CN117448270A - 一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 - Google Patents

一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含：步骤S1，将含有多能干细胞的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液铺在软质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经祖细胞；步骤S2，将含有中脑多巴胺能神经祖细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液铺在硬质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经前体细胞。本发明通过在不同的诱导分化阶段使用不同硬度培养基底调控细胞机械传导信号，在短时间内产生大批高纯度中脑多巴胺能神经前体细胞，显著缩短分化时间并提高细胞制品纯度和产量。中脑多巴胺能神经前体细胞能够进一步发展为成熟的中脑多巴胺能神经元，可应用于帕金森病的细胞药物。

Description

一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞 的方法
技术领域
本发明属于干细胞生物学和机械力学的学科交叉领域，涉及一种在体外高效诱导人多能干细胞向中脑多巴胺能神经前体细胞定向分化的方法。
背景技术
人类多能干细胞，包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞，是一种拥有自我复制和广泛分化能力的细胞，它们可以转化为身体内几乎所有种类的细胞。这些细胞所具备的独特生物特性和多样的分化能力为其在医学领域赋予了巨大的潜在价值，有望开启一系列创新的治疗策略。例如，通过细胞疗法，人多能干细胞可以被诱导成为各种中脑多巴胺能（mDA）神经前体细胞，如：神经细胞、心脏细胞或胰岛细胞等特定细胞，进而应用于治疗如神经退化性疾病、心脏病或糖尿病等。
举例来说，帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）是全球最普遍的神经退行性疾病之一，影响超过一千万的人群。该疾病的主要病理特点是中脑黑质的A9型多巴胺神经元大量丧失或损伤，从而导致纹状体内多巴胺的减少，进一步产生PD的典型运动障碍，如震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和步态不稳。虽然帕金森病的确切成因尚未明确，但遗传、环境和老化等因素被认为可能与其相关。目前，尽管存在多种治疗PD的方法，如药物治疗、深部脑刺激和物理疗法等，但它们大多只能暂时缓解症状而非治愈疾病。例如，多巴胺药物虽然短期内有效，但长期使用可能引发副作用。深部脑刺激手术的高成本和潜在风险也限制了其应用范围。因此，开发更为有效和安全的治疗策略仍是PD研究的核心目标。
PD的细胞治疗策略主要基于将干细胞诱导为mDA神经前体细胞，接着将这些细胞植入患者大脑的纹状体。这些细胞在植入体内后有潜力进一步发育成熟，替代已经丧失功能或死亡的mDA神经元，从而恢复多巴胺的合成和释放。与传统的治疗方法相比，细胞治疗为恢复患者自身产生多巴胺的机制提供了新的可能性，这可能会减缓或甚至逆转PD的进程。一些初步的临床研究已经表明，使用人胎儿来源的mDA神经元进行移植能够部分改善PD患者的临床症状。在过去的几年中，科学家们已经成功地在实验室环境下将人类多能干细胞诱导为mDA神经元，并在PD患者中进行了移植。但是，这种治疗方法仍面临一些挑战:如何确保获得高质量的mDA神经前体细胞、保证移植细胞的安全性、提高细胞的存活和整合能力等。解决了上述问题，PD的细胞治疗将成为一种更为稳定和可行的治疗选择。
在生物体内，mDA神经元的形成是由中脑神经底板细胞分化而来。在神经管的早期形成中，骨形态发生蛋白（BMP）和音猬因子（SHH）共同决定了细胞在腹背轴的定位和分化；而WNT、维甲酸、成纤维细胞生长因子8和BMP则共同影响细胞在前后轴的定位。借鉴生物体内mDA神经元的发生机制，研究者已经成功地在实验室环境中将人多能干细胞诱导为mDA神经细胞。许多研究都已经探讨了如何在体外环境中诱导人多能干细胞向mDA神经前体细胞方向分化。目前，一个被广泛采用的策略是：首先使用BMP和转化生长因子-β（TGF-β）的抑制剂，结合SHH的激动剂，来推进人多能干细胞向神经底板细胞的方向分化。随后，激活WNT信号，进一步诱导细胞分化为中脑细胞，形成mDA神经祖细胞。当得到mDA神经祖细胞后，再结合各种神经营养因子（例如脑源性和胶质细胞源性神经营养因子）、WNT信号激活剂、诱导因子TGF-β3、抗坏血酸、环腺苷酸和DAPT，进一步推动其向mDA神经前体细胞方向分化。但这种方法在转化效率上仍有局限性，尤其是在体内继续分化后，A9型的mDA神经元的比例仍需提高。因此，生物医药领域急需一种转化效率高的诱导分化方法来获得中脑多巴胺能神经前体细胞以既有效又安全地应用于临床。
发明内容
本发明提供了一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，可以用于中脑多巴胺能神经前体细胞的高效诱导分化, 能迅速产生大批高纯度的mDA神经前体细胞，显著缩短分化时间并提高细胞制品的纯度和产量,本发明采取的技术方案是：
一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含如下步骤：
步骤S1，将含有多能干细胞的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液铺在软质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经祖细胞；
步骤S2，将含有该中脑多巴胺能神经祖细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液铺在硬质细胞培养基底上，定向分化培养得到该中脑多巴胺能神经前体细胞。
进一步地，所述软质细胞培养基底为聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基硅氧烷微柱阵列，等效杨氏模量范围为：0.1~8kPa。
进一步地，所述软质细胞培养基底的等效杨氏模量为：5kPa。
进一步地，所述硬质细胞培养基底为硼硅酸盐玻璃载玻片或铝硅酸盐玻璃载玻片，等效杨氏模量范围为50~90GPa。
进一步地，所述硬质细胞培养基底的等效杨氏模量为：65GPa。
进一步地，所述该中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、N2补充剂、不含维生素A的B27补充剂、浓度为1~5mM的L-谷氨酰胺、浓度为1~15µM的TGF-β信号通路抑制剂、浓度为100~500nM的BMP信号通路抑制剂、浓度为0.5-9µM的GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、浓度为5-15µM的ROCK抑制剂；所述TGF-β信号通路抑制剂、所述BMP信号通路抑制剂和所述音猬因子通路激活剂在分化第1天至第7天添加到培养液中；所述ROCK抑制剂只在分化第1天添加到培养液中。
进一步地，所述TGF-β抑制剂是SB431542或RepSox；所述BMP信号通路抑制剂是LDN193189或DMH-1；所述GSK-3β抑制剂是CHIR99021或BIO；所述ROCK抑制剂是Y27632或Blebbistatin。
进一步地，所述L-谷氨酰胺浓度为2mM；所述TGF-β抑制剂浓度为10μM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为250nM；所述GSK-3β抑制剂分化第1天至第4天的浓度为0.7μM，分化第5天至第10天的浓度为7.5µM；所述ROCK抑制剂浓度为10µM。
进一步地，该音猬因子通路激活剂为浓度为0.5-2µM 的SAG或浓度为100~600ng/mL 的SHH蛋白或浓度为1~10µM 的Purmorphamine。
进一步地，该音猬因子通路激活剂为浓度为1µM 的SAG或浓度为500ng/mL 的SHH蛋白或浓度为5µM的Purmorphamine。
进一步地，该中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、不含维生素A 的B27补充剂、浓度为1~5mM的L-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP和DAPT；
所述多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子；所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10～50ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.1~1mM；所述TGF-β3的浓度为0.5~5ng/mL；所述GSK-3β抑制剂，也即WNT信号通路激活剂为CHIR99021，浓度为2~4µM；所述激活剂cAMP的浓度为0.2~2mM；所述DAPT浓度为1~15µM；所述GSK-3β抑制剂也即WNT信号通路激活剂CHIR99021在分化第11天至第12天添加到培养液中；所述DAPT在分化第13天至第15天添加到培养液中。
进一步地，该L-谷氨酰胺浓度为2mM；该脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；该神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为20ng/mL；该L-抗坏血酸的浓度为0.2mM；该TGF-β3的浓度为1ng/mL；该GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂浓度为3µM；该激活剂cAMP的浓度为0.5mM；该DAPT的浓度为10µM。
进一步地，在该步骤S1中，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养5～12天得到多巴胺能神经祖细胞，其中中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液每1～3天更换一次；
在该步骤S2中，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养3～8天得到多巴胺能神经前体细胞，其中，中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液每1～3天更换一次。
进一步地，在该步骤S1中，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养10天得到多巴胺能神经祖细胞，其中中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液每2天更换一次；
在该步骤S2中，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养5天得到多巴胺能神经前体细胞，其中，中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液每天更换一次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：为了迅速获得纯度高、数量众多的中脑多巴胺能神经前体细胞，本发明提供了与现有技术不同的策略，即结合生化因子诱导与细胞机械传导的调控。在分化的不同阶段，采用了两种不同硬度的培养基底来调整细胞的机械信号传递，从而缩短分化时间并提高细胞的纯度和产量。在诱导分化早期，选择硬度较低的培养基底以抑制细胞机械传导信号通路的活性；而在诱导分化后期，选择硬度较高的培养基底以激活细胞机械传导信号通路。这种诱导分化方法具有多种优势，如短时间内获得高纯度、高产量的细胞，且整个过程中不涉及异种成分。因此，本发明非常适用于制备临床应用级别的细胞，特别是在帕金森病治疗中的应用。
通过在不同的诱导分化阶段使用不同硬度细胞培养基底调控细胞机械传导信号，精细模拟体内多巴胺能神经细胞发育过程中的生物力学环境，从而能够在相对较短的时间里将多能干细胞转化为高纯度的mDA神经前体细胞。这些获得的mDA神经前体细胞还能进一步发展为成熟的mDA神经元。对这些细胞进行鉴定，包括检测其特定的蛋白表达（如通过免疫荧光和流式细胞技术），之后可以将其低温保存，为后续的医学研究或临床使用。本发明方法不仅操作简便、产出丰富、纯度高，而且整个分化过程仅需15天，并且全程不含异种成分,非常适合于使用患者自身的细胞来大规模生产适用于临床的mDA神经前体细胞。
附图说明
图1显示了本发明公开的高效诱导多能干细胞分化为mDA神经前体细胞技术的一个实施例的流程图；
图2 显示了人多能干细胞的显微照片；
图3显示了采用细胞免疫荧光染色对本发明得到的多巴胺能神经前体细胞进行特征性蛋白表达鉴定；
图4显示了采用流式细胞术对本发明得到的多巴胺能神经前体细胞进行特征性蛋白表达鉴定；
图5 显示了本发明得到的多巴胺能神经前体细胞的产率；
图6显示了采用细胞免疫荧光染色对由多巴胺能神经前体细胞终末分化得到的成熟多巴胺能神经元进行特征性蛋白表达鉴定。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
下面结合附图和实施案例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施案例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法可以用来诱导多能干细胞为各种中脑多巴胺能神经前体细胞，例如先诱导分化为mDA神经祖细胞，再诱导分化为多巴胺能神经前体细胞。多巴胺能神经前体细胞可用于帕金森的药物治疗。
以下以诱导多能干细胞为多巴胺能神经前体细胞为例，对本发明做出解释说明。
本发明的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含如下步骤：
步骤S1，将含有多能干细胞的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液铺在软质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经祖细胞；
步骤S2，将含有步骤S1所得到的中脑多巴胺能神经祖细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液铺在硬质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经前体细胞。
软质细胞培养基底为聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基硅氧烷微柱阵列，等效杨氏模量范围为：0.1~8kPa。
在一个最佳实施例中，软质细胞培养基底的等效杨氏模量为：5kPa。
硬质细胞培养基底为硼硅酸盐玻璃载玻片或铝硅酸盐玻璃载玻片，等效杨氏模量范围为50~90GPa。
在一个最佳实施例中，硬质细胞培养基底的等效杨氏模量为：65GPa。
中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、N2补充剂、不含维生素A的B27补充剂、浓度为1~5mM的L-谷氨酰胺、浓度为1~15µM的TGF-β信号通路抑制剂、浓度为100~500nM的BMP信号通路抑制剂、浓度为0.5-9µM的GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、浓度为5-15µM的ROCK抑制剂。
在一个最佳实施例中，L-谷氨酰胺浓度为2mM；TGF-β抑制剂浓度为10μM；BMP信号通路抑制剂的浓度为250nM；GSK-3β抑制剂浓度为0.7μM，后提高为7.5µM；ROCK抑制剂浓度为10µM。后提高为指的是过一定时间后，例如在诱导分化第四天。
TGF-β抑制剂可以是SB431542，也可以是RepSox；BMP信号通路抑制剂可以是LDN193189，也可以是DMH-1；GSK-3β抑制剂可以是CHIR99021，也可以是BIO；ROCK抑制剂可以是Y27632，也可以是Blebbistatin。
音猬因子通路激活剂为浓度为0.5-2µM 的SAG或浓度为100~600ng/mL 的SHH蛋白或浓度为1~10µM 的Purmorphamine。
在一个最佳实施例中，音猬因子通路激活剂为浓度为1µM 的SAG或浓度为500ng/mL 的SHH蛋白或浓度为5µM的Purmorphamine。
中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、不含维生素A 的B27补充剂、浓度为1~5mM的L-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP、DAPT。
多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子；脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10～50ng/mL；L-抗坏血酸的浓度为0.1~1mM；TGF-β3的浓度为0.5~5ng/mL；GSK-3β抑制剂，也即WNT信号通路激活剂为CHIR99021，浓度为2~4µM；激活剂cAMP的浓度为0.2~2mM；DAPT浓度为1~15µM。
在一个最佳实施例中，L-谷氨酰胺浓度为2mM；脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为20ng/mL；L-抗坏血酸的浓度为0.2mM；TGF-β3的浓度为1ng/mL；GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂浓度为3µM；激活剂cAMP的浓度为0.5mM；DAPT的浓度为10µM。
在步骤S1中，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养5～12天得到多巴胺能神经祖细胞，其中中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液每1～3天更换一次；
在步骤S2中，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞在35～39℃、3～7％CO2条件下定向分化培养3～8天得到多巴胺能神经前体细胞，其中，中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液每1～3天更换一次。
在一个最佳实施例中，在步骤S1中，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养10天得到多巴胺能神经祖细胞，其中中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液每2天更换一次；
在步骤S2中，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养5天得到多巴胺能神经前体细胞，其中，中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液每天更换一次。
在本发明其中一个实施例中，mDA神经祖细胞诱导培养液成分包括：神经细胞基础培养基（Neurobasal，NB，厂家：LifeTechnologies，货号：21103-049）、N2补充剂（N2supplement CTS，厂家：Thermo Fisher，货号：A1370701）、不含维生素A的B27补充剂（B27supplement minus vitamin A，厂家：Thermo Fisher，货号：12587010）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）、TGF-β信号通路抑制剂、BMP信号通路抑制剂、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、ROCK抑制剂（Ri）。所述TGF-β信号通路抑制剂为SB431542；所述BMP信号通路抑制剂为LDN193189；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂为CHIR99021；所述音猬因子通路激活剂为SAG；所述ROCK抑制剂（Ri）为Y27632。软质培养基底可以为聚丙烯酰胺凝胶，也可以为聚二甲基硅氧烷微珠阵列。
在本发明一较佳实施例中，在mDA神经祖细胞诱导培养液中，N2补充剂稀释100倍，B27补充剂稀释50倍（N2补充剂，B27补充剂购买来的原液分别是100X和50X），L-谷氨酰胺的浓度为1~5mM，优选2mM；所述TGF-β信号通路抑制剂的浓度为1~15µM，优选10µM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为100~500nM，优选250nM；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂的浓度为0.5-9µM，分化D0-D3优选0.7µM，分化D4-D9优选7.5µM；所述ROCK抑制剂的浓度为5-15µM，优选10µM；所述音猬因子通路激活剂可以为SAG，浓度为0.5-2µM，优选1µM；也可以是SHH蛋白，浓度为100~600ng/mL，优选500ng/mL；也可以是Purmorphamine，浓度为1~10µM，优选5µM。软质细胞培养基底可以为聚丙烯酰胺凝胶，也可以为聚二甲基硅氧烷微珠阵列，等效杨氏模量为0.1~8kPa，优选5kPa。
在本发明一较佳实施例中，诱导mDA神经祖细胞分化为mDA神经前体细胞的培养工艺（包括培养液和硬质细胞培养基底）中，mDA神经前体细胞诱导培养液成分包括：神经细胞基础培养基（Neurobasal，NB）、不含维生素A的B27补充剂（B27 supplement minus vitaminA，厂家：Thermo Fisher，货号：12587010）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）、mDA神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP、DAPT。所述mDA神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子（BDNF）和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF）；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂为CHIR99021。硬质细胞培养基底可以为硼硅酸盐玻璃，也可以为铝硅酸盐玻璃。
在本发明一较佳实施例中，本发明的工艺（包括培养液和硬质细胞培养基底）中：在mDA神经前体细胞诱导培养液中，B27补充剂稀释50倍（购买来的B27补充剂原液是50×），L-谷氨酰胺的浓度为1~5mM，优选2mM;所述脑源性细胞系衍生的神经营养因子（BDNF）的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；所述神经胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF）的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.1~1mM，优选0.2mM；所述TGF-β3的浓度为0.5~5ng/mL，优选1ng/mL；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂，可以是CHIR99021，浓度为2~4µM，优选3µM；所述激活剂cAMP的浓度为0.2~2mM，优选0.5mM；所述DAPT浓度为1~15µM，优选10µM。硬质细胞培养基底可以为硼硅酸盐玻璃，也可以为铝硅酸盐玻璃，等效杨氏模量为50~90GPa，优选65GPa。
mDA神经祖细胞的诱导培养液和软质细胞培养基底共同作用，使多能干细胞转化为mDA神经祖细胞；mDA神经前体细胞的诱导培养液和硬质细胞培养基底则协助mDA神经祖细胞进一步发展为mDA神经前体细胞。
Neurobasal培养基为无血清基础培养液，为神经干细胞和大脑神经元提供所需营养。N2和B27补充剂均为无血清、营养丰富的添加物，用于增强基础培养基。L-谷氨酰胺是细胞的能量供应源，并参与蛋白质和核酸的代谢。TGF-β抑制剂选用SB431542（CAS号为301836-41-9）。BMP信号通路抑制剂选用LDN193189（CAS号为1062368-24-4），也可以选用RepSox（CAS号为446859-33-2）或DMH-1（CAS号为1206711-16-1）。GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂选用CHIR99021（CAS号为252917-06-9），也可以选用BIO（CAS号为667463-62-9）。ROCK抑制剂选用Y27632（CAS号为146986-50-7），也可以为Blebbistatin（CAS号为856925-71-8）。音猬因子通路激活剂选用SAG（CAS号为912545-86-9），也可以选用Purmorphamine（CAS号为483367-10-8）或SHH蛋白（厂家：R&D systems，货号：8908-SH）。
在本发明其中一个实施例中，步骤S1，将含有被处理为单细胞状态的多能干细胞的mDA神经祖细胞诱导培养液铺在经过包被处理的软质细胞培养基底上。培养基底的等效硬度为0.1~8kPa优选5kPa。接着，在35～39℃优选37℃、3～7％优选5％ CO2条件下，持续培养5～12天优选10天，以诱导细胞向mDA神经祖细胞方向分化。在此过程中，培养液每1～3天优选2天更换一次；
步骤S2，将含有被处理为单细胞状态的mDA神经祖细胞的上述的mDA神经前体细胞诱导培养液铺在经过包被处理的硬质细胞培养基底上。培养基底的等效硬度为50~90GPa优选65GPa。然后，在35～39℃优选37℃、3～7％优选5％ CO2的环境中，继续培养3～8天优选5天，使其分化为mDA神经前体细胞。在这一阶段，每1～3天优选每1天更换一次培养液。
本发明结合了生化因子诱导与细胞机械传导的调控。在分化的不同阶段，采用了两种不同硬度的培养基底来调整细胞的机械信号传递，从而缩短分化时间并提高细胞的纯度和产量。在诱导分化早期，选择硬度较低的培养基底以抑制细胞机械传导信号通路的活性；而在诱导分化后期，选择硬度较高的培养基底以激活细胞机械传导信号通路。这种诱导分化方法具有多种优势，如短时间内获得高纯度、高产量的细胞，且整个过程中不涉及异种成分。所制备出的mDA神经前体细胞能够进一步发展为成熟的mDA神经元，因此，本发明非常适用于制备临床应用级别的细胞，特别是在帕金森病治疗中的应用。
实施例1：
本实施例展示了一种高效获取高纯度mDA神经前体细胞的工艺包括培养液和不同硬度的培养基底，如图1所示。该方法分为两个关键步骤。第一步，通过使用mDA神经祖细胞诱导培养液在软质细胞培养基底上对人多能干细胞进行10天的培养，实现其向中脑神经底板细胞，即mDA神经祖细胞的分化。所述的mDA神经祖细胞诱导培养液主要由以下成分组成：神经基础培养基（NB）、1×N2补充剂、1×不含维生素A的B27补充剂、2mM L-谷氨酰胺、10µMSB431542、250nM LDN193189、CHIR99021（D0~D3，0.7µM；D4~D9，7.5µM）、1µM SAG、10µMY27632。在不同的时间阶段，mDA神经祖细胞诱导培养液的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经祖细胞诱导培养液添加有：TGF-b信号通路抑制剂SB431542，BMP信号通路抑制剂LDN193189，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，SHH通路激活剂SAG，和ROCK抑制剂（Ri）Y27632。所述的软质细胞培养基底是等效杨氏模量为5kP的聚丙烯酰胺凝胶。第二步，利用mDA神经前体细胞诱导培养液在硬质细胞培养基底上对mDA神经祖细胞进行5天的培养，促使其向mDA神经前体细胞方向进一步分化。所述的mDA神经前体细胞诱导培养液主要由以下成分组成：NB、不含维生素A的B27补充剂、2mM L-glutamine、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM抗坏血酸、1ng/ml TGF-β3、0.5mM cAMP、10µM DAPT、3µM CHIR99021。在不同的时间阶段，mDA神经前体细胞诱导培养液的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经前体细胞诱导培养液添加有：神经营养因子（BDNF和GDNF），诱导因子抗坏血酸，cAMP，DAPT和TGF-β3，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021。所述的硬质细胞培养基底是杨氏模量为65GP的硼硅酸盐玻璃。
本实施例的具体操作步骤如下：
1、人多能干细胞的培养：
使用Essential 8培养基培养人多能干细胞于玻连蛋白（Vitronectin，厂家：Thermo Fisher，货号：A14700）或层粘连蛋白（Laminin, 厂家：Biolamina，货号：LN111）包被的孔板上，置于37°C，CO2浓度5%，饱和湿度的培养箱内。每4-5天，当多能干细胞生长至70-80%聚合度时，使用EDTA或者中性蛋白酶（Dispase）消化传代一次，传代比例为1：4到1：6之间。所用的多能干细胞应经过严格的多能性验证（表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷小鼠体内形成包含内，中，外三个胚层的畸胎瘤），并定期进行支原体检测。每天更换新鲜的Essential8培养基，并检查细胞的形态和生长状态。正常人多能干细胞的形态如图2所示。
2、制备软质细胞培养基底：杨氏模量为5kPa的聚丙烯酰胺凝胶
（1）将盖玻片（No.1，45 mm×50 mm；Fisher）在本生灯火焰中过火，然后浸泡在0.1N NaOH中，风干。
（2）将少量3-氨基丙基三甲氧基硅烷（Sigma）均匀地铺在玻璃表面上。4~5 分钟后，用蒸馏水清洗并浸泡盖玻片。然后将盖玻片浸入0.5%戊二醛 (Polysciences)的PBS溶液中30分钟。然后用蒸馏水彻底清洗盖玻片并风干。
（3）然后将25微升丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物（含有10%丙烯酰胺和浓度为0.025%的交联剂双丙烯酰胺）放在盖玻片上，并用一小块圆形盖玻片（1号，22毫米直径；Fisher）覆盖。
（4）聚合后，取下圆形盖玻片，用200mM HEPES（pH 8.5）冲洗凝胶。然后将凝胶吸干，并将200μL Sulfo-SANPAH（50mM磺基琥珀酰亚胺基 6（4‘-叠氮基-2’-硝基苯基) +200mM的pH 8.5的HEPES缓冲液）移液至凝胶表面。然后，将盖玻片室暴露在无菌罩紫外线下5分钟，盖玻片距离紫外线光影6英寸。然后除去Sulfo-SANPAH溶液，并重复光活化过程。
（5）光活化后，将聚丙烯酰胺片在200mM HEPES（pH 8.5）中洗涤数次。然后，将Vitronectin或Laminin溶液加到聚丙烯酰胺凝胶上，并在4°C 下孵育过夜。用200mM HEPES洗涤后，将凝胶保存在4°C。为了形成细胞培养室，用真空油脂（康宁）将盖玻片固定在70×50×6毫米有机玻璃板上，该板的中心有一个直径为35毫米的环形孔。在铺板细胞之前，将凝胶浸泡在37°C培养基中30~45分钟。
3、诱导人多能干细胞分化为mDA神经祖细胞
（6）第0天，当人多能干细胞成长至汇合度70-80%的时候，确认细胞状态良好后，使用Accutase消化细胞。计数后，接种细胞于Vitronectin或Laminin包被的杨氏模量为5kPa的聚丙烯酰胺凝胶上，细胞密度为40万个细胞/cm2。加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基。
（7）第1天至第3天，每天更换新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基。
（8）第4天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，但是不包括细胞机械传导抑制剂Y27632，同时提高培养基中CHIR99021的浓度。
（9）第6天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第4天使用的培养基相同。
（10）第7天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，但是不包括SB，LDN和SAG。
（11）第9天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第7天使用的培养基相同。
4、诱导mDA神经祖细胞分化为mDA神经前体细胞
（1）第10天，将前一天加入的培养基吸出，加入新鲜的mDA神经前体细胞诱导培养基。
（2）第11天，使用Accutase消化细胞30-40分钟，接种于15µg/ml聚-L-鸟氨酸溶液（Polyornithine， PO）+1µg/ml Laminin+2µg/ml纤连蛋白（Fibronectin）包被的杨氏模量为65GPa的硼硅酸盐玻璃上，接种密度为80万个细胞/cm2，使用与第10天相同的培养基培养。
（3）第12天，更换新鲜的mDA神经前体细胞诱导培养基，但是不含有CHIR99021。另外，在培养基中添加10µM DAPT。
（4）第13天至第14天，每天更换新鲜的神经前体细胞诱导培养基。
（5）收集并低温保存mDA神经前体细胞：在第15天，使用Accutase消化细胞20-40分钟，然后通过孔径为40µm的细胞过滤器以获得单细胞。进行细胞计数，离心，以8百万个细胞/毫升的密度重悬于细胞冻存液，然后将细胞分装放入冻存管中。最后，将收集到的细胞保存于低温储存设施中。
实施例2：
本实施例对实施例1得到的mDA神经前体细胞进行免疫荧光染色鉴定。
通过细胞免疫荧光染色技术，我们检测了细胞的表型，并确认所获得的细胞呈现LMX1A+/FOXA2+/EN1+的特征。其中，LMX1A、FOXA2和EN1都是mDA神经前体细胞的独特标志。图3显示了所获细胞的免疫荧光染色结果。由图可知，实施例1得到的细胞确实为mDA神经前体细胞，并且其纯度很高，特征蛋白LMX1A、FOXA2、和EN１的表达百分比都在90%以上。具体的免疫荧光染色步骤如下：
1）细胞固定步骤：
首先，取出已培养完成的12孔板，并去除培养液。接着，沿着12孔板的边缘慢慢加入1×PBS（pH7.4，1mL/孔）进行两次洗涤。之后，沿着板边缘缓慢加入4％的PFA（多聚甲醛，1mL/孔），并在室温下静置15分钟以固定细胞。随后，轻轻吸去PFA，并用1×PBS进行三次洗涤，每次加入1mL/孔。
2）对一抗进行孵化：
首先，向每孔中加入0.5％的Triton X-100（0.5mL/孔），并在37℃下孵育30分钟。接着，移除Triton X-100，并加入2％的BSA（0.5mL/孔）进行封闭处理，再在37℃下孵育30分钟。移除2％的BSA封闭液后，直接在封闭液中加入相应的一抗，并在4℃下孵育过夜。随后，移除一抗，并用1×PBS进行三次洗涤，每次加入1mL/孔。使用的一抗及其相关信息如下：Goat anti-FOXA2，来源于R&D，产品编号#AF2400；Rabbit anti-LMX1A，来源于Millipore，产品编号#ab10533；Mouse anti-EN1，来源于DSHB，产品编号#4G11。
3）进行二抗孵化：
首先，向每孔中加入已用1％BSA稀释至1:200的二抗，并在室温下避光孵育1小时。孵育后，移除二抗并用1×PBS进行三次洗涤，每次加入1mL/孔并持续5分钟。接着，加入已用1×PBS调制至终浓度为1μg/mL的DAPI（0.5mL/孔）进行染色，持续3分钟。染色后，移除DAPI并用1×PBS进行两次洗涤，每次加入1mL/孔。最终，向每孔中加入1×PBS（0.5mL/孔），然后在显微镜下进行观察和摄影。使用的二抗及其相关信息如下：Alexa Fluor 555 DonkeyAnti-rabbit IgG （H+L）Antibody，来源于Thermo Fisher，产品编号#A-31572；AlexaFluor 647 Donkey Anti-Goat IgG（H+L）Antibody，来源于Thermo Fisher，产品编号#A-21447；Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG（H+L）Antibody，来源于Thermo Fisher，产品编号#R37114。
实施例3：
本实施例对由实施例1得到的mDA神经前体细胞进行细胞流式鉴定并计算产率
通过流式细胞技术对细胞表型进行检测，具体的操作步骤遵循标准的流式细胞技术方法。图4显示了所获细胞的流式细胞计数结果。由图可知，实施例1得到的细胞确实为mDA神经前体细胞，并且其纯度很高，特征蛋白LMX1A和FOXA2双阳性的百分比为97.7%，特征蛋白FOXA2和EN１的双阳性的百分比为96.81%；对照组的细胞流式结果显示，特征蛋白LMX1A和FOXA2双阳性的百分比为91.76%，特征蛋白FOXA2和EN1双阳性的百分比为90.57%。使用的抗体信息如下：来自Millipore的Rabbit anti-LMX1A，产品编号#ab10533；来自BD的PEMouse anti-Human FoxA2，产品编号#561589；来自Invitrogen的Rabbit anti-EN1，产品编号#PA5-14149；以及来自Abcam的Goat anti-Rabbit IgG H&L（APC）Pre-adsorbed，产品编号#ab130805。
在对照组中脑多巴胺能神经前体细胞诱导分化过程中，对细胞的机械传导信号通路不做调控，使用普通培养材料（Polystyrene, 聚苯乙烯塑料）作为培养基底，步骤如下：第一步，通过使用mDA神经祖细胞诱导培养液对人多能干细胞进行10天的培养，实现其向中脑神经底板细胞，即mDA神经祖细胞的分化。所述的mDA神经祖细胞诱导培养液主要由以下成分组成：神经基础培养基（NB）、1×N2补充剂、1×不含维生素A的B27补充剂、2mM L-谷氨酰胺、10µM SB431542、250nM LDN193189、CHIR99021（D0~D3，0.7µM；D4~D9，7.5µM）、1µMSAG、10µM Y27632。在不同的时间阶段，mDA神经祖细胞诱导培养液的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经祖细胞诱导培养液添加有：TGF-β信号通路抑制剂SB431542，BMP信号通路抑制剂LDN193189，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，SHH通路激活剂SAG，和ROCK抑制剂（Ri）Y27632。第二步，利用mDA神经前体细胞诱导培养液对mDA神经祖细胞进行5天的培养，促使其向mDA神经前体细胞方向进一步分化。所述的mDA神经前体细胞诱导培养液主要由以下成分组成：NB、不含维生素A的B27补充剂、2mM L-glutamine、20ng/mlBDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM 抗坏血酸、1ng/ml TGF-β3、0.5mM cAMP、10µM DAPT、3µMCHIR99021。在不同的时间阶段，mDA神经前体细胞诱导培养液的具体组分需要按照图1所示调整。mDA神经前体细胞诱导培养液添加有：神经营养因子（BDNF和GDNF），诱导因子抗坏血酸，cAMP，DAPT和TGF-β3，GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021。具体的操作步骤参看实施例1。
具体的细胞流式术步骤如下：
1）细胞固定步骤：
首先，对培养在12孔板中的多巴胺神经前体细胞使用1×DPBS（0.5mL/孔）进行一次润洗。接着，加入0.5～1mL的Accutase消化液，并在37℃下消化3～5分钟，直到细胞分离。之后，使用2～4倍的DPBS来稀释消化液，并以200×g的转速进行离心，随后去除消化液和DPBS。最后，使用1mL的90％冷甲醇对细胞沉淀进行固定。
2）进行一抗孵化：
首先，将细胞样本在室温下以200×g的转速离心2分钟，并去除上层液体。随后，向细胞样本中加入5mL PBS并轻轻摇晃以混合。再次以200×g的转速离心3分钟，移除上层液体，并加入FACS缓冲液，轻轻摇晃使细胞均匀分散，调整细胞浓度至2×107个/mL。接着，向流式细胞仪的试管中分别加入50μL的样本细胞，并向其中加入50μL相应的一抗。轻轻摇晃5次以混合，然后在室温下避光孵育30分钟，期间每10分钟轻轻摇晃一次。孵育结束后，向每个试管中加入2mL FACS缓冲液，并用漩涡混合器混匀。
3）进行二抗孵化：
在室温下，以200×g的转速离心2分钟。移除上层液体，然后向每个试管中加入50μL相应的二抗。轻轻摇晃5次以混合，然后在室温下避光孵育15分钟。孵育结束后，向每个试管中加入300μL FACS缓冲液，并用漩涡混合器混匀。最后，使用流式细胞仪的相应通道来检测各标志物的阳性表达率。
接下来，结合细胞计数仪计数和细胞流式的结果，分别计算并比较实施例1中和对照组中的目的细胞产率。产率即为所获目的细胞即多巴胺能神经前体细胞数目与起始人多能干细胞数的比值。这里的多巴胺能神经前体细胞数以流式细胞术数鉴定的FOXA2和EN１双阳性比率为计算依据。结果如图5所示。
实施例4：
在本实施例中，诱导实施例1中得到的mDA神经前体细胞终末分化为成熟的mDA神经元并对其进行表型鉴定。
（1）mDA神经前体细胞进一步分化为成熟的mDA神经元：
按照上述实施例1中的方法，诱导分化细胞至第15天。然后，使用Accutase消化细胞，随后将其处理为单细胞悬液。接着，按照实施例1中第11天时的操作，将这些细胞接种到细胞培养板上，并继续培养到第25天。在此期间，每天更换新鲜的神经前体细胞诱导培养基。
（2）免疫荧光染色鉴定：
成熟mDA神经元应能够共同表达TH和FOAX2。为了验证这一点，可使用免疫荧光染色技术对这些神经元进行鉴定。对照组为人多能干细胞，以及mDA神经前体细胞。具体的免疫荧光染色的步骤与实施例2中描述的相同。图6显示了所获终末分化细胞的免疫荧光染色结果。由图可知，实施例1得到的细胞确实为mDA神经前体细胞，并且其可以继续终末分化为成熟的多巴胺能神经元。终末分化后成熟多巴胺能神经元的特征蛋白TH和FOXA2的表达百分比都在90%以上。使用的一抗包括：Rabbit anti-TH（来自PelFreez，产品编号#P40101-150）和Goat anti-FOXA2（来自R&D，产品编号#AF2400）。
综上所述，我们的结果表明：采用本发明的诱导培养液和方法，从多能干细胞分化得到的细胞确实表达了mDA神经前体细胞的特异性蛋白，并且这些细胞具有进一步分化为成熟mDA神经元的潜能。这进一步证实了实施例1中得到的细胞确实是高纯度的mDA神经前体细胞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (14)

1.一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤S1，将含有多能干细胞的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液铺在软质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经祖细胞；
步骤S2，将含有该中脑多巴胺能神经祖细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液铺在硬质细胞培养基底上，定向分化培养得到该中脑多巴胺能神经前体细胞。
2.如权利要求1的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述软质细胞培养基底为聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基硅氧烷微柱阵列，等效杨氏模量范围为：0.1~8kPa。
3.如权利要求2的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述软质细胞培养基底的等效杨氏模量为：5kPa。
4.如权利要求1的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述硬质细胞培养基底为硼硅酸盐玻璃载玻片或铝硅酸盐玻璃载玻片，等效杨氏模量范围为50~90GPa。
5.如权利要求4所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述硬质细胞培养基底的等效杨氏模量为：65GPa。
6.如权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述该中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、N2补充剂、不含维生素A的B27补充剂、浓度为1~5mM的L-谷氨酰胺、浓度为1~15µM的TGF-β信号通路抑制剂、浓度为100~500nM的BMP信号通路抑制剂、浓度为0.5-9µM的GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、浓度为5-15µM的ROCK抑制剂；所述TGF-β信号通路抑制剂、所述BMP信号通路抑制剂和所述音猬因子通路激活剂在分化第1天至第7天添加到培养液中；所述ROCK抑制剂只在分化第1天添加到培养液中。
7.根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述TGF-β抑制剂是SB431542或RepSox；所述BMP信号通路抑制剂是LDN193189或DMH-1；所述GSK-3β抑制剂是CHIR99021或BIO；所述ROCK抑制剂是Y27632或Blebbistatin。
8.根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述L-谷氨酰胺浓度为2mM；所述TGF-β抑制剂浓度为10μM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为250nM；所述GSK-3β抑制剂分化第1天至第4天的浓度为0.7μM，分化第5天至第10天的浓度为7.5µM；所述ROCK抑制剂浓度为10µM。
9. 根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该音猬因子通路激活剂为浓度为0.5-2µM 的SAG或浓度为100~600ng/mL 的SHH蛋白或浓度为1~10µM的Purmorphamine。
10.根据权利要求9所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该音猬因子通路激活剂为浓度为1µM 的SAG或浓度为500ng/mL 的SHH蛋白或浓度为5µM的Purmorphamine。
11.根据权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、不含维生素A 的B27补充剂、浓度为1~5mM的L-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP和DAPT；
所述多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子；所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10～50ng/mL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.1~1mM；所述TGF-β3的浓度为0.5~5ng/mL；所述GSK-3β抑制剂，也即WNT信号通路激活剂为CHIR99021，浓度为2~4µM；所述激活剂cAMP的浓度为0.2~2mM；所述DAPT浓度为1~15µM；所述GSK-3β抑制剂也即WNT信号通路激活剂CHIR99021在分化第11天至第12天添加到培养液中；所述DAPT在分化第13天至第15天添加到培养液中。
12.根据权利要求11所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该L-谷氨酰胺浓度为2mM；该脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；该神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为20ng/mL；该L-抗坏血酸的浓度为0.2mM；该TGF-β3的浓度为1ng/mL；该GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂浓度为3µM；该激活剂cAMP的浓度为0.5mM；该DAPT的浓度为10µM。
13.根据权利要求1至12任意一项所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，
在该步骤S1中，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养5～12天得到多巴胺能神经祖细胞，其中中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液每1～3天更换一次；
在该步骤S2中，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞在35～39℃、3～7％ CO2条件下定向分化培养3～8天得到多巴胺能神经前体细胞，其中，中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液每1～3天更换一次。
14.根据权利要求1至12任意一项所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，
在该步骤S1中，将含有已吹打成单细胞的多能干细胞在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养10天得到多巴胺能神经祖细胞，其中中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液每2天更换一次；
在该步骤S2中，将含有已吹打成单细胞的多巴胺能神经祖细胞在37℃、5％ CO2条件下定向分化培养5天得到多巴胺能神经前体细胞，其中，中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液每天更换一次。
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