das células ou dos indivíduos seleccionados em (d).

Por «sequências auxiliares estrangeiras» entendem-se sequências (ii) que codificam para um marcador de selecção, o qual pode ser igualmente um marcador fenotípico que permite seleccionar uma planta transformada de uma planta que não contenha o ADN estrangeiro transfectado. Como sequência que codifica para um marcador de selecção, ou gene marcador de selecção, pode citar-se nomeadamente um gene que confere uma resistência a um antibiótico (Herrera-Estrella et al., 1983), ou uma resistência a um herbicida (EP 242 246), ou ainda: 5 - o gene sul, que confere a resistência ao herbicida sulfonamida Asulam (WO 98/49316), - o gene nptll, que confere a resistência à canamicina (Bevan et al., 1983), - o gene hph, que confere a resistência à higromicina (Herrera-Estrella et al., 1983), - o gene bar, que confere a tolerância ao bialafos (White et al., 1990), - o gene EPSPS, que confere a tolerância ao glicosato (US 5 188 642), - o gene HPPD, que confere a tolerância aos isoxazóis (WO 96/38567), - o gene da cloranfenicol-acetil-transferase (CAT), que destoxifica o cloranfenicol.

No âmbito da invenção, será utilizado preferencialmente o gene bar ou o gene nptll.

Como sequência que codifica para um marcador fenotipico, ou gene marcador fenotipico útil como marcador de selecção (ii) no processo de acordo com a invenção, podem citar-se os genes relatores, permitindo uma selecção por um critério fenotipico, colorimétrico ou luminescente e facilmente detectável, como por exemplo: - o gene que codifica para o enzima β-glucuronidase (GUS) (Jefferson et ai., 1987), - o gene que codifica para a proteína fluorescente verde GFP, que permite visualizar, sob a radiação UV, as células transformadas (Chalfie et al., 1994), assim como todas as outras proteínas fluorescentes derivadas da GFP, - o gene NPTII que, utilizado em pequena dose, inibe a síntese dos cloroplastos, 6 ou mais geralmente, qualquer gene permitindo a expressão de um pigmento, como por exemplo, os genes que intervêm na sintese dos flavonóides (antocianos, flobafenos e derivados), que podem ser utilizados como genes relatores na transformação dos cereais. Este sistema relator permite a expressão de pigmentos indo do vermelho ao violeta em certos tecidos transformados. Pode citar-se o exemplo dos genes reguladores Lc (Ludwig et al., 1990), B e Cl, que intervêm na sintese dos antocianos, e o gene P, que intervém na sintese dos flobafenos (Grotewold et al., 1998).

De acordo com um modo preferido, pode-se integrar na cassete de expressão compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica para um marcador de selecção (ii) um outro gene marcador fenotipico do tipo gene relator de selecção não destrutiva, para facilitar as fases de selecção por simples observação visual, não destrutiva. A titulo de exemplo, pode citar-se a GFP descrita por Nielsen et al. (1999) e qualquer outra variante da GFP utilisável nas plantas, como por exemplo, as descritas por Seth J. Davis (1998).

Para a sequência que codifica para um marcador de selecção (ii) acima, será utilizado vantajosamente um promotor especifico de um tecido ou de um órgão para diferenciar a expressão deste gene marcador fenotipico (ii) em relação à expressão do marcador fenotipico de excisão (iii) da planta utilizada na fase (c) para cruzar a planta transformada. A presente invenção refere-se, portanto, a um sistema de dois componentes, que estão representados na figura n°l: - uma primeira planta, que não possui nenhuma transposase activa, se bem que apresentando um sistema transposão 7 endógeno, na qual uma construção, compreendendo a cassete de expressão do gene de interesse (i) e a do gene marcador de selecção (ii), pode ser aí integrada, - uma segunda planta conntendo no seu genoma um gene que codifica para uma transposase activa endógena e que é inserido num marcador fenotípico de excisão (iii).

De maneira preferencial, a planta monocotiledónea transformada de acordo com a invenção não contém nenhuma transposase activa, se bem que tenha um sistema transposão endógeno. De maneira preferida, a planta monocotiledónea transformada pode ser uma planta de milho, e pode pertencer: - à linhagem A188, que não contém nenhuma transposase activa, - a uma linhagem Ml sem qualquer transposase activa, proveniente do cruzamento das linhagens A188 e B73, e favorável à formação de calos de tipo II muito regenerantes - ou, mais geralmente, qualquer outra linhagem que não contenha nenhuma transposase activa.

Entre os elementos transponíveis de acordo com a invenção, podem utilizar-se, por exemplo, famílias de transposões postas em evidência nas monocotiledóneas, tais como: - o elemento Dotted (Dt), posto em evidência no milho - a família de elementos Mutator like (Mu) , posto em evidência no milho e no arroz - a família Activator/Dissociation like (Ac/Ds) , posta em evidência no milho (Míiller-Neumann et al., 1984), na 8 cevada (Chernyshev et al., 1988), e no painço (MacRae et al.r 1994) a família CACTA like ,posta em evidência no milho (Pereira et al., 1986), no sorgo (Chopra et al., 1999), na cevada (Chernyshev et al., 1988), e no arroz (Mototashi : R. et al., 1996) a família copia like, posta em evidência na cevada (Mannimem et al., 1993). De acordo com um modo preferido da invenção, o sistema de eliminação de genes marcadores é o sistema Ac/Ds de milho.

Os elementos da familia Activator/Dissociation (Ac/Ds) fazem parte dos elementos transponiveis de tipo II, e são assim compostos principalmente por dois domínios: - um gene que codifica para a proteína necessária à mobilidade das cópias, a transposase, - duas extremidades terminais invertidas e repetidas, denominadas ITR (Inverted Terminal Repeat). Os ITR e certas sequências flanqueadas parecem servir de referências para dirigir a acção da transposase. 0 elemento Ds é um elemento Ac que sofreu importantes mutações ou deleções na sequência que codifica para a transposase. Não pode ser excisada do seu sitio de inserção senão na presença de uma fonte de transposase activa Ac. É, portanto, Ac-dependente.

Por extensão pode chamar-se um elemento Ds qualquer elemento composto por dois ITR envolvendo qualquer sequência interna cujo tamanho seja inferior à do elemento autónomo.

De acordo com a presente invenção, a construção de ADN utilizada na fase (a) compreende uma cassete de expressão 9 do gene de interesse (i) e uma cassete de expressão do gene marcador de selecção (ii). 0 gene marcador a eliminar (ii) está integrado entre duas molduras provenientes das extremidades de um elemento Ac e contendo as sequências necessárias à transposição. 0 todo está inserido no ADN-T, que transporta assim um elemento transposão defectivo de tipo Ds contendo o gene de selecção. Este elemento é denominado Ds::M (M para Marcador de selecção ou Marcador fenotipico).

Quanto ao gene de interesse, está sobre o ADN-T e fora do elemento transponivel Ds::M.

De acordo com a presente invenção, as sequências nucleotidicas de interesse (i) podem ser todas as sequências de ácidos nucleicos permitindo dar ou melhorar um traço de carácter interessante na planta transgénica resultante. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico pode codificar para proteínas ou transcritos ARN antisentido, que podem permitir melhorar valores nutricionais, o rendimento, a resistência aos patogenes, às doenças, à seca, etc. Os referidos genes estão descritos, nomeadamente, nos pedidos de patente WO 91/02071 e WO 95/06128.

As sequências nucleicas de interesse podem igualmente ser introduzidas como ferramenta genética para gerar mutantes e/ou assistir à identificação, à marcação molecular ou ao isolamento de segmentos de genes de plantas. Outros exemplos estão descritos em Weising et al., 1995.

De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de interesse (i) é inserido numa construção de ácidos nucleicos, chamada cassete de expressão do gene de interesse, e está ligado de maneira operacional a elementos que permitem a sua expressão e eventualmente a sua regulação. 10

Entre estes elementos podem citar-se os promotores, os activadores e os terminadores de transcrição.

Entre os promotores de transcrição que podem ser utilizados, podem citar-se, nomeadamente, promotores constitutivos, promotores específicos de tecidos ou órgãos, assim como promotores específicos do desenvolvimento.

De maneira geral, será utilizado preferencialmente um promotor constitutivo, tal como o promotor pAct 1 do gene Act 1 do arroz contido no plasmideo pAct 1-F4 (Mc Elroy et al., 1991) ou o promotor p35S (Kay et al.r 1987), ou um promotor especifico de tecido, como o promotor HMWG de trigo ou cevada, ou ainda o promotor pCRU do gene da cruciferina do rabanete, que permitem, os três, uma expressão da proteina de interesse nos grãos (Roberts et al., 1989; Anderson O.D. et al., 1989; Depigny-This et al., 1992).

Outros elementos, tais como os intrões, enhancers, sequências de poliadenilação e derivados, podem igualmente estar presentes na sequência nucleica de interesse, para melhorar a expressão ou o funcionamento do gene transformante.

De maneira vantajosa, a cassete de expressão pode também conter sequências 5' não traduzidas, chamadas "leader". As referidas sequências podem melhorar a tradução.

Entre os terminadores utilizáveis nas construções da invenção, podem citar-se, nomeadamente: o terminador Nos correspondente à região 3' não-codificante do gene da nopalina-sintase do plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982). A cassete de expressão do gene de interesse (i) está inserida num vector nucleotidico, tal como um plasmideo, que compreende, além disso, a cassete de expressão do gene marcador (ii) inserida entre dois ITR. 11

De acordo com a presente invenção, a cassete de expressão do gene marcador (ii) compreende o ácido nucleico que codifica para o marcador de selecção ou o marcador fenotipico, flanqueado pelos elementos necessários à sua expressão, nomeadamente os promotores, os activadores e os terminadores de transcrição, tal como foram descritos acima.

De acordo com um modo de realização do processo da invenção, as células vegetais são transformadas por um vector, tal como definido anteriormente, transferido para um hospedeiro celular susceptivel de infectar as referidas células vegetais, permitindo a integração no genoma destas últimas, sequências nucleotidicas de interesse inicialmente contidas no genoma do vector acima mencionado. Vantajosamente, o hospedeiro celular utilizado é uma estirpe bacteriana, tal como Agrobacterium tumefaciens, nomeadamente de acordo com o método descrito no artigo de An et al. (1986), ou ainda Agrobacterium rhizogenes, nomeadamente de acordo com o método descrito no artigo de Guerche et al. (1987).

Por exemplo, a transformação das células vegetais pode ser realizada pela transferência da região T do plasmídeo circular extra cromossómico indicador de tumores Ti de Agrobacterium tumefaciens, utilizando um sistema binário (Watson et al., 1994). Para isso, são construídos dois vectores. Num destes vectores, a região T foi eliminada por deleção, à excepção das molduras esquerda e direita, sendo inserido um gene marcador entre eles para permitir a selecção nas células das plantas. 0 outro parceiro do sistema binário é um plasmídeo Ti auxiliar, plasmídeo modificado que já não tem a região T, mas que contém sempre os genes de virulência vir, necessários a transformação da célula vegetal. 12

De acordo com um modo preferido, pode utilizar-se o método descrito por Ishida et ai. (1996), para a transformação das monocotiledóneas.

Podem citar-se também outros modos de realização do processo da invenção, nomeadamente os métodos de transferência directa de genes para as células vegetais, tais como a microinjecção directa nos embrióides de planta (Neuhaus et al., 1987), a infiltração in planta de inflorescências (Bechtold et al., 1993) ou a electroporação de protoplastos (Chupeau et al., 1989), ou ainda a precipitação directa por meio de PEG de protoplastes (Schocher et al., 198 6) ou o bombardeamento de calos ou de embriões por canhão de partículas recobertas de ADN plasmídico de interesse (Fromm M. et al., 1990).

De acordo com um outro protocolo, a transformação é realizada de acordo com o método descrito por Finer et al. (1992), utilizando o canhão de partículas de tungsténio ou vantajosamente de ouro, sobre calos ou embriões. A selecção na fase (b) de células de plantas transformadas pode ser efectuada em meio selectivo ou por simples observação visual no caso da utilização de um gene marcador fenotípico. O cruzamento da fase (c) efectua-se entre a planta transformada e uma outra planta, tendo uma transposase activa endógena e que está ao meio de um marcador fenotípico de excisão (iii) , para se obter uma F1 ou qualquer outro indivíduo de geração posterior, segundo as técnicas conhecidas dos peritos na técnica. A outra planta é preferencialmente uma linhagem de elite com caracteres agronómicos de interesse.

De acordo com a presente invenção, entende-se por transposase activa endógena uma transposase activa obtida de maneira não transgénica. 13

De acordo com a presente invenção, a planta transformada e identificada é cruzada na fase (c) com uma outra planta pertencente a uma linhagem que contém no seu genoma um gene que codifica para uma transposase activa endógena, e que se encontra inserido num marcador fenotipico de excisão (iii).

Os transposões têm tendência para metilar-se no decurso das gerações, em particular no milho, e então algum transcrito já não é detectável. A fase activa do transposão corresponde, portanto, a um estado de fraca metilação, que permite a transcrição normal do gene. Associando-se ao transposão um marcador fenotipico de excisão, pode-se visualizar as células nas quais houve transposição e quantificar o nivel de actividade do transposão no organismo e visualizar assim a produção de transposase. 0 transposão é geralmente inserido entre o promotor e a parte codificante do marcador fenotipico de excisão, tornando impossível a sua expressão. Quando o transposão exprime a transposase, pode-se excisar do gene no qual estava inserido, o que restaura a actividade do gene. Podem-se visualizar assim por análise fenotípica as células nas quais houve produção da transposase susceptível de excisar o elemento Ds::M.

Por "marcador fenotipico de excisão" (iii) entende-se qualquer gene que codifica para um pigmento ou qualquer outro gene permitindo seguir a evolução da excisão do elemento Ac. A título de exemplo, um marcador fenotipico de excisão pode ser qualquer gene em que uma mutação dá um fenótipo visível no grão ou na planta ou numa parte da planta, por exemplo, genes intervindo na via bioquímica dos antocianos ou dos flobafenos. Podem citar-se os genes constitutivos Al, A2, C2, Bzl ou Bz2 e os genes reguladores Cl, Vpl, PI, Pl e RI. De acordo com a presente invenção, o alelo preferencial pode ser o alelo R-nj, que é um marcador 14 fenotípico endógeno da família RI presente em certas linhagens de milho. 0 alelo R-nj::transposão é portador de um elemento Ac activo, sendo a região cromossómica à qual pertence R-nj particularmente hipometilada (Brink et al., 1973). Quando o Ac se transpõe fora do gene R-nj, este último torna-se geralmente funcional, o que se traduz pela produção de sectores antocianados vileta de tipo "navajo" visíveis na coroa do grão, do qual é o embrião. Este fenótipo variegado é um bom meio para avaliar e localizar acontecimentos para os quais houve produção de transposase. Além disso, permite verificar a actividade do transposão no decurso de gerações e seguir a transposase ao longo dos cruzamentos. A titulo de exemplo de linhagens utilizáveis na fase (c) , contendo no seu genoma um gene que codifica para uma transposase activa endógena e que se encontra inserido num marcador fenotípico de excisão, podem citar-se as linhagens: - W22/R-nj::Ac, linhagem homozigótica para o alelo R-nj::Ac oriundo de grãos provenientes do Stock Center (http://www.agron.missouri.edu/) , - A188/R-nj::Ac, linhagem homozigótica para o alelo R- nj::Ac "introgressados" no fundo genético de A188, - Hill/R-nj::Ac, linhagem homozigótica para o alelo R- nj::Ac "introgressado" no fundo genético de Hill, - W23/P-vv, linhagem homozigótica para o alelo P-vv oriundo de grãos provenientes do Stock Center. Um elemento Ac está inserido no alelo P-rr, - ou mais geralmente qualquer linhagem possuindo um transposão activo inserido num gene de fenótipo visível e possuindo o genótipo necessário à sua expressão. 15 0 alelo portador do elemento Ac, se bem que instável, pode ser transferido para outras linhagens por vários cruzamentos. Basta verificar antes da "introgressão" que a linhagem receptora possui realmente a totalidade dos alelos necessários à expressão do fenótipo. No caso do alelo R-nj : :Ac, os alelos Al, A2, Bzl, Bz2 e Cl devem estar presentes ou podem ser "introgressados". A selecção, na fase (d) , dos indivíduos que transportam o gene de interesse (i) sem sequência auxiliar estrangeira pode ser realizada em plantas Fl, ou plantas F2, ou calos oriundos dos embriões Fl. A selecção dos indivíduos pode ser apreciada por técnicas conhecidas dos peritos na técnica, como as técnicas de PCR e de Southern, ou observações fenotípicas. É, portanto, efectuada, por exemplo, uma identificação dos acontecimentos transformados tendo integrado no seu genoma o ADN-T portador do gene marcador de selecção (ii), e uma selecção dos acontecimentos monocópia em particular. É possível efectuar uma selecção das plantas Fl resistentes para pesquisar as excisões somáticas, e uma análise das plantas F2 sensíveis para detectar eventuais excisões germinais. A presente invenção refere-se igualmente a um método para a obtenção de uma planta monocotiledónea transgénica que contém um gene de interesse sem sequência auxiliar estrangeira, no qual a selecção na fase (d) dos indivíduos se faz por via reprodutiva e compreende as seguintes fases: - selecção dos grãos Fl variegados; selecção dos acontecimentos de excisão somática do elemento DS: :M por técnica PCR; selecção dos acontecimentos de excisão germinal do elemento Ds: :M por técnica PCR; - obtenção de sementes de plantas F2 a partir destes acontecimentos. 16

Assim, de acordo com a presente invenção, a selecção dos indivíduos portadores do gene de interesse sem sequência auxiliar estrangeira pode ser derivada de uma análise da variegação do alelo marcador de excisão do transposão, nas espigas F1.

Entra igualmente no âmbito da invenção um método para a obtenção de uma planta monocotiledónea transgénica contendo um gene de interesse (i) sem sequência auxiliar estrangeira, no qual a selecção dos indivíduos, na fase (d) , se faz por via vegetativa e compreende as seguintes fases: - produção de calos a partir de embriões imaturos Fl; - selecção visual dos calos contendo o ADN-T e o elemento Ds::M; - multiplicação de calos e pesquisa de sectores de excisão do elemento Ds::M; - regeneração de plantas Fl a partir destes sectores de excisão.

De acordo com a presente invenção, podem ser obtidas plantas Fl directamente por regeneração, a partir de calos seleccionados na fase (d) , pela via da cultura in vitro de embriões imaturos de espigas Fl. A invenção permite obter plantas monocotiledóneas transgénicas ou partes de plantas, tais como células ou calos, contendo um gene de interesse sem sequências auxiliares.

As plantas monocotiledóneas híbridas, caracterizadas por serem obtidas pelo cruzamento de plantas obtidas pelos processos descritos acima, podem também ser obtidas através de um processo de acordo com a invenção.

Isto refere-se em particular às plantas de milho. 17 A invenção utiliza um método de selecção sobre calos dos acontecimentos que apresentam uma excisão do elemento Ds::M para a obtenção de plantas transgénicas contendo um gene de interesse (i) sem sequência auxiliar estrangeira, o qual compreende as seguintes fases: - produção de calos a partir de embriões imaturos F1

- selecção visual dos calos contendo o ADN-T e o elemento Ds : : M multiplicação dos calos e pesquisa de sectores de excisão do elemento Ds : :M regeneração de plantas F1 a partir destes sectores de excisão. A formação de calo é devida a uma proliferação celular, quer dizer, uma aglomeração de células indiferenciadas e rejuvenilizadas que poderão dar nascimento a embriões bipolares. Estes embriões bipolares, sob certas condições conhecidas dos peritos na técnica, podem comportar-se como embriões zigóticos — oriundos da fecundação entre uma célula sexual fêmea e uma célula sexual macho — e dar uma planta.

Durante as divisões celulares que têm lugar durante o crescimento do calo, pode ter lugar um certo número de acontecimentos de excisão do transposão Ds::M. 0 calo assim constituído é, portanto, quimérico e contém sectores de células possuindo o Ds::M e sectores de células que já não possuem o Ds::M. 0 gene marcador fenotípico permite identificar as células transformadas no decurso do processo de transgénese que possuem um fenótipo que pode exprimir-se no calo.

Alternativamente, este método pode igualmente servir para reconhecer as células nas quais já não se exprime o gene marcador fenotípico (iii) , seja por causa de uma 18 extinção do gene, seja por causa da excisão do gene. Deveerá escolher-se preferencialmente um gene marcador fenotipico do tipo GFP, antociano ou qualquer outro gene marcador de expressão colorimétrica. Pode igualmente utilizar-se o gene nptll, que inibe a síntese dos cloroplastos. A invenção utiliza um vector contendo duas cassetes de expressão, como as descritas anteriormente.

Pode ser obtida uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula de planta, ou um clone de uma tal célula, transformada por um vector como foi descrito anteriormente. A presente invenção pode igualmente aplicar-se a outras plantas, nomeadamente monocotiledóneas, que possuam: - um sistema transposão como foi descrito anteriormente, e - um sistema marcador fenotipico/ por exemplo, de tipo antociano, encontrado nas Poaceae (milho, sorgo, trigo, aveia, arroz), que são os dois componentes essenciais ao processo de acordo com a invenção.

Entre as monocotiledóneas que podem igualmente ser obtidas de acordo com o mesmo protocolo, podem citar-se, nomeadamente: Sorghum bicolor (sorgo), Hordeum vulgare (cevada), Triticum eastivum (trigo), Oriza sativa (arroz), Pennisetum glaucum (painço).

LEGENDA DAS FIGURAS

Figura n.a 1: esquema dos dois componentes do sistema: o Ds::M a eliminar e a fonte de transposase.

Figura n.a 2: cartas de restrição dos plasmídeos pBios340-nptII (figura 2A) e pBios342-bar (figura 2B) , derivados do plasmídeo pSB12. 19

Figura n.a 3: esquema das duas vias possíveis para se obterem plantas transgénicas sem gene marcador de selecção. Figura n.a 4: observação da excisão germinal.

Figura n.a 5: carta de restrição do plasmídeo pBios491 contendo o gene GFP e o gene NptII num elemento Ds.

Figura n.a 6: carta de restrição do plasmídeo pBios 424 compreendendo o promotor A9-barnase-terminador 3' CaMV e o gene de resistência à canamicina NptII num elemento dissociante Ds.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Obtenção de uma linhagem A188, Ac inactiva, transformada com o elemento Ds::M de maneira estável 1.1. Preparação dos construídos Ds::M 0 elemento Ac, cuja sequência serviu para fazer os construídos Ds::M, é o Ac inserido no locus p (Lechelt et ai., 1989) idêntico ao Ac9 do gene waxy (Fedoroff et ai., 1983) .

Os pés do Ds::M foram em seguida construídos por deleções internas do Ac. Os seus tamanhos são: -337 pb para a extremidade 3'Ac -404 pb para extremidade 5'Ac. O exemplo proposto nesta invenção trata de dois vectores que apresentam um polilinker num construído de ADN, permitindo assim fornecer um gene de interesse por clonagem.

As transformações das plantas foram efectuadas com dois vectores pBios340 e pBios 342, descritos abaixo, oriundos do mesmo vector de partida pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752), compreendendo as duas molduras LB e RB 20

No interior do elemento Ds foi introduzido um gene marcador de selecção (MS) sob o controle do promotor do gene actine 1 de arroz, seguido do primeiro intrão actine de arroz (Mc Elroy et al., 1991) . a) Ds::npt II (pBios340) O plasmideo pBios340 contém um ADN-T constituído pelas molduras de pSB12, da extremidade 5' do elemento Ac, o promotor e o primeiro intrão do gene Actine 1 de arroz, o quadro de leitura aberto npt II (Bevan et al., 1983), o terminador Nos (do gene que codifica para a nopalina-sintase isolado em Agrobacterium tumefaciens) e a extremidade 3' do elemento Ac. O Ds::npt II tem um tamanho de 3428 pb (figura n° 2). b) Ds::bar (pBios342) O plasmideo pBios342 tem a mesma organização que o pBios340 e possui o quadro de leitura aberto bar (White et al., 1990), no lugar do quadro de leitura aberto npt II (figura n° 2). O Ds::bar tem um tamanho de 3173 pb.

Para simplificar, a cassete de expressão promotor -intrão actine - quadro de leitura aberto npt II ou bar -terminador Nos será considerado como um gene funcional npt II ou bar. 1.2 Transformação do milho e regeneração a) escolha de uma linhagem que não possua nenhuma transposase Ac activa

As linhagens que podem ser utilizadas não devem, preferencialmente, conter nenhuma transposase activa para 21 que o ADN-T seja estável na planta transformada, e ter uma boa aptidão para a transformação por Agrobacterium tumefaciens.

Utiliza-se assim a linhagem A188, que é uma linhagem da espécie Zea mays subsp mays. A fim de avaliar a actividade das transposases endógenas, é analisado o estado de metilação dos elementos Ac. 0 ADN de cada planta foi digerido pelas endonucleases BglII e PvuII separadamente, depois por uma mistura destes dois enzimas.

PvuII é um enzima sensível à metilação. Uma vez que o resíduo citosina do seu sítio específico de corte é metilado (5' -C-A-G-mC-T-G-3'), o enzima já não pode cortar a sequência. Este enzima permite revelar um estado de metilação da sequência. Possui somente dois sítios de corte na sequência do elemento Ac, que pertencem ambos a duas regiões ricas em dinucleótidos CpG. Estas ilhotas são sensíveis à metilação nas plantas. 0 fragmento PvuII-PvuII de Ac faz 2524 pb.

BglII é uma endonuclease que não possui nenhum sítio no interior do elemento Ac, mas que é bastante frequente no genoma do milho.

Os produtos de digestão do ADN genómico foram separados por electroforese em gel de agarose e transferidos sobre membranas de nylon.

Uma sonda SAc de 1605 pb foi obtida por digestão do elemento Ac pela endonuclease HindIII. Este fragmento HindIII-HindIII corresponde a uma parte interna do elemento Ac e não pode, portanto, hibridar-se sobre os elementos Ds demasiado deletados em relação ao Ac e que já não possuam esta parte de Ac. A hibridação é, portanto, limitada aos elementos transponíveis e/ou às sequências que apresentam uma boa homologia com o elemento Ac. Esta sonda provém de 22 um plasmídeo que contém o elemento autónomo Ac9 inicialmente inserido no locus p do milho. Os fragmentos de 1605 pb foram extraídos do gel de agarose por digestão e migração. Foram em seguida purificados antes de ser hibridados sobre membranas de nylon.

Somente as bandas de tamanhos superiores a 8 kb estão presentes em cima de cada pista para as amostras de ADN de A188 e de uma linhagem de elite digeridas por PvuII e BglII/PvuII; nenhuma banda de tamanho próximo de 2,5 kb é visível. Este perfil de digestão mostra que o ADN genómico foi parcialmente digerido por PvuII. A ausência desta banda de 2524 pb nas plantas A188 pode ser devida a um estado de metilação das transposases Ac que seriam, portanto, inactivas, ou então na ausência de cópia completa de um elemento Ac nestes fundos genéticos.

Além disso, a linhagem A188 contém todos os genes constitutivos necessários (Al, A2, Bzl, Bz2, C2) e os alelos recessivos dos genes reguladores da via de síntese dos antocianos (r-r, Cl, pl) . Ela não exprime, portanto, nenhum pigmento do tipo antociano, salvo nas anteras da bainha das folhas, que pode por vazes ser vermelha. É, portanto, uma linhagem receptora interessante para a expressão do marcador antociano após o cruzamento. c) transformação por Agrobacterium e regeneração A técnica de transformação utilizada é a descrita por Ishida et al., 1996. Foi utilizado Agrobacterium tumefaciens, nomeadamente a partir de embriões imaturos de 10 dias após a fecundação. Todos os meios utilizados são dados na referência citada. A transformação começa com uma fase de cultura em que os embriões imaturos das plantas de milho são postos em contacto durante pelo menos 5 dias com uma estirpe de Agrobacterium tumefaciens, como LBA 4404 23 (Ooms et al., 1981) ou outra EHA 101 (Hood et al., 1986), EHA 105 (Hood et al., 1993), AGL1 (Lazo et al., 1991) contendo os vectores superbinários. O plasmídeo suprbinário é o resultado de uma recombinação homóloga entre um vector intermediário portador de ADN-T contendo o gene de interesse e/ou o marcador de selecção derivado dos plasmideos descritos nos exemplos anteriores, e o vector pSBl de Japan Tobacco (EP 672 752) , que contém os genes virB e virG do plasmideo pTiBo542 presente na estirpe supervirulenta A281 de Agrobacterium tumefaclens (ATCC 37349) e uma região homóloga encontrada no vector intermediário permitindo esta recombinação homóloga. Os embriões são em seguida colocados em meio LSAs durante 3 dias, na obscuridade, e a 25°C. Uma primeira selecção é efectuada em calos transformados: os calos embriógenos são transferidos para meio LSD5 contendo fosfinotricina a 5 mg/1 e cefotaxima a 250 mg/1 (eliminação ou limitação da contaminação por Agrobacterium tumefaciens). Esta fase é conduzida 2 semanas na obscuridade e a 25°C. A segunda fase de selecção é realizada por transferência dos embriões que se desenvolveram em meio LSD5, para meio LSD10 (fosfinotricina a 10 mg/1), na presença de cefotaxima, durante 3 semanas, nas mesmas condições que anteriormente. A terceira fase de selecção consiste em excisar os calos de tipo I (fragmentos de 1 a 2 mm) e em transferí-los 3 semanas para a obscuridade e a 25°C em meio LSD 10, na presença de cefotaxima. A regeneração das plântulas é efectuada excisando-se os calos tipo I que proliferaram e transferindo-os para meio LSZ na presença de fosfinotricina a 5 mg/1 e cefotaxima durante 2 semanas a 22°C e sob luz contínua.

Tendo as plântulas regenerado, são transferidas para meio RM + G2 contendo 100 mg/1 de cefotaxima durante 2 semanas a 22°C e sob iluminação continua para a fase de 24 desenvolvimento. As plantas obtidas são então transferidas para o laboratório de plantas, com vista à sua aclimatação em estufa. 1.3 Selecção de transformantes resistentes e análise molecular a) selecção em meio selectivo

Selecção dos acontecimentos de transformação resistentes ao glufosinato (Ds::bar) Vários meios selectivos, o meio de iniciação de calos, de maturação, e de regeneração permitem eliminar eficazmente os acontecimentos não transformados sensíveis ao agente selectivo. Somente os calos transformados são regenerados e podem dar plântulas. A fim de eliminar as plântulas derivadas de um escapamento eventual e que se desenvolveram na proximidade de plantas resistentes (o gene bar produz uma proteína que permite à planta destoxificar o glufosinato), é realizada uma pincelada sobre uma parte de uma folha da planta (leaf painting assay) no estádio de seis folhas, com uma solução contendo glufosinato (Basta 0,5% (v/v)). A folha sensível apresenta, uma semana mais tarde, uma secura característica.

Selecção dos acontecimentos de transformação resistentes à canamicina (Ds::nptII) A selecção dos acontecimentos de transformação foi realizada em meios contendo diferentes concentrações de canamicina ou de geneticina.

Foi igualmente realizado um teste de reconhecimento das plantas transformadas em estufa. Algumas gotas de uma 25 solução de canamicina (500 mg/1) e de Tween 20 (0,1 %(p/v)) são depositadas no cartucho que as folhas das plantas jovens formam (estádio de três folhas, cerca de duas a três semanas). As folhas das plantas sensiveis apresentam, ao crescerem, dois sectores esbranquiçados no local em que estiveram em contacto com a solução. Este teste não é destrutivo e permite recuperar as plantas sensiveis. b) análise molecular

As plantas regeneradas são analisadas por PCR e por Southern blot a fim de eliminar os escapamentos e identificar os acontecimentos de transformação monocópias que serão utilizados nesta invenção de maneira preferencial. Estas plantas que tenham integrado o ADN-T no seu genoma são os transformantes primários TO. A técnica de análise utilizada é derivada da descrita por Southern (1976) .

Identificação por PCR

Foram realizados PCR ao ADN extraído destas plantas, a fim de verificar que as plantas resistentes aos agentes selectivos têm bem integrado no seu genoma o ADN-T e que não houve transposição do Ds::M. O par de oligonucleótidos EM13-EM14 (SEQ ID n°l - SEQ ID n°2) amplia um fragmento cujo tamanho é 280 pb quando o Ds::M se excisou do ADN-T, e nenhum fragmento se o Ds::M estiver sempre inserido no seu sítio inicial no ADN-T. O par de oligonucleótidos Actintl-Actint2 (SEQ ID n°3 - SEQ ID n°4) amplia um fragmento de intrão actine presente no Ds::MS, cujo tamanho é de 480 pb. 26

Os acontecimentos de transformação seleccionados em meio selectivo, positivos à PCR com o par Actintl-Actint2 ne negativos à PCR com o par EM13-EM14, têm, portanto, integrada no seu genoma, pelo menos uma parte do ADN-T contendo o elemento Ds::M que permaneceu no seu sitio de inserção inicial.

Determinação do número de cópias do ADN-T

Foram efectuadas análises moleculares ao ADN extraído de folhas das plantas seleccionadas, a fim de determinar os acontecimentos de transformação monocópias. 0 ADN das plantas positivas Ds::bar foi digerido por endonuclease FcoRV que só corta uma vez no ADN-T entre o quadro de leitura aberto bar e o intrão Actine. 0 ADN das plantas positivas foi digerido por endonuclease Ncol, que só corta uma vez no ADN de transferência no interior do quadro de leitura aberto nptll.

Após a electroforese, foram efectuadas transferências e as membranas resultantes foram hibridadas sucessivamente com as seguintes sondas: para as plantas Ds::bar, sondas Bar (gene Bar digerido por Smal, denominado S006), intrão Actine (denominado S063) e 5'Nos (denominado S064); para as plantas Ds::nptII, sondas npt II (denominado S020), intrão Actine (denominado S063) e 5'Nos (denominado S064).

As sondas intrão Actine, 5'Nos e nptll são definidas por PCR a partir de oligonucleótidos escolhidos de acordo com os métodos conhecidos dos peritos na técnica (ver quadro anexo) .

As sondas Bar, npt II e intrão Actine permitem estimar o número de cópias de ADN de transferência inserido no genoma. A sonda 5'Nos permite pôr em evidência uma excisão 27 potencial do elemento Ds do ADN-T. Estas três sondas permitem, portanto, determinar as plantas possuindo uma só cópia do ADN de transferência completo.

Para Ds::bar, quando a inserção do ADN-T é única, é revelado um fragmento para cada uma das três sondas. Além disso, se o Ds não for excisado, o tamanho dos fragmentos de ADN revelados pelas duas sondas Bar e 5'Nos é o mesmo.

Para Ds::nptII, quando a inserção do ADN-T é única, é revelado um fragmento pelas sondas 5'Nos e Intrão Actine, e são revelados dois fragmentos pela sonda nptll. Além disso, se o Ds não for excisado, um destes dois fragmentos é igualmente revelado pela sonda 5'Nos e o outro pela sonda Intrão Actine.

De acordo com a invenção, as plantas escolhidas para os cruzamentos com a fonte de transposase são preferencialmente as plantas provenientes dos acontecimentos de transformação monocópias.

Exemplo 2: Cruzamento com uma linhagem R-nj::Ac possuindo a transposase Ac inserida num gene marcador fenotipico 2.1 Fonte de transposase R-nj::Ac A linhagem W22/R-nj::Ac contém os genes constitutivos C2, Al, A2 e os genes reguladores Cl, pl, B-b. Esta linhagem transporta, portanto, todos os factores requeridos para a pigmentação violeta na aleurona (identificada como normal). Esta linhagem possui, além disso, o alelo instável R-nj::Ac criado por translocação de cromossoma por Dellaporta et al., em 1988.

Esta linhagem homozigótica para o alelo R-nj::Ac e utilizada aqui é oriunda de grãos provenientes do Stock Center (http://www.aqron.missouri.edu/) e é denominada As.

Os grãos apresentam sectores coloridos mais ou menos 28 grandes, correspondentes às células nas quais o Ac se excisou do alelo R-nj.

Foram realizadas análises moleculares ao ADN extraído de folhas de plantas As homozigóticas para o alelo R-nj : :Ac, a fim de se avaliar a actividade do elemento Ac inserido no gene R-nj. Este estudo do estado de metilação dos Ac presentes nas linhagens As foi realizado como para as linhagens A188 e as linhagens de elite que servem para a transformação e a introgressão dos genes de interesse. Estão presentes numerosas bandas de tamanhos superiores a 8 kb no cimo de cada pista de todas as amostras. Elas correspondem ao ADN não digerido ou parcialmente digerido. No entanto, a presença de uma banda de 2,5 kb proveniente da digestão por PvuII, um enzima sensível à metilação, indica que pelo menos uma cópia do elemento Ac é não metilada no genoma desta linhagem As. 2.2 Introgressão do alelo R-nj::Ac em outras linhagens 0 elemento R-nj::Ac pode ser vantajosamente introgredido nas linhagens conhecidas para ser favorável à regeneração de calos, como a linhagem A188 (Walbot et al., 1994) ou a linhagem Hill. 0 elemento R-nj ::Ac pode ser igualmente introgredido em linhagens de elite, utilizadas para a introgressão dos genes de interesse.

Para verificar a actividade do elemento Ac no decurso de gerações, foi efectuada uma análise fenotípica aos grãos de espigas oriundos destes cruzamentos. As espigas obtidas por estes cruzamentos apresentam grãos variegados.

Os resultados dos cruzamentos entre a linhagem As e as linhagens de elite, ou A188 e Ml, mostram que o gene R-nj pode-se exprimir noutros fundos genéticos, seja pela presença dos genes constitutivos necessários à expressão do 29 fenótipo nestas linhagens (como é o caso para A188), seja por que são fornecidos à célula por uma linhagem As. A variegação observada nos grãos sugere que o Ac está sempre activo nesta geração, porque transpõe fora do alelo R-nj em certas partes dos grãos oriundos destes cruzamentos. Múltiplas introgressões realizadas nas linhagens A188 e Hill e numa linhagem de elite (até 3 cruzamentos na linhagem, o que corresponde a cerca de 93% de A188 e 7% de W22) permitiram confirmar estes resultados. Linhagens homozigóticas para o alelo R-nj::Ac foram, portanto, realizadas por autofecundações. 2.3 Cruzamentos A fecundação é realizada manualmente por uma técnica conhecida dos peritos na técnica, pelo depósito de pólen da fonte de transposase As sobre as espigas dos transposantes, de preferência no sentido da planta macho possuindo a transposase para a planta fêmea contendo o elemento Ds::M.

Uma parte da espiga é por vezes colhida a fim de lhe extrair embriões imaturos destinados a protocolos de biologia celular, como a recuperação de embriões ou a calogénese. A secção cortada é preferencialmente coberta com um fungicida, a fim de se evitar apodrecimento e as bactérias.

Os embriões colhidos 10 a 15 dias após a fecundação são colocados, com a parte abaulada para cima, em 25 ml do meio de regeneração RM+ (Ishida et al., 1996/ Negrotto et. al., 2000). As caixas são em seguida colocadas numa câmara de cultura com fotoperiodo regulado (16 horas dia - 8 horas noite) e a temperatura constante (23°C). As plântulas são 30 em seguida aclimatadas no laboratório de plantas ao fim de 10-15 dias após a colocação em cultura e antes de serem transferidas para a estufa.

Exemplo 3: Selecção dos acontecimentos que apresentam uma excisão do elemento Ds::MS

Os estudos moleculares, descritos no exemplo 1.3, permitiram a identificação de um acontecimento de transformação monocópia Ds::nptII e de um acontecimento monocópia Ds::bar utilizados preferencialmente para avaliar uma potencial excisão. Estes estudos mostraram igualmente que o elemento Ds::M é estável na linhagem A188 (estudo efectuado em transformantes primários TO e primeiros descendentes TI por PCR e Southern).

Os estudos fenotipicos e moleculares da linhagem As, descritos no exemplo 2), permitiram mostrar que existia no seu genoma (pelo menos) uma cópia do elemento Ac activo capaz de se excisar fora do alelo R-nj no background genético inicial da linhagem W22 ou no background de uma outra linhagem. A análise fenotípica da variegação do alelo R-nj nas espigas F1 provenientes dos cruzamentos As X Ds::M confirmou que o elemento Ac era sempre activo nesta geração: a presença de sectores antocianos em todos os grão maduros mostra que houve uma produção de transposase e excisão somática do Ac fora do seu sitio de inserção inicial. O aporte por cruzamento de um novo elemento Ds na célula não mudou em nada a capacidade para seguir a actividade da fonte de transposase. É considerado que o elemento Ds não está geneticamente ligado ao alelo R-nj::Ac. 31

Fica, portanto, por determinar se a transposase expressa pelo elemento Ac inserido no alelo R-nj pode permitir a excisão dos elementos Ds::bar e Ds::nptII. 3.1 A partir de plantas F1 (via clássica)

Foram empreendidos cruzamentos após o estabelecimento de linhagens mopnocópias a fim de se verificar se os elementos Ds::bar e Ds::nptII são capazes de transferir in planta.

As plantas fonte de transposase serviram de polinizadoras (por causa da semi-esterilidade fêmea destas plantas). a) pesquisa por PCR de excisão somática em plantas Fl resistentes ao agente de selecção

Foi semeada uma parte da descendência Fl proveniente dos cruzamentos entre as plantas Ds::MS e as plantas As e o ADN foi isolado de folhas jovens de cada planta Fl assim gerada. Sendo um dos parentes hemizigótico para o ADN-T, e sendo o outro homozigótico para o alelo R-nj::Ac, era esperado que os dois componentes Ac e Ds fossem transmitidos a 50% das plantas Fl provenientes destes cruzamentos. A fim de identificar as plantas Fl possuindo o ADN-T e detectar eventuais excisões somáticas, foram realizados testes de resistência ao marcador selectivo nas plantas jovens em paralelo com testes de amplificação de sequência sobre o ADN de folhas:

- para as plantas Ds::nptII 32

Colocam-se no cartucho formado pelas folhas da planta 3 a 5 ml de uma solução de sulfato de canamicina a 500 mg/1 + 0,1% de tween. As plantas sensíveis desenvolvem sectores cloróticos nas partes das folhas que estiveram em contacto com a solução. - para as plantas Ds::bar

Realiza-se um "leaf painting" pincelando uma folha com uma solução de glufosinato de amónio.

Uma primeira selecção da resistência ao antibiótico ou ao herbicida por uma aplicação não destrutiva permitiu determinar quais as plantas que possuíam o gene marcador de selecção.

Quando um elemento Ds se excisa após a produção de transposase, permanece um sítio dador vazio. Uma amplificação por PCR com os oligonucleótidos EM13 (SEQ ID n°l) e EM14 (SEQ ID n°2) permite sintetizar um fragmento específico de 280 pb quando o ADN-T é deletado do elemento Ds::bar ou Ds::nptII. Foi, portanto, realizada uma série de amplificações com o par EM13-EM14 no ADN extraído das plantas provenientes do cruzamento Ds::nptII X Ac, a fim de detectar uma eventual excisão somática em certas células das amostras de folhas colhidas. A análise por PCR destas plantas F1 mostrou que havia presença de excisão somática para todas as plantas F1 tendo herdado o ADN-T e o alelo R-nj::Ac. Nenhuma amplificação detectou nas plantas que possuíam apenas o ADN-T, nem nas plantas que não possuíam nenhum dos dois componentes.

Além disso, todas as plantas, para as quais foi detectada uma excisão somática, se revelaram ser globalmente resistentes ao antibiótico.

Esta banda indica, portanto, a presença de uma excisão somática em certas células de indivíduos portadores de ADN- 33 T e do alelo R-nj::Ac. De acordo com o que estava previsto, nenhum acontecimento de excisão germinal do elemento Ds::M se produziu para estas plantas, estando os dois componentes reunidos na mesma célula desde muito poucas gerações celulares (da fecundação à jovem planta).

Teria sido necessário que a transposição tivesse tido lugar nos gâmetas, nas ou células mães dos gâmetas, para se poder esperar observar uma excisão germinal. 0 que aumenta a possibilidade de excisão ao nivel dos gâmetas fracos, teria sido, portanto, espantoso obter uma excisão germinal desde a geração F1.

No entanto na estratégia encarada é a frequente excisão germinal que é preferencial para a eliminação do gene marcador: - uma excisão germinal não toca geralmente nos gâmetas e conduz à formação de grãos e de indivíduos quiméricos, em que a maior parte das células possuem ainda o marcador de excisão - uma excisão germinal toca as células, que se vão diferenciar na via da gametogénese, e conduz à formação de grãos e de indivíduos constituídos por células em que o Ds foi excisado (e pode ser reinserido) e que já não possuem o gene marcador de selecção. b) pesquisa por PCR de excisões germinais potenciais do gene marcador entre as plantas sensíveis É por essa razão que a pesquisa de uma excisão germinal é efectuada na geração F2. As bandas de amplificação específica da excisão foram doseadas para cada planta Fl, permitindo esta dosagem reflectir, através da taxa de excisão somática, a actividade da fonte de transposase. 34

As plantas F1 que apresentam a maior excisão somática foram cruzadas com plantas da linhagem A188 ou com plantas de uma linhagem de elite. Estes cruzamentos foram realizados nos dois sentidos, tendo as plantas que possuem os dois componentes Ac/Ds::M servido de fêmeas e/ou machos para aumentar as possibilidades de excisão germinal por planta F1. Os grãos assim formados foram levados à maturação. Foram semeados lotes de grãos F2 provenientes de plantas F1 Ds::nptII X Ac resistentes à canamicina e de plantas F1 Ds::bar X Ac resistentes ao glufosinato e provenientes de diversos cruzamentos. Nenhum exame fenotipico sustentado sobre a variegação foi aqui realizado. Os grãos que exprimem o fenótipo ou os grãos não pigmentados são escolhidos para semear com a mesma possibilidade, para evitar qualquer desvio.

Uma maneira simples de testar a frequência de excisão germinal neste sistema é seleccionar as plantas F2 pela sua sensibilidade ao agente selectivo e testá-las por análises moleculares. Plantas F2 Ds::bar e plantas F2 Ds::nptII foram assim testadas para a amplificação por PCR da banda especifica de excisão de 280 pb.

Uma planta F2 é sensivel ao agente selectivo seja através da segregação, e por consequência a banda de 280 pb não deve ser amplificada, seja por excisão germinal do gene marcador e, neste caso, a banda especifica de excisão é detectável por PCR. Este estudo permitiu amplificar a banda especifica de excisão a partir do ADN de plantas F2 provenientes dos cruzamentos: - Ds::bar/Ac X A188, - Ds::bar/Ac X linhagem de elite, - linhagem de elite X Da::nptII/Ac - Ds::nptII/Ac X linhagem de elite. 35

Foram efectuadas hibridações Southern, assim como análises PCR, nestas plantas seleccionadas, assim como nas plantas iniciais TI Ds::bar e TO DS::nptII, e os resultados obtidos são os seguintes.

As análises por PCR e Southern mostram que as plantas F2 seleccionadas herdaram uma parte do ADN-T contendo a moldura esquerda, as sequências de interesse, a cicatriz deixada pela excisão do Ds e a moldura direita, o elemento Ds::M não foi geneticamente transmitido às plantas F2 como o seria para a F1. Estas plantas F2 são, portanto, plantas provenientes de acontecimentos de excisão germinal do elemento Ds::M fora do ADN-T.

As frequências globais de excisão germinal são variáveis de uma descendência F2 para outra e são bastante fracas. No que diz respeito ao construído Ds::bar, nas plantas que herdaram o ADN-T, somente algumas plantas não possuem já o elemento Ds::bar, o que dá uma frequência de excisão germinal de 0,4%. A frequência de excisão germinal do elemento Ds::nptII é um pouco mais elevada e atinge 0,7%.

Esta frequência de excisão germinal é relativamente baixa. O fenómeno de transição floral é mais raro no milho que no tomate ou na arabeta: no milho, só há dois ou três meristemas por individuos que se diferenciam em órgãos sexuais e formam os gâmetas: um para a panícula (órgão macho) e um ou dois para as espigas (órgãos fêmeas) . É preciso, portanto, que a excisão germinal toque, ou um destes meristemas antes da gametogénese, ou um gâmeta. c) Segregação do ADN-T e do alelo R-nj::Ac

Uma vez que tenha sido caracterizada a planta F2, portadora do ADN-T sem o gene marcador de selecção, pode-se proceder à segregação da transposase inserida no R-nj e do 36 ADN-T. Esta segregação pode ter lugar no decurso da introgressão do ADN-T na linhagem de elite. Basta seleccionar as plantas que contêm o ADN-T, mas que não exprimem o pigmento antociano de tipo navajo. Esta segregação pode igualmente ser seguida por análises moleculares de tipo Southern graças às sondas Sac e S064. 3.2 Método de selecção sobre calos para os embriões F1 Ds ::nptll X As A fim de aumentar a frequência de excisão germinal, foi realizada uma fase de calogénese nos embriões F1 imaturos possuindo os dois componentes , quer dizer, o elemento Ds::nptII inserido no ADN-T e a fonte de transposase Ac inserida no alelo R-nj. A linhagem escolhida como fonte de transposase é aqui uma fonte homozigótica proveniente da primeira introgressão de W22/R-nj::Ac em A188. 0 calo possui, portanto, aproximadamente 75% do genoma de A188 e 25% do genoma de W22. A188 é uma linhagem que permite obter calo do tipo II.

Durante o crescimento do calo e a partir de uma célula que tenha conhecido um acontecimento de excisão somática, é possível gerar um sector de calo embriogéneo constituído por um aglomerado de células somaclonais que já não possuem o gene marcador de selecção. Uma identificação fenotípica ou molecular deste sector permitiria regenerar um indivíduo sem gene marcador a partir destas células com uma frequência mais elevada que pela via clássica. a) iniciação de calos a partir de embriões imaturos F1 em meio selectivo e selecção de calos resistentes

Embriões F1 oriundos de cruzamentos entre as plantas transgénicas Ds::M e as fontes de transposase homozigóticas 37 para o alelo R-nj::Ac foram colhidos de 10 a 12 dias após a fecundação, colocados esterilmente num meio N6 e postos em cultura numa câmara escura, a fim de iniciar a formação de calos indiferenciados de tipo II, de acordo com o método de Armstrong et al., 1985.

Após ter eliminado os eixos germinativos após 15 dias de iniciação, os calos são mantidos na obscuridade a 25°C durante todo o tempo que dura a indução de calos e a primeira parte da multiplicação. Os calos começam a tornar-se visiveis 1 semana após a iniciação. A cada sub-cultura, quer dizer, todas as duas ou três semanas, as partes brancas, embriógenas e quebradiças são seleccionadas e separadas das partes mais compactas ou mucosas.

Ao fim de 2 a 3 semanas de iniciação, os calos formados são duplicados em duas partes: - uma metade é posta num meio N6 não selectivo, para continuar a multiplicação dos calos; - a outra metade é posta num meio N6 contendo canamicina a 50 mg/1, para identificar os calos resistentes portadores do ADN-T. A selecção de calos com a canamicina necessita de uma fase à luz, em câmara de cultura. O antibiótico inibe, com efeito, a síntese de peptídeos nas mitocôndrias e nos cloroplastos. A inibição é baseada na semelhança entre a síntese proteica destes organitos e a síntese proteica bacteriana. As células vegetais são, portanto, geralmente intolerantes aos aminoglicósidos como a canamicina e a gentamicina. Mas para uma dose relativamente fraca, a canamicina não é destrutiva e permite uma selecção por fenótipo colorimétrico: os calos resistentes que possuem o gene nptll esverdeiam quando são expostos à luz (os cloroplastos funcionais 38 acumulam a clorofila), enquanto os calos sensíveis permanecem amarelos.

Esta fase de selecção permite identificar os calos que possuem o ADN-T e o elemento Ds::nptII e eliminar os calos que só possuem no seu qenoma o componente R-nj::Ac (no caso de uma fonte de transposase homozigótica). b) multiplicação dos calos resistentes em meio não selectivo

As partes dos calos resistentes que foram duplicadas e postas em meio não selectivo são cultivadas na obscuridade. Há, portanto, multiplicação das células que possuem os dois componentes. No decurso desta multiplicação, vai haver produção de transposase e um certo número de células vão sair de acontecimentos de excisão do elemento Ds::nptII fora do ADN-T. Estas células, ao multiplicarem-se, vão conduzir à formação de calos quiméricos constituídos por sectores de excisão somática do Ds::nptII e de sectores sem excisão.

Os calos são em seguida postos à luz, durante uma semana. As partes amarelas são grosseiramente isoladas. c) regeneração de plântulas a partir de um sector de excisão

As pontas dos calos isolados são postas a regenerar num meio não selectivo em câmara de cultura e à luz. São assim regeneradas plantas a partir de diferentes partes embriogéneas e potencialmente a partir de um sector de excisão do elemento Ds::nptII. d) pesquisa de excisão germinal em plantas sensíveis 39

As plantas, quando tiverem atingido o estádio de três folhas, são tratadas com uma solução de sulfato de canamicina. As plantas que apresentam sectores cloróticos são, portanto, plantas sensíveis ao agente selectivo, que são oriundas de um calo inicialmente resistente. Entre as plantas testadas, certas plantas originárias do mesmo embrião revelaram-se ser sensíveis à canamicina.

Análises PCR e Southern mostraram, com efeito, que o elemento Ds::nptII tinha sido excisado do seu local inicial e não se tinha reinserido. A frequência de excisão é, portanto, consideravelmente aumentada através da cultura de calos e atinge 8% das plantas assim regeneradas.

Uma sequenciação das cicatrizes deixadas no ADN-T pela excisão do elemento Ds::nptII foi efectuada para as plantas geradas pela via reprodutiva e pela via vegetativa. A análise das sequências obtidas mostra que certas plantas da via reprodutiva são oriundas de dois acontecimentos de excisão germinal diferentes, se bem que provenientes do mesmo cruzamento. Pelo contrário, as sequências das cicatrizes para as plantas obtidas por calogénese são idênticas, o que confirmaria que esta plantas são provenientes do mesmo acontecimento de excisão. 3.3 Método melhorado de selecção de acontecimentos de excisão germinal na geração F1

De acordo com um modo de realização preferido da invenção, a cassete de expressão compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica para um marcador de selecção (II) compreende igualmente, no interior do elemento Ds, um outro gene marcador fenotípico de tipo gene relator não destrutivo. Este gene relator pode ser, por exemplo, o gene que codifica para uma proteína fluorescente verde GFP (Nielsen et al., 1999), cuja detecção de 40 expressão nos tecidos não é destrutiva: a observação é realizada sob uma lupa equipada com uma iluminação de comprimento de onda especifico. Quando o elemento Ds se excisa, o gene GFP já não está presente, e os sectores de excisão somática são reconhecíveis sob a "lupa GFP", porque já não fluorescem.

No âmbito deste exemplo, o plasmídeo pBios491 é derivado do plasmideo pBios340 (Ds::nptII) descrito no exemplo la, por uma inserção, no interior do elemento Ds e no mesmo quadro de leitura que a cassete NptII, de uma cassete de expressão contendo o promotor CsVMV do virus do mosaico de nervuras da mandioca (WO 97/48819), o primeiro intrão do gene actine 1 do arroz, o quadro de leitura aberto GFP (Nielsen et al., 1999) e o terminador Nos. O Ds::GFP-nptII tem um tamanho de 5473 pb (Figura n°5) .

Como é descrito nos exemplos 3.1 e 3.2, a selecção dos acontecimentos de excisão germinal pode seguir as seguintes fases: - os embriões TI oriundos do cruzamento entre os transformantes portadores da cassete gene de interesse -Ds::MS e a fonte de transposase são recuperados 10 dias após a polinização; - estes embriões são colhidos e são postos em cultura num meio de calogénese não selectivo na obscuridade durante 15 a 30 dias; - os calos são então observados sob lupa GFP e a fracção não fluorescente do calo, correspondente aos sectores de excisão somática, é então colhida para multiplicação e regeneração da planta. As plantas assim produzidas contêm o gene de interesse sem sequência auxiliar estrangeira. 41 0 interesse deste vector Ds::GFP-MS no âmbito da invenção é, portanto, múltiplo; com efeito: - a identificação dos embriões imaturos F1 portadores de transgene, que fluorescem, faz-se por simples observação visual sob a lupa GFP; - a calogénese a partir dos embriões seleccionados pode fazer-se num meio não selectivo, a fim de induzir numerosos começos de calos e favorecer, assim, o começo de zonas de excisão somática desprovidas do gene de selecção; - a selecção de calos oriundos de células em que houve excisão somática é facilitada sob a lupa de fluorescência; além disso, estes calos podem ser colhidos directamente e precisamente, a fim de ser postos em regeneração; - uma vez as plantas regeneradas, a ausência de fluorescência (excisão somática) pode também ser confirmada. 4.1 Produção de plantas macho estéreis desprovidas do gene marcador canamicina 4.1 Preparação dos construídos A9-barnase-Ds::nptll 0 plasmídeo pBios424 é derivado do plasmídeo pBios340 descrito no exemplo la por inserção da cassete "gene de interesse" contendo o promotor A9 (WO 92 11379), correspondente à região 5' não codificante do gene A9 de Arabidopsis thaliana, o quadro de leitura aberto do gene barnase (Hartley, 1988; Gene Bank n°X 12871) e o terminador 3'CaMV (Franck et al., 1980; Gene Bank n°V 00141), fora do elemento Ds. O gene barnase, que confere a esterilidade macho, codifica uma Ribonuclease (RNase). Este gene foi 42 isolado a partir de Bacillus amyloliquefasciens e é descrito na publicação de Hartley (1988). 0 A9-barnase-Ds::nptll tem um tamanho de 12495 pb (Figura 6). 0 plasmídeo superbinário pRec424, utilizado para a transformação, é obtido por recombinação homóloga entre um vector intermediário derivado do plasmideo pBios424 e o vector pSBl de Japan Tobacco (EP 672 752), como é descrito no exemplo lb. 4.2 Selecção de transformantes resistentes e análise molecular

Foram produzidos 7 acontecimentos de transformação em que 5 foram seleccionados como sendo machos estéreis (A9-barnase) e resistentes à canamicina (Nptll). A análise molecular destes acontecimentos foi realizada para determinar as inserções simples. Esta análise permite caracterizar os acontecimentos de transformação retidos em trmos de número de cópias do ADN-T integrado e do número de loci de integração utilizados. Para isso são utilizadas diferentes sondas moleculares. 0 ADN genómico das plantas foi digerido pelo enzima de restrição iVcol, separado por electroforese sobre gel de agarose e transferido para membrana de nylon (membranas Hybond N+) com vista à hibridação com as diferentes sondas moleculares.

Escolha de sondas moleculares: • A utilização das sondas Promotor A9 (S007, SEQ ID NO:7), Barnase (S032, SEQ ID NO:8), Intrão actine, acoplada à restrição enzimática Ncol, permite caracterizar o perfil molecular dos acontecimentos de transformação. 43 • Sendo conhecida a sequência do plasmídeo de base, foram sintetizados pares de oligonucleótidos especificos de regiões plasmidicas situadas no exterior do ADN-T e depois utilizados como começos para gerar por PCR uma sonda extramoldura direita (RB) e uma sonda extramoldura esquerda (LB) . Do lado direito, a 40 pares de bases da moldura direita, a amplificação PCR gerou uma sonda de 353 pares de bases e do lado esquerdo, a 29 pares de bases da moldura esquerda, a amplificação gerou uma sonda de 299 pares de bases. A sonda chamada "sonda extramolduras" é constituida por uma mistura de duas sondas descritas acima. A sua utilização permite referenciar as plantas que não apresentam integração de regiões do plasmideo próximas do ADN-T. O tamanho dos sinais esperados após a hibridação com as diferentes sondas para uma inserção única do ADN-T não truncada e quando não há transbordamento da moldura é o seguinte: enzima de número tamanho dos sinais esperados restrição de sonda promotor sonda intrão sonda sonda extra- cópias A9 (pro A9) actine barnase molduras Ncol 1 > 1189 pb > 2550 pb 2733 pb sem sinal O balanço dos sinais observados nos transformantes primários mostra que os 5 acontecimentos apresentam perfis de inserção simples (1 ou 2 cópias).

4.3 Cruzamento com uma linhagem R-nj::Ac e selecção de acontecimentos que apresentam uma excisão do elemento Ds::MS

Os transformantes primários que apresentam perfis de inserção simples foram cruzados com a fonte de transposase 44 homozigótica para o alelo Rnj-Ac, como descrito no exemplo 2.

Os embriões correspondentes à geração TI (ou Fl) foram colhidos 15 dias após a fecundação, e postos em cultura in vitro no meio de cultura contendo 50 mg de canamicina.

Uma análise PCR com os oligonucleótidos adequados pode permitir verificar se estes acontecimentos de excisão somática tiveram lugar nos TI seleccionados.

As amostras de ADN das plantas TO e TI foram submetidas a uma amplificação PCR com o auxilio dos oligonucleótidos Barn5 (SEQ ID NO:6) e EM11 (SEQ ID NO:5). Se o Os::nptII for excisado do T-DNA, um fragmento de 7 60 pb pode ser amplificado. Se não for excisado o fragmento de 4160 pb que deveria ser amplificado, não aparece nestas condições PCR. A banda de amplificação de 760 pb revelando a excisão do Ds::nptll está presente na maior parte das amostras de plantas Tl, mas não nas TO. Nenhuma excisão somática foi posta em evidência nos TO, o que demonstra que a excisão está bem controlada. O gel de electroforese foi transferido para membrana de nylon, para ser hibridado com uma sonda 3'CaMV, a fim de confirmar a identidade do fragmento amplificado.

As experiências de PCR permitiram, portanto, confirmar bem a presença de excisão somática na maior parte das plantas Tl portadoras dos 2 constituintes: Os::nptII e transposase.

Após a saida de in vitro, as plantas Tl são aclimatadas no laboratório de plantas e depois em estufa. Na floração, as plantas Tl seleccionadas são cruzadas com uma linhagem de elite, definida como sendo uma linhagem que apresenta um potencial agronómico e comercial importante, num dado periodo. De acordo com o método da invenção, acontecimentos de excisão germinal podem ser encontrados 45 triando um grande número de F2 provenientes destas linhagens Tl.

Iniciadores utilizados para detectar a excisão dos elementos Ds::Bar e Ds::nptII

Nome SEQ ID n.s sequências EM13 1 5'-CGACAATCTGATCATGAGCG-3' EM14 2 5'-CTTAATAACACATTGCGGACG-3' Barn5 6 5'-GGTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3' EM11 5 5'-CATTGCGGACGTTTTTAATGTACTG-3'

Iniciadores utilizados para detectar os transformantes Ds::nptII

Nome SEQ ID n.a sequências Actint1 3 5'-CGAATTCGCGCCGGTAAC-3' Actint2 4 5'-TCGTGCCGAATTCGATATCAAGC-3'

As sondas utilizadas para os Southern blots são dadas abaixo nome métodos de obtenção sequência alvo tamanho S006 fragmento de restrição: Smal-Smal gene Bar 600 pb SO 63 fragmento PCR: par de oligo-nucleótidos Actintl-Actint2 intrão Actine 480 pb SO 64 fragmento PCR: par de oligo-nucleótidos 5'Nosl-5'Nos2 5'pNos 130 pb S020 fragmento PCR: par de oligo-nucleótidos cana7-cana8 gene npt II 1000 pb 46

Sac fragmento de restrição: HindIII-HindIII gene Ac 1605 pb S007 fragmento de restrição: HindIII-HindIII Barnase 90 0 pb S032 fragmento de restrição: Xball/Xhol promotor A9 1000 pb 47

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<210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido sintético <4 0 0> 1 cgacaatctg atcatgagcg 20 <210> 2 <211> 21

<212> ADN 50 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido sintético <4 0 0> 2 cttaataaca cattgcggac g 21 <210> 3

<211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido sintético <4 0 0> 3 cgaattcgcg ccggtaac 18 <210> 4 <211> 23

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido sintético <4 0 0> 4 tcgtgccgaa ttcgatatca age 23 <210> 5 <211> 25

<212> ADN 51 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial oligonucleótido sintético EM11 <4 0 0> 5 cattgcggac gtttttaatg tactg 25 <210> 6 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequênc oligonucleótido sintético Barn5 <4 0 0 > 6 ggtttcgctc atgtgttgag c <210> 7 <211> 985 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana 21 <4 0 0> 7 52 ctcgaggtcg acggtatcga taagcttgca tgatgatgat aagtaatcat tggagaattg ctaccacgtt ctctttgata ttcctcgatt aagtaattgt atccactaga actttgggaa tataatattt tggggaaata' gattttctct ataagtacat gtttctgttt cgttatattg taaatatgtt tatgaaataa gcgagaaagg tttaatggat tcgagattta gtattcttaa ctaagttatg ttgatctcaa atccttaatt gaacgaaaga tgagtaaaat actaaaaatc caaaaacaaa ccatgtgtta ccgtcaaatc aagcatttac gtgtaaccgg atcaaccgga tataaatgat aaattaattg aatatcttaa tttgttattt cecctagctt ttagtttttt caagatcaca aaaaaaaagc atcacttcac actatttaca tacacfcttta ttctataaat gaataaaaaa cacaagtact ctaga tgcctgcagg tagacattgt aggttggttt 60 tctaacacat gcactggaga attattgact 120 ttcctcgtga tttcatcagc ctctccgaaa 180 tctcccatct aatttatgta ttagagaagt 240 actgattttg ttgtgtgaca ttatattttt 300 ttgtcgtggt tgagtcttta ttagagcatg 360 aattaattaa acgtatcgag tgataaatgc 420 atttttgttt cattatcatt gattataaaa 480 atgttctcct aagaagagta caagtggtgg 540 ttttctcaaa agtcaaateg cattagttaa 600 aatgtgttta aaagatgtta accactaatc 660 tttgggtttt gaatatgttg tggagatgta 720 ttaatctgtg aaagaaacta catcacaeac 780 tatcatgcaa aaéttatgaa gtaactagat 840 ttcatgacct aattattctc gaagcccaaa 900 atagatgatg gaattcacca atccaaaagt 960 985 <210> 8 <211> 898

<212> ADN <213> Bacillus amyloliquefaciens <4 0 0> 8 aagcttctag gacatatcat ggtggcatca cttctcaaac tattaactat gatttacaaa gcttcctgcg aactctgate gaggacatcg aaactgatag ggaacaaatc ggaatactac cccgctcgtt cgagagtgtg actttcttaa accsfcggcac aagctacctg aaagggaacc agggaaggca acatcaggct acaacggacc gaggccgttt ggtcaatttc tccagctgaa aataaaatca agaagtatca ggtgaaaacc ttggaatgga cttcaggttt tacgatcaat aggttatcaa ataattacat ttgcagaçgt aaetcccggg tcagaaattc attatcagac ttttcagctt actttccgga accggggcag taagaaagga gcgacctcca tggacgcttt ggcagtttga tccgtgaagc gggagatgaa cacgtttgac tacaaaatca cgctccgggg caaaagcgga agaccggatt ctttacaaaa tacataaagt tccggtccaa aatccggcca gccgcacatg ccagacattg atgggattgt acaaagcaag gaaagcggaa caatatggaa ggggttgcgg gaagcacaag aaaagcatcg cgaacatggc ctttactcaa atcagafcaac gtgtaataaa tctgcagccg tttctgaaga aaaaaagcag aaaaaggagc ctgaccggat cagctgactg ggctgcgaca acacaaaccc attatcttca ccctcggetg gcggagacat gtgaagcgga gcgactggct gaaaaaaacg tttttcttca tccgagacag gaaaaatggt tcattaacgg ttgcccttcc gggtggagta aaaatggcgc tcaccatcat gcaagctt 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 898

Lisboa

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES Método para a obtenção de uma planta monocotiledónea transgénica contendo um gene de interesse (i) sem sequência auxiliar estrangeira, compreendendo as seguintes fases: a) a transformação de pelo menos uma célula de planta que não possua nenhuma transposase activa, com um vector compreendendo duas cassetes de expressão, uma compreendendo uma sequência nucleotidica de interesse (i) , a outra compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica para um marcador de selecção (ii) enquadrado pelas sequências mobilizáveis de um transposão, compreendendo a referida cassete de expressão uma sequência nucleotidica de interesse (i) que está fora do elemento transposão; b) a selecção das plantas transformadas com o marcador de selecção (ii); c) o cruzamento de uma planta transformada com uma outra planta pertencente a uma linhagem que contém no seu genoma um gene que codifica para uma transposase activa endógena, e que se encontra no meio de um marcador fenotipico de excisão (iii), para se obter uma F1 ou qualquer outro indivíduo de geração posterior; d) a selecção das células ou dos indivíduos portadores do gene de interesse sem sequência auxiliar estrangeira, a partir da geração Fl; e) a regeneração de plantas a partir das células ou dos indivíduos seleccionados em (d). 2
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual as sequências auxiliares estranqeiras codificam para um qene marcador de selecção (ii) que confere uma resistência a um antibiótico ou a um herbicida, como o qene nptll ou o qene bar.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual as sequências auxiliares estranqeiras codificam para um qene marcador fenotipico (ii).
4. 4. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, no qual as sequências mobilizáveis de um transposão enquadram, além da cassete de expressão que compreende uma sequência nucleotidica que codifica para um marcador de selecção (ii), uma segunda cassete de expressão compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica para um gene relator à selecção não destrutiva.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual a sequência nucleotidica que codifica para um gene relator à selecção não destrutiva codifica para uma GFP.
6. 6. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, no qual a planta monocotiledónea transgénica é uma planta de milho.
7. 7. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, no qual o sistema transposão é o sistema Ac/Ds.
8. 8. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, no qual os indivíduos na fase (d) podem ser plantas Fl, plantas F2 ou calos. 3
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 6, no qual a planta transformada pertence à linhagem A188.
10. 10. Método de acordo com uma das reivindicações 6 a 9, no qual a planta transformada é cruzada na fase (c) com uma outra planta, na qual o elemento Ac activo está situado numa região cromossómica tal que a excisão do referido elemento Ac se traduza pela produção de sectores antocianados na coroa do grão, de que é o embrião.
11. 11. Método de acordo com uma das reivindicações 7 a 10, no qual a selecção dos indivíduos na fase (d) se faz por via reprodutiva, compreendendo as seguintes fases: - selecção dos grãos F1 variegados; - selecção dos acontecimentos de excisão somática do elemento transposão defectivo do tipo Ds contendo o gene de selecção (denominado Ds::M) pela técnica PCR; - selecção dos acontecimentos de excisão germinal do elemento Ds::M pela técnica PCR; - obtenção de sementes de plantas F2 a partir destes acontecimentos.
12. 12. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, no qual a selecção dos indivíduos na fase (d) se faz por via vegetativa, compreendendo as seguintes fases: - produção de calos a partir de embriões imaturos Fl; - selecção visual dos calos contendo o ADN-T e o elemento transposão defectivo de tipo Ds que contém o gene de selecção (denominado Ds::M): - multiplicação dos calos e pesquisa de sectores de escisão do elemento Ds::M; 4 - regeneração de plantas F1 a partir destes sectores de excisão.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 10 para a obtenção de plantas F1 directamente regeneradas a partir de calos seleccionados, pela via de cultura in vitro de embriões imaturos de espigas F1. Lisboa,