CN111218466A - 一种表达肝素酶的融合基因mbp-h1及其重组质粒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达肝素酶的融合基因MBP‑H1及其重组质粒和应用，涉及肝素酶生产技术领域。本发明所述融合基因MBP‑H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，然后利用所述融合基因MBP‑H1构建pET‑28a‑MBP‑H1融合蛋白重组质粒，最后对pET‑28a‑MBP‑H1进行初步诱导表达条件优化，确定其最优诱导表达条件为在37℃，200rpm条件下培养至菌液OD600为0.7左右时，加入IPTG(100mM)至终浓度为0.1mM，30℃，200rpm诱导9h，肝素酶酶活最高可达4512U/L。

Description

一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用

技术领域

本发明属于肝素酶生产技术领域，具体涉及一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用。

背景技术

目前市场上已有的几种肝素类药物大多都是由化学法制备，该方法处理过于激烈，容易导致肝素失去生物活性，使得该法制备的低分子量肝素具有微观非均相、多分散性和结构变异大等缺点。相比之下，酶法制备的反应条件更加温和，产物中不会引入有毒物质，反应效率高，而且肝素酶和产物易于分离，同时利用固定化酶技术还可实现生产的连续化，大大节约成本，是一种生产低分子量肝素的工业化途径。迄今为止，虽然有许多通过肝素酶裂解法制备低分子量肝素的研究报道，但仍然存在许多限制因素，例如肝素酶来源狭隘，许多制备低分子量肝素所用的肝素酶基本都是来源于肝素黄杆菌，此外肝素酶的制备成本较高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用，将该肝素酶基因构建麦芽糖结合蛋白-肝素酶融合蛋白，以提高其表达量和可溶性，有望解决工业上应用酶法制备低分子量肝素的瓶颈。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1，所述融合基因MBP-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述融合基因MBP-H1中H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述基因H1来源于拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15，所述拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15的保藏编号为CGMCCNo.13723。

本发明还提供了一种包含所述融合基因MBP-H1的重组质粒。

本发明还提供了所述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：将所述融合基因MBP-H1克隆至载体pET-28a上，得重组质粒pET-28a-MBP-H1。

优选的，将所述融合基因MBP-H1插入载体pET-28a的XbaI和XhoI酶切位点之间。

本发明还提供了一种重组菌，包含所述重组质粒或利用所述构建方法构建得到的重组质粒。

本发明还提供了所述重组菌在生产肝素酶MBP融合蛋白中的应用。

优选的，在生产所述肝素酶MBP融合蛋白时，将所述重组菌在37℃、200rpm的条件下培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM后，于30℃、200rpm诱导所述肝素酶MBP融合蛋白的表达。

优选的，所述诱导的时间为9h。

本发明提供了一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1，所述融合基因MBP-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，然后利用所述融合基因MBP-H1构建重组载体pET-28a-MBP-H1，最后确定其最优诱导表达条件为37℃，200rpm条件下培养至菌液OD600为0.7左右时，加入IPTG(100mM)至终浓度为0.1mM，30℃，200rpm诱导9h，肝素酶酶活最高可达4512U/L。

附图说明

图1为实施例1中目的基因与质粒的双酶切图；

图2为实施例1中重组子的双酶切验证图；

图3为实施例1中测序比对结果图；

图4为诱导剂IPTG浓度的优化结果图；

图5为诱导时间的优化结果图；

图6为肝素酶标准曲线；

图7为诱导温度的优化结果图。

生物保藏信息

菌株NX-TZ-3-15，建议分类命名为Raoultella sp.，于2017年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13723。

具体实施方式

本发明提供了一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1，所述融合基因MBP-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述融合基因MBP-H1中H1的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.2所示。本发明所述基因H1优选来源于拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15，所述拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15的保藏编号为CGMCC No.13723。

本发明对所述融合基因MBP-H1的制备方法并没有特殊限定，可利用分子生物学手段克隆连接构建，也可以直接由基因公司合成。在本发明实施例中，优选由生工生物工程(上海)股份有限公司合成所述融合基因MBP-H1。

本发明还提供了一种包含所述融合基因MBP-H1的重组质粒。

本发明所述重组质粒的载体优选为pET-28a。

本发明还公开了所述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：将所述融合基因MBP-H1克隆至载体pET-28a上，得重组质粒pET-28a-MBP-H1。

在本发明所述构建方法中，优选将所述融合基因MBP-H1插入到pET-28a载体上的XbaI和XhoI酶切位点之间。本发明对所述克隆的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。

本发明还提供了一种重组菌，包含所述重组质粒或利用所述方法构建方法构建得到的重组质粒。

本发明所述重组菌优选的将所述重组质粒转化至E.coli TOP10感受态细胞中。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定。

本发明在制备得到所述重组菌后，优选的还包括对重组子的验证，所述验证优选的包括：挑选单克隆菌培养后提取质粒，双酶切验证后测序。

本发明还提供了所述重组菌在生产肝素酶MBP融合蛋白中的应用。

本发明所述生产肝素酶MBP融合蛋白时，其生产条件优选的包括：将所述重组菌在37℃、200rpm的条件下培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM后，于30℃、200rpm诱导所述肝素酶MBP融合蛋白的表达；所述诱导的时间为9h。

下面结合实施例对本发明提供的一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

1、将实施例中需要用到的实验试剂和实验仪器进行整理，如表1和表2所示：

表1实验试剂

表2实验仪器

2、各种溶液的配制方法

(1)LB培养基(％)：蛋白胨1，酵母提取物0.5，氯化钠1，pH 7.0。

(2)LB固体培养基(含50μg/mL卡那霉素)配制方法：在LB培养基中加入2％的琼脂粉，然后在121℃高压下灭菌20min；将高压灭菌后的培养基置于无菌操作台内，待其冷却至不烫手时加入0.1％的0.05g/mL卡那霉素，混匀倒平板；待平板内的培养基凝固后，用封口膜将其密封，倒置于4℃冰箱，备用。

(3)10％过硫酸铵(APS)：100mgAPS溶于1mL灭菌水中，现配现用。

(4)考马斯亮蓝R-250染色液(500mL)：1.25g考马斯亮蓝R250，加入225mL甲醇，50mL冰醋酸，225mL灭菌水配置而成。

(5)脱色液(1L)：200mL乙醇，70mL冰醋酸，730mL灭菌水配置而成。

(6)天青A溶液：称取0.5g天青A，用10mL超纯水使其完全溶解，取2mL溶液定容至500mL，经滤纸过滤后置于4℃冰箱保存。临用前作10倍稀释，混匀制得0.002％天青A溶液供测试用。

(7)0.25M醋酸钠-0.0025M醋酸钙(pH7.0)缓冲液：20.5g醋酸钠和0.4405g醋酸钙,调pH 7.0，定容到1L。

(8)16％的分离胶与6％的浓缩胶，如表3所示：

表3分离胶和浓缩胶成分表

实施例1

1.11委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成MBP-H1序列(如SEQ ID NO.1所示)。

1.12培养菌株E.coli TOP10 pET-28a，提取质粒后双酶切将上述纯化后的PCR产物与载体质粒pET-28a用XbaI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，双酶切条件为：37℃酶切2h，双酶切反应体系(50μL)如表4所示：

表4双酶切体系成分表

将上述目的基因与载体质粒的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后进行切胶回收。结果如图1所示，其中泳道M为DL10000 DNAMarker；泳道1为目的基因双酶切产物；泳道2为质粒双酶切产物；经双酶切后的目的基因和质粒条带均在理论目的条带上。

1.13目的基因MBP-H1与载体质粒pET-28a的连接

将目的基因与载体质粒酶切后胶回收的产物进行连接。

连接条件为16℃过夜连接，随后65℃灭酶活10min。其中连接体系(20μL)如表5所示：

表5连接体系成分表

目的基因MBP-H1与质粒pET-28a的摩尔比为3.2:1左右，目的基因与载体的总质量约0.4μg。

1.14转化E.coli TOP10感受态细胞

(1)将E.coli TOP10感受态细胞于冰上融解至半融化状态，

(2)在超净工作台中取5μL上述连接产物加入到E.coliTOP10感受态细胞，冰上放置30min；

(3)将离心管放入金属浴中，42℃热击45s；

(4)快速取出离心管，冰浴5min；

(5)在超净工作台中加入200μL LB培养基，37℃，200rpm，复苏培养1.5h；

(6)取出100μL培养液涂布于含卡那霉素50μg/mL的LB平板，待细胞培养液全部被培养基吸收后倒置平板，将平板放置于37℃恒温培养箱，12～16h内观察是否长出菌落。

1.15重组子的验证

(1)挑取数个上述单克隆菌落接种至10mL LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)，37℃，200rpm，过夜培养12h。取500μL菌液加入500μL灭菌50％甘油中，分装在1.5mL的EP管中置于-20℃保存。

(2)剩余菌液提取质粒，重组质粒命名为pET-28a-MBP-H1。取上述质粒按照1.12的体系进行双酶切验证，之后取3μL酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示，其中泳道M为DL10000 DNA Marker；泳道1为pET-28a-MBP-H1-1；泳道2为pET-28a-MBP-H1-2；泳道3为pET-28a。显示pET-28a-MBP-H1-1和pET-28a-MBP-H1-2的酶切验证均有目的条带(2000bp左右与5000bp左右)，表示目的基因MBP-H1已成功插入到质粒pET-28a中。

(3)将酶切验证成功的质粒送往广州艾基生物技术有限公司测序。结果如图3所示，两者在H1基因内均无基因突变，可将两者分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞。

1.16阳性克隆的诱导以及蛋白的表达检验

利用天青A法测定酶活，结果如表6所示，E.coli BL21(DE3)pET-28a-MBP-H1-2的酶活比E.coli BL21(DE3)pET-28a-MBP-H1-1高，故后续采用pET-28a-MBP-H1-2作为研究对象进行诱导表达条件的优化。

表6融合蛋白酶活

实施例2

2.1实验方法

2.1.1诱导剂IPTG浓度的优化

从甘油管中保藏的E.coli BL21(DE3)pET-28a-MBP-H1-2取50μL，到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。取100μL种子液加入到10mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃，200rpm培养至OD600为0.7左右，加入终浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1mM的IPTG，每组做三个平行对照，37℃，200rpm，诱导10h。取200μL/孔加入96孔板，用酶标仪测OD₆₀₀，随后破碎细胞提取粗酶液测酶活。

诱导结果如图4所示，其中，-●-表示OD₆₀₀；-■-表示酶活(U/L)；随着IPTG浓度的增加，酶活曲线大致方向为逐渐下降，其OD₆₀₀生长曲线，也呈下降趋势。在IPTG浓度为0.1mM时，所产肝素酶酶活最高(4512U/L)。

2.1.2诱导时间的优化

从甘油管中保藏的E.coli BL21(DE3)pET-28a-MBP-H1-2取50μL，到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。取100μL种子液加入到10mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃，200rpm培养至OD600为0.7左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，200rpm，诱导6、7、8、9、10h，每组做三个平行对照。取200μL/孔加入96孔板，用酶标仪测OD₆₀0，随后破碎细胞提取粗酶液测酶活。测酶活方法见1.11，结果如图5所示，其中，-●-表示OD₆₀₀；-■-表示酶活(U/L)；随着诱导时间的增加，菌体密度OD₆₀₀也逐渐增加，但增加的幅度不是很大，而酶活也在逐渐增加，说明此时重组大肠杆菌把菌体内大部分的物质都用来合成外源蛋白，而在诱导后期，酶活稍有降低，此时的大肠杆菌可能已经开始老化，部分肝素酶被降解，以致降低酶活。当诱导时间为9h，此时的肝素酶活性最高。

2.1.3诱导温度的优化

从甘油管中保藏的E.coli BL21(DE3)pET-28a-MBP-H1-2取50μL，到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。取100μL种子液加入到10mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃，200rpm培养至OD600为0.7左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，在20、25、30、37℃的温度下诱导，每组做三个平行对照，200rpm，诱导9h。取200μL/孔加入96孔板，用酶标仪测OD₆₀₀，随后破碎细胞提取粗酶液测酶活。

测酶活方法如下：

(1)肝素标准曲线测定

取0.04g肝素钠加入1mL超纯水，配成4％(w/v)的肝素钠溶液，用超纯水将其进行不同程度的稀释，配成0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％(w/v)的肝素钠标准溶液1mL。

取6支试管，分别加入5mL 0.002％天青A溶液，其中一支加入5μL超纯水作空白对照，其它试管依次加入5μL 0.1％-0.5％的肝素钠标准溶液，充分混匀后取200μL/孔加入96孔板中，测620nm处的吸光度值(做3组平行样取平均值)。标准曲线如图6所示，y＝-0.1158x+0.8038，R²＝0.9986。

(2)提取粗酶液

取10mL培养后的菌液4℃，6000rpm离心10min，将得到的湿箘体用10mL 0.25M醋酸钠-0.0025M醋酸钙(pH7.0)缓冲液重悬后置于冰水混合物上进行超声破碎(功率20％，开3s/关6s，6min)，然后取1mL细胞破碎液4℃，7800rpm离心10min，上清即为粗酶液。

(3)酶活的测定

200μL粗酶液+50μL肝素溶液(0.025g肝素钠标准品用1mL 0.25M醋酸钠-0.0025M醋酸钙缓冲溶液溶解)，充分混匀后立即取10μL+10mL0.002％天青A溶液，充分混匀后取200μL/孔加到96孔板(做3组平行样取平均值)，测620nm处的吸光度值，然后在30℃保温，隔15min取10μL测其在620nm处的吸光度值。

(4)酶活的定义

30℃，pH＝7.0的条件下每小时降解1mg肝素所需的酶量为一个单位(U)。

(5)酶活的计算公式

由标准曲线可得整个250μL体系中不同时刻的肝素含量(μg)，两个不同时刻的肝素含量的差值即为这段时间内的肝素降解量。

结果如图7所示，其中，-●-表示OD₆₀₀；-■-表示酶活(U/L)；当诱导温度低时，此时的菌体生长也较为缓慢，因此导致目的蛋白的合成也较慢，随着诱导温度的升高，菌体密度OD₆₀₀也逐渐升高，而酶活在30℃时达到最高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1985

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taccatgggc agcagccatc 60

atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatgaaa actgaagaag 120

gtaaactggt aatctggatt aacggcgata aaggctataa cggtctcgct gaagtcggta 180

agaaattcga gaaagatacc ggaattaaag tcaccgttga gcatccggat aaactggaag 240

agaaattccc acaggttgcg gcaactggcg atggccctga cattatcttc tgggcacacg 300

accgctttgg tggctacgct caatctggcc tgttggctga aatcaccccg gacaaagcgt 360

tccaggacaa gctgtatccg tttacctggg atgccgtacg ttacaacggc aagctgattg 420

cttacccgat cgctgttgaa gcgttatcgc tgatttataa caaagatctg ctgccgaacc 480

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tgactgatga aggtctggaa gcggttaata aagacaaacc gctgggtgcc gtagcgctga 1020

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agaaaggtga aatcatgccg aacatcccgc agatgtccgc tttctggtat gccgtgcgta 1140

ctgcggtgat caacgccgcc agcggtcgtc agactgtcga tgaagccctg aaagacgcgc 1200

agactaattc gagctcgaac aacaacaaca ataacaataa caacaacctc gggatcgagg 1260

gacgtgaaaa cctgtacttc cagggtggat ccatgcggat gaagcagtat ttgattgccc 1320

cttcgattct gtcggctgat tttgcccgcc tgggcgagga taccgccaaa gctctggctg 1380

caggtgcgga cgttgtgcac tttgacgtga tggacaacca ctacgtgccg aatctgacca 1440

tcggccctat ggtgttgaaa gcgctacgca actatggcat caccgccccg atcgacgtgc 1500

acctgatggt gaaaccggtc gaccgcatca ttcctgattt cgccgcggcg ggcgccagca 1560

tcatcacctt ccacccggaa gcctctgagc acgtcgatcg cagcctgcag ctgatcaaag 1620

aacatggctg taaagccggt ctggtgttta acccggccac gccgctgagc taccttgatt 1680

atgtgatgga taagctggac gttattctgc tgatgtccgt taacccgggg ttcggcggtc 1740

agtccttcat cccccagact ctggataaac tgcgcgaagt gcgtcagcgc atcgatgcgt 1800

cgggttatga tattcgtctg gaagtcgacg gcggcgtgaa ggtcagtaat attgcggata 1860

ttgcggcggc aggcgcagat atgtttgttg ccggttcggc gattttcgat cgtccggact 1920

acaaggaggt tatcgatcaa atgcgtagtg aattagcaaa ggttagtcat ggataactcg 1980

agcgg 1985

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcggatga agcagtattt gattgcccct tcgattctgt cggctgattt tgcccgcctg 60

ggcgaggata ccgccaaagc tctggctgca ggtgcggacg ttgtgcactt tgacgtgatg 120

gacaaccact acgtgccgaa tctgaccatc ggccctatgg tgttgaaagc gctacgcaac 180

tatggcatca ccgccccgat cgacgtgcac ctgatggtga aaccggtcga ccgcatcatt 240

cctgatttcg ccgcggcggg cgccagcatc atcaccttcc acccggaagc ctctgagcac 300

gtcgatcgca gcctgcagct gatcaaagaa catggctgta aagccggtct ggtgtttaac 360

ccggccacgc cgctgagcta ccttgattat gtgatggata agctggacgt tattctgctg 420

atgtccgtta acccggggtt cggcggtcag tccttcatcc cccagaccct ggataaactg 480

cgcgaagtgc gtcagcgcat cgatgcgtcg ggttatgata ttcgtctgga agtcgacggc 540

ggcgtgaagg tcagtaatat tgcggatatt gcggcggcag gcgcagatat gtttgttgcc 600

ggttcggcga ttttcgatcg tccggactac aaggaggtta tcgatcaaat gcgtagtgaa 660

ttagcaaagg ttagtcatgg ataa 684

Claims (10)

1.一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1，其特征在于，所述融合基因MBP-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述融合基因MBP-H1，其特征在于，所述融合基因MBP-H1中H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述融合基因MBP-H1，其特征在于，所述基因H1来源于拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15，所述拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15的保藏编号为CGMCC No.13723。

4.一种包含权利要求1或2所述融合基因MBP-H1的重组质粒。

5.权利要求4所述重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述融合基因MBP-H1克隆至载体pET-28a上，得重组质粒pET-28a-MBP-H1。

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，将所述融合基因MBP-H1插入载体pET-28a的XbaI和XhoI酶切位点之间。

7.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求4所述重组质粒或利用权利要求5或6所述构建方法构建方法构建得到的重组质粒。

8.权利要求7所述重组菌在生产肝素酶MBP融合蛋白中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在生产所述肝素酶MBP融合蛋白时，将所述重组菌在37℃、200rpm的条件下培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM后，于30℃、200rpm诱导所述肝素酶MBP融合蛋白的表达。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述诱导的时间为9h。

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