CN117448271A - 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 - Google Patents
一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117448271A CN117448271A CN202311783776.0A CN202311783776A CN117448271A CN 117448271 A CN117448271 A CN 117448271A CN 202311783776 A CN202311783776 A CN 202311783776A CN 117448271 A CN117448271 A CN 117448271A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- concentration
- cell
- inhibitor
- pluripotent stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 249
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 119
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title claims abstract description 68
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims abstract description 79
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 75
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 69
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 31
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 30
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 claims description 29
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical group CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 claims description 24
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 24
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical group C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 24
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 21
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 21
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 claims description 19
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 claims description 17
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 claims description 17
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 claims description 16
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 16
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 claims description 16
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 claims description 16
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 15
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 14
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 14
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical group C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 claims description 11
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000009347 mechanical transmission Effects 0.000 claims description 10
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 claims description 8
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 claims description 7
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 claims description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 claims description 5
- 229940125400 channel inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 5
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 claims description 4
- JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N DMH1 Chemical compound C1=CC(OC(C)C)=CC=C1C1=CN2N=CC(C=3C4=CC=CC=C4N=CC=3)=C2N=C1 JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 4
- 101100356682 Caenorhabditis elegans rho-1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150111584 RHOA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010001589 Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005640 Myosin Type II Human genes 0.000 claims description 2
- 108010045128 Myosin Type II Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 102100021796 Sonic hedgehog protein Human genes 0.000 claims 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003892 spreading Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 61
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- VFSUUTYAEQOIMW-YHBQERECSA-N 3-chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[3-(pyridin-4-yl)benzyl]-1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical compound C1C[C@@H](NC)CC[C@@H]1N(C(=O)C1=C(C2=CC=CC=C2S1)Cl)CC1=CC=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1 VFSUUTYAEQOIMW-YHBQERECSA-N 0.000 description 14
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 14
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 description 9
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 description 9
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 101001038339 Homo sapiens LIM homeobox transcription factor 1-alpha Proteins 0.000 description 5
- 102100040290 LIM homeobox transcription factor 1-alpha Human genes 0.000 description 5
- FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N purmorphamine Chemical compound C1CCCCC1N1C2=NC(OC=3C4=CC=CC=C4C=CC=3)=NC(NC=3C=CC(=CC=3)N3CCOCC3)=C2N=C1 FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 4
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 3
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 3
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- -1 cAMP Chemical compound 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWNOWCGAHDFNFJ-RUCXOUQFSA-N (2s)-2,5-bis(azanyl)-5-oxidanylidene-pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O NWNOWCGAHDFNFJ-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 2
- LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 1,5-naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1h-pyrazol-4-yl]- Chemical compound CC1=CC=CC(C2=C(C=NN2)C=2N=C3C=CC=NC3=CC=2)=N1 LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 2
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 2
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 2
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- 241001573498 Compacta Species 0.000 description 1
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 1
- 102000003956 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101150057663 Foxa2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010061533 Myotonia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 101001062354 Xenopus tropicalis Forkhead box protein A2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001144 postural effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002660 stem cell treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含如下步骤：将含有多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经祖细胞；该神经祖细胞培养液含有细胞机械传导通路抑制剂；将含有多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经前体细胞；该神经前体细胞培养液含有细胞机械传导通路激活剂。本发明将生化因子添加与细胞机械传导通路调控相结合，在诱导分化的初期，采用小分子药物来抑制细胞机械传导信号通路；在分化的后期，使用小分子药物来激活这一通路，在短时间内获得高纯度、高产量的细胞，适合于生产临床级别的细胞。
Description
技术领域
本发明属于干细胞生物学和力学的学科交叉领域，具体涉及一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的高效分化方法。
背景技术
人多能干细胞，包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞，是一类具有自我更新和广泛分化潜力的细胞，能够分化为体内的几乎所有细胞类型。这种细胞的独特的生物学特性和广泛的分化潜力，使其在现代医学中具有巨大的应用价值，带来了潜在的革命性的治疗方法和无限的可能性。例如，在细胞治疗中，人多能干细胞可以被诱导分化为特定的细胞类型，如神经细胞、心肌细胞或胰岛细胞，用于治疗神经退行性疾病、心脏疾病或糖尿病等。
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是最常见的进行性神经退行性疾病之一，影响着全球一千万以上的人口。其病理特征是中脑黑质致密部的A9类型多巴胺（mDA）能神经元大量死亡或受损，这导致了纹状体中神经递质多巴胺的缺失，进而引起一系列PD的标志性运动症状包括：震颤，肌强直，运动迟缓，和姿势步态障碍。尽管帕金森病的确切原因尚不清楚，但研究认为遗传、环境因素和年龄都可能与其发病有关。现有的帕金森病治疗方法主要包括药物治疗、深部脑刺激手术以及物理治疗等。尽管这些方法在一定程度上可以缓解症状，但它们都存在局限性。药物治疗，如多巴胺前体药物，虽然可以提供短期的症状缓解，但长期使用可能导致副作用，如运动并发症和药物耐受性。深部脑刺激手术虽然对某些患者有效，但手术风险和高昂的成本使其不适合所有患者。此外，这些治疗方法都无法根本性地治疗帕金森病，只能暂时缓解症状，而不能阻止疾病的进展。因此，寻找更有效、更安全的治疗方法仍然是PD研究的重要方向。
PD的干细胞疗法旨在通过将干细胞转化为mDA神经前体细胞，然后将其移植到患者的大脑中，这些细胞可以在体内继续成熟，并替代死亡或受损的mDA神经元发挥生理作用，恢复多巴胺的生产和释放。因此，与传统治疗手段不同，干细胞疗法具有很大潜力能够让机体恢复自主产生多巴胺的能力，因而延迟甚至逆转PD的疾病进展。一些早期的临床试验也显示，来自人胎儿的mDA神经元移植可以在一定程度上改善帕金森病患者的症状。近年来，研究者已经在实验室中成功地将人多能干细胞转化为mDA神经元，并移植到帕金森病患者脑内。然而，这种疗法仍然需要解决一些问题，例如如何获得高纯度的mDA神经前体细胞、确保移植细胞的安全性、提高细胞的存活率和功能整合等。尽管如此，干细胞疗法为帕金森病的治疗提供了一个有前景的方向，持续的研究正在努力克服这些挑战，使其成为一种有效和可靠的治疗手段。
在生物体中，mDA神经元源于中脑神经底板细胞的分化。在胚胎早期的神经管形成阶段，骨形态发生蛋白（BMP）与音猬因子（SHH）共同作用，决定了细胞在腹背轴上的分化方向；而WNT、维甲酸、成纤维细胞生长因子8和BMP则共同决策细胞在前后轴的命运。仿照生物体内mDA神经元的生成，人多能干细胞在实验环境下也能被诱导为mDA神经细胞。众多研究已经描述了如何在体外将人多能干细胞诱导为mDA神经前体细胞。目前，一种相对高效的策略是：初步利用BMP和转化生长因子-β（TGF-β）的抑制剂，结合SHH的激动剂，推动人多能干细胞向神经底板细胞方向分化。接着，通过WNT信号的激活，进一步引导其成为中脑细胞，从而形成mDA神经祖细胞。在获得mDA神经祖细胞后，结合神经营养因子（如脑源性和胶质细胞源性神经营养因子）、WNT信号激活剂、诱导因子TGF-β3、抗坏血酸、环腺苷酸和DAPT，进一步诱导其向mDA神经前体细胞方向发展。然而，这种方法的转化效率并不理想，特别是在体内继续分化后，A9型的mDA神经元所占比例仍有待优化。因此，我们仍需深入研究，以解决这些问题，确保其在临床应用中的效果和安全性。
发明内容
本发明提供了一种新颖的mDA神经前体细胞的诱导分化技术，以及其在帕金森病治疗中的潜在应用。此方法能迅速产生大批高纯度的mDA神经前体细胞，显著缩短了分化时间并提高了细胞制品的纯度和产出。与传统的干细胞诱导分化方法不同，本发明结合了生化因子诱导与调节细胞机械传导途径。在分化的初期阶段，采用小分子药物来抑制细胞机械传导信号；而在分化的后期，使用小分子药物来增强细胞机械传导信号。因此，由于本发明方法具有高速分化、高纯度和大量产出mDA神经前体细胞的特点，非常适合于临床级细胞制品的制备和帕金森病的干细胞治疗。
本发明提供了一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含如下步骤：
步骤S1，将含有多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经祖细胞；该神经祖细胞培养液含有细胞机械传导通路抑制剂；
步骤S2，将含有多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经前体细胞；该神经前体细胞培养液含有细胞机械传导通路激活剂。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，所述神经祖细胞培养液包括：神经细胞基础培养基、N2补充剂、不含维生素A的B27补充剂、L-谷氨酰胺、TGF-β信号通路抑制剂、BMP信号通路抑制剂、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、细胞机械传导通路抑制剂；其中，L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM；所述TGF-β信号通路抑制剂的浓度为1～15µM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为100～500nM；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂的浓度为0.5-9µM；所述细胞机械传导信号通路抑制剂的浓度为5-15µM。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，所述TGF-β抑制剂是SB431542或RepSox；所述BMP信号通路抑制剂是LDN193189或DMH-1；所述GSK-3β抑制剂是CHIR99021或BIO；所述细胞机械传导信号通路抑制剂是Rho激酶抑制剂Y27632或肌球蛋白II抑制剂Blebbistatin。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，L-谷氨酰胺浓度为2mM；所述TGF-β抑制剂浓度为10μM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为250nM；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.7μM，后提高为7.5µM；所述细胞机械传导信号通路抑制剂浓度为10µM。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，所述音猬因子通路激活剂为浓度为0.5-2µM 的SAG或浓度为100～600ng/mL 的SHH蛋白或浓度为1～10µM 的Purmorphamine。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，所述音猬因子通路激活剂为浓度为1µM 的SAG或浓度为500ng/mL 的SHH蛋白或浓度为5µM的Purmorphamine。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养5～12天得到多巴胺能神经祖细胞，其中培养液每1～3天更换一次。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养10天得到多巴胺能神经祖细胞，其中培养液每2天更换一次。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，该神经前体细胞培养液包含：神经细胞基础培养基、B27补充剂、L-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP、DAPT、细胞机械传导通路激活剂，其中，L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM；所述多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子；所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10～50ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.1～1mM；所述TGF-β3的浓度为0.5～5ng/mL；所述GSK-3β抑制剂也即WNT信号通路激活剂为浓度为2～4µM 的CHIR99021；所述激活剂cAMP的浓度为0.2～2mM；所述DAPT浓度为1～15µM；所述细胞机械传导通路激活剂浓度为1-20µM。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂为CHIR99021或BIO；所述细胞机械传导通路激活剂为Hippo-YAP/Taz信号通路激活剂PY-60或RhoA激活剂溶血磷脂酸。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，所述L-谷氨酰胺浓度为2mM；所述脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；所述神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为20ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.2mM；所述TGF-β3的浓度为1ng/mL；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂浓度为3µM；所述激活剂cAMP的浓度为0.5mM；所述DAPT的浓度为10µM；所述细胞机械传导通路激活剂的浓度为10µM。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养3～8天得到多巴胺能神经前体细胞，其中培养液每1～3天更换一次。
如上所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养5天得到多巴胺能神经前体细胞，其中培养液每天更换一次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过在不同的诱导分化阶段使用小分子药物精准调控细胞机械传导信号，从而能够在相对较短的时间里将多能干细胞转化为高纯度的mDA神经前体细胞。这些获得的mDA神经前体细胞还能进一步发展为成熟的mDA神经元。对这些细胞进行鉴定，包括检测其特定的蛋白表达（如通过免疫荧光和流式细胞技术），之后可以将其低温保存，为后续的医学研究所用。此方法不仅操作简便、产出丰富、纯度高，而且整个分化过程仅需15天，并且全程不含异种成分。这为使用患者自身的细胞来大规模生产适用于临床的mDA神经前体细胞提供了一种高效且实用的策略。
附图说明
图1显示了本发明公开的高效诱导多能干细胞分化为mDA神经前体细胞方法的一个实施例的流程图；
图2 显示了人多能干细胞的显微镜照片；
图3显示了采用细胞免疫荧光染色对本发明得到的多巴胺能神经前体细胞进行特征性蛋白表达鉴定；
图4为采用流式细胞术对由实施例1和实施例3得到的多巴胺能神经前体细胞与对照组细胞进行定量比较；
图5显示了通过本发明实施例1和实施例3得到的多巴胺能神经前体细胞与对照组的产率对比；
图6显示了采用细胞免疫荧光染色对由多巴胺能神经前体细胞终末分化得到的成熟多巴胺能神经元进行特征性蛋白表达鉴定。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，并不因此将本发明限制在所述的实施案例范围之中。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明的一种诱导多能干细胞高效分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法中，诱导多能干细胞分化为mDA神经祖细胞的培养液，即mDA神经祖细胞诱导培养液，包括：神经细胞基础培养基（Neurobasal，NB，厂家：LifeTechnologies，货号：21103-049）、N2补充剂（N2 supplement CTS，厂家：Thermo Fisher，货号：A1370701）、不含维生素A的B27补充剂（B27 supplement minus vitamin A，厂家：Thermo Fisher，货号：12587010）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）、TGF-β信号通路抑制剂、BMP信号通路抑制剂、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、细胞机械传导通路抑制剂。所述TGF-β信号通路抑制剂为SB431542；所述BMP信号通路抑制剂为LDN193189；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂为CHIR99021；所述音猬因子通路激活剂为SAG；所述细胞机械传导通路抑制剂为Y27632。
在本发明一较佳实施例中，所述mDA神经祖细胞诱导培养液中，N2补充剂稀释100倍，B27补充剂稀释50倍（N2补充剂，B27补充剂购买来的原液分别是100X和50X），L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM，优选2mM；所述TGF-β信号通路抑制剂的浓度为1～15µM，优选10µM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为100～500nM，优选250nM；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂的浓度为0.5-9µM，分化D0-D3优选0.7µM，分化D4-D9优选7.5µM；所述细胞机械传导信号通路抑制剂的浓度为5-15µM，优选10µM；所述音猬因子通路激活剂可以为SAG，浓度为0.5-2µM，优选1µM；也可以是SHH蛋白，浓度为100～600ng/mL，优选500ng/mL；也可以是Purmorphamine，浓度为1～10µM，优选5µM。
本发明的诱导mDA神经祖细胞分化为mDA神经前体细胞的培养液，即mDA神经前体细胞诱导培养液，包括：神经细胞基础培养基（Neurobasal，NB）、不含维生素A的B27补充剂（B27 supplement minus vitamin A，厂家：Thermo Fisher，货号：12587010）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）、mDA神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP、DAPT、细胞机械传导通路激活剂。所述mDA神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子（BDNF）和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF）；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂为CHIR99021；所述细胞机械传导通路激活剂为PY-60。
在本发明一较佳实施例中，所述mDA神经前体细胞诱导培养液中，B27补充剂稀释50倍（购买来的B27补充剂原液是50×），L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM，优选2mM;所述脑源性细胞系衍生的神经营养因子（BDNF）的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；所述神经胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF）的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.1～1mM，优选0.2mM；所述TGF-β3的浓度为0.5～5ng/mL，优选1ng/mL；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂，可以是CHIR99021，浓度为2～4µM，优选3µM；所述激活剂cAMP的浓度为0.2～2mM，优选0.5mM；所述DAPT浓度为1～15µM，优选10µM；所述细胞机械传导通路激活剂，浓度为1-20µM，优选10µM。
所述mDA神经祖细胞的诱导培养液中的成分共同作用，使多能干细胞转化为mDA神经祖细胞；所述mDA神经前体细胞的诱导培养液中的成分则协助mDA神经祖细胞进一步发展为mDA神经前体细胞。Neurobasal培养基为无血清基础培养液，为神经干细胞和大脑神经元提供所需营养。N2和B27补充剂均为无血清、营养丰富的添加物，用于增强基础培养基。L-谷氨酰胺是细胞的能量供应源，并参与蛋白质和核酸的代谢。所述TGF-β抑制剂选用SB431542（CAS号为301836-41-9）。所述BMP信号通路抑制剂选用LDN193189（CAS号为1062368-24-4），也可以选用RepSox（CAS号为446859-33-2）或DMH-1（CAS号为1206711-16-1）。所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂选用CHIR99021（CAS号为252917-06-9），也可以选用BIO（CAS号为667463-62-9）。所述细胞机械传导信号通路抑制剂选用Y27632（CAS号为146986-50-7），也可以为Blebbistatin（CAS号为856925-71-8）。所述音猬因子通路激活剂选用SAG（CAS号为912545-86-9），也可以选用Purmorphamine（CAS号为483367-10-8）或SHH蛋白（厂家：R&Dsystems，货号：8908-SH）。所述细胞机械传导信号通路激活剂剂选用PY-60（CAS号为2765218-56-0），也可以选用RhoA激活剂溶血磷脂酸（LPA，CAS号为65528-98-5）。
本发明的诱导多能干细胞分化为mDA神经前体细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S1，将含有多能干细胞的上述的mDA神经祖细胞诱导培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到mDA神经祖细胞，该神经祖细胞诱导培养液含有细胞机械传导信号通路抑制剂；
步骤S2，将含有mDA神经祖细胞的上述的mDA神经前体细胞诱导培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到mDA神经前体细胞，该神经前体细胞诱导培养液含有细胞机械传导信号通路激活剂。
具体地，步骤S1，将含有被处理为单细胞状态的多能干细胞的上述的mDA神经祖细胞诱导培养液铺在经过包被处理的细胞培养板上。接着，在35～39℃优选37℃、3～7％优选5％ CO2条件下，持续培养5～12天优选10天，以诱导细胞向mDA神经祖细胞方向分化。在此过程中，培养液每1～3天优选2天更换一次；
步骤S2，将含有被处理为单细胞状态的mDA神经祖细胞的上述的mDA神经前体细胞诱导培养液铺在经过包被处理的细胞培养板上。然后，在35～39℃优选37℃、3～7％优选5％ CO2的环境中，继续培养3～8天优选5天，使其分化为mDA神经前体细胞。在这一阶段，每1～3天优选每1天更换一次培养液。
实施例1：
本实施例展示了一种高效获取高纯度mDA神经前体细胞的方法，如图1所示。分为两个关键步骤。第一步，通过使用mDA神经祖细胞诱导培养基对人多能干细胞进行10天的培养，实现其向中脑神经底板细胞，即mDA神经祖细胞的分化。所述的mDA神经祖细胞诱导培养基主要由以下成分组成：神经基础培养基（NB）、1×N2补充剂、1×不含维生素A的B27补充剂、2mM L-谷氨酰胺、10µM SB431542、250nM LDN193189、CHIR99021（D0～D3，0.7µM；D4～D9，7.5µM）、1µM SAG、10µM Y27632。在不同的时间阶段，mDA神经祖细胞诱导培养基的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经祖细胞诱导培养基添加有：TGF-b信号通路抑制剂SB431542，BMP信号通路抑制剂LDN193189，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，SHH通路激活剂SAG，和细胞机械传导通路抑制剂Y27632。第二步，利用mDA神经前体细胞诱导培养基对mDA神经祖细胞进行5天的培养，促使其向mDA神经前体细胞方向进一步分化。所述的mDA神经前体细胞诱导培养基主要由以下成分组成：NB、不含维生素A的B27补充剂、2mML-glutamine、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM抗坏血酸、1ng/ml TGF-β3、0.5mM cAMP、10µM DAPT、3µM CHIR99021、10µM PY-60。在不同的时间阶段，mDA神经前体细胞诱导培养基的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经前体细胞诱导培养基添加有：神经营养因子（BDNF和GDNF），诱导因子抗坏血酸，cAMP，DAPT和TGF-β3，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，和细胞机械传导通路激活剂PY-60。
本实施例的具体操作步骤如下：
1.人多能干细胞的培养：
使用Essential 8培养基培养人多能干细胞于玻连蛋白（Vitronectin）或层粘连蛋白（Laminin）包被的孔板上，置于37°C，CO2浓度5%，饱和湿度的培养箱内。每4-5天，当多能干细胞生长至70-80%聚合度时，使用EDTA或者中性蛋白酶（Dispase）消化传代一次，传代比例为1：4到1：6之间。所用的多能干细胞应经过严格的多能性验证（表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷小鼠体内形成包含内，中，外三个胚层的畸胎瘤），并定期进行支原体检测。每天更换新鲜的Essential8培养基，并检查细胞生长状态。正常的人多能干细胞生长形态如图2所示。
2.诱导人多能干细胞分化为mDA神经祖细胞：
（1）第0天，当人多能干细胞成长至汇合度70-80%的时候，确认细胞状态良好后，使用Accutase消化细胞。计数后，接种细胞于Vitronectin或Laminin包被的孔板上，细胞密度为40万个细胞/cm2。加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基。
（2）第1天至第3天，每天更换新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基。
（3）第4天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，但是不包括细胞机械传导抑制剂Y27632，同时提高培养基中CHIR99021的浓度。
（4）第6天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第4天使用的培养基相同。
（5）第7天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，但是不包括SB，LDN和SAG。
（6）第9天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第7天使用的培养基相同。
3.诱导mDA神经祖细胞分化为mDA神经前体细胞：
（1）第10天，将前一天加入的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经前体细胞诱导培养基。
（2）第11天，使用Accutase消化细胞30-40分钟，接种于15μg/ml聚-L-鸟氨酸溶液（Polyornithine， PO）+1μg/ml Laminin+2μg/ml纤连蛋白（Fibronectin）包被的孔板上，接种密度为80万个细胞/cm2，使用与第10天相同的培养基培养。
（3）第12天，更换新鲜的mDA神经前体细胞诱导培养基，但是不含有CHIR99021。另外，在培养基中添加10μM DAPT。
（4）第13天至第14天，每天更换新鲜的神经前体细胞诱导培养基。
（5）收集并低温保存mDA神经前体细胞：在第15天，使用Accutase消化细胞20-40分钟，然后通过孔径为40mm的细胞过滤器以获得单细胞。进行细胞计数，离心，以8百万个细胞/毫升的密度重悬于细胞冻存液，然后将细胞分装放入冻存管中。最后，将收集到的细胞保存于低温储存设施中。
实施例2：
本实施例对实施例1得到的mDA神经前体细胞进行免疫荧光染色鉴定。
通过细胞免疫荧光染色技术，我们检测了细胞的表型，并确认所获得的细胞呈现LMX1A+/FOXA2+/EN1+的特征。其中，LMX1A、FOXA2和EN1都是mDA神经前体细胞的独特标志。图3显示了所获细胞的免疫荧光染色结果。由图可知，实施例1得到的细胞确实为mDA神经前体细胞，并且其纯度很高，特征蛋白LMX1A、FOXA2、和EN１的表达百分比都在90%以上。具体的免疫荧光染色步骤如下：
1）细胞固定步骤：
首先，取出已培养完成的12孔板，并去除培养液。接着，沿着12孔板的边缘慢慢加入1×PBS（pH7.4，1mL/孔）进行两次洗涤。之后，沿着板边缘缓慢加入4％的PFA（多聚甲醛，1mL/孔），并在室温下静置15分钟以固定细胞。随后，轻轻吸去PFA，并用1×PBS进行三次洗涤，每次加入1mL/孔。
2）对一抗进行孵化：
首先，向每孔中加入0.5％的Triton X-100（0.5mL/孔），并在37℃下孵育30分钟。接着，移除Triton X-100，并加入2％的BSA（0.5mL/孔）进行封闭处理，再在37℃下孵育30分钟。移除2％的BSA封闭液后，直接在封闭液中加入相应的一抗，并在4℃下孵育过夜。随后，移除一抗，并用1×PBS进行三次洗涤，每次加入1mL/孔。使用的一抗及其相关信息如下：Goat anti-FOXA2，来源于R&D，产品编号#AF2400；Rabbit anti-LMX1A，来源于Millipore，产品编号#ab10533；Mouse anti-EN1，来源于DSHB，产品编号#4G11。
3）进行二抗孵化：
首先，向每孔中加入已用1％BSA稀释至1:200的二抗，并在室温下避光孵育1小时。孵育后，移除二抗并用1×PBS进行三次洗涤，每次加入1mL/孔并持续5分钟。接着，加入已用1×PBS调制至终浓度为1μg/mL的DAPI（0.5mL/孔）进行染色，持续3分钟。染色后，移除DAPI并用1×PBS进行两次洗涤，每次加入1mL/孔。最终，向每孔中加入1×PBS（0.5mL/孔），然后在显微镜下进行观察和摄影。使用的二抗及其相关信息如下：Alexa Fluor 555 DonkeyAnti-rabbit IgG （H+L）Antibody，来源于Thermo Fisher，产品编号#A-31572；AlexaFluor 647 Donkey Anti-Goat IgG（H+L）Antibody，来源于Thermo Fisher，产品编号#A-21447；Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG（H+L）Antibody，来源于Thermo Fisher，产品编号#R37114。
实施例3：
其他来源的mDA神经祖细胞也可以按本发明步骤S2提供的方法高效分化为mDA神经前体细胞。在本实施例中，分两步得到mDA神经前体细胞：第一步，使用一种常见的方法将多能干细胞分化为mDA神经祖细胞，在分化过程中不对细胞机械传导信号通路进行调控；第二步，使用本发明步骤S2提供的方法，即使用小分子药物激活细胞机械传导信号通路，从而将mDA神经祖细胞高效分化为mDA神经前体细胞。
具体步骤如下：
第一步，不对细胞机械传导信号通路进行调控，而是使用普通的mDA神经祖细胞诱导培养基对人多能干细胞进行10天的培养，实现其向中脑神经底板细胞，即mDA神经祖细胞的分化。所述的mDA神经祖细胞诱导培养基主要由以下成分组成：神经基础培养基（NB）、1×N2补充剂、1×不含维生素A的B27补充剂、2mM L-谷氨酰胺、10µM SB431542、250nMLDN193189、CHIR99021（D0～D3，0.7µM；D4～D9，7.5µM）、1µM SAG和10µM Y27632。其中，Y27632仅为提高细胞存活率，在D0加入，需在D1天去除。在D0-D10时间阶段内，mDA神经祖细胞诱导培养基的其他组分按照图1所示调整。mDA神经祖细胞诱导培养基添加有：TGF-β信号通路抑制剂SB431542，BMP信号通路抑制剂LDN193189，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，SHH通路激活剂SAG，和ROCK抑制剂Y27632。
具体的操作步骤如下：
（1）第0天，当人多能干细胞成长至汇合度70-80%的时候，确认细胞状态良好后，使用Accutase消化细胞。计数后，接种细胞于Vitronectin或Laminin包被的孔板上，细胞密度为40万个细胞/cm2。加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基。
（2）第1天至第3天，每天更换新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基。
（3）第4天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基。提高培养基中CHIR99021的浓度。
（4）第6天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第4天使用的培养基相同。
（5）第7天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，但是不包括SB，LDN和SAG。
（6）第9天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第7天使用的培养基相同。
第二步，使用mDA神经前体细胞诱导培养基对mDA神经祖细胞进行5天的培养，并且添加小分子药物以激活细胞机械传导信号通路，继续诱导mDA神经祖细胞高效分化为mDA神经前体细胞。所述的mDA神经前体细胞诱导培养基主要由以下成分组成：NB、不含维生素A的B27补充剂、2mM L-glutamine、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM 抗坏血酸、1ng/mlTGF-β3、0.5mM cAMP、10µM DAPT和3µM CHIR99021。在不同的时间阶段，mDA神经前体细胞诱导培养基的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经前体细胞诱导培养基添加有：神经营养因子（BDNF和GDNF），诱导因子抗坏血酸，cAMP，DAPT，TGF-β3，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，和细胞机械传导通路激活剂PY-60。
具体的操作步骤如下：
（7）第10天，将前一天加入的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经前体细胞诱导培养基（添加有细胞机械传导信号通路激活剂PY-60）。
（8）第11天，使用Accutase消化细胞30-40分钟，接种于15µg/ml聚-L-鸟氨酸溶液（Polyornithine， PO）+1µg/ml Laminin+2µg/ml纤连蛋白（Fibronectin）包被的孔板上，接种密度为80万个细胞/cm2，使用与第10天相同的培养基培养。
（9）第12天，更换新鲜的mDA神经前体细胞诱导培养基，但是不含有CHIR99021。另外，在培养基中添加10µM DAPT。
（10）第13天至第14天，每天更换新鲜的神经前体细胞诱导培养基。
（11）收集并低温保存mDA神经前体细胞：在第15天，使用Accutase消化细胞20-40分钟，然后通过孔径为40µm的细胞过滤器以获得单细胞。进行细胞计数，离心，以8百万个细胞/毫升的密度重悬于细胞冻存液，然后将细胞分装放入冻存管中。最后，将收集到的细胞保存于低温储存设施中。
实施例4：
本实施例对实施例1得到的mDA神经前体细胞进行细胞流式和产率鉴定并与对照组进行定量对比。通过流式细胞技术对细胞表型进行检测，具体的操作步骤遵循标准的流式细胞技术方法。图4显示了所获细胞的流式细胞计数结果。由图可知，实施例1得到的细胞确实为mDA神经前体细胞，并且其纯度最高，特征蛋白LMX1A和FOXA2双阳性的百分比为98.72%，特征蛋白FOXA2和EN１的双阳性的百分比为97.31%；实施例3得到mDA神经前体细胞纯度较高，特征蛋白LMX1A和FOXA2双阳性的百分比为93.5%，特征蛋白FOXA2和EN１的双阳性的百分比为92.8%；对照组的细胞流式结果显示，特征蛋白LMX1A和FOXA2双阳性的百分比为91.2%，特征蛋白FOXA2和EN１的双阳性的百分比为90.81%。使用的抗体信息如下：来自Millipore的Rabbit anti-LMX1A，产品编号#ab10533；来自BD的PE Mouse anti-HumanFoxA2，产品编号#561589；来自Invitrogen的Rabbit anti-EN1，产品编号#PA5-14149；以及来自Abcam的Goat anti-Rabbit IgG H&L（APC）Pre-adsorbed，产品编号#ab130805。
在对照组的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导分化过程中，对细胞的机械传导信号通路不做调控，步骤如下：第一步，通过使用mDA神经祖细胞诱导培养基对人多能干细胞进行10天的培养，实现其向中脑神经底板细胞，即mDA神经祖细胞的分化。所述的mDA神经祖细胞诱导培养基主要由以下成分组成：神经基础培养基（NB）、1×N2补充剂、1×不含维生素A的B27补充剂、2mM L-谷氨酰胺、10µM SB431542、250nM LDN193189、CHIR99021（D0～D3，0.7µM；D4～D9，7.5µM）和1µM SAG。在不同的时间阶段，mDA神经祖细胞诱导培养基的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经祖细胞诱导培养基添加有：TGF-β信号通路抑制剂SB431542，BMP信号通路抑制剂LDN193189，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，和SHH通路激活剂SAG。第二步，利用mDA神经前体细胞诱导培养基对mDA神经祖细胞进行5天的培养，促使其向mDA神经前体细胞方向进一步分化。所述的mDA神经前体细胞诱导培养基主要由以下成分组成：NB、不含维生素A的B27补充剂、2mM L-glutamine、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM 抗坏血酸、1ng/ml TGF-β3、0.5mM cAMP、10µM DAPT和3µMCHIR99021。在不同的时间阶段，mDA神经前体细胞诱导培养基的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经前体细胞诱导培养基添加有：神经营养因子（BDNF和GDNF）、诱导因子抗坏血酸、cAMP、DAPT、TGF-β3、和GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021。具体的操作步骤参考实施例1。
具体的细胞流式步骤如下：
1）细胞固定步骤：
首先，对培养在12孔板中的多巴胺神经前体细胞使用1×DPBS（0.5mL/孔）进行一次润洗。接着，加入0.5～1mL的Accutase消化液，并在37℃下消化3～5分钟，直到细胞分离。之后，使用2～4倍的DPBS来稀释消化液，并以200×g的转速进行离心，随后去除消化液和DPBS。最后，使用1mL的90％冷甲醇对细胞沉淀进行固定。
2）进行一抗孵化：
首先，将细胞样本在室温下以200×g的转速离心2分钟，并去除上层液体。随后，向细胞样本中加入5mL PBS并轻轻摇晃以混合。再次以200×g的转速离心3分钟，移除上层液体，并加入FACS缓冲液，轻轻摇晃使细胞均匀分散，调整细胞浓度至2×107个/mL。接着，向流式细胞仪的试管中分别加入50μL的样本细胞，并向其中加入50μL相应的一抗。轻轻摇晃5次以混合，然后在室温下避光孵育30分钟，期间每10分钟轻轻摇晃一次。孵育结束后，向每个试管中加入2mL FACS缓冲液，并用漩涡混合器混匀。
3）进行二抗孵化：
在室温下，以200×g的转速离心2分钟。移除上层液体，然后向每个试管中加入50μL相应的二抗。轻轻摇晃5次以混合，然后在室温下避光孵育15分钟。孵育结束后，向每个试管中加入300μL FACS缓冲液，并用漩涡混合器混匀。最后，使用流式细胞仪的相应通道来检测各标志物的阳性表达率。
接下来，结合细胞计数仪计数和细胞流式的结果，分别计算并比较实施例1、实施例3和对照组的目的细胞产率。产率为所获目的细胞即多巴胺能神经前体细胞数目与起始人多能干细胞数目的比值。这里的多巴胺能神经前体细胞数以流式细胞术数鉴定的FOXA2和EN１双阳性比率为计算依据。结果如图5所示。由图可知，实施例1的目的细胞产率最高，约为23倍；实施例3的目的细胞产率次之，约为18倍；对照组的目的细胞产率最低，约为15倍。
实施例5：
在本实施例中，诱导实施例1中得到的mDA神经前体细胞终末分化为成熟的mDA神经元并对其进行表型鉴定。
mDA神经前体细胞进一步分化为成熟的mDA神经元：
按照上述实施例1中的方法，诱导分化细胞至第15天。然后，使用Accutase消化细胞，随后将其处理为单细胞悬液。接着，按照实施例1中第11天时的操作，将这些细胞接种到细胞培养板上，并继续培养到第25天。在此期间，每天更换新鲜的神经前体细胞诱导培养基。
免疫荧光染色鉴定：
成熟mDA神经元应能够共同表达TH和FOXA2。为了验证这一点，可使用免疫荧光染色技术对这些神经元进行鉴定。具体的免疫荧光染色的步骤与实施例2中描述的相同。图6显示了所获终末分化细胞的免疫荧光染色结果。由图可知，实施例1得到的细胞确实为mDA神经前体细胞，并且其可以继续终末分化为成熟的多巴胺能神经元。终末分化后成熟多巴胺能神经元的特征蛋白TH和FOXA2的表达百分比都在90%以上。使用的一抗包括：Rabbitanti-TH（来自PelFreez，产品编号#P40101-150）和Goat anti-FOXA2（来自R&D，产品编号#AF2400）。
综上所述，我们的结果表明：采用本发明的诱导培养液和方法，从多能干细胞分化得到的细胞确实表达了mDA神经前体细胞的特异性蛋白，并且这些细胞具有进一步分化为成熟mDA神经元的潜能。这进一步证实了实施例1中得到的细胞确实是高纯度的mDA神经前体细胞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (13)
1.一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤S1，将含有多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经祖细胞；该神经祖细胞培养液含有细胞机械传导通路抑制剂；
步骤S2，将含有多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经前体细胞；该神经前体细胞培养液含有细胞机械传导通路激活剂。
2.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述神经祖细胞培养液包括：神经细胞基础培养基、N2补充剂、不含维生素A的B27补充剂、L-谷氨酰胺、TGF-β信号通路抑制剂、BMP信号通路抑制剂、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、细胞机械传导通路抑制剂；其中，L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM；所述TGF-β信号通路抑制剂的浓度为1～15µM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为100～500nM；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂的浓度为0.5-9µM；所述细胞机械传导信号通路抑制剂的浓度为5-15µM。
3.根据权利要求2所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述TGF-β抑制剂是SB431542或RepSox；所述BMP信号通路抑制剂是LDN193189或DMH-1；所述GSK-3β抑制剂是CHIR99021或BIO；所述细胞机械传导信号通路抑制剂是Rho激酶抑制剂Y27632或肌球蛋白II抑制剂Blebbistatin。
4.根据权利要求2所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，L-谷氨酰胺浓度为2mM；所述TGF-β抑制剂浓度为10μM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为250nM；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.7μM，后提高为7.5µM；所述细胞机械传导信号通路抑制剂浓度为10µM。
5.根据权利要求2所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述音猬因子通路激活剂为浓度为0.5-2µM 的SAG或浓度为100～600ng/mL 的SHH蛋白或浓度为1～10µM 的Purmorphamine。
6.根据权利要求5所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述音猬因子通路激活剂为浓度为1µM 的SAG或浓度为500ng/mL 的SHH蛋白或浓度为5µM的Purmorphamine。
7. 根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养5～12天得到多巴胺能神经祖细胞，其中培养液每1～3天更换一次。
8.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养10天得到多巴胺能神经祖细胞，其中培养液每2天更换一次。
9.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该神经前体细胞培养液包含：神经细胞基础培养基、B27补充剂、L-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP、DAPT、细胞机械传导通路激活剂，其中，L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM；所述多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子；所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10～50ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.1～1mM；所述TGF-β3的浓度为0.5～5ng/mL；所述GSK-3β抑制剂也即WNT信号通路激活剂为浓度为2～4µM 的CHIR99021；所述激活剂cAMP的浓度为0.2～2mM；所述DAPT浓度为1～15µM；所述细胞机械传导通路激活剂浓度为1-20µM。
10.根据权利要求9所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂为CHIR99021或BIO；所述细胞机械传导通路激活剂为Hippo-YAP/Taz信号通路激活剂PY-60或RhoA激活剂溶血磷脂酸。
11.根据权利要求9所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述L-谷氨酰胺浓度为2mM；所述脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；所述神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为20ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.2mM；所述TGF-β3的浓度为1ng/mL；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂浓度为3µM；所述激活剂cAMP的浓度为0.5mM；所述DAPT的浓度为10µM；所述细胞机械传导通路激活剂的浓度为10µM。
12.根据权利要求9所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养3～8天得到多巴胺能神经前体细胞，其中培养液每1～3天更换一次。
13.根据权利要求9所述的一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在包被的细胞培养板上，在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养5天得到多巴胺能神经前体细胞，其中培养液每天更换一次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311783776.0A CN117448271A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311783776.0A CN117448271A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117448271A true CN117448271A (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=89591415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311783776.0A Pending CN117448271A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117448271A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130189775A1 (en) * | 2011-08-05 | 2013-07-25 | Ye Fang | MODULATION OF THE MAMMALIAN RECEPTOR mTOR TO INHIBIT STEM CELL DIFFERENTIATION INTO NEURONS |
| US20160326490A1 (en) * | 2015-05-07 | 2016-11-10 | William J. Freed | Modeling connections between dopaminergic neurons and the cerebral cortex |
| CN109880800A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-06-14 | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 | 一种中脑多巴胺能神经前体细胞及其制备方法和应用 |
| WO2023277135A1 (ja) * | 2021-06-30 | 2023-01-05 | 住友化学株式会社 | 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団 |
| CN115916240A (zh) * | 2020-08-17 | 2023-04-04 | 中国科学院动物研究所 | 一种神经类细胞的扩增培养基及培养方法 |
| CN116286644A (zh) * | 2022-12-28 | 2023-06-23 | 蚌埠医学院 | 一种人诱导性多潜能干细胞诱导分化为多巴胺能神经元祖细胞的方法 |
| CN117050946A (zh) * | 2023-07-20 | 2023-11-14 | 南京恩瑞恺诺生物技术有限公司 | 一种高效分化制备中脑多巴胺能神经元的方法 |
-
2023
- 2023-12-22 CN CN202311783776.0A patent/CN117448271A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130189775A1 (en) * | 2011-08-05 | 2013-07-25 | Ye Fang | MODULATION OF THE MAMMALIAN RECEPTOR mTOR TO INHIBIT STEM CELL DIFFERENTIATION INTO NEURONS |
| US20160326490A1 (en) * | 2015-05-07 | 2016-11-10 | William J. Freed | Modeling connections between dopaminergic neurons and the cerebral cortex |
| CN109880800A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-06-14 | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 | 一种中脑多巴胺能神经前体细胞及其制备方法和应用 |
| CN114606188A (zh) * | 2019-03-06 | 2022-06-10 | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 | 一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用 |
| CN115916240A (zh) * | 2020-08-17 | 2023-04-04 | 中国科学院动物研究所 | 一种神经类细胞的扩增培养基及培养方法 |
| WO2023277135A1 (ja) * | 2021-06-30 | 2023-01-05 | 住友化学株式会社 | 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団 |
| CN116286644A (zh) * | 2022-12-28 | 2023-06-23 | 蚌埠医学院 | 一种人诱导性多潜能干细胞诱导分化为多巴胺能神经元祖细胞的方法 |
| CN117050946A (zh) * | 2023-07-20 | 2023-11-14 | 南京恩瑞恺诺生物技术有限公司 | 一种高效分化制备中脑多巴胺能神经元的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 包笑妹等: "Hippo/YAP 信号通路在神经系统中的作用及 机制研究进展", 《遗传HEREDITAS》, vol. 39, no. 7, 31 July 2017 (2017-07-31), pages 630 - 641 * |
| 谢海航;梁宁;苏中强;吴玉兰;蔡皓然;徐丽萍;龙大宏;: "定向诱导人尿液细胞源性多能干细胞向多巴胺能神经元的分化", 解剖学研究, no. 02, 25 April 2020 (2020-04-25), pages 11 - 19 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104031882B (zh) | 人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法 | |
| US10724000B2 (en) | Small molecule based conversion of somatic cells into neural crest cells | |
| CN113046309B (zh) | 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用 | |
| CN107475200B (zh) | 一种背根神经节源的神经嵴干细胞的分离、培养与分化方法 | |
| JP2007528196A (ja) | 間葉系幹細胞の神経細胞への分化法と神経変性疾患用の神経細胞含有薬剤成分 | |
| CN107429233B (zh) | 神经系统细胞的制造方法 | |
| CN117448271A (zh) | 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 | |
| CN105754943B (zh) | 一种裸鼹鼠海马神经元培养方法 | |
| CN115354029B (zh) | 神经类器官的制备方法和神经类器官 | |
| CN107164325B (zh) | MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒 | |
| CN110302398A (zh) | 一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物、其制备方法及医药用途 | |
| WO2022134031A1 (zh) | 一种光感受器神经元细胞的化学诱导方法 | |
| CA2473749C (en) | Pure populations of astrocyte restricted precursor cells and methods for isolation and use thereof | |
| CN117448270A (zh) | 一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 | |
| Qi et al. | Modeling, applications and challenges of inner ear organoid | |
| AU2003216111A1 (en) | Pure populations of astrocyte restricted precursor cells and methods for isolation and use thereof | |
| CN103031274A (zh) | 小分子化合物tws119作为神经干细胞分化诱导剂的新应用 | |
| CN106520697B (zh) | 一种裸鼹鼠drg神经元培养方法 | |
| KR20080094431A (ko) | 말초 혈액 유래 단핵 세포로부터 신경 전구 세포를 분리,배양 및 분화하는 방법 | |
| US20050142660A1 (en) | Conditioned medium for culturing Schwann cells | |
| CN112608883B (zh) | 一种光感受器神经元细胞的化学诱导方法 | |
| CN112980775B (zh) | 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液 | |
| TW201816114A (zh) | 末梢神經細胞之製造方法 | |
| CN117448272A (zh) | 规模化生产制备神经干细胞及其外泌体的方法 | |
| US7323333B2 (en) | Materials and methods for regulating process formation in cell culture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |