WO2016048005A2 - 신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체 및 그의 용도 - Google Patents

신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체 및 그의 용도 Download PDF

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    • C07C225/16—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated and containing six-membered aromatic rings
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    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention was made by 2015R1A5A6001906 under the support of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Food and 2015R1A5A6001906 under the support of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Ministry of Education, Science and Technology.
  • the title of research project is” Individually recognized health functional food raw materials for weight control and metabolic disease improvement using Korean gin extract ", the host institution is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group, research period is 2013.11.27 ⁇ 2014.10.26, No.
  • BMI> 25 Approximately 25% of the world's population is currently overweight (BMI> 25), and more than 300 million people in the Western region, including 120 million in the major markets of the United States, Europe and Japan, are obese (BMI> 30).
  • BMI> 30 are classified as The highest percentage of obesity among the OECD countries is the United States, with 31% of the population being obese, followed by Mexico (24%), the United Kingdom (23%), Greece (22%), Australia (22%), New Zealand (21%), Hungary (19%), Canada (14%), Spain (13%), Ireland (13%), Germany (13%), Portugal (13%), Finland (13% 0, Turkey ( 12%), followed by Belgium (12%), with a high proportion of obese patients in China, with 70 million people being obese, and the market for weight control rapidly expanding, with a total market size of 10 billion yuan.
  • Non-alcoholic fatty liver disease refers to a disease in which triglycerides accumulate in the liver regardless of drinking, and include steatosis and non-alcoholic steatohepatitis (NFLD). NASH). Simple fatty liver is considered to be a benign disease with a good prognosis, but NASH with inflammation or fibrosis along with fatty liver has been recognized as a proliferative disease that causes cirrhosis or liver cancer as a progressive liver disease.
  • Obesity and insulin resistance are risk factors for representative nonalcoholic fatty liver disease.
  • Risk factors for progression of hepatic fibrosis include obesity (BMI> 30), blood liver function index (AST / ALT> 1) and diabetes, especially if hepatitis C carriers are non-alcoholic fatty liver.
  • BMI> 30 obesity
  • AST / ALT> 1 blood liver function index
  • diabetes especially if hepatitis C carriers are non-alcoholic fatty liver.
  • the need for prevention and treatment is emerging. 69-100% of nonalcoholic fatty liver patients are obese, 20-40% of obese patients are accompanied by nonalcoholic fatty liver, and in particular, the prevalence of liver disease in male obese patients is higher than that of female obese.
  • In Western society 3-30% of normal weight adults as well as obese patients are reported to have non-alcoholic fatty liver disease.
  • Non-alcoholic fatty liver is a problem not only in adults but also in obese children. 10-77% of obese children (resident in Europe, USA and Asia) show nonalcoholic fatty liver lesions because obesity is the most important risk factor for nonalcoholic liver disease.
  • Obesity treatments sold at home and abroad include 'Zenical' (Roche Korea), the main ingredient of orlistat, approved by the US FDA, 'Reductyl' (Ilsung New Drug), which is based on sibutramine, and green tea catechol. Exorije '(Savior Pharmaceuticals).
  • Xenical which inhibits lipase action, causes gastrointestinal side effects such as fatty stool, gas production, and decreased fat-soluble vitamin absorption. And side effects.
  • many products developed as anti-obesity drugs have been banned due to serious side effects.
  • aminophylline has been reported to have a wide range of side effects in the mental nervous system, the circulatory system, and the digestive system, despite its excellent body fat-degrading effect. The sale was forbidden.
  • the conventional synthetic drugs show limitations due to side effects, there is a growing demand for the development of a new composition for treating obesity, which is safe and can be taken for a long time, and is suitable for the treatment of chronic diseases.
  • the present inventors have made diligent research efforts to develop compounds having a prophylactic or therapeutic activity for metabolic diseases including obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome.
  • the novel pentadienoyl piperidine derivative having the structure of Formula 1 has a prophylactic and therapeutic effect on the lipid metabolism disease by reducing the body fat and blood sugar and greatly improving the indicators of various metabolic diseases
  • the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic diseases selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome.
  • Still another object of the present invention is to provide a food composition for improving or alleviating metabolic diseases selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing, ameliorating or treating metabolic diseases selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome.
  • the present invention provides a pentadienoyl piperidine derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • R 1 is a C 1 -C 3 alkyl group.
  • the present inventors have made diligent research efforts to develop compounds having a prophylactic or therapeutic activity for metabolic diseases including obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome.
  • the novel pentadienoyl piperidine derivative having the structure of Formula 1 has a prophylactic and therapeutic effect on the lipid metabolism disease by reducing the body fat and blood sugar and greatly improving the indicators of various metabolic diseases Found.
  • alkyl refers to a straight or branched saturated hydrocarbon group, and includes, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, etc.
  • C 1 -C 3 alkyl refers to alkyl units having 1 to 3 carbon atoms. Is an alkyl group, and when C 1 -C 3 alkyl is substituted, the carbon number of the substituent is not included.
  • R 1 of Formula 1 is a methyl group.
  • the compounds of the present invention may be used in the form of pharmaceutically acceptable salts, and acid salts formed by pharmaceutically acceptable free acids are useful as salts.
  • acid salts formed by pharmaceutically acceptable free acids are useful as salts.
  • Inorganic acids and organic acids can be used as the free acid.
  • pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the invention include hydrochloride, bromate, sulfate, phosphate, citrate, acetate, trifluoroacetate, lactate, tartarate, maleate, fumarate, gluconate, Methanesulfonate, glyconate, succinate, 4-toluenesulfonate, gluturonate, embonate, glutamate, or aspartate, but may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto All salts formed using various inorganic and organic acids are included.
  • the compounds of the invention may also exist in the form of solvates (eg hydrates).
  • the present invention provides an obesity, diabetes mellitus, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome comprising the pentadienoyl piperidine derivative of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic disease (metabolic disease) selected from the group consisting of (insulin resistance syndrome).
  • metabolic disease metabolic disease
  • the compounds of the present invention inhibit the differentiation of fat precursor cells, reduce body weight and visceral fat, reduce blood lipid concentration, improve blood liver function index, reduce blood sugar as well as metabolic inflammation It was confirmed that the reaction was suppressed. Accordingly, the compounds of the present invention can be usefully used as an effective prophylactic or therapeutic composition that variously improves various metabolic diseases.
  • diabetes refers to a chronic disease characterized by a relative or absolute lack of insulin resulting in glucose-intolerance.
  • Diabetes of the present invention includes all types of diabetes, including, for example, type 1 diabetes, type 2 diabetes and hereditary diabetes.
  • Type 1 diabetes is insulin dependent diabetes mellitus, mainly caused by the destruction of ⁇ -cells.
  • Type 2 diabetes is insulin-independent diabetes, caused by insufficient insulin secretion after meals or by insulin resistance.
  • dislipidemia is a concept including hyperlipidemia, and hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, low HDL-cholesterolemia, which is indicated by an increase in the level of fat in the blood, and metabolic abnormalities of lipoproteins. An abnormal lipid condition that is a problem.
  • fatty liver refers to a condition in which fat accumulates in hepatic cells due to adipose metabolism disorder of the liver, which causes various diseases such as angina pectoris, myocardial infarction, stroke, arteriosclerosis, fatty liver and pancreatitis. .
  • insulin resistance refers to the inability of insulin to lower blood sugar and thus the cells not effectively burning glucose.
  • insulin resistance is high, the body produces too much insulin, which can lead to high blood pressure or dyslipidemia, as well as heart disease and diabetes.
  • type 2 diabetes does not notice an increase in insulin in the muscles and adipose tissue, so the action of insulin does not occur.
  • insulin resistance syndrome is a generic term for the disease caused by insulin resistance, and the resistance of cells to insulin action, hyperinsulinemia and very low density lipoprotein (VLDL) and neutrality. It is a disease characterized by an increase in fat, a decrease in high density lipoprotein (HDL), and high blood pressure, and is a concept recognized as a risk factor for cardiovascular disease and type 2 diabetes (Reaven GM, Diabetes, 37). : 1595-607, (1988). Insulin resistance is also known to increase atherosclerosis by increasing intracellular oxidative stress and altering signaling systems, along with risk factors such as hypertension, diabetes and smoking (Freeman BA et al, Lab Invest 47). : 412-26, (1982)), Kawamura M et al, J Clin Invest 94: 771-8, (1994).
  • metabolic disease is a conceptualization of a group of cardiovascular disease and type 2 diabetes risk factors clustered with one disease group, insulin resistance and related various complex metabolic disorders and clinical It is a concept that encompasses all aspects.
  • Reaven insisted that the common cause of these symptoms was insulin resistance in the body, which is poorly insulin-induced, and called it insulin resistance syndrome.
  • WHO World Health Organization
  • treatment means (a) inhibiting the development of a disease, disorder or condition; (b) alleviation of a disease, illness or condition; Or (c) eliminating a disease, condition or symptom.
  • the composition of the present invention serves to inhibit, eliminate or alleviate the development of the symptoms of metabolic disease. Accordingly, the composition of the present invention may be itself a composition for treating metabolic diseases, or may be administered together with a composition for treating other metabolic diseases and applied as a therapeutic aid for these diseases.
  • treatment or "therapeutic agent” in this specification includes the meaning of "therapeutic assistant” or "therapeutic assistant”.
  • the dyslipidemia treated or prevented with the composition of the present invention is hyperlipidemia.
  • hyperlipidemia refers to a disease caused by a large amount of fat in the blood due to poor metabolism of triglycerides and cholesterol. More specifically, hyperlipidemia includes hypercholesterolemia or hypertriglyceridemia with high incidence with increased lipid components such as triglycerides, LDL cholesterol, phospholipids and free fatty acids in the blood.
  • the fatty liver to be treated or prevented with the composition of the present invention is non-alcoholic fatty liver.
  • non-alcoholic fatty liver refers to a disease in which excessive amounts of fat accumulate in liver cells regardless of excessive alcohol absorption.
  • the composition of the present invention reduces adipocyte differentiation. More specifically, the compositions of the present invention reduce blood fat, liver fat or visceral fat. Even more specifically, the visceral fat includes one or more fats selected from epididymal fat, perirenal fat, mesenteric fat, and celiac fat.
  • liver and intestine in the present invention include cells or tissue, respectively.
  • the composition of the present invention reduces the activity of alanine aminotransferase (ALT) or aspartate aminotransferase (AST) in the blood.
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • the composition of the present invention significantly reduced the amount of ALT and AST in the blood by 60-65%, respectively, than in the high-fat diet, thereby significantly alleviating fatty liver, more specifically non-alcoholic fatty liver phenomenon, It was confirmed to have an effect of improving.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like. It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. Specifically, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response to response of the patient. Can be.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.001-100 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or may be in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the invention consists of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome comprising the pentadienoyl piperidine derivative of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient It provides a food composition for improving or alleviating metabolic diseases selected from the group.
  • the composition of the present invention when made of a food composition, it includes not only the piperine derivative of the present invention as an active ingredient, but also components commonly added in the manufacture of foods, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings. And flavoring agents.
  • the above carbohydrates are conventional monosaccharides such as glucose, fructose and other disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like.
  • Phosphorous sugar and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural flavoring agents [tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food composition of the present invention is prepared with a drink, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, tofu extract, jujube extract, licorice extract, etc. are added in addition to piperonal which is an active ingredient of the present invention. It can be included as.
  • the present invention provides an obesity comprising administering to a subject in need thereof a composition comprising a pentadienoyl piperidine derivative of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • a method for preventing, ameliorating or treating metabolic disease selected from the group consisting of diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome.
  • administration refers to the formation of the same amount in a subject's body by directly administering a therapeutically effective amount of a composition of the invention to an individual in need thereof (i.e., the subject). Say what you can.
  • administration includes the injection of the active ingredient (pentadienoyl piperidine derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof) of the present invention into the lesion site, so that the term “administer” is equivalent to "inject". Used in the sense.
  • a “therapeutically effective amount” of a composition means that the content of the extract is sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to the individual to whom the composition is to be administered, and includes a “prophylactically effective amount” as used herein.
  • the term “individual” includes, without limitation, human, mouse, rat, guinea pig, dog, cat, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, baboon, or rhesus monkey, specifically, an individual of the present invention is a human to be.
  • the present invention provides a novel pentadienoyl piperidine derivative, a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases including the same, a functional food composition for improving or alleviating metabolic diseases and a metabolic disease using the composition Provide prevention, amelioration or treatment.
  • Pentadienoyl piperidine derivatives of the present invention inhibit the differentiation of fat precursor cells, reduce body weight and visceral fat, decrease blood lipid concentration, improve blood liver function index, and reduce blood sugar
  • it can be usefully used as a pharmaceutical or functional food composition showing the prophylactic or therapeutic activity of metabolic diseases selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome by inhibiting metabolic inflammatory reactions. .
  • Figure 1 shows the effect of inhibiting the differentiation of the novel pentadienoyl piperidine compound (Fig. 1a, LJ-2501; Fig. 1b, LJ-2488; Fig. 1c, LJ-2495; Fig. 1d, LJ-2496) in 3T3L1 cells Figure shown.
  • *, ** Student's t -test showed significant differences in DMSO treatment-control with * P ⁇ 0.05 and ** P ⁇ 0.01, respectively.
  • FIG. 2 is a diagram showing the SIRT1 activation capacity of LJ-2501, the enzyme reaction rate (FIG. 2B) and coenzyme (NAD) according to the SIRT1 activity (Fig. 2A), substrate (p53-382) concentration according to the concentration of LJ-2501, respectively + ) Shows the enzyme reaction rate (Fig. 2c) according to the concentration.
  • Figure 3 is a diagram showing the weight gain of the mice fed the experimental diet, weight change over time (Fig. 3a), weight gain during the 10-week experimental breeding period (Fig. 3b) and dietary intake (Fig. 3c) Indicates. Each value is the mean ⁇ standard error of 8 mouse measurements. The letters on the graph bars represent significant differences at P ⁇ 0.001 by one-way ANOVA and Duncan multirange test.
  • Figure 4 shows the phantom picture and visceral fat weight of each area of the mice fed the experimental diet.
  • Figure 5 shows the blood lipid concentration of the mice ingested the experimental diet. Letters in the same column represent significant differences at P ⁇ 0.05 by one-way ANOVA and Duncan multirange test.
  • Figure 6 is a picture showing a liver tissue picture (Fig. 6a) and liver weight (Fig. 6b) of the mouse. Each value is the mean ⁇ standard error of 8 mouse measurements. Letters in the same column represent significant differences at P ⁇ 0.05 by one-way ANOVA and Duncan multirange test.
  • Figure 7 is a diagram showing the liver tissue lipid concentration (triglyceride, cholesterol (Fig. 7a), free fatty acid (Fig. 7b)) and liver function indicators (Fig. 7b) of the mouse. Letters in the same column represent significant differences at P ⁇ 0.05 by one-way ANOVA and Duncan multirange test.
  • FIG. 8 is a diagram showing the concentration of cytokine in the mouse, IL-6, TNF- ⁇ (Fig. 8a), MCP-1, leptin (Fig. 8b), respectively. Letters in the same column represent significant differences at P ⁇ 0.05 by one-way ANOVA and Duncan multirange test.
  • FIG. 9 shows oral glucose tolerance test results in mice fed the experimental diet, oral glucose tolerance (FIG. 9A), AUC (FIG. 9B), fasting blood glucose (FIG. 9C), fasting blood insulin (FIG. 9D) and insulin resistance, respectively.
  • Indicator HOMA-IR, FIG. 9E is shown. Letters in the same column represent significant differences at P ⁇ 0.05 by one-way ANOVA and Duncan multirange test.
  • FIG. 10 is a diagram showing a change in gene expression related to adipose tissue production of mouse visceral adipose tissue.
  • the top panel is a representative gel picture of RT-PCR analysis and the bottom panel shows the relative expression levels of these genes.
  • FIG. 11 is a diagram showing the expression of genes related to heat generation of mouse visceral adipose tissue.
  • the top panel of FIG. 11A is a representative gel picture of RT-PCR analysis and the bottom panel shows the relative expression levels of these genes. Data was normalized based on GAPDH mRNA and all expression levels are relative to ND mice.
  • FIG. 12 is a diagram showing the change in the expression of the adipogenesis-related genes of mouse liver tissue.
  • the top panel of FIG. 12A is a representative gel picture of RT-PCR analysis and the bottom panel shows the relative expression levels of these genes. Data was normalized based on GAPDH mRNA and all expression levels are relative to ND mice.
  • Example 2 mouse Adipose precursor cell line (3T3-L1) Used LJ -2501 Inhibitory Effect of Adipocyte Differentiation
  • Adipocyte 3T3L1 cells were dispensed in 12-well plates and 37 ° C., 5% CO 2 using DMEM medium supplemented with 1% penicillin-streptomycin, 1% non-essential amino acids and 10% fatal bovine serum (FBS). Incubate until grown confluent in the incubator. Confluent 3T3L1 cells were cultured for two days in a culture medium containing 0.5 mM isobutyl-methylxanthine, 1 ⁇ M dexamethasone (MDI), and 1 ⁇ g / ml insulin to form differentiated adipocytes.
  • MDI dexamethasone
  • the cells were differentiated into mature adipocytes while incubated for two more days in a DMEM medium containing 1 ⁇ g / ml insulin. Subsequently, the cells were further cultured for 10 days while replacing the DMEM medium at two-day intervals to form fully differentiated stem cells.
  • a total of four new compounds were treated to the culture medium at different concentrations every two days from the first day of differentiation by adding DMI to 3T3-L1 cells.
  • the structures and molecular weights of the four novel compounds are shown in Table 1.
  • Derivative compounds were dissolved in DMSO, and negative controls containing only DMSO were included in the experiment. After incubation for a total of 14 days, the culture solution was removed at the time of differentiation was completed, and stained fat cells contained in the differentiated adipocytes. To do this, wash the cells twice with PBS (phosphate buffered saline), fix the cells with 10% buffered neutral formalin for 1 hour, wash once again with PBS, and then oil-red-O which specifically stains fat.
  • PBS phosphate buffered saline
  • SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit BML-AK555, ENZO Life Sciences Inc., NY, USA.
  • SIRT1 activity was measured as a result showed the maximum activity at 600 ⁇ M concentration (Fig. 2).
  • Enzyme kinetics were measured by increasing the concentration of substrate (p53-382) or coenzyme (NAD + ) with LJ2501 (600 ⁇ M), and the LJ2501 showed no change in Vmax value.
  • Example 4 using a mouse LJ -2501 Compounds Reduce Body Weight and Visceral Fat
  • the obesity induction diet used in this experiment was a high fat diet (HFD: 40% calorie, 17 g lard + 3% corn oil / 100 g diet), LJ-2501, LJ-2488, LJ-2495, The diet supplemented with LJ-2496 compound had the same composition as HFD but contained 0.05% of each compound (Table 2).
  • HFD high fat diet
  • Libut the obese drug sibutramine
  • Chow normal diet group
  • mice 40 male 5-week-old C57BL / 6J mice (Orient, Korea) were adapted to the laboratory environment for 1 week with solid feed, followed by normal diet group, high-fat diet control group, two kinds of test substance group, and two kinds according to the egg mass method.
  • the diet was fed daily with water between 10 and 11 am, the dietary intake was measured daily and the body weight was measured weekly. Body weight was measured 2 hours after removing the feed container to prevent sudden weight change due to feed intake.
  • blood, liver, and visceral fat tissue were collected under anesthesia with diethyl ether to prepare 0.1 M phosphate buffer solution (pH). 7.4), and then weighed. Blood collected from the abdominal aorta was centrifuged at 1000 x g for 15 minutes to separate plasma.
  • the final body weight and weight gain after 10 weeks of intake of the experimental diet was 60% significantly lower in the cumulative weight gain in the LJ-2501 supplemented group compared to the high fat diet control group (HFD).
  • the weight loss effect was significantly superior to LJ-2488 (-14%) and better than the control drug sibutramine (-33%).
  • the dietary intake of mice fed LJ-2501 was not different from the HFD control group, and thus, the anti-obesity effect of LJ-2501 was not due to decreased appetite (FIG. 3).
  • Example 5 LJ And prevention of hyperlipidemia of -2501 compound
  • Plasma total cholesterol, triglyceride, glucose concentration, and lipid components of liver tissues were measured in experimental animals bred for 10 weeks. Plasma total cholesterol, triglyceride and free fatty acid concentrations were measured twice each using a commercial clinical kit.
  • Plasma lipid concentrations of mice fed the experimental diet for 10 weeks were 34% triglyceride concentration, 35% total cholesterol concentration (35%) and LDL + VLDL cholesterol in the LJ2501 intake group compared to the high-fat diet control group (HFD).
  • the concentration of 27% (FIG. 5B) and free fatty acid concentrations of 69% were significantly decreased (FIG. 5C).
  • blood HDL cholesterol concentration was not significantly different between the HFD group and all experimental groups (Fig. 5b).
  • the LJ-2501's triglyceride, cholesterol, and free fatty acid concentration reduction effects were much better than that of LJ-2488 and better than the control drug sibutramine. Therefore, it can be seen that the LJ2501 compound has an excellent effect on improving hyperlipidemia induced by high fat diet.
  • Example 6 LJ -2498 of compound Non-Alcoholic Fatty Liver Prevention and Treatment Benefits
  • the dried lipid was dissolved in 1 mL of methanol and used for lipid component analysis.
  • Triglyceride and cholesterol concentrations of hepatic lipid extracts were measured using the same commercial lipid analysis kit (Bio Clinical System) used for the analysis of plasma.
  • GOT glutamate oxaloacetate transferase
  • GPT glutamate pyruvate transferase
  • FIG. 6A A photograph of liver tissue extracted from mice fed with an experimental diet for 10 weeks is shown in FIG. 6A.
  • HFD high-fat diet control group
  • mice fed the LJ2501 compound may have a smaller liver and darker color than the HFD group, suggesting that fatty liver was alleviated.
  • the LJ2501 intake group was significantly reduced 41% compared to the high-fat diet control group (Fig. 6b).
  • the lipid concentrations of liver tissue were significantly lower in the LJ2501 intake group than in the high-fat diet control group (HFD), 35% in neutral fat, 53% in cholesterol and 77% in free fatty acid, and measured in blood.
  • Hepatic function index (alanine aminotransferase, ALT; aspartate aminotransferase, AST) was also significantly reduced by 60-65% (FIGS. 7A and 7B).
  • the effect of LJ-2501 on the reduction of hepatic triglyceride and free fatty acid concentrations was much better than that of LJ-2488 and better than the control drug sibutramine. Therefore, it can be seen that the LJ2501 compound significantly alleviates the fatty liver phenomenon in high fat diet-induced obesity.
  • Example 7 LJ Of -2501 compound Metabolic inflammatory response Inhibitory effect
  • TNF ⁇ , MCP-1, IL-6, leptin and insulin concentrations in plasma were measured by ELISA method, using a mouse Adipokine Magnetic Bead Panel kit (MADKMAG-71K, EMD Millipore Corporation, MA, USA).
  • TLR4 toll-like receptor4
  • TLR4 toll-like receptor4
  • IKK is activated to activate NF-kB
  • TNF- ⁇ is an inflammatory cytokine.
  • IL-6 is known to promote the secretion of inflammatory reactions.
  • TNF- ⁇ and IL-6 activate SOCS3 (cytokine signaling 3) and JNK to phosphorylate the serine residues of the insulin receptor substrate (IRS) to inhibit sugar transport, and insulin resistance in peripheral tissues such as liver or muscle. It is known to induce.
  • SOCS3 cytokine signaling 3
  • JNK insulin receptor substrate
  • the LJ2501 intake group showed 38% IL-6, 25% TNF- ⁇ (Fig. 8A), 22% MCP-1, and 25 leptin compared to the high-fat diet control group (HFD). % Significantly decreased (FIG. 8b), and the effect of reducing the inflammatory cytokine concentration of LJ-2501 was found to be superior to LJ-2488.
  • Example 8 LJ Of -2501 compound Type 2 diabetes Prevention and Treatment Benefits
  • the animals were fasted for 18 hours, and then d-glucose corresponding to 2 g / kg body weight was orally administered. After 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes, blood was passed through the tail vein of the mouse. Was taken. Glucose concentrations of the collected blood were measured using a strip-acting glucose sensor (ONETOUCH Ultra, Inverness Medical Ltd. Stockport, UK).
  • Blood glucose was measured by oral administration of 2 g glucose / 10 ml distilled water / kg BW at 15, 30, 60, and 120 minute intervals in the tail vein. The concentration was decreased compared to the HFD group, and the AUC (area under the curve) value for the blood glucose concentration was reduced by 35% in the LJ2501 compound group compared to the HFD group. On the other hand, fasting blood glucose was significantly reduced by 20% compared to HFD group, and blood insulin concentration was 59% significantly lower than that of HFD group. The calculated insulin resistance indicator (HOMA-IR) was also significantly reduced in percent (FIG. 9). Therefore, it can be seen that LJ2501 compound has an excellent effect on improving oral glucose tolerance and improving fasting glucose-induced fasting by fat diet. The effect of LJ2501 compound on improving insulin resistance and type 2 diabetes is LJ2488, and control. It was found to be significantly superior to sibutramine used as a drug.
  • Example 9 LJ Of -2501 compound Anti-obesity And mechanism of regulating metabolic disease
  • Tissue was ground by adding 1 ml of Trizol solution per 0.1 g of epididymal adipose tissue, and then centrifuged at 12,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was transferred to a new tube and 200 ⁇ l of chloroform was added and vortexed. After repeating this process twice, the supernatant was transferred to a new tube, and isopropanol and supernatant were added at a 1: 1 ratio.
  • RNA samples extracted at 260 nm and 280 nm wavelengths was measured using a UV / VIS spectrophotometer (Beckman coulter, DU730), and agarose gel electrophoresis was performed to check the quality of RNA samples.
  • RNA samples extracted from epididymal adipose tissue were synthesized by performing reverse transcription using oligo dT primers and Superscript reverse transcriptase (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA). PCR was performed using primers on the 5 'and 3' flanking sequences of the gene cDNA to be amplified using the synthesized cDNA, and the primer sequences used were shown in Table 3. 1 ⁇ l of the amplified PCR product was electrophoresed on 1% agarose gel to confirm DNA bands.
  • Primer sequence gene primer Sequence 5'3 ') Annealing Temperature (°C) PCR Product (bp) Peroxisome proliferator activated receptor gamma 2 (PPAR ⁇ 2) F TTCGGAATCAGCTCTGTGGA 55 148 R CCATTGGGTCAGCTCTTGTG CCAAT / enhancer binding protein alpha (C / EBP ⁇ ) F TCGGTGCGTCTAAGATGAGG 55 187 R TCAAGGCACATTTTTGCTCC CD36 antigen (CD36) F ATGACGTGGCAAAGAACAGC 55 160 R GAAGGCTCAAAGATGGCTCC Fatty acid synthase (FAS) F TTGCCCGAGTCAGAGAACC 55 171 R CGTCCACAATAGCTTCATAGC Lipoprotein lipase (leptin) F CTCCAAGGTTGTCCAGGGTT 55 143 R AAAACTCCCCACAGAATGGG Cytochrome C oxidase subunit 2 (COX2) F CCGAGTCGTTCTGCCAATAG 55
  • Adipogenesis is a process in which adipocytes (preadipocytes) are transformed into mature adipocytes through proliferation and differentiation, and are accompanied by morphological changes and changes in gene expression patterns.
  • lipids accumulate and genes specific to adipose tissues such as fatty acid binding protein (aP2), lipoprotein lipase (LPL), and fatty acid synthase (FAS) are expressed.
  • AP2 fatty acid binding protein
  • LPL lipoprotein lipase
  • FAS fatty acid synthase
  • Three transcription factors play a central role: peroxisome proliferator activated receptor gamma, C / EBPs (CCAAT enhancer-binding proterins) and SREBP-1c (sterol regulatory binding protein-1c).
  • LJ2501 supplement intake can be seen that contributes to the suppression of visceral fat mass by reducing the nuclear transcription factor and its target gene expression that plays a pivotal role in the production of adipose tissue in visceral adipose tissue (Fig. 10).
  • Mitochondrial dysfunction is associated with aging, heart disease, gastrointestinal disorders, endocrine disorders, and neurological disorders.
  • Mitochondrial oxidative disorders are known to increase fatty acid glucose production and lead to fatty liver, resulting in hypertriglyceridemia.
  • Mitochondria form a proton concentration gradient between the mitochondrial inner and outer membranes using an electron transfer system, and form ATP through F0F1-ATPase as a driving force.
  • F0F1-ATPase does not work properly, the proton gradient is resolved through uncoupling proteins (UCPs) and heat is generated during this process.
  • UCPs uncoupling proteins
  • PKA protein kinase A
  • SIRT1 sirtuin 1
  • LJ2501 Supplementary intake of LJ2501 increased PGC-1 ⁇ , SIRT1, and UCP1 gene expressions of visceral adipose tissue, which were reduced by high-fat diets, to levels similar to those of the Chow group, and increased phosphorylation of CREB protein.
  • LJ2501 intake can be seen that the anti-obesity effect by significantly improving the inhibition of heat generation induced by obesity in visceral adipose tissue (Figs. 11a and 11b).
  • Mitochondrial biosynthesis plays an important role in improving mitochondrial heat-generating ability in addition to allied respiration.
  • PGC-1 ⁇ activates nuclear respiratory factor-1 (NRF-1) and the latter plays an important role in mitochondrial biosynthesis by activating the promoter of the electron transport system COX2 (cytochrome C oxidase subunit 2).
  • NRF-1 nuclear respiratory factor-1
  • COX2 cytochrome C oxidase subunit 2
  • TFAM mitochondrial transcription factor A
  • LJ2501 uptake was found to play a role in increasing mitochondrial biosynthesis by increasing the expression of NRF-1, COX2, TFAM, which plays an important role in mitochondrial biosynthesis (Fig. 11a).
  • the liver receptor X ⁇ (SREBP1c) signaling system is known to be a major pathway for inducing fatty liver in liver tissue. That is, LXR ⁇ , together with SREBP-1c, is a nuclear transcription factor that regulates liposynthesis in liver tissue, and regulates the expression of liposynthetic genes such as lipoprotein lipase (LPL), FAS, and acetyl-CoA carboxylas (ACC).
  • LPL lipoprotein lipase
  • FAS acetyl-CoA carboxylas
  • ACC Activated AMP-activated protein kinase
  • AMPK Activated AMP-activated protein kinase inhibits LXR ⁇ promoter activity and consequently improves fatty liver.
  • HFD-induced mice significantly decreased AMPK phosphorylation in liver tissue compared to Chow group, and the expression of liposynthetic genes such as LXR ⁇ , SREBP-1c, LPL, FAS and ACC were significantly increased.
  • liposynthetic genes such as LXR ⁇ , SREBP-1c, LPL, FAS and ACC
  • ingestion of LJ2501 compound reversed the decrease in phosphorylation of AMPK protein and increased expression of downstream signaling genes caused by HFD intake, and restored to the level similar to that of the Chow diet group (FIG. 12).

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Abstract

본 발명은 신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체, 이를 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 대사질환의 개선 또는 완화용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펜타디에노일 피페리딘 유도체는 지방전구세포의 분화를 억제하며, 체중 및 내장지방을 감소시키고, 혈중 지질농도를 감소시키며, 혈중 간기능지표를 개선시키고, 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 대사성염증반응을 억제함으로써 궁극적으로 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환의 예방 또는 치료 활성을 나타내는 의약 또는 기능성 식품 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체 및 그의 용도
본 발명은 대한민국 농림수산식품부 지원 하의 과제번호 1130373 및 교육과학기술부의 지원 하의 2015R1A5A6001906에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제번호 1130373의 연구관리 전문기관은 농림수산식품기술기획평가원, 연구 사업명은 "기술사업화지원사업", 연구과제명은 "한인진추출물을 활용한 체중조절 및 대사성질환 개선용도의 개별인정형 건강기능식품 원료", 주관기관은 연세대학교 산학협력단, 연구기간은 2013.11.27 ~ 2014.10.26이고, 상기 과제번호 2015R1A5A6001906의 연구관리 전문기관은 한국연구재단, 연구 사업명은 "선도연구센터 육성사업 이공학분야(SRC)", 연구과제명은 "식품영양유전체연구센타", 주관기관은 경북대학교 산학협력단, 연구기간은 2013.03.01 ~ 2014.02.28이다. 본 특허출원은 2014년 9월 23일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2014-0126959호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명은 신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체 및 이를 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
생활환경의 변화에 의해 현대인들의 내장지방형 비만이 증가하면서 당뇨병, 고혈압, 지질대사이상, 인슐린저항성 등을 수반하는 대사증후군(metabolic syndrome)의 발병이 급증하고 있다. 이들 질환은 상호간의 발생위험을 증가시키며, 노화, 스트레스 및 면역기능저하 등의 다원적인 생체대사변화와 관련이 있는 공통 질환이다. 비만은 외관상의 문제뿐 아니라, 지방간, 고혈압, 당뇨병, 심혈관계 질환 등의 만성질환을 유발한다.
세계인구 중 약 25%에 해당하는 17억명이 현재 과체중(BMI>25)이고, 주요 시장인 미국, 유럽, 일본의 1억2천명을 포함한 서구지역의 3억명 이상이 비만환자(BMI> 30)로 분류되고 있다. OECD 국가 중에서 비만율이 가장 높은 나라는 미국으로, 전 국민의 31%가 비만환자이고, 그 다음이 멕시코(24%), 영국(23%), 그리스(22%), 호주(22%), 뉴질랜드(21%), 헝가리(19%), 캐나다(14%), 스페인(13%), 아일랜드(13%), 독일(13%), 포르투칼(13%), 핀랜드(13%0, 터키(12%), 벨기에(12%)의 순으로 전체 인구 중 비만환자 비율이 높게 나타나고 있다. 중국은 7천만명이 비만인구이고, 급속도로 체중조절 관련 시장이 확대되고 있으며, 총 시장규모는 100억위안 정도로 예측하고 있다. 아울러 현재 세계적으로 어린이 5명 중 1명이 소아비만에 해당되며, 그 숫자도 급속도로 증가하고 있어 소아비만이 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 소아비만은 혈중 콜레스테롤과 중성지방의 수치가 높아 생활습관병으로 불리는 당뇨, 고혈압, 뇌졸중 등의 주요 원인이 되고, 소아비만아의 80% 이상이 성인비만으로 연결되어 나이가 들수록 비만으로 인한 건강상의 문제는 더욱 심각해질 수 있다. 또한 지방이 많을수록 성호르몬 분비가 자극되어 나이에 비해 사춘기가 빨리 찾아와 성장장애를 가져올 수 있으며, 혈액순환 및 영양 공급에도 영향을 미쳐 성장저해요소의 원인이 되었다.　　　
비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, 이하 NAFLD)은 음주와 관계없이 간 내에 중성지방이 축적되는 질환을 의미하고, 여기에는 단순지방간(steatosis)과 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 포함한다. 단순 지방간은 임상적으로 예후가 양호한 양성 질환으로 생각되고 있으나, 지방간과 함께 염증 혹은 섬유화를 동반하는 NASH는 진행성 간질환으로 간경변 또는 간암을 유발하는 전구 질환으로 인지되고 있다.
비만과 인슐린저항성은 대표적인 비알콜성 지방간질환의 위험인자이다. 간섬유증 진행의 위험인자로는 가령, 비만(BMI>30), 혈중 간기능지표 비율(AST/ALT >1) 및 당뇨를 들 수 있고, 특히 C형 간염 보균자가 비알콜지방간일 경우 간암까지 진행될 수 있어 예방 및 치료의 필요성이 대두되고 있다. 비알콜성 지방간환자의 69-100%는 비만환자이고, 비만환자의 20-40%는 비알콜성 지방간을 동반하며, 특히, 남성 비만환자의 간질환 유병율이 여성비만자에 비해 더 높게 나타난다. 서구사회에서는 비만환자뿐만 아니라 정상체중 성인의 3-30%가 비알콜성 지방간병변을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 우리와 식생활이 유사한 일본의 비알콜성 지방간 유병율은 약 20%로 추정되며, 이중 1%가 NASH로 추정된다. 비알콜성 지방간은 성인 뿐 아니라 비만아동에서도 문제가 된다. 비만아동(유럽, 미국 및 아시아 거주)의 10-77%가 비알콜성 지방간 병변을 보이는데, 이는 비알콜성 간질환의 가장 중요한 위험인자가 비만이기 때문이다.
국내외에서 판매되는 비만치료제로는 미 FDA에서 승인을 받은 orlistat을 주원료로 하는 '제니칼'(한국로슈), sibutramine을 원료로 하는 '리덕틸'(일성신약), 그리고 녹차 카테콜 성분을 원료로 하는'엑소리제'(구주제약)등이 있다. 리파아제작용을 억제하는 제니칼의 경우 지방변, 가스생성, 지용성비타민 흡수저하 등의 위장계 부작용을, 그리고 리덕틸의 경우에는 교감신경계의 세로토닌과 노르아드레날린 농도를 증가시킴으로서 두통, 구갈, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용을 나타낸다. 이외에도 그동안 항비만 약제로 개발된 제품 중에는 심각한 부작용으로 인해 판매가 금지된 것들도 상당수에 이른다. 예를 들어, 아미노필린은 탁월한 체지방 분해효과에도 불구하고 정신 신경계, 순환기계, 소화기계에 걸쳐 폭넓은 부작용이 보고된 바 있고, 펜프루라민, 덱스펜플루라민, 토피라메이, 에페드린 등도 비만치료 부적합 약물로 판정되어 판매가 금지되었다. 이와 같이 종래의 합성의약품이 부작용으로 인한 한계를 보임에 따라, 안전하고 장기 복용이 가능하여 만성질환의 치료에 적합한 새로은 비만 치료용 조성물의 개발에 대한 요구가 커지고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군 등을 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 화합물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1의 구조를 가지는 신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체가 체내 지방 및 혈당을 감소시키고 다양한 대사질환의 지표를 크게 개선시킴으로서 상기 지질대사질환에 대한 예방 및 치료효과를 가진다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환의 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 1
Figure PCTKR2015009944-appb-I000001
상기 화학식에서, R1은 C1-C3 알킬기이다.
본 발명자들은 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군 등을 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 화합물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1의 구조를 가지는 신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체가 체내 지방 및 혈당을 감소시키고 다양한 대사질환의 지표를 크게 개선시킴으로서 상기 지질대사질환에 대한 예방 및 치료효과를 가진다는 사실을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다. C1-C3 알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1-C3 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1은 메틸기이다.
R1이 메틸기인 화학식 1 화합물의 IUPAC 명칭은 "(2E,4E)-5-(4-(메틸티오)페닐)-1-(피페린-1-일)펜타-2,4-디엔-1-온"이다. 하기의 실시예에서 보는 바와 같이, 상기 화합물은 페닐기의 치환기(알킬티오) 및 치환 위치(meta)를 달리하는 유사한 백본의 다른 화합물에 비하여 월등한 항-비만 효과를 보임이 확인되었다.
본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 화합물의 약제학적 허용 가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 젖산염, 주석산염, 말레인산염, 푸마린산염, 글루콘산염, 메탄설폰산염, 글리콘산염, 숙신산염, 4-톨루엔설폰산염, 글루투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 또는 아스파트산염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함된다. 또한, 본 발명의 화합물은 용매화물(예를 들면 수화물)의 형태로도 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증(dyslipidemia), 지방간 및 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환(metabolic disease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물은 지방전구세포의 분화를 억제하며, 체중 및 내장지방을 감소시키고, 혈중 지질농도를 감소시키며, 혈중 간기능지표를 개선시키고, 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 대사성염증반응을 억제함이 확인되었다. 이에, 본 발명의 화합물은 다양한 대사질환(metabolic disease)을 다각적으로 개선하는 효율적인 예방 또는 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “당뇨”는 포도당-비관용(intolerance)을 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. 본 발명의 당뇨는 모든 종류의 당뇨병을 포함하며, 예를 들어, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β-세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제2형 당뇨는 인슐린 비의존성 당뇨병으로서, 식사 후 불충분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 내성에 의해 초래된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이상지방혈증(dyslipidemia)"은 고지혈증을 포함하는 개념으로, 혈액내의 지방수치 증가로 나타나는 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 낮은 HDL-콜레스테롤혈증 외에도 지단백의 대사이상 등의 문제로 나타나는 비정상적 지질상태를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지방간"은 간의 지방대사 장애로 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적된 상태를 말하며, 이는 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화, 지방간 및 췌장염 등과 같은 다양한 질병의 원인이 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인슐린 저항성"은 혈당을 낮추는 인슐린의 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것을 말한다. 인슐린 저항성이 높을 경우, 인체는 너무 많은 인슐린을 만들어 내고 이로 인해 고혈압이나 이상지방혈증은 물론 심장병, 당뇨병 등까지 초래할 수 있다. 특히 제2형 당뇨병에서는 근육과 지방조직에서 인슐린의 증가를 알아채지 못하여, 인슐린의 작용이 일어나지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인슐린 저항성 증후군"은 상기 인슐린 저항성에 의하여 유발된 질환을 총칭하는 개념으로 인슐린 작용에 대한 세포의 저항성, 고인슐린혈증 및 초저밀도지단백(very low density lipoprotein, VLDL)과 중성지방의 증가, 고밀도지단백(high density lipoprotein, HDL)의 감소 및 고혈압 등을 특징으로 하는 질환을 의미하며, 심혈관질환과 제2형 당뇨병의 위험인자로 인식되고 있는 개념이다(Reaven GM, Diabetes, 37: 1595-607, (1988)). 또한 인슐린 저항성은 고혈압, 당뇨 및 흡연 등의 위험인자들과 함께 세포 내 산화스트레스를 증가시키고 신호전달체계를 변화시켜 염증반응을 유발하여 죽상경화증을 진행시킨다고 알려져 있다(Freeman BA et al, Lab Invest 47: 412-26, (1982)), Kawamura M et al, J Clin Invest 94: 771-8, (1994)).
본 명세서에서 사용되는 용어 "대사질환"은 각종 심혈관 질환과 제2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것으로 인슐린 저항성 및 이와 관련된 복잡하고 다양한 여러 대사이상과 임상 양상을 모두 포괄하여 의미하는 개념이다. 1988년 Reaven은 이러한 증상들의 공통적인 원인이 체내의 인슐린 작용이 잘되지 않는 인슐린 저항성임을 주장하고 인슐린 저항성 증후군이라고 명명했으나 1998년 세계보건기구(WHO)는 인슐린 저항성이 이 증상들의 모든 요소를 다 설명할 수 없기에 대사증후군 또는 대사질환이라는 용어를 도입하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 대사질환의 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 대사 질환의 치료용 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 대사 질환의 치료용 조성물과 함께 투여되어 이들 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제"는 "치료 보조" 또는 "치료 보조제"의 의미를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료 또는 예방되는 이상지방혈증은 고지혈증이다.
본 명세서에서 사용되는 용어“고지혈증”은 중성 지방과 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 지방량이 많아 유발되는 질환을 말한다. 보다 구체적으로 고지혈증이란 혈액내의 중성지방, LDL 콜레스테롤, 인지질 및 유리 지방산 등의 지질 성분이 증가된 상태로 발생빈도가 높은 고콜레스테롤혈증 또는 고중성지방혈증을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료 또는 예방되는 지방간은 비알콜성 지방간이다.
본 명세서에서 용어 "비알콜성 지방간(Non-alcoholic fatty liver, NAFL)"은 과도한 알콜의 흡수와 무관하게 간세포에 과도한 양의 지방이 축적되는 질환을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 지방세포 분화를 감소시킨다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물은 혈중 지방, 간 지방 또는 내장 지방을 감소시킨다. 보다 더 구체적으로는, 상기 내장 지방은 부고환지방, 신장주변지방, 장간막지방 및 후복강지방으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 지방을 포함한다.
본 발명에서 용어 "간" 및 "내장"은 각각 세포 또는 조직을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈액내 ALT(alanine aminotransferase) 또는 AST(aspartate aminotransferase)의 활성을 감소시킨다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 고지방식이 대조군보다 혈액 내 ALT 및 AST의 양을 각각 60-65%로 유의하게 감소시킴으로써, 지방간, 보다 구체적으로는 비알코올성 지방간 현상을 현저히 완화시켜 지방간을 개선하는 효과를 가짐이 확인되었다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 약제학적 조성물은 경구투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질 중의용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환의 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 펜타디에노일 피페리딘 유도체는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위하여 이를 생략한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 본 발명의 피페린 유도체 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트 린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 피페로날 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증(dyslipidemia), 지방간 및 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환(metabolic disease)의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 상기 조성물을 필요로 하는 개체(즉, 대상체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다. 따라서, 용어 "투여"는 본 발명의 유효성분(펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염)을 병변 부위에 주입하는 것을 포함하므로, 용어 "투여하다"는 "주입하다"와 같은 의미로 사용된다.
조성물의“치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 추출물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "개체"는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 개체는 인간이다.
본 발명에서 이용되는 펜타디에노일 피페리딘 유도체는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위하여 이를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 신규한 펜타디에노일 피페리딘 유도체, 이를 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이를 이용한 대사질환의 개선 또는 완화용 기능성 식품 조성물 및 상기 조성물을 이용한 대사질환의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 펜타디에노일 피페리딘 유도체는 지방전구세포의 분화를 억제하며, 체중 및 내장지방을 감소시키고, 혈중 지질농도를 감소시키며, 혈중 간기능지표를 개선시키고, 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 대사성염증반응을 억제함으로써 궁극적으로 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환의 예방 또는 치료 활성을 나타내는 의약 또는 기능성 식품 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 3T3L1 세포에서 신규한 펜타디에노일 피페리딘 화합물(도 1a, LJ-2501; 도 1b, LJ-2488; 도 1c, LJ-2495; 도 1d, LJ-2496)의 지방분화 억제효능을 나타낸 그림이다. *,**스튜던트 t-검정에 희해 DMSO 처리-대조군의 값과 *P < 0.05 및 **P<0.01에서 각각 유의적인 차이를 가짐.
도 2는 LJ-2501의 SIRT1 활성화 능력을 나타낸 그림으로, 각각 LJ-2501의 농도에 따른 SIRT1 활성(도 2a), 기질(p53-382) 농도에 따른 효소반응속도(도 2b) 및 조효소(NAD+) 농도에 따른 효소반응속도(도 2c)를 각각 보여준다.
도 3은 실험식이를 섭취한 마우스의 체중 증가량을 보여주는 그림으로, 각각 시간 경과에 따른 체중변화(도 3a), 10주 간의 실험사육 기간 동안의 체중 증가량(도 3b) 및 식이 섭취량(도 3c)를 나타낸다. 각 값은 8마리 마우스 측정값의 평균±표준오차이다. 그래프 막대 위의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.001에서의 유의적 차이를 나타낸다.
도 4는 실험식이를 섭취한 마우스의 개복사진 및 부위 별 내장지방 무게를 나타낸다.
각 값은 8마리 마우스 측정값의 평균±표준오차이다. 그래프 막대 위의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.001에서의 유의적 차이를 나타낸다.
도 5는 실험식이를 섭취한 마우스의 혈중 지질농도를 나타낸다. 같은 열 내의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 유의적 차이를 나타낸다.
도 6은 마우스의 간조직 사진(도 6a) 및 간무게(도 6b)를 보여주는 그림이다. 각 값은 8마리 마우스 측정값의 평균±표준오차이다. 같은 열 내의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 유의적 차이를 나타낸다.
도 7은 마우스의 간조직 지질농도[중성지방, 콜레스테롤(도 7a), 자유지방산(도 7b)] 및 간기능 지표(도 7b)를 보여주는 그림이다. 같은 열 내의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 유의적 차이를 나타낸다.
도 8은 마우스의 혈중 사이토카인 농도를 나타낸 그림으로, IL-6, TNF-α(도 8a), MCP-1, 렙틴(도 8b) 농도를 각각 나타낸다. 같은 열 내의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 유의적 차이를 나타낸다.
도 9는 실험식이를 섭취시킨 마우스를 대상으로 한 경구 포도당 내성실험 결과로서 각각 경구 포도당 내성(도 9a) AUC(도 9b), 공복혈당(도 9c), 공복 혈중 인슐린(도 9d) 및 인슐린 저항성 지표(HOMA-IR, 도 9e)를 나타낸다. 같은 열 내의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 유의적 차이를 나타낸다.
도 10은 마우스 내장지방조직의 지방조직생성 관련 유전자 발현변화를 나타낸 그림이다. 상부 패널은 RT-PCR 분석의 대표적인 젤 사진이고 하부 패널은 이들 유전자의 상대적 발현량을 나타낸다. 데이터는 GAPDH mRNA를 기준으로 표준화되었으며 모든 발현 수준은 Chow 식이를 먹인 마우스에 대한 상대적인 값이다. 각 데이터는 세 번의 독립적인 실험에 대한 결과이다(실험당 n=2 또는 3). 그래프 막대 위의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 다른 식이그룹과의 유의적 차이를 나타낸다.
도 11은 마우스 내장지방조직의 열발생 관련 유전자 발현변화를 보여주는 그림이다. 도 11a의 상부 패널은 RT-PCR 분석의 대표적인 젤 사진이고 하부 패널은 이들 유전자의 상대적 발현량을 나타낸다. 데이터는 GAPDH mRNA를 기준으로 표준화되었으며 모든 발현 수준은 ND 마우스에 대한 상대적인 값이다. 도 11b는 웨스턴 블롯팅으로 측정되고 β-액틴 단백질로 표준화된 p-CREB 및 총 CREB의 단백질 수준을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험에 대한 결과이다(실험당 n=2 또는 3). 그래프 막대 위의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 다른 식이그룹과의 유의적 차이를 나타낸다.
도 12는 마우스 간조직의 지방생성 관련 유전자의 발현 변화를 보여주는 그림이다. 도 12a의 상부 패널은 RT-PCR 분석의 대표적인 젤 사진이고 하부 패널은 이들 유전자의 상대적 발현량을 나타낸다. 데이터는 GAPDH mRNA를 기준으로 표준화되었으며 모든 발현 수준은 ND 마우스에 대한 상대적인 값이다. 도 11b는 웨스턴 블롯팅으로 측정되고 β-액틴 단백질로 표준화된 p-AMPK 및 총 p-AMPK의 단백질 수준을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험에 대한 결과이다(실험당 n=2 또는 3). 그래프 막대 위의 문자는 일원분산분석 및 Duncan 다중범위검정에 의한 P<0.05에서의 다른 식이그룹과의 유의적 차이를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 화합물의 합성
1)( 2E,4E )-5-(4-( 메틸티오 )페닐)-1-(피페린-1-일)펜타-2,4- 디엔 -1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000002
LJ -2501
(E)-디에틸4-옥소-4-(피페린-1-일)부트-2-에닐포스포네이트(50 mg, 0.17 mmol)과 4-메틸티오벤즈알데하이드(28 μL, 0.216 mmol)을 -10℃에서 THF(1.5 mL)에 용해시키고 포타슘 tert-부톡사이드(0.51 mL, 0.51 mmol)를 넣고 동일 온도에서 무수반응 조건으로 20분 간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 올린 뒤 증류수를 넣어서 반응을 종료시켰다. EtOAc를 가한 후 유층을 분리하여 증류수와 포화 NaCl용액으로 씻고 무수 Na2SO4로 건조한 후 여과한 여액을 감압증류하여 얻어진 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산: EtOAc(2:1))로 정제하여 목적물(17 mg, 28.3%)을 얻었다.
1H NMR(500 MHz, CDCl3):δ 7.45-7.50(dd, 1H, J=9.6, 14.6 Hz), 7.36(bs, 1H), 7.34(bs, 1H), 7.20(bs, 1H), 7.18(bs, 1H), 6.79-6.88(m, 2H), 6.42-6.45(d, 1H, J=14.6Hz), 3.59(t, 4H, J=5.9Hz), 2.48(s, 3H), 1.66(m, 2H), 1.60(m, 4H).
2) ( 2E,4E )-5-(2,5- 디메톡시페닐 )-1-(피페린-1-일)펜타-2,4- 디엔 -1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000003
LJ -2488
(E)-디에틸4-옥소-4-(피페린-1-일)부트-2-에닐포스포네이트(50 mg, 0.17 mmol)과 2,5-디메톡시벤즈알데하이드(28.4 mg, 0.17 mmol)을 -10℃에서 THF(1.5 mL)에 용해시키고 포타슘 tert -부톡사이드(0.51 mL, 0.51 mmol)을 넣고 동일 온도에서 무수반응 조건으로 20분 간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 올린 뒤 증류수를 넣어서 반응을 종료시켰다. EtOAc를 가한 후 유층을 분리하여 증류수와 포화 NaCl용액으로 씻고 무수 Na2SO4로 건조한 후 여과한 여액을 감압증류하여 얻어진 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산: EtOAc(2:1))로 정제하여 목적 화합물 (40.7 mg, 78.6%)을 얻었다.
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.48-6.53(dd, 1H, J=3.2Hz), 7.16-7.19(bs, 1H), 7.02(bs, 1H), 6.88-6.95(m, 1H), 6.81(d, 1H, J=3.2Hz), 6.42-6.48(bs, 2H), 3.81 (s, 4H), 3.78(s, 3H), 3.59(t, 4H, J=3.2Hz), 1.66(m, 2H), 1.56-1.60(m, 4H).
3)(2E,4E )-5-(4- 에톡시페닐 )-1-(피페린-1-일)펜타-2,4- 디엔 -1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000004
LJ -2495
(E)-디에틸4-옥소-4-(피페린-1-일)부트-2-에닐포스포네이트 (50mg, 0.17 mmol)과 4-에톡시벤즈알데하이드(30 μL, 0.216 mmol)를 -10℃에서 THF(1.5 mL)에 용해시키고 포타슘 tert -부톡사이드(0.51 mL, 0.51 mmol)를 넣고 동일 온도에서 무수반응 조건으로 20분 간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 올린 뒤 증류수를 넣어서 반응을 종료시켰다. EtOAc를 가한 후 유층을 분리하여 증류수와 포화 NaCl용액으로 씻고 무수 Na2SO4로 건조한 후 여과한 여액을 감압증류하여 얻어진 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산: EtOAc(2:1))로 정제하여 목적 화합물(19 mg, 30.8%)을 얻었다.
1H NMR(500 MHz, CDCl3):δ 7.44-7.49(dd, 1H, J=4.6, 14.7 Hz), 7.36-7.38 (d, 2H, J=8.7 Hz), 6.84-6.86(d, 2H, J=8.7 Hz), 6.78-6.80(d, 2H, J=7.3 Hz), 6.39-6.42(d, 1H, J= 14.6 Hz), 4.03(q, 2H, J=6.8 Hz), 3.58(t, 4H, J=5.5 Hz), 1.65(m, 2H), 1.60(m, 4H), 1.41(t, 3H, J=7.3 Hz).
4)(2E,4E )-1-(피페린-1-일)-5-(4- 프로폭시페닐 )펜타-2,4- 디엔 -1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000005
LJ -2496
(E)-디에틸4-옥소-4-(피페린-1-일)부트-2-에닐포스포네이트 (50 mg, 0.17 mmol)과 4-프로폭시벤즈알데하이드(36 mg, 0.216 mmol)를 -10℃에서 THF(1.5 mL)에 용해시키고 포타슘 tert -부톡사이드(0.51 mL, 0.51 mmol)를 넣고 동일 온도에서 무수반응 조건으로 20분 간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 올린 뒤 증류수를 넣어서 반응을 종료시켰다. EtOAc를 가한 후 유층을 분리하여 증류수와 포화 NaCl용액으로 씻고 무수 Na2SO4로 건조한 후 여과한 여액을 감압증류하여 얻어진 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산: EtOAc(2:1))로 정제하여 목적 화합물(21.1 mg, 32.6%)을 얻었다.
1H NMR(500 MHz, CDCl3):δ 7.42-7.47(dd, 1H, J=9.6, 14.7 Hz), 7.37(d, 2H, J=8.2 Hz), 6.84-6.86(d, 2H, J=8.2 Hz), 6.73-6.79(m, 2H), 6.39-6.42(d, 1H, J=14.6 Hz), 3.92(t, 2H, J=6.8 Hz), 3.58(bs, 4H), 1.76-1.83(m, 2H), 1.65(m, 2H), 1.59(m, 4H), 1.02(t, 3H, J=7.3 Hz).
실시예 2: 마우스 지방전구세포주(3T3-L1)를 이용한 LJ -2501의 지방세포분화 억제효능
1) 세포배양 및 Oil-red O 염색
지방전구세포인 3T3L1 세포를 12-웰 플레이트에 분주하고 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 10% FBS(fatal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 컨플루언트한 상태로 자랄 때까지 배양시켰다. 컨플루언트한 상태로 자란 3T3L1 세포를 0.5 mM 이소부틸-메틸잔틴, 1 μM 덱사메타손(MDI), 그리고 1 μg/ml 인슐린이 첨가된 배양액에서 이틀간 배양하여 분화된 지방세포(differentiated adipocytes)로 만든 후, 1 μg/ml 인슐린을 포함하는 DMEM 배양액에서 이틀간 더 배양시키면서 성숙한 지방세포(mature adipocyte)로 분화시켰다. 그 후에는 이틀 간격으로 DMEM 배양액을 교체하면서 10일간 더 배양하여 완전히 분화된 지장세포를 형성시켰다.
3T3-L1세포에 DMI를 첨가하여 분화시키는 첫 날부터 이틀 간격으로 총 4종의 신규한 화합물을 농도를 달리하여 배양액에 처리하였다. 총 4종의 신규한 화합물의 구조 및 분자량은 표 1에 제시된 바와 같다. 유도체 화합물은 DMSO에 녹여서 사용하였으며, DMSO만 첨가한 음성 대조군을 실험에 포함시켰다. 총 14일간 배양하여 분화가 완성된 시점에 배양액을 제거하고 분화된 지방세포에 함유된 지방구를 염색하였다. 이를 위해 PBS(phosphate buffered saline)로 세포를 2회 세척한 후 10% 완충 중성 포르말린으로 세포를 1시간 고정하고 다시 PBS로 1회 세척한 후, 지방을 특이적으로 붉게 염색시키는 Oil-red-O 염료 1 ml를 12-웰 플레이트에 가하여 1시간 동안 지방구를 염색하고 증류슈로 2회 세척하였다. 분화된 3T3L1 세포에 함유된 중성지방농도를 측정하기 위해 염색된 지방구를 1 ml의 이소부탄올에 녹인 후, 600 nm에서 O.D 값을 측정하였다.
펜타디에노일 피페리딘 화합물의 구조
No 유도체 IUPAC 명칭 구조 분자량 (g/mol)
1 LJ-2501 (2E,4E)-5-(4-(메틸티오)페닐)-1-(피페린-1-일)펜타-2,4-디엔-1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000006
 287.42
2 LJ-2488 (2E,4E)-5-(2,5-디메톡시페닐)-1-(피페린-1-일)펜타-2,4-디엔-1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000007
 301.38
3 LJ-2495 (2E,4E)-5-(4-에톡시페닐)-1-(피페린-1-일)펜타-2,4-디엔-1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000008
 285.38
4 LJ-2496 (2E,4E)-1-(피페린-1-일)-5-(4-프로폭시페닐)펜타-2,4-디엔-1-온
Figure PCTKR2015009944-appb-I000009
 299.41
2) LJ -2501 화합물의 지방세포분화 억제능
총 4종의 신규한 화합물을 다양한 농도로 3T3L1 세포에 처리하여 지방세포분화 억제효과를 측정한 결과, LJ-2501의 지방세포분화 억제활성이 가장 탁월하게 나타났다(EC50 값, 101 μM). LJ-2488 또한 지방전구세포의 분화를 억제하였으나 그 효과가 LJ-2501에 비해 훨씬 미미하였고(EC50 값, 2.8 mM), LJ-2501과 구조가 아주 유사한 LJ-2495와 LJ-2496 화합물의 경우 지방세포분화 억제효과를 나타내지 않았다(도 1).
실시예 3: LJ -2501의 SIRT1 활성화 능력
1) SIRT1 활성 측정 방법
테스트 튜브에서 SIRT1 활성을 분석하기 위해 SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit (BML-AK555, ENZO Life Sciences Inc., NY, USA)를 이용하여 기질에 포함되어 있는 아세틸화 라이신의 탈아세틸화 정도를 측정하였다. 96-웰 플레이트에 0.067 U/㎕의 인간 재조합 SIRT1 효소와 테스트 물질을 섞고 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 다시 167 μM의 기질[인체 p53의 379-382번 아미노산 펩타이드, Arg-His-Lys-Lys(Ac)]과 1667 μM의 NAD+를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. SIRT1 반응을 정지시키기 위해 2 mM의 니코틴아마이드가 포함된 디벨로퍼 50 μL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 발색된 형광량은 여기 360 nm, 발광 460 nm에서 측정하였다.
2) LJ2501 화합물의 SIRT1 활성화 능력
LJ2501 화합물의 농도를 증가시켜 가면서 SIRT1 활성을 측정한 결과 600 μM 농도에서 활성이 최대로 나타났다(도 2). LJ2501(600 μM)을 첨가한 상태에서 기질(p53-382) 또는 조효소(NAD+) 농도를 증가시키며 enzyme kinetics를 측정한 결과, LJ2501은 Vmax 값은 변화를 시키지 않고, 효소에 대한 기질(91 μM vs 0.13 μM) 또는 조효소(682 μM vs 74 μM)의 Km 값을 감소시킴으로서(친화도를 증가시킴으로서) SIRT1 활성자 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 4: 마우스를 이용한 LJ -2501 화합물의 체중 및 내장지방 감소효능
1) 실험식이 제조 및 실험동물의 사육
본 실험에서 사용한 비만유도식이는 고지방대조식이(high fat diet, HFD: 40% 지방 열량, 17g 라드 + 3% 콘 오일/ 100 g 식이)이며, LJ-2501, LJ-2488, LJ-2495, LJ-2496 화합물이 보충된 식이는 HFD와 조성이 동일하되 각 화합물이 0.05% 수준으로 포함되었다(표 2). 대조약물로 비만치료제인 시부트라민(Sibut)을 0.01% 수준으로 고지방식이에 첨가하여 사용하였으며, 정상식이군(Chow)은 상업적인 설치류 먹이(rodent chow)를 섭취시켰다.
실험식이 조성표(g/kg diet)
성분 고지방 대조식이 (HFD) LJ-2501 보충식이 (LJ2501) LJ-2488 보충식이 (LJ2488) 시부트라민 보충식이 (Sibut)
카제인 200 200 200 200
DL-메티오닌 3 3 3 3
옥수수 전분 111 110.5 110.5 110
수크로오스 370 370 370 370
셀룰로오스 50 50 50 50
옥수수유 30 30 30 30
라아드 170 170 170 170
비타민 복합물 12 12 12 12
미네랄 복합물 42 42 42 42
콜린 비타르트레이트 2 2 2 2
콜레스테롤 10 10 10 10
tert -부티하이드로퀴논 0.04 0.04 0.04 0.04
실험물질 - 0.5 0.5 0.1
총합(g) 1,000 1,000 1,000 1,000
지방(% 칼로리) 39.0 39.0 39.0 39.0
총 열량, kJ/kg diet 19,315 19,315 19,315 19,315
5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스 40 마리(오리엔트, 한국)를 고형사료로 1주일 간 실험실 환경에 적응시킨 후, 난괴법에 따라 정상식이군, 고지방식이대조군, 두가지 종류의 실험물질군, 그리고 두가지 종류의 대조약물군으로 임의 배치하여, 총 10주간 사육하였다(n=8/군). 식이는 매일 오전 10-11시 사이에 물과 함께 공급하였으며, 식이 섭취량은 매일, 그리고 체중은 매주 측정하였다. 사료섭취에 따른 갑작스런 체중변화를 막기 위해 사료 통을 제거하고 2시간 후에 체중을 측정하였다. 실험동물을 12시간 이상 금식시킨 후, 디에틸에테르로 마취한 상태에서 혈액, 간 및 내장지방조직(부고환지방, 신장주변지방, 장간막지방 및 후복강지방)을 채취하여 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)으로 세척한 후, 무게를 측정하였다. 복부대동맥으로부터 채혈한 혈액은 1000×g에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다.
2) 체중 및 내장지방 무게 변화
실험식이를 10주간 섭취시킨 후 최종 체중 및 체중 증가량을 살펴보면, 고지방식이대조군(HFD)에 비해 LJ-2501을 보충 섭취시킨 군에서 누적체중증가량이 60% 유의하게 감소하였고, 이와 같은 LJ-2501의 체중감소효과는 LJ-2488(-14%)에 비해 월등히 우수하고 대조약물인 시뷰트라민(-33%)보다도 더 우수한 것으로 나타났다. LJ-2501을 섭취한 마우스의 식이섭취량은 HFD 대조군과 차이가 없었고, 따라서 LJ-2501의 항비만효과는 식욕저하에 기인한 것이 아님을 알 수 있다(도 3).
실험식이를 10주간 섭취시킨 후 마우스의 개복사진(도 4a)으로부터 HFD군에 비해 LJ-2501군의 내장지방량이 현저히 감소하였음을 육안으로 확인할 수 있었다. 내장지방을 구성하는 부고환지방, 신장주변지방, 장간막지방 및 후복강지방을 각기 적출하여 무게를 측정한 결과, 대조군(HFD)에 비해 LJ-2501 섭취군에서 부고환지방, 신장주변지방, 장간막지방, 후복강지방무게가 유의하게 감소하였고, 이 네가지 부위를 합한 총내장지방무게가 72% 유의하게 감소하였다(도 4b). 이와 같은 LJ-2501의 내장지방량 감소효과는 LJ-2488(-6%)에 비해 월등히 우수하고 대조약물인 시뷰트라민(-22%)보다도 더 우수한 것으로 나타났다. 따라서 LJ2501 화합물은 매우 탁월한 체중 및 내장지방량 감소효과가 있음이 확인되었다.
실시예 5: LJ -2501 화합물의 고지혈증 예방 및 치료 효능
1) 혈액의 생화학분석 방법
상기에서 10주간 사육된 실험동물을 대상으로 혈장 총콜레스테롤, 중성지방, 포도당농도, 그리고 간조직의 지질성분을 다음과 같이 측정하였다. 혈장 총콜레스테롤, 중성지방 및 유리지방산 농도는 상업용 측정키트(Bio Clinical System)를 이용하여 각각 2회 반복 측정하였다.
2) 혈장 지질농도의 변화
실험식이를 10주간 섭취시킨 마우스의 혈장 지질농도를 살펴보면, LJ2501 섭취군에서 고지방식이대조군(HFD)에 비해 중성지방농도가 34%, 총콜레스테롤 농도가 35%(도 5a), LDL+VLDL 콜레스테롤 농도가 27%(도 5b), 유리지방산 농도가 69% 각기 유의하게 감소하였다(도 5c). 한편, 혈중 HDL 콜레스테롤 농도는 HFD군과 모든 실험군 간에 유의한 차이가 없었다(도 5b). 이러한 LJ-2501의 중성지방, 콜레스테롤 및 유리지방산 농도 감소효과는 LJ-2488에 비해 월등히 우수하고 대조약물인 시부트라민보다도 더 우수한 것으로 나타났다. 따라서 LJ2501 화합물은 고지방식이 섭취로 인해 유도된 고지혈증을 개선하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 6: LJ -2498 화합물의 비알콜성지방간 예방 및 치료 효능
1) 간조직의 지질농도 분석방법
간조직의 지질성분을 Folch 등의 방법(Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 1957;226:497-509)에 준하여 다음과 같이 추출하였다. 0.25 g의 간조직에 1 mL의 증류수를 가한 후 폴리트론 균질기(IKA-WERKE GmbH & Co., Ultra-Turrax, Staufen, Germany)를 사용하여 균질화시켰다. 균질액에 클로로포름:메탄올 용액(2:1, v/v) 5 mL을 가하여 잘 혼합한 후, 1000 x g에서 10분간 원심분리하여 하층액을 분리하였고, 상층액에 다시 클로로포름:메탄올 용액(2: 1, v/v) 2 mL을 첨가한 후, 동일 과정을 반복하여 간의 지질성분을 완전히 분리하였다. 이렇게 얻은 하층액에 클로로포름:메탄올:0.05% CaCl2(3:48:47, v/v/v) 용액 3 mL을 가하여 1분간 혼합한 후 1000 x g에서 10분간 원심분리하였고, 최종 하층액을 취하여 질소가스로 완전히 건조시킨 후, 건조된 지질을 1 mL의 메탄올에 용해하여 지질성분 분석에 사용하였다. 간조직 지질추출액의 중성지방 및 콜레스테롤 농도는 혈장의 분석을 위해 사용된 것과 동일한 상업용 지질분석 키트(Bio Clinical System)를 사용하여 측정하였다.
2) 혈중 간기능지표 분석방법
공복시 혈청의 GOT(glutamate oxaloacetate transferase) 및 GPT(glutamate pyruvate transferase) 활성은 생화학자동분석기(Express Plus, Chiron Diagnostics Co., USA)를 이용하여 측정하였으며, 분석용 킷 시약은 Bayer 사(Tarrytown, NY, USA)로부터 구입하였다.
3) 간무게 및 간조직의 지질농도의 변화
실험식이를 10주간 섭취시킨 마우스로부터 적출한 간조직의 사진이 도 6a에 나타나 있다. 고지방식이대조군(HFD)의 경우 Chow군에 비해 간조직이 더 크고 색깔도 연한 것이 육안상으로 관찰되었다. 한편, LJ2501 화합물을 섭취한 마우스는 HFD군에 비해 간이 상대적으로 더 작고 색상도 더 진하여 지방간이 완화되었음을 짐작할 수 있다. 실험동물의 간무게를 측정한 결과, LJ2501 섭취군에서 고지방식이대조군에 비해 41% 유의하게 감소하였다(도 6b).
간조직의 지질농도를 살펴보면, LJ2501 섭취군에서 고지방식이대조군(HFD)에 비해 중성지방농도가 35%, 콜테스테롤농도가 53%, 그리고 유리지방산 농고가 77% 유의하게 감소하였고, 혈중에서 측정된 간기능 지수(alanine aminotransferase, ALT; aspartate aminotransferase, AST) 또한 60-65% 유의하게 감소하였다(도 7a 및 7b). 이러한 LJ-2501의 간조직 중성지방 콜레스테롤 및 유리지방산 농도 감소효과는 LJ-2488에 비해 월등히 우수하고 대조약물인 시뷰트라민보다도 더 우수한 것으로 나타났다. 따라서 LJ2501 화합물은 고지방식이로 유도된 비만에서 나타나는 지방간 현상을 현저히 완화시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 7: LJ -2501 화합물의 대사성염증반응 억제효과
1) 혈중 염증성 싸이토카인 농도 분석방법
혈장의 TNFα, MCP-1, IL-6, 렙틴 및 인슐린 농도는 ELISA 방법에 의해 측정되었으며, Mouse Adipokine Magnetic Bead Panel 키트(MADKMAG-71K, EMD Millipore Corporation, MA, USA)를 이용하였다.
2) 혈중 염증성 싸이토카인 농도 변화
영양소 또는 대사물질 공급과잉에 의해 발생하는 염증반응에 대하여 최근 'metaflammation'이라는 용어가 등장하고, 비만을 'chronic and low-level inflammation'으로 해석하는 등, 비만과 면역체계와의 상관관계에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 그 예로, 고유 면역반응에 관여하는 TLR4(toll-like receptor4)의 경우 식이성지방(특히, 포화지방산)을 리간드로 사용하여 염증반응 및 인슐린저항성 경로에서 중요한 요소로 작용한다. 고지방식이에 의해 비만이 유도되면 체액에 유리지방산(특히 포화지방산)이 증가하게 되고, TLR4에 유리 지방산이 리간드로 결합하면 IKK를 활성화시켜 NF-kB를 활성화시키고, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 등의 분비를 촉진하여 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 그 외에도 TNF-α 및 IL-6는 SOCS3(cytokine signaling 3)와 JNK를 활성화시킴으로서 IRS(insulin receptor substrate)의 세린 잔기를 인산화 하여 당수송을 저해하고, 간 또는 근육 등의 말초조직에서 인슐린저항성을 유도하는 것으로 알려져 있다.
혈중 염증성 사이토카인 농도를 살펴보면, LJ2501 섭취군에서 고지방식이대조군(HFD)에 비해 IL-6가 38%, TNF-α가 25%(도 8a), MCP-1이 22%, 그리고 렙틴이 25% 유의하게 감소하였고(도 8b), 이러한 LJ-2501의 염증성 사이토카인 농도 감소 효과는 LJ-2488에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다.
실시예 8: LJ -2501 화합물의 2형당뇨 예방 및 치료 효능
1) 경구 포도당 내성시험 방법
실험사육 8주째에 실험동물을 18시간 공복시킨 후 2 g/kg 체중에 해당하는 d-글루코오스를 경구투여 하고 15분, 30분, 60분, 120분이 경과한 시점에 마우스의 꼬리정맥을 통해 혈액을 채취하였다. 채혈된 혈액의 글루코오스 농도는 스트립-작동 혈당센서(ONETOUCH Ultra, Inverness Medical Ltd. Stockport, UK) 기기를 이용하여 측정하였다.
2) 공복시 혈당 및 인슐린 농도 측정방법
공복시 혈장의 글루코오스 농도는 생화학자동분석기(Express Plus, Chiron Diagnostics Co., USA)를 이용하여 측정하며, 분석용 킷 시약은 Bayer사(Tarrytown, NY, USA)로부터 구입하였다. 혈장 인슐린 농도는 Rat Insulin RIA 킷(LINCO Research, Inc, St. Charles, USA)를 사용하여 측정하였다.
3) 경구 포도당 내성시험 결과
마우스에게 2 g 글루코오스/10 ml 증류수/kg BW을 경구투여한 후 꼬리정맥에서 15, 30, 60, 120 분 간격으로 혈액을 채취하여 혈당을 측정한 결과, LJ2501 화합물군의 경우 모든 시간대에서 혈중 포도당 농도가 HFD군에 비해 감소하였고, 혈중 포도당 농도에 대한 AUC(area under the curve) 값을 계산한 결과, LJ2501 화합물군에서 HFD군에 비해 35% 유의하게 감소하였다. 한편, 고지방식이를 섭취하는 마우스에게 LJ2501 화합물을 10주간 보충 섭취시킨 후 측정된 공복시 혈당은 HFD군에 비해 20% 유의하게 감소하였고, 혈중 인슐린 농도는 59% 유의하게 감소하였고, 이 두가지 지표를 토대로 계산된 인슐린저항성 지표(HOMA-IR) 역시 % 유의하게 감소하였다(도 9). 따라서 LJ2501 화합물은 경구 포도당 내성을 개선시키고 지방식이로 유도된 공복 시 혈당증가 현상을 개선하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있으며, 이와 같은 LJ2501 화합물의 인슐린저항성 및 2형 당뇨 개선효과는 LJ2488, 그리고 대조약물로 사용된 시뷰트라민에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다.
실시예 9: LJ -2501 화합물의 항비만 및 대사질환 조절 작용기작 규명
1) Trizol 방법을 이용한 RNA 분리 및 확인
부고환지방조직 0.1g당 Trizol 용액 1 ml을 첨가하여 조직을 분쇄한 후, 4℃, 12,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 클로로포름 200 ㎕을 첨가하고, 볼텍싱하였다. 이 과정을 두 번 반복한 다음, 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올과 상층액을 1:1 비율로 첨가하였다. 10회 세게 흔든 다음 실온에서 10분 동안 방치한 후, 12,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 70% 에탄올 1 ml을 가한 후 7,500×g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 5분 동안 건조시키고, nuclease free water를 사용하여 RNA 펠렛을 용해시켰다. UV/VIS 분광광도계(Beckman coulter, DU730)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고, 아가로스 젤 전기영동을 실시하여 RNA 시료의 품질을 확인하였다.
2) RT- PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) 방법
부고환지방조직에서 추출된 RNA시료를 대상으로 올리고 dT 프라이머와 Superscript 역전사 효소(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하고 증폭하고자 하는 유전자 cDNA의 5'과 3'인접 서열(flanking sequence)을 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머 서열은 표 3에 표시하였다. 증폭된 PCR 산물 1 ㎕를 1% 아가로스 젤에 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하였다.
프라이머 서열
유전자 프라이머 서열 ( 5'3 ') 어닐링 온도 (℃) PCR 산물(bp)
Peroxisome proliferator activated receptor gamma 2 (PPARγ2) F TTCGGAATCAGCTCTGTGGA 55 148
R CCATTGGGTCAGCTCTTGTG
CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPα) F TCGGTGCGTCTAAGATGAGG 55 187
R TCAAGGCACATTTTTGCTCC
CD36 antigen (CD36) F ATGACGTGGCAAAGAACAGC 55 160
R GAAGGCTCAAAGATGGCTCC
Fatty acid synthase (FAS) F TTGCCCGAGTCAGAGAACC 55 171
R CGTCCACAATAGCTTCATAGC
Lipoprotein lipase (leptin) F CTCCAAGGTTGTCCAGGGTT 55 143
R AAAACTCCCCACAGAATGGG
Cytochrome C oxidase subunit 2 (COX2) F CCGAGTCGTTCTGCCAATAG 55 159
R AACCCTGGTCGGTTTGATGT
Mitochondrialtranscription factor A (TFAM) F AGTGTGGCAGTCCATAGGCA 55 123
R CAGTGCTTTTAGCACGCTCC
Nuclear respiratory factor-1 (NRF-1) F TTTCATGGACCCAGGCATTA 55 119
R TGGTGGCCTGAGTTTGTGTT
Sirtuin 1 (SIRT1) F AGCTCCTTGGAGACTGCGAT 55 182
R ATGAAGAGGTGTTGGTGGCA
Peroxisome proliferative activated receptor γ coactivator 1α(PGC-1α) F TAAATCTGCGGGATGATGGA 55 117
R GTTTCGTTCGACCTGCGTAA
Uncoupling protein 1 (UCP1) F GGTTTTGCACCACACTCCTG 55 111
R ACATGGACATCGCACAGCTT
SREBP1c (SREBP1c) F TTGTGGAGCTCAAAGACCTG 55 94
R TGCAAGAAGCGGATGTAGTC
Liver X receptor (LXR) F TCCTACACGAGGATCAAGCG 55 119
R AGTCGCAATGCAAAGACCTG
Lipoprotein lipase (LPL) F TGCCGCTGTTTTGTTTTACC 55 172
R TCACAGTTTCTGCTCCCAGC
Acetyl-CoA carboxylase (ACC) F TGATGTCAATCTCCCCGCAGC 60 353
R TTGCTTCTTCTCTGTTTTCTCCC
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) F AGAACATCATCCCTGCATCC 55 321
R TCCACCACCCTGTTGCTGTA
3) 웨스턴 블롯팅 분석
막자사발에 일정량의 내장지방 또는 간조직을 액체질소 및 라이시스 완충액과 함께 균질화시킨 후, 13,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 가운데 층을 취하고 Bradford 방법에 의해 단백질을 정량하였다. 50 ㎍의 단백질량을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동시킨 후 PVDF 하이퍼필름에 전기블롯팅하였다. 해당 항체를 사용하여 반응시키고, ECL로 검출하였다.
4) 지방합성 조절 작용기작 규명
지방조직생성(adipogenesis)은 지방선구세포(preadipocyte)가 증식 및 분화 과정을 거쳐 성숙한 지방세포(adipocyte)로 변화되는 과정이며, 세포의 형태학적 변화 및 유전자 발현양상의 변화 등이 수반된다. 즉, 이 과정에서 지질이 축적되고 aP2(fatty acid binding protein), LPL(lipoprotein lipase), 그리고 FAS(fatty acid synthase)와 같은 지방조직에 특이적인 유전자들이 발현되는데, 이러한 유전자들의 발현조절에는 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor gamma), C/EBPs(CCAAT enhancer-binding proterins) 및 SREBP-1c(sterol regulatory binding protein-1c)의 세 가지 전사인자들이 중추적인 역할을 담당하고 있다.
RT-PCR을 이용하여 부고환지방조직의 mRNA 발현정도를 평가한 결과, HFD군의 경우 ND군에 비해 지방조직 생성에 중요한 역할을 담당하는 핵전사인자인 C/EBPα와 PPARγ2, 그리고 이들의 타겟 유전자인 CD36, FAS(fatty acid synthase) 및 렙틴 발현이 모두 유의하게 증가하였다. 한편 LJ2501 섭취군의 경우 HFD군에 의해 내장지방조직에서 증가하였던 핵전사인자(C/EBPα와 PPARγ2) 및 이의 타겟유전자 발현이 모두 Chow 군과 유사한 수준으로 다시 감소하였다. 또한 따라서 LJ2501 보충 섭취는 내장지방조직에서 지방조직 생성에 중추적 역할을 하는 핵전사인자 및 이의 타겟 유전자발현을 감소시키므로서 내장지방량 억제에 기여하였음을 알 수 있다(도 10).
5) 열발생 조절 작용기작 규명
미토콘드리아의 기능장애는 노화, 심장병, 위장장애, 내분비장애, 신경장애와 관련이 있으며, 미토콘드리아 산화과정 장애는 간조직의 글루코스 생산을 증가시키고 고중성지방혈증을 유발시켜 지방간을 초래하는 것으로 알려져 있다. 미토콘드리아는 전자전달계를 이용하여 미토콘드리아 내막과 외막 사이의 양성자 농도구배를 형성하게 되며, 이를 구동력으로 F0F1-ATPase를 통해 ATP를 형성하게 된다. 그러나 F0F1-ATPase가 정상적으로 작동하지 않을 경우 UCPs(uncoupling proteins)를 통해 양성자 농도구배를 해소하며 이 과정에서 열이 발생하게 된다. 최근 이러한 에너지 소모 기작을 통하여 지방조직에서 UCP들이 산화 환원 균형를 유지하며 열발생을 촉진함이 보고되면서, UCP가 비만치료의 새로운 타겟으로 관심을 받고 있다.
고지방식이를 섭취시킨 결과 내장지방조직에서 PKA(protein kinase A) 활성이 감소되고, 후자는 CREB의 인산화 저하를 통해 PGC-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 alpha)의 발현을 저하시키게 된다. 또한 PGC-1α의 deacetylation을 촉매하는 효소인 sirtuin 1(SIRT1)의 발현이 저하되고 후자는 UCP1 발현을 저하시키게 된다. 한편 LJ2501을 보충 섭취시킨 결과, 고지방식이 섭취에 의해 감소하였던 내장지방조직의 PGC-1α, SIRT1, UCP1 유전자발현이 Chow군과 유사한 수준으로 다시 증가하였고 CREB 단백질의 인산화가 증가하였다. 또한 LJ2501 섭취는 내장지방조직에서 비만으로 인해 유도된 열발생 저해현상을 현저히 개선함으로써 항비만효과를 나타냈음을 알 수 있다(도 11a 및 11 b).
미토콘드리아의 열발생 능력을 향상시키는데 있어서 연합해지 호흡 외에 미토콘드리아 생합성이 중요한 역할을 한다. PGC-1α는 NRF-1(nuclear respiratory factor-1)을 활성화시키고, 후자는 전자전달계 COX2(cytochrome C oxidase subunit 2)의 프로모터를 활성화시키므로서 미토콘드리아 생합성에 중요한 역할을 한다. NRF-1의 또 다른 타겟 유전자인 TFAM(mitochondrial transcription factor A)는 미토콘드리아 DNA의 전사와 복제를 개시하는 역할을 한다. 본 실험에서 LJ2501 섭취는 미토콘드리아 생합성에 중요한 역할을 하는 NRF-1, COX2, TFAM의 발현을 증가시킴으로서 미토콘드리아의 생합성을 증가시키는 역할을 하는 것이 확인되었다(도 11a).
6) 지방합성 조절 작용기작 규명
간조직에서 LXRα(liver receptor Xα)-SREBP1c 신호전달체계는 지방간을 유도하는 주요한 경로로 알려져 있다. 즉, LXRα는 SREBP-1c와 함께 간 조직에서 지방합성을 조절하는 핵 전사인자이며, LPL(lipoprotein lipase), FAS, ACC (acetyl-CoA carboxylas) 등의 지방합성 유전자들의 발현을 조절한다. 활성화된 AMPK(AMP-activated protein kinase)는 LXRα 프로모터 활성을 억제하고 결과적으로 지방간을 개선시키는 역할을 한다. 본 연구에서 HFD를 섭취시킨 마우스의 경우 Chow군에 비해 간조직의 AMPK 인산화가 유의하게 감소하였고 LXRα, SREBP-1c, LPL, FAS, ACC 등의 지방합성 유전자 발현은 모두 유의하게 증가되었다. 아울러 LJ2501 화합물의 섭취는 HFD 섭취로 인해 야기된 AMPK 단백질의 인산화 감소 및 하위 신호전달체계 유전자들의 발현 증가현상을 역전시켜서 Chow 식이군과 유사한 수준으로 회복시켰다(도 12).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염:
    화학식 1
    Figure PCTKR2015009944-appb-I000010
    상기 화학식에서, R1은 C1-C3 알킬기이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R1은 메틸기인 것을 특징으로 하는 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항의 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증(dyslipidemia), 지방간 및 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환(metabolic disease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 이상지방혈증은 고지혈증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 지방간은 비알콜성 지방간인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포 분화를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 혈중 지방, 간 지방 또는 내장 지방을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 내장 지방은 부고환지방, 신장주변지방, 장간막지방 및 후복강지방으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 지방을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 혈액내 ALT(alanine aminotransferase) 또는 AST(aspartate aminotransferase)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항의 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환의 개선 또는 완화용 식품 조성물.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항의 펜타디에노일 피페리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증(dyslipidemia), 지방간 및 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환(metabolic disease)의 예방, 개선 또는 치료방법.
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