CN109371081A - 一种活性猪脑多肽的制备方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种活性猪脑多肽的制备方法，包括将猪脑去除脑膜后，加入磷酸缓冲盐溶液高速匀浆；再按猪脑质量比加入胰蛋白酶水解1‑3小时；再用盐酸调pH至6.0，加入Protamex复合蛋白酶1.6‑2.4％，温度为50℃‑70℃水浴4小时，90‑100℃灭活10min；最后离心后取上清即得到活性猪脑多肽。还可以进一步将其超滤。按照本发明所述的制备方法得到活性猪脑多肽，提高了其水解度，增加产量和活性。

Description

一种活性猪脑多肽的制备方法及其产品
技术领域
本发明属于生物技术多肽制备领域，涉及一种活性猪脑多肽的制备方法及其产品。
背景技术
脑蛋白水解产物活性脑多肽是一种大脑所特有的肽能神经营养药物，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。阿尔茨海默病是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，是老年痴呆症的一种。临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种精神症状和障碍。张道东等采用脑蛋白水解物注射液治疗AD患者，对其疗效和安全性进行了观察和评估。治疗3周后在简易智力状态检查量(MMSE)评分、韦氏成人记忆量表(WMS)评分、日常生活活动能力(ADL)及临床总体疗效(CGI)等方面明显优于传统药物。结果表明脑蛋白水解物注射液能迅速改善大脑的血液供应，增加脑活性、促进有氧代谢，对AD具有较好的治疗作用。近年来，脑蛋白水解物得到国内外的广泛关注，对其化学成分，药理作用，临床疗效及生产工艺都有不同的研究成果。
大分子的蛋白质可以采用酸水解，碱水解和酶水解等方法进行水解，但是酸水解使色氨酸全部破坏，丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、半胱氨酸部分被破坏；碱水解可以引起消旋作用，因此大部分采用酶水解的方法。其优点在于安全性高，条件温和，可定位生产特定的肽类，成本低廉。但是不同的酶作用于不同的底物，其制备工艺的具体参数和步骤都成为限制最后产物的关键因素，因此，本发明从多角度出发，探索出一种新的活性猪脑多肽的制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种活性猪脑多肽的制备方法及其产品。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种活性猪脑多肽的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
1)取猪脑，去除脑膜，加入2-3倍量的磷酸缓冲盐溶液，然后进行匀浆；
2)按猪脑质量比加入胰蛋白酶4-6％，温度37℃-45℃水浴1-3小时；
3)用盐酸调pH至6.0，加入Protamex复合蛋白酶1.6-2.4％，温度为50℃-70℃水浴4小时，灭活；
4)离心后取上清。
进一步，所述磷酸缓冲盐溶液pH8.0-8.5。
进一步，所述匀浆为速度10000-16000转/分，每次5min，间隔3-5min，反复5-7次。
进一步，所述灭活为调pH8，于90-100℃10min；
进一步，所述胰蛋白酶加入量为5％。
进一步，所述Protamex复合蛋白酶加入量为2％。
进一步，所述步骤4)中离心速率为8000-12000rpm，离心时间为5-10min。
进一步，制备方法还包括步骤5)将步骤4)的上清进行超滤。
以上任一项所述的制备方法制备的活性猪脑多肽。
本发明的有益效果在于：1.在匀浆过程中用磷酸盐缓冲液代替传统的超纯水，充分保证组织在匀浆时pH的稳定，为蛋白的提取时提供温和的环境；2.双酶的结合提高水解度，利用2种酶在不同pH才有活性，减少一个灭活的步骤，对已经水解出的多肽活性减少损失，间接提高水解产物脑多肽的活性。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实施例1中不同胰蛋白酶添加量的水解度曲线图；
图2为实施例2中胰蛋白酶不同作用时间的水解度曲线图；
图3为实施例3中Protamex复合蛋白酶不同添加量的水解度的曲线图；
图4为实施例4中Protamex复合蛋白酶水解时不同pH的水解度曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
1.实验试剂：
胰蛋白酶：武汉佰兴生物科技有限公司，活性10000U/g，CAS:9002-07-7；Protamex复合蛋白酶(诺维信，活力以每克安森ANSON单位(AU/g)标定，1.5AU/g)。
2.仪器：高速匀浆机：蒙特ETS－2
3.实验方法：采用甲醛滴定法测定水解度(DH)。
实施例1
一种活性猪脑多肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)取新鲜猪脑50g，去除脑膜，加入2倍量的pH8.1磷酸缓冲盐溶液(100ml PBS)，然后在高速匀浆机进行匀浆，匀浆速度为10000转/分，每次5min，间隔3-5min，反复5-7次；
2)按猪脑的质量比加入胰蛋白酶1％，温度37℃下水浴2小时；
3)用盐酸调pH至6.0，加入Protamex复合蛋白酶2％，温度50℃下水浴4小时，再调pH8，于90-100℃10min灭活；
4)离心5-10min，转速8000-10000rpm，取上清检测。
按照与上述相同的步骤，区别在于步骤2)中胰蛋白酶的加入量分别为2％，3％4％，5％，6％，7％，8％，分别制备得不同样品，测量其水解度，结果如表1所示，图1为不同胰蛋白酶添加量的水解度曲线图。
表1 不同胰蛋白酶添加量的水解度
从表1可以看出，胰蛋白酶添加量在4-8％之间，水解度比较好，但是6-8％的添加量比5％的水解度并没有随添加浓度成正比上升，所以确定添加量在4-6％比较合适，最好的为5％。
实施例2
一种活性猪脑多肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)取新鲜猪脑100g，去除脑膜，加入2倍量的pH8.3磷酸缓冲盐溶液(200ml PBS)，然后在高速匀浆机进行匀浆，匀浆速度为12000转/分，每次5min，间隔3-5min，反复5-7次；
2)按猪脑的质量比加入胰蛋白酶5％，温度37℃下水浴1小时；
3)用盐酸调pH至6.0，加入Protamex复合蛋白酶2％，温度50℃下水浴4小时，再调pH8，于90-100℃10min灭活；
4)离心5-10min，转速8000-10000rpm，取上清检测。
按照与上述相同的步骤，区别在于步骤2)中胰蛋白酶的水浴时间分别为1.5小时，2小时，2.5小时，3小时，3.5小时，4小时分别制备得不同样品，测量其水解度，结果如表2所示，图2为胰蛋白酶作用时间的水解度曲线图。
表2 胰蛋白酶作用时间对水解的影响
从表2可知，胰蛋白酶水解的时间在1.5-3小时比较合适，最优选的是2小时。
实施例3
一种活性猪脑多肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)取新鲜猪脑50g，去除脑膜，加入3倍量的pH8.5磷酸缓冲盐溶液(150ml PBS)，然后在高速匀浆机进行匀浆，匀浆速度为12000转/分，每次5min，间隔3-5min，反复5次；
2)加入胰蛋白酶5％，温度37℃下水浴2小时；
3)用盐酸调pH至6.0，加入Protamex复合蛋白酶0.4％，温度50℃下水浴4小时，调pH8，于90-100℃10min灭活；
4)离心5min，转速10000rpm，取上清检测。
按照与上述相同的步骤，区别在于步骤3)中Protamex复合蛋白酶的加入量分别为0.8％，1.2％，1.6％，2％，2.4％，分别制备得不同样品，测量其水解度，结果如表3所示，图3为Protamex复合蛋白酶不同添加量的水解度的曲线图。
表3 Protamex复合蛋白酶添加量对水解度的影响
从表3可知，Protamex复合蛋白酶在1.6-3％时，本发明的活性猪脑多肽的制备方法中猪脑蛋白水解度比较高，高于2.4％，水解度增长平缓，优选为2-2.4％。
实施例4
一种活性猪脑多肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)取新鲜猪脑50g，去除脑膜，加入3倍量的pH8.5磷酸缓冲盐溶液(150ml PBS)，然后在高速匀浆机进行匀浆，匀浆速度为12000转/分，每次5min，间隔3-5min，反复5次；
2)加入胰蛋白酶5％，温度37℃下水浴2小时；
3)用盐酸调pH至5.0，加入Protamex复合蛋白酶2％，温度50℃下水浴4小时，调pH8，于90-100℃10min灭活；
4)离心8min，转速10000rpm，取上清检测。
按照与上述相同的步骤，区别在于步骤3)中Protamex复合蛋白酶水解的pH分别为pH5.5，pH6，pH6.5，pH7，pH7.5，分别制备得不同样品，测量其水解度，结果如表4所示，图4为Protamex复合蛋白酶水解时不同pH的水解度曲线图。
表4 Protamex复合蛋白酶水解pH对水解度的影响
由表4可以看出，在本发明的活性猪脑多肽的制备方法中，Protamex复合蛋白酶水解时pH6.0时，猪脑蛋白水解度比较高。随着pH的增加，其水解度反而降低。
实施例5
一种活性猪脑多肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)取新鲜猪脑100g，去除脑膜，加入3倍量的pH8.5磷酸缓冲盐溶液(300ml PBS)，然后在高速匀浆机进行匀浆，匀浆速度为16000转/分，每次5min，间隔3-5min，反复5次；
2)加入胰蛋白酶5％，温度37℃下水浴2小时；
3)用盐酸调pH至6.0，加入Protamex复合蛋白酶2％，温度50℃下水浴4小时，调pH8，于90-100℃10min灭活；
4)离心10min，转速10000rpm，取上清，再用超滤膜为1KD超滤浓缩。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种活性猪脑多肽的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
1)取猪脑，去除脑膜，加入2-3倍量的磷酸缓冲盐溶液，然后进行匀浆；
2)按猪脑质量比加入胰蛋白酶4-6％，温度37℃-45℃水浴1-3小时；
3)用盐酸调pH至6.0，加入Protamex复合蛋白酶1.6-2.4％，温度为50℃-70℃水浴4小时，灭活；
4)离心后取上清。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲盐溶液pH8.0-8.5。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述匀浆为速度10000-16000转/分，每次5min，间隔3-5min，反复5-7次。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭活为调pH8，于90-100℃灭活10min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶加入量为5％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Protamex复合蛋白酶加入量为2％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中离心速率为8000-12000rpm，离心时间为5-10min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤5)将步骤4)的上清进行超滤。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备的活性猪脑多肽。
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