WO2020013435A1 - 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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phenformin
gosipol
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cisplatin
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김수열
박종배
이호
장현철
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an anticancer agent combination that can exhibit a synergistic effect through the combined administration of an anticancer agent in the treatment of cancer, and more specifically, in combination with gossypol and phenformin.
  • anticancer drugs that can produce synergistic effects.
  • Cancer is a tumor mass composed of undifferentiated cells that disregard the necessary conditions in the tissue and proliferate indefinitely, unlike normal cells, which can perform regular and moderate proliferation and inhibition according to the needs of the individual.
  • This unlimited proliferation of cancer cells is an incurable disease that penetrates into surrounding tissues and, more seriously, metastasizes to other organs in the body, causing severe pain and eventually causing death.
  • Cancer is classified into blood cancer and solid cancer, and it occurs in almost every part of the body such as pancreatic cancer, breast cancer, oral cancer, liver cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, and skin cancer.
  • These treatment methods include a small number of targeted therapeutics such as Gleevec or Herceptin.
  • chemotherapy with chemotherapy to prevent surgery or radiation therapy and cell proliferation is the main method.
  • the biggest problem of conventional chemotherapeutic agents is the side effects and drug resistance caused by cytotoxicity, which is the main factor that eventually causes the treatment to fail despite the initial successful response by the anticancer agent. Therefore, in order to overcome the limitations of such chemotherapeutic agents, it is necessary to continuously develop a targeted therapeutic agent having a clear anticancer mechanism.
  • anticancer drugs have been developed and marketed through numerous studies. Among them, drugs that target the process of blocking the ATP synthesis pathway in cancer cells to induce cell proliferation and apoptosis have also been used. Gossypol and phenformin are known as anticancer compounds using such intracellular pathways (Korean Patent Publication No. 10-1579371, Korean Patent Registration No. 10-145806).
  • Gosipol is a naturally occurring double nonphenolic compound derived from Gossypium sp., Known as an inhibitor of Aldehyde dehydrogenase (ALDH) in vivo, such as safrole or coumarins. Therefore, research on the therapeutic use using the same is being conducted. Human studies of Gosipol as a male contraceptive have been reported to indicate the safety of long-term administration of these compounds.
  • ADH Aldehyde dehydrogenase
  • Phenformin is a biguanide-based drug such as metformin or buformin, and is known as a drug for treating diabetes.
  • biguanide-based drugs such as phenformin are known to be effective in the treatment of cancers lacking the p53 gene by activating AMP-activated protein kinase (AMPK), a key enzyme that physiologically regulates carbohydrate and lipid metabolism.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • the present inventors endeavored to find a cancer treatment drug that can exhibit a synergistic anticancer effect even at a small dose.
  • synergy between the respective anticancer drugs through the combination of triple drug and the combination of gosipol and phenformin and anticancer drugs It was expected to be effective.
  • cancer cells in various carcinomas when sorafenib, vemurafenib irinotecan, cisplatin, ciclilatin, parclitaxel, or doxorubicin are mixed with gosipol and phenformin.
  • the anticancer agent selected in the present invention was mixed with Gosipol and phenformin.
  • the present invention was completed by confirming that the drug may be an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising gossypol, phenformin, and an anticancer agent as an active ingredient.
  • the anticancer agent may be any one of sorafenib, vemurafenib, irinotecan, cisplatin, cisplatin, parclitaxel, and doxorubicin. .
  • the Gosipol is a compound of Formula 1
  • the phenformin may be a compound of Formula 2:
  • the pharmaceutical composition may be a mixture containing Gosipol, phenformin and anticancer agent in a molar ratio of 0.1 to 10: 10 to 500: 1.
  • the cancer is from the group consisting of kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, melanoma, colon cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, breast cancer, stomach cancer, brain cancer, rectal cancer, blood cancer and ovarian cancer It may be one or more selected.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises Gosipol, phenformin, and an anticancer agent as an active ingredient.
  • the anticancer agent selected as the anticancer agent is sorafenib, somurafenib, Vemurafenib, irinotecan, cisplatin, ciclilatin, parclitaxel, and doxorubicin, respectively, which are Gosipol and Pen.
  • the synergistic effect of cancer proliferation inhibitory effect and cancer cell killing effect was significantly higher than that of each treatment group and the dual drug treatment group of Gosipol + Penformin. Can be provided.
  • 1A-1C show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by the combined treatment of gosipol, phenformin and anticancer agents (sorafenib, sunitinib, or pazopanib) in kidney cancer cell lines.
  • 2A-2C show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by the combined treatment of gosipol, phenformin and an anticancer agent (bemurafenib, cisplatin, or oxaliplatin) in melanoma cell lines.
  • 3A-3C show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by the combined treatment of gosipol, phenformin and an anticancer agent (irinotecan, cisplatin, or capecitabine) in colorectal cancer cell lines.
  • an anticancer agent irinotecan, cisplatin, or capecitabine
  • 4A to 4C show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by combination treatment of gosipol, phenformin and anticancer agent (irinotecan, cisplatin, or 5-FU) in lung cancer cell lines.
  • 5A-5C show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by the combination treatment of gosipol, phenformin and an anticancer agent (paclitaxel, cisplatin, or doxorubicin) in breast cancer cell lines.
  • gosipol phenformin
  • an anticancer agent paclitaxel, cisplatin, or doxorubicin
  • 6A-6C show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by combination treatment of gosipol, phenformin and anticancer agent (cisplatin, paclitaxel, or irinotecan) in ovarian cancer cell lines.
  • FIGS. 7A-7C show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by combination treatment of gosipol, phenformin and an anticancer agent (doxorubicin, docetaxel, or irinotecan) in prostate cancer cell lines.
  • gosipol phenformin
  • an anticancer agent doxorubicin, docetaxel, or irinotecan
  • 8A and 8B show the synergistic effect of cell proliferation inhibition by combination treatment of gosipol, phenformin and anticancer agent (cisplatin, or sorafenib) in liver cancer cell lines.
  • Figure 9 shows the effect of reducing tumor growth in the triple combination group of gosipol, phenformin and irinotecan in a non-small cell lung cancer mouse model:
  • Figure 9a is a diagram confirming the change in size of the tumor according to the number of days of breeding.
  • Figure 9b is a photograph comparing the tumor size in each drug administration group after the completion of breeding.
  • Figure 9c is a diagram confirming the tumor weight in each drug administration group after the completion of breeding.
  • FIG. 10 is a diagram confirming the change in the size of the tumor in the combined administration group of gosipol, phenformin and gemcitabine in the non-small cell lung cancer mouse model.
  • FIG. 11 shows the effect of reducing tumor growth in the triple combination group of gosipol, phenformin and bemurafenib in the melanoma mouse model:
  • Figure 11a is a diagram confirming the change in size of the tumor according to the number of days of breeding
  • Figure 11b is a photograph comparing the tumor size in each drug administration group after the completion of breeding.
  • Figure 11c is a diagram confirming the tumor weight in each drug administration group after the completion of breeding.
  • Figure 12 shows the effect of reducing tumor growth in the combined administration group of Gosipol, phenformin and irinotecan in gastric cancer mouse model:
  • Figure 12a is a diagram confirming the change in size of the tumor according to the number of days of breeding
  • 12b is a photograph comparing tumor size in each drug administration group after completion of breeding.
  • Figure 12c is a diagram confirming the tumor weight in each drug administration group after the completion of breeding.
  • Figure 13 shows the effect of reducing tumor growth in the combined dose group of Gosipol, phenformin and doxorubicin in the prostate cancer mouse model:
  • Figure 13a is a diagram confirming the change in size of the tumor according to the number of days of breeding
  • Figure 13b is a photograph comparing the tumor size in each drug administration group after the completion of breeding.
  • Figure 13c is a diagram confirming the tumor weight in each drug administration group after the completion of breeding.
  • the present invention includes gossypol, phenformin, and an anticancer agent as an active ingredient, and the anticancer agent is sorafenib, somurafenib, Vemurafenib, irinotecan, cisplatin, cisplatin, It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which is any one of paclitaxel and doxorubicin.
  • the present invention includes gossypol, phenformin, and an anticancer agent as an active ingredient, and the anticancer agent is sorafenib, somurafenib, Vemurafenib, irinotecan, cisplatin, cisplatin, It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which is any one of paclitaxel and doxorubicin.
  • the “golfol” of the compositions provided herein serves as inhibitors and activity inhibitors of expression of ALDH in cells.
  • Gosipol is a cell mechanism in which ALDH produces NDAH in the intracellular serine-folate mechanism and ATP is generated from it.
  • Gosipol acts as an inhibitor of ALDH expression and activity and causes intracellular ATP deficiency, Can be killed.
  • the Gosipol has the structure of Formula 1 below:
  • the “penformin” of the compositions provided herein serves as an inhibitor of mitochondrial complex I in cells. Specifically, phenformin can reduce the mitochondrial membrane potential through the inhibition of the activity of mitochondrial complex I, and as a result, cancer cells can be effectively killed because the synthesis of intracellular ATP is reduced.
  • the phenformin has the structure of [Formula 2]:
  • Gosipol and phenformin included as an active ingredient of the composition provided by the present invention may include all ranges of equivalents and equivalents, which are recognized by those skilled in the art to exhibit the same or similar level of pharmaceutically. .
  • the Gosipol and phenformin may be used by selecting their pharmaceutically acceptable salts, hydrates or solvates.
  • the Gosipol acts as an inhibitor of ALDH expression and activity to cause intracellular ATP deficiency, thereby killing cancer cells
  • the phenformin is an inhibitor of mitochondrial complex I, which decreases the mitochondrial membrane potential and increases the ATP deficiency phenomenon. Since the effect can be shown, an increased cancer growth inhibitory effect can be expected through the combination treatment of gosypol and phenformin.
  • the present invention provides an anticancer agent composition that can exhibit synergistic effects in inhibiting cancer cell growth by adding a combination of the anti-cancer agent as well as the Gosipol and phenformin.
  • the present invention provides any one of sorafenib, vemurafenib, irinotecan, cisplatin, ciclilatin, parclitaxel, and doxorubicin as the anticancer agent.
  • the present inventors use various anticancer agents in addition to Gosipol and phenformin for cell lines of kidney cancer, melanoma, colon cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, liver cancer and gastric cancer Was mixed and treated, and only anticancer drugs showing synergistic effects were selected.
  • sorafenib is known as a kinase inhibitor that can be mainly used in the treatment of kidney cancer, liver cancer and prostate cancer.
  • Sorafenib is a small molecule inhibitor of various tyrosine protein kinases, such as VEGFR, PDGFR and Raf kinase.
  • bemurafenib is a compound named as an abbreviation of V600E mutated BRAF inhibition, and is a B-Raf enzyme inhibitor.
  • Vemurafenib is an anticancer agent mainly used for the treatment of end stage melanoma, and it is known that V600E BRAF mutations in about 60% of patients with melanoma may have a specific therapeutic effect.
  • Irinotecan is an anticancer agent widely used in the treatment of colorectal cancer, small cell lung cancer, and pancreatic cancer, and is known to be able to achieve synergistic effects through combination treatment with other anticancer agents. Irinotecan acts as an inhibitor of topoisomerase, blocks the activity of topoisomerase 1 in cancer cells, and is known to exhibit DNA destruction and cell death effects.
  • Cisplatin is an anticancer agent used to treat testicular cancer, bladder cancer, ovarian cancer, prostate cancer, cancer of the head and neck. Cisplatin is known to induce cell disorders and cell death by specifically reacting to DNA of cancer cells, forming crosslinks between or within DNA chains, thereby inhibiting DNA synthesis of cancer cells.
  • Paclitaxel is a drug used as a treatment for various cancers such as ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and pancreatic cancer. Paclitaxel plays a role in inhibiting cell growth by affecting microtube formation during cell division, but side effects such as hair loss, inhibition of bone marrow function, allergic reactions, myalgia and pulmonary inflammation are known.
  • Doxorubicin has been identified as Streptomyces peucetius var. A type of antibiotic produced by caesius. It is an anticancer agent used to show anticancer effects against malignant lymphoma, breast cancer and lung cancer. Insertion between DNA base pairs of cancer cells inhibits topoisomerase II activity, RNA polymerase and DNA polymerase reactions, and is known to play a role in cleaving the chain of single strand DNA.
  • Gosipol, phenformin and the anticancer agent may be mixed with the anticancer agent in a molar ratio of 0.1 to 10: 10 to 500: 1, specifically, 1 to 7: 50 to 200: 1 is mixed in a molar ratio of more. desirable.
  • the Gosipol and phenformin are mixed in a molar ratio of 2.5 to 5: 100: 1 It is more preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a selected anticancer agent at a concentration of 20 nM to 10 ⁇ M, wherein the concentrations of gosipol and phenformin may be mixed at the above-described mixing ratio. That is, the Gosipol can be selectively used by a person skilled in the art in a concentration range of 0.002 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.02 ⁇ M to 70 ⁇ M, more preferably 0.05 to 50 ⁇ M.
  • phenformin can also be mixed at the above-mentioned mixing ratios, so selected by the skilled person in the concentration range of 0.2 ⁇ M to 5 mM, preferably 1 ⁇ M to 2 mM, more preferably 2 ⁇ M to 1 mM. Can be used as
  • the "cancer” is a group consisting of kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, melanoma, colon cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, breast cancer, gastric cancer, brain cancer, rectal cancer, blood cancer and ovarian cancer It is preferably one or more selected from, but is not limited thereto.
  • the cancer is preferably one or more selected from the group consisting of kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, melanoma, colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, stomach cancer and colon cancer, but is not limited thereto.
  • the cancer preferably includes cancer stem cells, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when the “cancer” is "renal cancer", the pharmaceutical composition of the present invention, using a combination of gosipol, phenformin and sorafenib, may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment It is preferable. Combining sunitinib or pazopanib without using sorafenib will not produce a significant synergistic effect, and the effect of the combination treatment would be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment, Do.
  • Combining cisplatin or oxaliplatin without the use of vemurafenib does not produce a significant synergistic effect and the effect by the combination treatment would be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably uses a combination of gosipol, phenformin and irinotecan, which may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment.
  • Combining cisplatin or capecitabine without the use of irinotecan does not produce a significant synergistic effect, and the effect of the combination treatment would be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention uses a combination of gosipol, phenformin and irinotecan, because it may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment.
  • Combining cisplatin or 5-FU without the use of irinotecan does not produce a significant synergistic effect and the effect by the combination treatment will be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention uses a combination of gosipol, phenformin, and paclitaxel, because it may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment. Combining cisplatin or doxorubicin without using paclitaxel will not produce a significant synergistic effect and the effect by the combination treatment will be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention uses a combination of gosipol, phenformin, and cisplatin, because it may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment. Combining paclitaxel or irinotecan without using cisplatin will not produce a significant synergistic effect and the effect by the combination treatment will be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention use a combination of gosipol, phenformin and doxorubicin, because it can exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment.
  • Combination of docetaxel or irinotecan without the use of doxorubicin will not produce a significant synergistic effect and the effect by the combined treatment will be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention use a combination of gosipol, phenformin and cisplatin, because it may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment. Combination of sorafenib without cisplatin would not produce a significant synergistic effect, and the effect of the combination treatment would be undesirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention uses a combination of gosipol, phenformin and irinotecan, because it may exhibit a synergistic effect on cancer prevention or treatment.
  • the pharmaceutical composition comprising Gosipol, phenformin and an anticancer agent of the present invention may be formulated and administered in various oral or parenteral dosage forms as described below. It is not limited to this.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard / soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs, etc. These formulations may contain, in addition to the active ingredients, diluents (e.g., lactose, dextrose). Rose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine), lubricants such as silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or polyethylene glycols.
  • diluents e.g., lactose, dextrose
  • Rose sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine
  • lubricants such as silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or polyethylene glycols.
  • Tablets may also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, and optionally such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt. Disintegrant or boiling mixtures and / or absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, and optionally such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt.
  • compositions comprising Gosipol, Penformin and anticancer agents of the present invention may be administered parenterally, and parenteral administration may be by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection.
  • parenteral administration may be by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection.
  • Gosipol, phenformin and anticancer agent may be mixed with water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which may be prepared in an ampule or vial unit dosage form.
  • compositions may contain sterile and / or preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, auxiliaries such as salts and / or buffers for the control of osmotic pressure, and other therapeutically useful substances, and conventional methods of mixing, granulating It may be formulated according to the formulation or coating method.
  • the dosage to the human body of the pharmaceutical composition comprising Gosipol, phenformin and anticancer agent of the present invention may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the patient, Based on an adult patient weighing 60 kg, it is generally 0.001 to 1,000 mg / day, preferably 0.01 to 500 mg / day, once or several times a day at regular intervals according to the judgment of the doctor or pharmacist It may be administered in divided doses.
  • a combination of anticancer agents used in the prior art was selected to select a combination of anticancer agents that can exhibit synergistic effects of anticancer activity. Therefore, in addition to gossypol and phenformin, an anticancer drug was selected to increase the anticancer effect by adding three anticancer drugs in combination with a triple combination.
  • sorafenib, sunitinib and pazopanib are selected as anticancer drug candidates in addition to gosipol and phenformin to select combinations that may exhibit synergistic effects of anticancer activity on kidney cancer. ), Respectively.
  • each cell was inoculated into a 96 well plate at a density of 5000 to 20,000 cells / well according to the amplifier of incubation time.
  • the anticancer mixtures of Tables 1 to 3 were added to each well and incubated in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • the anticancer drug mixture was mixed at the stock concentration, and then 100 ⁇ l was added to prepare the final concentration of each anticancer drug properly.
  • Cells were further incubated for 48 hours after treatment with anticancer agents, and then 10% (w / v) trichloroacetic acid (TCA) was added to each well, and the cells were fixed by incubating at 4 ° C. for 60 minutes. The fixed extracellular supernatant was removed and the plate was washed 5 times with tap water and then air dried. After drying, 100 ⁇ l of 0.4% (w / v) Sulforhodamine B solution containing 1% acetic acid was added to each well, and the cells were stained by standing at room temperature for 5 minutes. After staining the cells were washed 5 times with 1% acetic acid to remove the uncolored dye, and dried in air.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the stained dye was immobilized with 10 mM trizma base and the absorbance was measured at 515 nm using a plate reader.
  • the cell proliferation of the cell line cultured without the anticancer agent was measured, and the cell proliferation of each experimental group for the untreated control was calculated as a relative ratio and expressed as a percentage (%). .
  • FIG. 1A Design of Triple Drug Treatment Group Experiments Containing Sorafenib
  • ⁇ M Sample Name Anticancer agent
  • FIG. 1B Design of Triple Drug Treatment Group Experiments Including Sunitinib (FIG. 1B) number Sample Name Anticancer agent ( ⁇ M) One Gossipol single treatment group Gosipol (2.5 ⁇ M) - - 2 Phenformin single treatment group - Phenformin (100 ⁇ M) - 3 Sunitinib single treatment group - - Sunitinib (10 ⁇ M) 4 Dual Drug Treatment Group Gosipol (2.5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) - 5 Triple drug treatment group Gosipol (2.5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) Sunitinib (10 ⁇ M)
  • each renal cancer cell was confirmed to be able to inhibit the proliferation of cancer cells when the anticancer agent of gosipol, phenformin or sorafenib alone was treated alone.
  • the double-drug treatment group of gosypol and phenformin showed a similar level of cell proliferation inhibitory effect as the sorafenib alone treatment group, especially in the triple drug treatment group mixed with gosypol, phenformin and sorafenib.
  • UACC62 cell line or A375 cell line which is a melanoma cell line, was cultured, respectively, and the cell growth was inhibited in melanoma cells through SRB analysis by performing the same method as in [Example 1]. It was confirmed whether the synergistic effect of the anticancer action by the mixed administration of the anticancer agents disclosed in Table 6.
  • FIG. 2B Design of Triple Drug Treatment Group Including Cisplatin (FIG. 2B) number Sample Name Anticancer agent ( ⁇ M) One Dual Drug Treatment Group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) - 2 Cisplatin alone group - - Cisplatin (10 ⁇ M) 3 Triple drug treatment group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) Cisplatin (10 ⁇ M)
  • each melanoma cell proliferated to a significant level in both the monotherapy group of Gosipol, phenformin or bemurafenib, and the dual drug treatment group of Gosipol and phenformin. It was confirmed that can be suppressed. However, especially in the triple drug treatment group mixed with gosipol, phenformin and bemurafenib, it was confirmed that the cell proliferation level was significantly suppressed as compared with the case of single or double treatment of each anticancer agent. When mixed with Paul and phenformin it was confirmed that it can exhibit a synergistic effect of anticancer action (Fig. 2a).
  • cisplatin (FIG. 2B) and oxaliplatin (FIG. 2C) show only the level of cell proliferation inhibitory effect similar to that of the double drug treatment group. It was confirmed that the synergistic effect of anticancer action by triple drug treatment was not shown.
  • anticancer drug candidates in addition to gosipol and phenformin were selected from irinotecan, cisplatin, and capecitabin, respectively. It was.
  • HT29 cell line or Colo205 cell line which is a colorectal cancer cell line, is cultured, respectively, and the cell growth is inhibited in colorectal cancer cells through SRB analysis by performing the same method as in [Example 1]. It was confirmed whether the synergistic effect of the anticancer action by the mixed administration of the anticancer agents disclosed in Table 9].
  • FIG. 3A Design of Triple Drug Treatment Group Experiments Including Irinotecan
  • ⁇ M Sample Name Anticancer agent
  • FIG. 3B Design of Triple Drug Treatment Group Experiments Including Cisplatin (FIG. 3B) number Sample Name Anticancer agent ( ⁇ M) One Gossipol single treatment group Gosipol (2.5 ⁇ M) - - 2 Phenformin single treatment group - Phenformin (75 ⁇ M) - 3 Cisplatin alone group - - Cisplatin (10 ⁇ M) 4 Dual Drug Treatment Group Gosipol (2.5 ⁇ M) Phenformin (75 ⁇ M) - 5 Triple drug treatment group Gosipol (2.5 ⁇ M) Phenformin (75 ⁇ M) Cisplatin (10 ⁇ M)
  • each of the colorectal cancer cells inhibited the proliferation of cancer cells at a significant level both in the group treated with Gosipol, phenformin or irinotecan alone, and in the double drug treatment group with Gosipol and phenformin. It was confirmed that it could be done. However, especially in the triple drug treatment group mixed with Gosipol, phenformin and irinotecan, it was confirmed that the level of cell proliferation was significantly suppressed compared to the case of treatment with each anticancer agent alone or double, and the irinotecan was shown to be Gosifol and Penform. It was confirmed that when mixed with Min can exhibit the synergistic effect of anticancer action (FIG.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • irinotecan In order to select combinations that may exhibit synergistic effects of anticancer activity against non-small cell lung cancer, irinotecan, cisplatin and 5-fluurorasyl (5-noteuro) as anticancer drug candidates in addition to gosipol and phenformin. fluorouracil, 5-FU), respectively.
  • A549 cell line or H522 cell line which is a non-small cell lung cancer cell line, was cultured, respectively, and the cell growth was inhibited in non-small cell lung cancer cells through SRB analysis by performing the same method as in [Example 1]. 10] to Table 12 it was confirmed whether the synergistic effect of the anticancer action by the mixed administration of the anticancer agents disclosed in Table 12.
  • FIG. 4B Design of Triple Drug Treatment Group Including Cisplatin (FIG. 4B) number Sample Name Anticancer agent ( ⁇ M) One Dual Drug Treatment Group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) - 2 Cisplatin alone group - - Cisplatin (20 ⁇ M) 3 Triple drug treatment group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) Cisplatin (20 ⁇ M)
  • each of the non-small cell lung cancer cells proliferated to a significant level in both the monotherapy group of Gosipol, phenformin or irinotecan and the dual drug treatment group of Gosipol and phenformin. It was confirmed that can be suppressed. However, especially in the triple drug treatment group mixed with Gosipol, phenformin, and irinotecan, the cell proliferation level is significantly suppressed as well as the cell number decreases due to the decrease in the number of cells compared with the treatment with each anticancer agent alone or double. It was confirmed that irinotecan can exhibit a synergistic effect of anticancer action when mixed with gosipol and phenformin (FIG.
  • FIG. 4A shows only the level of cell proliferation inhibitory effect similar to that of the double drug treatment group in the triple drug treatment group, and does not show the synergistic effect of anticancer action by the triple drug treatment. Confirmed.
  • paclitaxel In order to select a combination that may exhibit the synergistic effect of anticancer action on breast cancer, paclitaxel, cisplatin, and doxorubicin were selected as anticancer drug candidates in addition to gosipol and phenformin.
  • the BT549 cell line or MB231 cell line which is a breast cancer cell line, was cultured, respectively, and the cell growth was inhibited in breast cancer cells through SRB analysis by following the same method as in [Example 1]. It was confirmed whether the synergistic effect of the anticancer action by the mixed administration of the anticancer agents disclosed in the].
  • FIG. 5A Design of Triple Drug Treatment Group Including Paclitaxel
  • FIG. 5A number Sample Name Anticancer agent ( ⁇ M)
  • FIG. 5B Design of Triple Drug Treatment Group Including Cisplatin (FIG. 5B) number Sample Name Anticancer agent ( ⁇ M) One Gossipol single treatment group Gosipol (5 ⁇ M) - - 2 Phenformin single treatment group - Phenformin (100 ⁇ M) - 3 Cisplatin alone group - - Cisplatin (1 ⁇ M) 4 Dual Drug Treatment Group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) - 5 Triple drug treatment group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) Cisplatin (1 ⁇ M)
  • each breast cancer cell may inhibit the proliferation of cancer cells to a significant level both in the monotherapy group of gosipol, phenformin or irinotecan, and in the dual drug treatment group of gosipol and phenformin. It was confirmed that it can. However, especially in the triple drug treatment group mixed with Gosipol, phenformin, and irinotecan, the cell proliferation level is significantly suppressed as well as the cell number decreases due to the decrease in the number of cells compared with the treatment with each anticancer agent alone or double. It was confirmed that irinotecan can exhibit a synergistic effect of anticancer action when mixed with gosypol and phenformin (FIG. 5A).
  • Cisplatin, paclitaxel, and irinotecan were selected as candidates for anticancer agents in addition to gosipol and phenformin, respectively, in order to select a combination that may exhibit synergistic effects of anticancer activity on ovarian cancer.
  • SK-OV-3 or OVCAR3 cell line which is an ovarian cancer cell line, was cultured, respectively, and the cell growth was inhibited in ovarian cancer cells through SRB analysis by performing the same method as in [Example 1].
  • SRB analysis by performing the same method as in [Example 1].
  • [Table 18] it was confirmed whether the synergistic effect of the anticancer action by the mixed administration of the anticancer drugs disclosed.
  • FIG. 6A Design of Triple Drug Treatment Group Experiments Including Cisplatin (FIG. 6A) number Sample Name Anticancer agent ( ⁇ M) One Gossipol single treatment group Gosipol (5 ⁇ M) - - 2 Phenformin single treatment group - Phenformin (100 ⁇ M) - 3 Cisplatin alone group - - Cisplatin (1 nM) 4 Dual Drug Treatment Group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) - 5 Triple drug treatment group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) Cisplatin (1 nM)
  • each of the ovarian cancer cells inhibited the proliferation of cancer cells to a significant level both in the group treated with Gosipol, phenformin or cisplatin alone and in the double drug treatment group with Gosifol and phenformin. It was confirmed that it could be done.
  • the triple drug treatment group mixed with gosipol, phenformin and cisplatin not only significantly inhibited the cell proliferation level but also decreased the cell number compared to the treatment with each anticancer agent alone or in duplicate.
  • cisplatin can exhibit a synergistic effect of anticancer action when mixed with Gosipol and phenformin (Fig. 6a).
  • Figs. 6b and 6c show only the level of cell proliferation inhibitory effect similar to that of the double drug treatment group in the triple drug treatment group, thus synergistic effect of anticancer action by triple drug treatment. It confirmed that it did not show.
  • Doxorubicin, Docetaxel, and irinotecan were selected as candidates for anticancer drugs in addition to Gosipol and phenformin, respectively, in order to select a combination that may exhibit synergistic effects of anticancer activity on prostate cancer.
  • the PC3 cell line or DU145 cell line which is a prostate cancer cell line, is cultured, respectively, and the cell growth is inhibited in prostate cancer cells through SRB analysis by performing the same method as in [Example 1]. It was confirmed whether the synergistic effect of the anticancer action by the mixed administration of the anticancer agents disclosed in Table 21].
  • each prostate cancer cell inhibited the proliferation of cancer cells at a significant level in both the group treated with gosypol, phenformin or doxorubicin alone, and the double drug treated group with gosypol and phenformin. It was confirmed that it could be done. However, especially in the triple drug treatment group mixed with Gosipol, phenformin and doxorubicin, it was confirmed that the level of cell proliferation was significantly suppressed compared to the case of treatment with each anticancer agent alone or double, and doxorubicin was found in Gosifol and Penpor. It was confirmed that when mixed with Min can exhibit the synergistic effect of anticancer action (Fig. 7a).
  • docetaxel Fig. 7b
  • irinotecan Fig. 7c
  • cisplatin and sorafettip were selected as candidates for anticancer agents in addition to gosipol and phenformin.
  • SNU449 or Huh7 cell line which is a liver cancer cell line, was cultured, respectively, and the cell growth was inhibited in liver cancer cells through SRB analysis by performing the same method as in [Example 1] below [Table 22] and [Table 23] It was confirmed whether the synergistic effect of the anticancer action by the mixed administration of the anticancer agents disclosed in the.
  • FIG. 8A Design of Triple Drug Treatment Group Experiments Including Cisplatin
  • ⁇ M Sample Name Anticancer agent
  • Gosipol One Gossipol single treatment group Gosipol (5 ⁇ M) - - 2 Phenformin single treatment group - Phenformin (100 ⁇ M) - 3 Cisplatin alone group - - Cisplatin (1 uM) 4 Dual Drug Treatment Group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) - 5 Triple drug treatment group Gosipol (5 ⁇ M) Phenformin (100 ⁇ M) Cisplatin (1 uM)
  • each prostate cancer cell inhibited the proliferation of cancer cells at a significant level in both the group treated with Gosipol, phenformin or cisplatin alone and the double drug treatment group with Gosipol and phenformin. It was confirmed that it could be done.
  • the triple drug treatment group mixed with gosipol, phenformin and cisplatin not only significantly inhibited the cell proliferation level but also decreased the number of cells compared with the treatment with each anticancer agent alone or in duplicate. It was confirmed that the apoptosis effect, cisplatin can exhibit the synergistic effect of anticancer action when mixed with Gosipol and phenformin (FIG.
  • mice 6-8 week old Balb / c-nu mice (Central Lab. Animal, Highland Heights, KY, USA) were prepared to make a lung cancer mouse model.
  • 7.5 ⁇ 10 6 A549 cell line was cultured and injected into the prepared mouse subcutaneously with 1 ml syringe. Mice were reared for 1 week and divided into four groups of eight animals each, and these were used as control or experimental groups as defined in Tables 24 and 25 below.
  • Solvent control, bi-drug and triple-drug treated mice were orally administered with a solvent or drug once daily, 6 days per week, and mice in the irinotecan monotreated group were injected intravenously with a drug once daily and daily, It was bred in the same environment for a total of 49 days.
  • the body weight and tumor size of the mouse group were checked every 7 days, and averaged.
  • the initial tumor size after lung cancer cell injection was specified using a caliper. Tumor volume was calculated using Equation 1 below.
  • Dosage composition One Solvent control Solvent (5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ⁇ l) 2 Dual Drug Administration Group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) - 3 Irinotecan alone group - - Irinotecan (20 mg / kg / 100 ⁇ l) 4 Triple drug group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) Irinotecan (20 mg / kg / 100 ⁇ l)
  • Dosage composition One Solvent control Solvent (5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ⁇ l) 2 Dual Drug Administration Group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) - 3 Gemcitabine administered group - - Gemcetabine (40 mg / kg / 100 ⁇ l) 4 Triple drug group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) Gemcitabine (40 mg / kg / 100 ⁇ l)
  • the gemcitabine administration group did not show the anti-cancer synergy effect by triple drug administration (Fig. 10).
  • Gemcitabine alone group showed tumor growth at a level similar to that of the solvent group, and showed a significant tumor growth inhibitory effect in the double drug administration group of gosypol and phenformin.
  • the triple administration of drug by adding gemcitabine to gosipol and phenformin it was confirmed that the growth level of the double drug group and the tumor size were similar.
  • an anticancer drug combination was administered to a mouse model xenograft xenograft.
  • the melanoma mouse model is the same as the method for producing a lung cancer mouse model in [Example 9], but a melanoma model was prepared by xenografting A375 cells. The prepared melanoma mouse model was then used as a control or experimental group as defined in Table 26 below.
  • Dosage composition One Solvent control Solvent (5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ⁇ l) 2 Dual Drug Administration Group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) - 3 Vemurafenib alone - - Vemurafenib (30 mg / kg / 100 ⁇ l) 4 Triple drug group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) Vemurafenib (30 mg / kg / 100 ⁇ l)
  • an anticancer drug combination was administered to a mouse model transplanted with gastric cancer.
  • the gastric cancer mouse model is the same as the method for producing a lung cancer mouse model in the above [Example 9], a gastric cancer mouse model was prepared by xenografting SNU638 cells (1.5 ⁇ 10 7 ). Then, the prepared gastric cancer mouse model was used as a control or experimental group as defined in Table 27 below.
  • Dosage composition One Solvent control Solvent (5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ⁇ l) 2 Gossipol alone group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) - - 3 Penformin alone group - Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) - 4 Dual Drug Administration Group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) - 5 Irinotecan alone group - - Irinotecan (30 mg / kg / 100 ⁇ l) 6 Triple drug group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) Irinotecan (30 mg / kg / 100 ⁇ l)
  • the solvent control group, Gosipol alone group and phenformin alone group was confirmed that the growth level of gastric cancer tumors are similar (Fig. 12a and 12b).
  • the dual drug group and the irinotecan group significantly reduced the growth level of the tumor.
  • tumor growth was hardly observed in the triple drug-administered group, which was administered in combination with Gossipol, phenformin, and irinotecan in combination.
  • the tumor weight and size of the triple drug administration group is significantly reduced compared to the other control and administration group (Fig. 12b and 12c).
  • an anticancer drug combination was administered to a mouse model transplanted with prostate cancer.
  • the prostate cancer mouse model is the same as the method for preparing a lung cancer mouse model in [Example 9], but a prostate cancer mouse model was prepared by xenografting PC3 cells (5 ⁇ 10 6 ). The prepared prostate cancer mouse model was then used as a control or experimental group as defined in Table 287 below.
  • Dosage composition One Solvent control Solvent (5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ⁇ l) 2 Dual Drug Administration Group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) - 3 Doxorubicin alone - - Doxorubicin (5 mg / kg / 100 ⁇ l) 4 Triple drug group Gosipol (80 mg / kg / 100 ⁇ l) Phenformin (100 mg / kg / 100 ⁇ l) Doxorubicin (5 mg / kg / 100 ⁇ l)
  • FIG. 13 it was confirmed that tumor growth inhibition was significantly induced in the double drug administration group and doxorubicin alone administration group as compared to the solvent control group, and in addition, the tumor growth level in the triple drug administration group was lowest.
  • FIG. 13A and 13B After breeding for a total of 16 days, even when comparing the tumor size and weight at the expense of the mouse, it was confirmed that the tumor weight and size of the triple drug administration group is significantly reduced compared to the other control and administration group (Fig. 13b and 13c).
  • the anticancer drug combinations that can exhibit synergistic activity of the anticancer effect were selected by co-administration with Gosipol and phenformin.
  • the combination of anticancer drugs that can exhibit synergistic effects according to the carcinoma is different, as summarized in Table 29 below.

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Abstract

본 발명은 암 치료에 있어서 항암제의 병용 투여를 통해 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)에 더하여 병용 처리하였을 때 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제를 제시한다. 본 발명에서 상기 항암제로서 선별한 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin)으로, 이들은 각각 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하여 3중 약물의 조합으로 병용 처리할 때, 각각의 단독 처리군 및 고시폴+펜포르민의 이중약물 처리군에 비해 암 증식 억제 효과 및 암세포 사멸 효과에 있어서 유의적으로 시너지 효과를 제공할 수 있다.

Description

고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 암 치료에 있어서 항암제의 병용 투여를 통해 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)에 더하여 병용 처리하였을 때 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제를 제시한다.
암이란 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 무제한의 증식을 하는 암 세포는 주위의 조직으로 침투하고 더 심각한 경우는 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래하는 난치병이다.
암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 췌장암, 유방암, 구강암, 간암, 난소암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생하며, 이들의 치료방법으로 최근 글리벡 또는 허셉틴과 같은 소수의 표적치료제가 특정 암의 치료에 이용되고 있으나 현재까지는 수술이나 방사선 요법 및 세포증식을 억제하는 화학요법제를 이용한 항암제 치료가 주된 방법이다. 그러나 표적치료제가 아니기 때문에 기존 화학요법제의 가장 큰 문제는 세포독성으로 인한 부작용과 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 따라서, 이러한 화학요법제의 한계를 극복하기 위해서는 항암작용 기전이 명확한 표적 치료제 개발이 지속적으로 필요하다.
종래 수많은 연구를 통해 다양한 항암 약물들이 개발 및 시판되고 있다. 이 중 암세포 내의 ATP 합성 경로를 차단하여 세포의 증식 억제 및 세포사멸을 유도하는 과정을 타겟으로 하는 약물들 또한 사용되고 있다. 이러한 세포내 경로를 사용한 항암 화합물로서 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)이 알려져 있다(대한민국 등록공보 제 10-1579371호, 대한민국 등록특허 제 10-145806호).
고시폴은 조면실유 (Gossypium sp.)로부터 유도되는 천연적으로 존재하는 이중 비페놀성 화합물로, 사프롤(safrole), 또는 쿠마린(coumarins)과 같이 생체 내에서 Aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 억제제로서 알려져 있어, 이를 이용한 치료 용도에 대하여 연구되고 있다. 남성 피임제로서의 고시폴의 인체 실험은 이들 화합물의 장기간 투여의 안전성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다.
펜포르민(Phenformin)은 메트포르민(Metformin), 또는 부포르민(buformin)과 같은 바이구아나이드(biguanide) 계열의 약물로 당뇨병 치료제로 알려져 있다. 그러나, 펜포르민과 같은 바이구아나이드 계열 약물들이 탄수화물 대사와 지질 대사를 생리적으로 조절하는 핵심 효소인 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시켜 p53 유전자가 결여된 암의 치료에 효과적인 것으로 알려지기 시작하면서, 펜포르민 약물의 항암 효과에 대한 연구가 진행되었고, 펜포르민의 항암 효과에 대한 가능성이 입증되었다.
이와 같이, 고시폴 및 펜포르민에 대한 각각의 항암 효과에 대하여는 알려져 있으나, 이들을 이용하여 보다 높은 활성의 항암 효과를 나타낼 수 있음에 대하여는 보고된 바 없다.
따라서, 본 발명자들은 적은 용량으로도 상승적 항암 효과를 나타낼 수 있는 암 치료약물을 발굴하기 위해 노력한 결과, 고시폴 및 펜포르민과 항암제를 혼합하여 3중 약물의 병용 투여를 통해 각각의 항암제 간의 시너지 효과가 나타날 수 있을 것으로 기대하였다. 이에, 고시폴 및 펜포르민과 함께 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib) 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 또는 독소루비신(Doxorubicin)을 혼합하였을 때, 다양한 암종에서 암세포 증식 억제 효과, 및 암 전이 억제 효과가 현저히 상승하였고, 마우스 모델에 이종이식된 종양의 성장 억제 수준 역시 시너지 효과를 나타내므로, 본 발명에서 선별한 항암제를 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합한 3중 약물의 구성이 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분이 될 수 있을 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 각각의 항암제를 적은 용량으로 투여하여도 혼합에 따라 상승적 치료 효과를 나타낼 수 있는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 고시폴은 하기 [화학식 1]의 화합물이고, 상기 펜포르민은 하기 [화합식 2]의 화합물일 수 있다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019005913-appb-I000001
; 및
[화학식 2]
Figure PCTKR2019005913-appb-I000002
.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 0.1 내지 10 : 10 내지 500 : 1의 몰비율로 혼합하여 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 항암제로서 선별한 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin)으로, 이들은 각각 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하여 3중 약물의 조합으로 병용 처리할 때, 각각의 단독 처리군 및 고시폴+펜포르민의 이중약물 처리군에 비해 암 증식 억제 효과 및 암세포 사멸 효과에 있어서 유의적으로 시너지 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 사용하여 암을 치료하는 경우, 낮은 농도의 약물 만으로도 유의적인 암 세포 증식 억제 및 종양 성장 억제 효과를 나타낼 수 있으므로, 정상 세포의 생존에는 영향을 미치지 않으면서 특이적으로 암 만을 사멸할 수 있어, 효과적이다.
도 1a 내지 도 1c는 신장암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(소라페닙, 수니티닙, 또는 파조파닙)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 흑색종 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(베무라페닙, 시스플라틴, 또는 옥살리플라틴)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 대장암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(이리노테칸, 시스플라틴, 또는 카페시타빈)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 폐암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(이리노테칸, 시스플라틴, 또는 5-FU)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 유방암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(파클리탁셀, 시스플라틴, 또는 독소루비신)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 난소암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(시스플라틴, 파클리탁셀, 또는 이리노테칸)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c는 전립선암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(독소루비신, 도세탁셀, 또는 이리노테칸)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 8a와 도 8b는 간암 세포주에서 고시폴, 펜포르민 및 항암제(시스플라틴, 또는 소라페닙)의 병용 처리에 의한 세포증식 저해의 시너지 효과를 나타낸다.
도 9는 비소세포성폐암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 병용 투여(triple combination)군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다:
도 9a는 사육 일수에 따른 종양의 크기 변화를 확인한 도이고;
도 9b는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 크기를 비교한 사진이며; 및
도 9c는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 무게를 확인한 도이다.
도 10은 비소세포성폐암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 젬시타빈의 병용 투여군에서의 종양의 크기 변화를 확인한 도이다.
도 11은 흑색종 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙의 병용 투여(triple combination)군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다:
도 11a는 사육 일수에 따른 종양의 크기 변화를 확인한 도이고;
도 11b는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 크기를 비교한 사진이며; 및
도 11c는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 무게를 확인한 도이다.
도 12는 위암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 병용 투여군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다:
도 12a는 사육 일수에 따른 종양의 크기 변화를 확인한 도이고;
도 12b는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 크기를 비교한 사진이며; 및
도 12c는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 무게를 확인한 도이다.
도 13은 전립선암 마우스 모델에서 고시폴, 펜포르민 및 독소루비신의 병용 투여군에서의 종양 성장 감소 효과를 나타낸다:
도 13a는 사육 일수에 따른 종양의 크기 변화를 확인한 도이고;
도 13b는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 크기를 비교한 사진이며; 및
도 13c는 사육 종료 후 각 약물 투여군에서 종양 무게를 확인한 도이다.
본 발명은 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 항암제를 유효성분으로 포함하고, 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin) 및 항암제를 유효성분으로 포함하고, 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조성물의 “고시폴”은 세포 내에서 ALDH의 발현 억제제 및 활성 억제제로서 역할을 가진다. 구체적으로, 고시폴은 세포 내 serine-folate 기작에서 ALDH가 NDAH를 생성하여 이로부터 ATP가 생성되는 세포 기작에서, 고시폴이 ALDH 발현 및 활성 억제제로서 작용하여 세포 내 ATP 결핍을 유발함에 따라 암세포가 사멸될 수 있다. 상기 고시폴은 하기 [화학식 1]의 구조를 가진다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019005913-appb-I000003
.
본 발명에서 제공하는 조성물의 “펜포르민”은 세포 내에서 미토콘드리아 복합체 I의 억제제 역할을 한다. 구체적으로, 펜포르민은 미토콘드리아 복합체 I의 활성 억제를 통해 미토콘드리아 막 전위를 감소시킬 수 있으며, 결과적으로 세포 내 ATP의 합성이 저하되기 때문에 암세포가 효과적으로 사멸될 수 있다. 상기 펜포르민은 하기 [화학식 2]의 구조를 가진다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2019005913-appb-I000004
.
본 발명에서 제공하는 조성물의 유효성분으로서 포함되는 고시폴 및 펜포르민에 있어서, 약학적으로 동일 또는 유사한 수준의 효과를 나타내는 것으로 당업자에게 인정되는, 동등물 및 등가물의 범위를 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 고시폴 및 펜포르민은 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 선택하여 사용할 수 있다.
즉, 상기 고시폴은 ALDH 발현 및 활성 저해제로서 세포 내 ATP 결핍이 유발되어 암세포가 사멸될 수 있는 역할을 하며, 상기 펜포르민은 미토콘드리아 복합체 I의 억제제로서 미토콘드리아 막전위를 감소시켜 ATP 결핍 현상의 상승 효과를 나타낼 수 있으므로, 고시폴 및 펜포르민을 병용 처리하는 것을 통해 증가된 암 성장 억제 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서는 상기 고시폴 및 펜포르민 뿐 아니라 항암제의 조합을 더하여 보다 암세포 성장 억제에 있어서 보다 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 구성을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 항암제로서 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나를 제공한다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서, 본 발명자들은 신장암, 흑색종, 대장암, 비소세포성폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간암 및 위암 세포주에 대하여 고시폴 및 펜포르민에 더해 다양한 항암제를 혼합하여 병용 처리하였고, 이에 의한 시너지 효과를 나타내는 항암제만을 선별하였다.
보다 구체적으로, 상기 소라페닙은 신장암, 간암 및 전립선암 등의 치료에 주로 사용될 수 있는 kinase 억제제로 알려져 있다. 소라페닙은 다양한 티로신 단백질 인산화효소(tyrosine protein kinase)인, VEGFR, PDGFR 및 Raf족 인산화효소 등의 소분자 억제제이다.
또한, 상기 베무라페닙은 V600E mutated BRAF inhibition의 약어로서 명명된 화합물로서, B-Raf 효소 억제제이다. 베무라페닙은 주로 말기 흑색종의 치료에 사용되는 항암제로서, 흑색종 환자의 약 60%가 가지고 있는 V600E BRAF 변이 흑색종에서 특이적으로 치료 효과를 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다.
이리노테칸은 대장암, 소세포성 폐암 및 췌장암의 치료에 널리 사용되는 항암제로서, 주로 다른 항암제와 혼합하여 병용처리를 통해 시너지 효과를 도모할 수 있는 것으로 알려진 항암제이다. 이리노테칸은 토포이성화효소(topoisomerase)의 억제제로서 역할을 하여, 암세포 내 topoisomerase 1의 활성을 차단하여 DNA 파괴 및 세포 사멸 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
시스플라틴은 고환암, 방광암, 난소암, 전립선암, 머리 및 목에 생긴 암 등의 치료에 사용되는 항암제이다. 시스플라틴은 암세포의 DNA에 특이적으로 반응하여, DNA 사슬간 또는 사슬 내에 가교를 형성해 암세포의 DNA 합성을 저해함으로서 세포 장애 및 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
파클리탁셀은 난소암, 유방암, 폐암 및 췌장암 등 다양한 암에 대한 치료제로 사용되는 약물이다. 파클리탁셀은 세포 분열시 마이크로튜브 형성에 영향을 미침으로서 세포 생장을 억제하는 역할을 하나, 탈모, 골수 기능의 억제, 알러지 반응, 근육통 및 폐염증과 같은 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다.
독소루비신은 Streptomyces peucetius var. caesius가 생산하는 항생물질의 일종으로, 악성림프종, 유방암 및 폐암 등에 대해 항암효과를 나타내어 사용되는 항암제이다. 암세포의 DNA 염기쌍 간에 삽입되면, 토포이성화효소 II 활성, RNA 중합효소 및 DNA 중합 효소반응을 저해하며, single strand DNA의 사슬을 절단하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 고시폴, 상기 펜포르민 및 상기 항암제를 병용 투여하는 것을 통해, 암 증식 억제 및 사멸 유도 효과에 있어서 유의적인 시너지 효과를 얻을 수 있다. 이 때 고시폴, 펜포르민 및 항암제는 항암제를 0.1 내지 10 : 10 내지 500 : 1의 몰비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1 내지 7 : 50 내지 200 : 1의 몰비율로 혼합되는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물을 통해 적은 농도의 항암제를 사용하여 유의적으로 암 예방 및 치료 효과를 얻고자 하는 관점에서, 상기 고시폴 및 펜포르민은 2.5 내지 5 : 100 : 1의 몰비율로 혼합되는 것이 보다 바람직하다.
보다 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 선택되는 항암제를 20 nM 내지 10 μM 농도로 포함할 수 있으며, 이 때 고시폴 및 펜포르민의 농도는 상술한 혼합 비율로 혼합할 수 있다. 즉, 상기 고시폴은 0.002 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.02 μM 내지 70 μM, 보다 바람직하게는 0.05 내지 50 μM의 농도 범위에서 통상의 기술자에 의해 선택적으로 사용 가능하다. 또한, 펜포르민 또한 상술한 혼합 비율로 혼합할 수 있어, 0.2 μM 내지 5 mM, 바람직하게는 1 μM 내지 2 mM, 보다 바람직하게는 2 μM 내지 1 mM의 농도 범위에서 통상의 기술자에 의해 선택적으로 사용 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 "암"은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 위암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 암은 바람직하게는 암줄기세포를 포함하는 것이나, 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 "암"이 "신장암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 소라페닙의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 소라페닙을 사용하지 않고, 수니티닙(sunitinib) 또는 파조파닙(pazopanib)을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "흑색종"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 베무라페닙을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 옥살리플라틴을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "대장암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 이리노테칸을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 카페시타빈을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "폐암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 이리노테칸을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 5-FU를 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "유방암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 파클리탁셀의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 파클리탁셀을 사용하지 않고, 시스플라틴 또는 독소루비신을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "난소암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 시스플라틴을 사용하지 않고, 파클리탁셀 또는 이리노테칸을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "전립선암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 독소루비신의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 독소루비신을 사용하지 않고, 도세탁셀 또는 이리노테칸을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "간암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다. 시스플라틴을 사용하지 않고, 소라페닙을 조합하면, 유의적인 시너지 효과를 나타내지 않아, 병용 치료에 의한 효과가 바람직하지 않을 것이다.
상기 "암"이 "위암"인 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸의 조합을 사용하는 것이, 암 예방 또는 치료에 대해 시너지 효과를 나타낼 수 있어, 바람직하다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 본 발명의 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명의 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 고시폴, 펜포르민 및 항암제를 포함하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
신장암 (renal cell carcinoma)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
본 발명에서는 종래 사용되는 항암제를 혼합하여 병용 처리하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합을 선별하고자 하였다. 이에, 고시폴(gossypol) 및 펜포르민(phenformin)에 더해 추가 항암제를 혼합하여 3종 투여(triple combination)함으로써 항암 효과가 상승되도록 하는 항암제 약물을 선발하였다. 먼저, 신장암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib) 및 파조파닙(pazopanib)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 신장암 세포주인 ACHN 세포주 또는 CAKI-1 세포주를 각각 배양하면서, 배양 시간의 증폭기에 따라 각각의 세포를 5000 내지 20,000 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후, 하기 [표 1] 내지 [표 3]의 항암제 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고 24 시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 항암제 혼합물은 원액(stock) 농도에서 각각 혼합 후, 100 ㎕ 씩 첨가하여 각각의 항암제 약물의 최종 농도가 적절히 첨가될 수 있도록 준비하였다. 항암제를 처리한 후 48 시간 동안 세포를 추가 배양한 다음, 각각의 웰에 10%(w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 가하고 4℃에서 60 분간 배양하여 세포를 고정하였다. 고정한 세포 외의 상층액을 제거하고 수돗물로 5 회 정도 플레이트를 세척한 다음 공기에서 건조(air dry)하였다. 건조 후 각각의 웰에 1% 아세트산을 포함하는 0.4%(w/v) 술포로다민 B 완충용액(Sulforhodamine B solution) 100 ㎕을 가하고, 실온에서 5 분동안 방치하여 세포를 염색하였다. 세포의 염색 후에 1% 아세트산으로 5 회 세척하여 착색되지 않은 염색약을 제거한 다음 공기에서 건조하였다. 착색된 염색약은 10 mM 트리즈마 염기(trizma base)로 고정화한 후, 플레이트 리더기를 사용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 무처리 대조군(control)으로서, 항암제를 처리하지 않고 배양한 세포주의 세포 증식 정도를 측정하였으며, 상기 무처리 대조군에 대한 각각의 실험군의 세포 증식 정도를 상대적인 비율로 계산하여 백분율(%)로 나타내었다.
소라페닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 1a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 소라페닙 단독처리군 - - 소라페닙(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) 소라페닙(10 μM)
수니티닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 1b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 수니티닙 단독처리군 - - 수니티닙(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) 수니티닙(10 μM)
파조파닙를 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 1c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 소라페닙 단독처리군 - - 파조파닙(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(100 μM) 파조파닙(10 μM)
그 결과, 먼저 도 1a에서 나타난 바와 같이 각각의 신장암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 소라페닙의 각각의 항암제를 단독으로 처리하였을 때 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 또한, 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군은 소라페닙 단독처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과를 나타내며, 특히 고시폴, 펜포르민 및 소라페닙을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 소라페닙은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 1a).이에 비해, 도 1b 및 도 1c에서 나타난 바와 같이 수니티닙(도 1b) 및 파조파닙(도 1c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 2]
흑색종 (Melanoma)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
흑색종에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 베무라페닙(Vemurafenib, PLX032), 시스플라틴(cisplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 흑색종 세포주인 UACC62 세포주 또는 A375 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 흑색종 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 4] 내지 [표 6]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
베무라페닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 2a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 베무라페닙 단독처리군 - - 베무라페닙(0.5 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 베무라페닙(0.5 μM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 2b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(10 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(10 μM)
옥살리플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 2c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 옥살리플라틴 단독처리군 - - 옥살리플라틴(10 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 옥살리플라틴(10 μM)
그 결과, 먼저 도 2a에서 나타난 바와 같이 각각의 흑색종 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 베무라페닙의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 베무라페닙은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 2a).
이에 비해, 도 2b 및 도 2c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 2b) 및 옥살리플라틴(도 2c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 3]
대장암 (colorectal cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
대장암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin) 및 카페시타빈(capecitabin)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 대장암 세포주인 HT29 세포주 또는 Colo205 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 대장암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 7] 내지 [표 9]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 3a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(50 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(50 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(50 μM) 이리노테칸(1 μM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 3b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(75 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) 시스플라틴(10 μM)
카페시타빈을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 3c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(2.5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(75 μM) -
3 카페시타빈 단독처리군 - - 카페시타빈 (10 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(2.5 μM) 펜포르민(75 μM) 카페시타빈 (10 μM)
그 결과, 먼저 도 3a에서 나타난 바와 같이 각각의 대장암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 이리노테칸의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 이리노테칸은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 3a).이에 비해, 도 3b 및 도 3c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 3b) 및 카페시타빈(도 3c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 4]
비소세포성폐암(NSCLC)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
비소세포성폐암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin) 및 5-플루로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 비소세포성 폐암 세포주인 A549 세포주 또는 H522 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 비소세포성폐암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 10] 내지 [표 12]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 4a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 이리노테칸(1 μM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 4b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(20 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(20 μM)
5-FU를 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 4c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
2 5-FU 단독처리군 - - 5-FU(5 μM)
3 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 5-FU(5 μM)
그 결과, 먼저 도 4a에서 나타난 바와 같이 각각의 비소세포성폐암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 이리노테칸의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 이리노테칸은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 4a).이에 비해, 도 4b 및 도 4c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 4b) 및 5-FU(도 4c)는 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 5]
유방암(Breast cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
유방암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 파클리탁셀(parclitaxel), 시스플라틴 및 독소루비신(Doxorubicin)을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 유방암 세포주인 BT549 세포주 또는 MB231 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 유방암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 13] 내지 [표 15]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
파클리탁셀을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 5a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 파클리탁셀 단독처리군 - - 파클리탁셀(50 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 파클리탁셀(50 nM)
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 5b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(1 μM)
독소루비신을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 5c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 독소루비신 단독처리군 - - 독소루비신(1 μM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 독소루비신(1 μM)
그 결과, 먼저 도 5a에서 나타난 바와 같이 각각의 유방암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 이리노테칸의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 이리노테칸은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 5a).이에 비해, 도 5b 및 도 5c에서 나타난 바와 같이 시스플라틴(도 5b) 및 독소루비신(도 5c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 6]
난소암(ovarian cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
난소암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 시스플라틴, 파클리탁셀 및 이리노테칸을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 난소암 세포주인 SK-OV-3 또는 OVCAR3 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 난소암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 16] 내지 [표 18]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 6a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(1 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(1 nM)
파클리탁셀을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 6b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 파클리탁셀 단독처리군 - - 파클리탁셀(50 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 파클리탁셀(50 nM)
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 6c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(0.5 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 이리노테칸(0.5 uM)
그 결과, 먼저 도 6a에서 나타난 바와 같이 각각의 난소암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 시스플라틴의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 OVCAR3 세포주의 경우, 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 시스플라틴은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 6a).이에 비해, 도 6b 및 도 6c에서 나타난 바와 같이 파클리탁셀(도 6b) 및 이리노테칸 (도 6c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 7]
전립선암(Prostate cancer) 에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
전립선암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 독소루비신, 도세탁셀(Docetaxel) 및 이리노테칸을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 전립선암 세포주인 PC3 세포주 또는 DU145 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 전립선암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 19] 내지 [표 21]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
독소루비신을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 7a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 독소루비신 단독처리군 - - 독소루비신(1 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 독소루비신(1 nM)
도세탁셀을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 7b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 도세탁셀 단독처리군 - - 도세탁셀(50 nM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 도세탁셀(50 nM)
이리노테칸을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 7c)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 이리노테칸 단독처리군 - - 이리노테칸(0.5 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 이리노테칸(0.5 uM)
그 결과, 먼저 도 7a에서 나타난 바와 같이 각각의 전립선암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 독소루비신의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 고시폴, 펜포르민 및 독소루비신을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제된 것을 확인하여, 독소루비신은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 7a).이에 비해, 도 7b 및 도 7c에서 나타난 바와 같이 도세탁셀(도 7b) 및 이리노테칸(도 7c)은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 8]
간암(liver cancer)에서 고시폴 및 펜포르민과의 병용 처리로 시너지 효과를 나타내는 항암제 선별
간암에 대한 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 조합을 선별하기 위해, 고시폴 및 펜포르민에 더한 항암제 후보군으로 시스플라틴 및 소라페팁을 각각 대상으로 하였다.
구체적으로, 간암 세포주인 SNU449 또는 Huh7 세포주를 각각 배양하고, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법을 수행하여 SRB 분석을 통해 간암 세포에서 세포 생장이 억제됨에 있어서 하기 [표 22] 및 [표 23]에 개시된 항암제들의 혼합 투여에 의한 항암 작용의 시너지 효과가 나타나는지 확인하였다.
시스플라틴을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 8a)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 시스플라틴 단독처리군 - - 시스플라틴(1 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 시스플라틴(1 uM)
소라페닙을 포함하는 삼중약물 처리군 실험의 설계(도 8b)
번호 시료명 항암제(μM)
1 고시폴 단독처리군 고시폴(5 μM) - -
2 펜포르민 단독처리군 - 펜포르민(100 μM) -
3 소라페닙 단독처리군 - - 소라페닙(5 uM)
4 이중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) -
5 삼중약물 처리군 고시폴(5 μM) 펜포르민(100 μM) 소라페닙(5 uM)
그 결과, 먼저 도 8a에서 나타난 바와 같이 각각의 전립선암 세포는 고시폴, 펜포르민 또는 시스플라틴의 단독 처리군 및 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 처리군에서 모두 유의적인 수준으로 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다. 그러나, 특히 OVCAR3 세포주의 경우, 고시폴, 펜포르민 및 시스플라틴을 혼합한 삼중 약물 처리군에서는 각각의 항암제를 단독 또는 이중으로 처리하는 경우에 비해 세포 증식 수준이 현저히 억제될 뿐 아니라 세포 수가 감소하여 세포 사멸 효과가 나타나는 것으로 확인하여, 시스플라틴은 고시폴 및 펜포르민과 함께 혼합하였을 때 항암 작용의 시너지 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 8a).이에 비해, 도 8b에서 나타난 바와 같이 소라페닙은 삼중약물 처리군의 세포 증식 억제 수준이 이중약물 처리군과 유사한 수준의 세포 증식 억제 효과만을 나타내므로, 삼중 약물 처리에 의한 항암 작용의 시너지 효과는 나타내지 않는 것으로 확인하였다.
[실시예 9]
비소세포성 폐암 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
고시폴 및 펜포르민과 더불어 상기 실시예들에서 선별한 항암제들을 혼합하여 삼중약물을 처리하는 것이 각각을 단독 처리하는것에 비해 시너지로 상승된 암세포 생장 억제 효과를 나타낼 수 있음을 세포 수준(In vitro)에서 확인하였으므로, 이후 생체 내(In Vivo) 수준에서도 동일한 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.
먼저, 폐암 마우스 모델을 만들기 위하여 6 내지 8 주령의 Balb/c-nu 마우스(Central Lab. Animal, Highland Heights, KY, USA)를 준비하였다. 또한, 7.5×106의 A549 세포주를 배양하고 상기 준비한 마우스에 1 ㎖ 실린지로 피하 주사하였다. 1 주 동안 마우스를 사육하여 각각 8 마리씩 총 4 군으로 나누고, 이들을 하기 [표 24] 및 [표 25]에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다. 용매 대조군, 이중약물 처리군 및 삼중약물 처리군의 마우스에는 용매 또는 약물을 매일 1회씩, 주당 6일로 경구 투여하였으며, 이리노테칸 단독처리군의 마우스에는 약물을 매일 1회씩, 주당 1일로 정맥 주사하면서, 총 49일 동안 동일 환경에서 사육하였다. 사육하면서, 매 7일마다 마우스 군의 체중 및 종양의 크기를 확인하여 평균을 구하였다. 폐암 세포 주입 후 초기 종양의 크기는 캘리퍼(calliper)를 사용하여 특정하였다. 종양 부피는 하기 [수학식 1]을 사용하여 구하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2019005913-appb-I000005
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) -
3 이리노테칸 단독투여군 - - 이리노테칸(20 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) 이리노테칸(20 ㎎/㎏/100㎕)
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) -
3 젬시타빈 단독투여군 - - 젬세타빈(40 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) 젬시타빈(40 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 이리노테칸을 투여한 실험군에서 폐암 종양이 성장하는 마우스 모델에서 종양 부피 및 무게에서 약물 처리에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 폐암 세포주 주입을 통해 폐암 종양을 이식한 마우스 모델 중 약물을 투여하지 않은 용매 대조군에서 지속적으로 종양 부피가 증가하였다. 이에 비해, 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 투여군과 이리노테칸 단독투여군은 종양 부피의 증가 크기가 다소 감소하는 경향을 나타내었고, 그 수준은 서로간 유사한 수준인 것으로 확인하였다. 그러나, 이러한 종양 부피 증가가 억제되는 효과는 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 삼중약물로 병용 투여한 경우에서 보다 시너지 효과를 나타내어, 총 7주간의 폐암 마우스 모델 사육 후에도 유의적으로 종양이 증가하지 않음을 확인하였다(도 9a). 사육 종료 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 9b 및 도 9c).
반면, 도 10에서 나타난 바와 같이, 젬시타빈 투여 실험군의 경우에는 삼중 약물 투여에 의한 항암 시너지 효과가 나타나지 않았다(도 10). 젬시타빈 단독 투여군은 용매 투여군과 유사한 수준으로 종양이 성장하였으며, 고시폴 및 펜포르민의 이중 약물 투여군에서 유의적인 종양 성장 억제 효과를 나타내는 것으로 확인하였다. 이와 함께, 고시폴 및 펜포르민에 젬시타빈을 더해 삼중으로 약물을 투여함에도 불구하고, 이중 약물 투여군과 종양 크기의 성장 수준이 유사한 정도인 것으로 확인하였다.
[실시예 10]
흑색종 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
본 발명의 항암제 병용 투여에 의한 시너지 효과를 생체 내에서 다시 한번 확인하기 위해, 흑색종을 이종이식한 마우스 모델에 항암제 조합을 투여하였다.
구체적으로, 흑색종 마우스 모델은 상기 [실시예 9]에서 폐암 마우스 모델을 제조하는 방법과 동일하되, A375 세포를 이종이식하여 흑색종 모델을 제조하였다. 그런 다음, 제조된 흑색종 마우스 모델을 하기 [표 26]에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) -
3 베무라페닙 단독투여군 - - 베무라페닙(30 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) 베무라페닙(30 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이 흑색종 세포주의 이종이식으로 인해 종양이 성장하는 마우스 모델에서 종양 부피 및 무게가, 항암제 약물 처리에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 용매 대조군에 비해, 고시폴 및 펜포르민의 이중약물 투여군과 베무라페닙 단독투여군은 종양 부피의 증가 크기의 수준이 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 그러나, 이러한 종양 부피 증가가 억제되는 효과는 고시폴, 펜포르민 및 베무라페닙을 삼중약물로 병용 투여한 경우에서 보다 시너지 효과를 나타내는 것으로 확인하였다(도 11a). 사육 종료 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 11b 및 도 11c).
[실시예 11]
위암 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
본 발명의 항암제 병용 투여에 의한 시너지 효과를 생체 내에서 다시 한번 확인하기 위해, 위암을 이종이식한 마우스 모델에 항암제 조합을 투여하였다.
구체적으로, 위암 마우스 모델은 상기 [실시예 9]에서 폐암 마우스 모델을 제조하는 방법과 동일하되, SNU638 세포(1.5×107)를 이종이식하여 위암 마우스 모델을 제조하였다. 그런 다음, 제조된 위암 마우스 모델을 하기 [표 27]에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 고시폴 단독투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) - -
3 펜포르민 단독투여군 - 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) -
4 이중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) -
5 이리노테칸 단독투여군 - - 이리노테칸(30 ㎎/㎏/100㎕)
6 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) 이리노테칸(30 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이 용매 대조군, 고시폴 단독투여군 및 펜포르민 단독 투여군은 위암 종양의 성장 수준이 유사한 수준인 것으로 확인하였다(도 12a 및 도 12b). 이에 비해, 이중약물 투여군 및 이리노테칸 투여군은 종양의 성장 수준이 유의적으로 감소하였다. 또한, 고시폴, 펜포르민 및 이리노테칸을 모두 혼합하여 병용 투여한 삼중 약물 투여군에서는 종양 성장이 거의 나타나지 않은 것으로 확인하였다. 총 35일간 사육한 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 12b 및 도 12c).
[실시예 12]
전립선암 모델에서 고시폴 및 펜포르민의 병용 투여에 의한 항암 효과의 확인
본 발명의 항암제 병용 투여에 의한 시너지 효과를 생체 내에서 다시 한번 확인하기 위해, 전립선암을 이종이식한 마우스 모델에 항암제 조합을 투여하였다.
구체적으로, 전립선암 마우스 모델은 상기 [실시예 9]에서 폐암 마우스 모델을 제조하는 방법과 동일하되, PC3 세포(5×106)를 이종이식하여 전립선암 마우스 모델을 제조하였다. 그런 다음, 제조된 전립선암 마우스 모델을 하기 [표 287에 정의된 바와 같이 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.
번호 명칭 투여 조성
1 용매대조군 용매(5% DMSO, 5% cremophor in PBS, 100 ㎕)
2 이중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) -
3 독소루비신 단독투여군 - - 독소루비신(5 ㎎/㎏/100㎕)
4 삼중약물 투여군 고시폴(80 ㎎/㎏/100㎕) 펜포르민(100 ㎎/㎏/100㎕) 독소루비신 (5 ㎎/㎏/100㎕)
그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이 용매 대조군에 비해 이중약물 투여군 및 독소루비신 단독 투여군이 유의적으로 종양 성장 억제가 유도된 것으로 확인하였으며, 이에 더하여 삼중 약물 투여군에서의 종양 성장 수준이 가장 낮은 것으로 확인하였다(도 13a 및 도 13b). 총 16일간 사육한 후, 마우스를 희생하여 종양 크기 및 무게를 비교하였을 때에도, 삼중약물 투여군의 종양 무게 및 크기가 다른 대조군 및 투여군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 13b 및 도 13c).
이와 같이, 본 발명에서는 고시폴 및 펜포르민과 함께 병용 투여하여 항암 효과의 시너지 활성을 나타낼 수 있는 항암제 조합을 선별하였다. 암종에 따라 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항암제 조합이 각기 다르며, 이를 요약하면 하기 [표 29]에서 나타난 바와 같다.
고시폴 및 펜포르민과 함께 병용 투여하여 시너지 효과 나타내는 약물
암 종 시너지 효과 유 시너지 효과 무
신장암 소라페닙 수니티닙 , 파조파닙
흑색종 베무라페닙 시스플라틴, 옥살리플라틴
대장암 이리노테칸 시스플라틴 , 카페시타빈
폐암 이리노테칸 시스플라틴, 5-FU
유방암 파클리탁셀 시스플라틴, 독소루비신
난소암 시스플라틴 파클리탁셀, 이리노테칸
전립선암 독소루비신 도세탁셀, 이리노테칸
간암 시스플라틴 소라페닙
위암 이리노테칸 -
본 발명자들은 고시폴 및 펜포르민과 함께 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib) 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 또는 독소루비신(Doxorubicin)을 혼합하였을 때, 다양한 암종에서 암세포 증식 억제 효과, 및 암 전이 억제 효과가 현저히 상승하였고, 마우스 모델에 이종이식된 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Claims (17)

  1. 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin), 및 항암제를 유효성분으로 포함하고,
    상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 고시폴은 하기 [화학식 1]의 화합물인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019005913-appb-I000006
    .
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 펜포르민은 하기 [화학식 2]의 화합물인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019005913-appb-I000007
    .
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 고시폴, 펜포르민, 및 항암제를 0.1 내지 10 : 10 내지 500 : 1의 몰비율로 혼합하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 암줄기세포를 포함하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin), 및 항암제를 유효성분으로 포함하고,
    상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나인, 암 전이 억제용 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 전이 억제용 약학적 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 암은 암줄기세포를 포함하는 것인, 암 전이 억제용 약학적 조성물.
  10. 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin), 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물로 암을 치료하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나인, 암을 치료하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암을 치료하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 암은 암줄기세포를 포함하는 것인, 암을 치료하는 방법.
  14. 고시폴(gossypol), 펜포르민(phenformin), 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 암 치료 용도.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 항암제는 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(Vemurafenib), 이리노테칸(irinotecan), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(parclitaxel) 및 독소루비신(Doxorubicin) 중 어느 하나인, 암 치료 용도.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 암은 신장암, 간암, 전립선암, 흑색종, 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 혈액암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 치료 용도.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 암은 암줄기세포를 포함하는 것인, 암 치료 용도.
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