CN111763685A

CN111763685A - 一种与胡萝卜类胡萝卜素合成相关的psy2基因序列及其应用

Info

Publication number: CN111763685A
Application number: CN201910263912.0A
Authority: CN
Inventors: 熊爱生; 丁旭; 徐志胜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2020-10-13

Abstract

PSY2基因是参与类胡萝卜素合成的关键基因。本专利从胡萝卜中克隆了一个新的PSY基因DcPSY2。该基因开放阅读框长为1317bp，编码438个氨基酸。DcPSY2编码的蛋白属于亲水性蛋白。与豆科的红木PSY进化关系最近，具有高度保守性。荧光定量表达分析表明DcPSY2基因在高温和高盐胁迫下，相对表达水平在处理后2h达到峰值，且均与对照呈显著差异(P＜0.05)。在低温和干旱胁迫下，处理后1h胡萝卜DcPSY2基因的表达量上调最为明显。本发明利用聚合酶扩增技术从胡萝卜中克隆获得胡萝卜DcPSY2基因，该胡萝卜DcPSY2基因对胡萝卜植株逆境胁迫有响应。

Description

一种与胡萝卜类胡萝卜素合成相关的PSY2基因序列及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及植物的一个PSY2基因及其应用。本发明从胡萝卜品种‘君川红’中获得一个与类胡萝卜素合成相关的基因DcPSY2，该基因能够应用于胡萝卜的类胡萝卜素合成途径研究和应用。

背景技术

胡萝卜(Daucus carota L.)是两年生根菜类蔬菜作物，属于伞形科(Apiaceae)胡萝卜属，是野生胡萝卜的变种。胡萝卜具有丰富的营养价值和药用价值，在我国种植非常普遍。胡萝卜以肉质直根为主要食用器官，根据其肉质根的长度、形状、颜色等不同，可以将胡萝卜划分为不同类型。胡萝卜含有丰富的营养物质，如类胡萝卜素、维生素、淀粉、糖分和脂质等，主要来源于次生韧皮部。

植物生产中，高温、干旱等非生物胁迫严重影响作物产量和品质。非生物胁迫也会导致胡萝卜营养供给不平衡，生理代谢紊乱，进而影响其生长发育以及有机物的积累。类胡萝卜素在逆境调控中发挥重要的作用，研究证实类胡萝卜素可参与水稻抗氧化胁迫，提高水稻抗逆能力。

DcPSY2基因在胡萝卜中编码八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)，该酶位于类胡萝卜素合成通路的上端，主要通过控制碳源流向，催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)前体合成八氢番茄红素，是番茄红素合成途径中的关键酶。已有研究表明，PSY的过表达可以提高类胡萝卜素的含量。

发明内容

本发明提供了一种胡萝卜DcPSY2基因制备方法和用途。所获得的DcPSY2基因有利于深入了解胡萝卜类胡萝卜素合成途径和DcPSY2响应机制。

附图说明

图1.胡萝卜DcPSY2蛋白同其他物种PSY蛋白氨基酸序列的比对

图2.胡萝卜与其他物种PSY蛋白的系统进化树

图3.胡萝卜DcPSY2蛋白氨基酸序列的疏水性和亲水性分析

图4.胡萝卜DcPSY2蛋白的二级结构

图5.胡萝卜DcPSY2基因在’君川红’中所处高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(200g·L^-1 PEG)和高盐(200mmol·L^-1 NaCl)下处理后的表达量分析。

具体实施方式

1.胡萝卜总RNA的提取及cDNA的合成：按照试剂盒(北京Tiangen生化科技有限公司)所述操作步骤对胡萝卜叶片进行总RNA提取。通过微量紫外检测仪Nano-Drop测定RNA浓度。随后，参照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物公司)试剂盒完成RNA的反转录操作。

2.胡萝卜DcPSY2基因的克隆：在本实验室的胡萝卜转录组和基因组数据库中检索得到胡萝卜DcPSY2基因序列，并对该序列进行克隆分析。利用Primer Premier 5.0软件设计一对克隆引物(上游DcPSY2-F：5’-TGGTGTGAATGGTTGAGGCCTCT-3’；下游DcPSY2-R：5’-GAATTTTTACATGGCCAATTGTG-3’)，利用高保真酶Prime STAR Max，以胡萝卜‘君川红’cDNA为模板，采用30μL体系进行扩增。PCR反应扩增程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。取5μL PCR产物用以1.2％琼脂糖凝胶电泳来确定目标产物后，将剩余25μL PCR产物委托通用生物系统有限公司(安徽)进行测序。

3.序列分析：运用NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行ProteinBlast比较，得到其他物种PSY蛋白的氨基酸序列。采用DNAMAN6.0软件进行物种间多重比对以及PSY蛋白的亲/疏水性分析。使用MEGA7.0软件构建系统进化树。用在线的SMS序列处理工具包分析各物种的氨基酸组成、ExPASy序列处理工具包分析理化性质。利用SignalP软件得到胡萝卜PSY蛋白信号肽预测图。选用SOPMA软件预测DcPSY2蛋白的二级结构。采用IBMSPSS Statistic 22和Excel 2010软件处理分析荧光定量PCR数据。

4.实时定量PCR反应：荧光定量PCR使用Hieff qPCR SYBR-Green Master Mix试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)，并按照试验说明操作。DcPSY2基因的表达检测上游引物为DcPSY2-F(5’-ATATGAGGTGTGGAGGCAGA-3’)，下游引物为DcPSY2-R(5’-GGAGTTATATGTGACGCATTAGGT-3’)。以胡萝卜的Actin基因作为内参基因，其上游引物为Actin-F(5’-CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3’)，下游引物为Actin-R(5’-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3’)。扩增体系总体积为20μL：cDNA模板2.0μL，SYBR PremixEx Taq酶10μL，ddH2O 7.2μL，0.1μmol·L^-1正、反向荧光定量引物各0.4μL。扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。将每个样本进行3次生物学重复。采用Bio-Rad CFX Manager完成数据处理。相对定量参照2^-ΔΔCt法。采用Microsoft Excel2010和SPSS 22.0进行表达分析。

实验结果：1).对本发明克隆获得的胡萝卜DcPSY2基因编码的氨基酸进行多序列比对结果如图1所示，PSY蛋白氨基酸序列长度在上述植物中存在一定的差异，序列长度为419～440个氨基酸；18种植物PSY蛋白氨基酸序列的相似性为82.22％，PSY蛋白是高度保守的。2).将本发明克隆获得的胡萝卜DcPSY2基因编码的氨基酸序列与其他物种的PSY蛋白序列进行对比，发现胡萝卜的PSY蛋白与豆科红木PSY蛋白进化关系最近(图2)。3).对本发明克隆获得的胡萝卜DcPSY2基因编码的氨基酸序列进行亲疏水性分析，结果显示，胡萝卜DcPSY2氨基酸位于第317位的精氨酸(Arg)亲水性最强，位于第416位的丙氨酸(Ala)疏水性最强。从总体来看，胡萝卜DcPSY2蛋白属于亲水性蛋白(图3)。4).二级结构预测结果表明，胡萝卜DcPSY2蛋白主要由53.65％的α-螺旋，5.48％的β-折叠，12.79％的延伸主链和28.08％的随机卷曲四部分组成(图4)。5).荧光定量PCR结果显示，DcPSY2基因在不同胁迫下，相对表达量出现峰值时的处理时间有差异。当高温和高盐胁迫下，DcPSY2基因相对表达水平在处理后2h达到峰值，分别为对照的2.40倍和11.37倍，且均与对照呈显著差异(P＜0.05)。在低温和干旱胁迫下，处理后1h胡萝卜DcPSY2基因的表达量上调最为明显，分别为对照的5.89倍、4.50倍(图5)。

Claims

1.一种胡萝卜PSY2基因的获得。

2.权利要求1所述的DcPSY2基因编码的PSY蛋白的氨基酸序列。

3.一种制备权利要求1所述的源于DcPSY2基因的方法，包括以下步骤：

1)基于胡萝卜转录组测序信息，进行检索分析，获得DcPSY2的基因序列；

2)设计引物，正向：5’-TGGTGTGAATGGTTGAGGCCTCT-3’，反向：5’-GAATTTTTACATGGCCAATTGTG-3’，通过PCR方法从‘君川红胡萝卜’中克隆获得DcPSY2基因。

4.权利要求1所述的胡萝卜DcPSY2基因功能研究：采用荧光定量PCR方法，完成胡萝卜DcPSY2基因在’君川红’中所处高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(200g·L^-1PEG)和高盐(200mmol·L^-1NaCl)下处理的表达量分析。

5.权利要求1所述的胡萝卜DcPSY2基因应用。