CN104096214A - 一种脑蛋白水解物冻干粉针剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脑蛋白水解物冻干粉针剂及其制备方法，取猪脑，去杂，加纯化水匀浆；匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；清液调节pH至1.7～3，加热至100～110℃，保温15～45min，然后调pH至8.0～9.0；8～10kd膜超滤，收集滤液；滤液上柱层析，洗脱液调pH至8.0～9.0，阴离子交换膜浓缩，0.2μm膜过滤得原液；原液冻结，然后解冻，加赋形剂，调pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤；灌装，冻干。所得冻干粉针剂中多肽与对照品相似≥0.90，含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量比例≥85％，无需额外补充添加氨基酸，完全依靠猪脑水解制得，稳定安全。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种脑蛋白水解物冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术
脑蛋白水解物产品是由原材料经检验、检疫合格，提取，精制，灭菌等生产工艺制备得到；脑蛋白水解物的主要成分是低分子肽和游离氨基酸。易通过血脑屏障进入脑神经细胞，低分子肽具有与天然存在的神经营养因子相同的作用，能诱导神经元分化、维持正常神经细胞的功能、增加神经递质的产生和突触传递，保护神经细胞免受各种损害，调节人体脑代谢、神经传递及神经生长；能提高葡萄糖分解酶活性，增加脑对葡萄糖的无氧能量代谢，降低脑内乳酸的浓度，在缺血缺氧时对神经细胞的线粒体有保护作用。
脑蛋白水解物注射液上世纪由奥地利EBEWE药厂进口注册，到2010年底，已有公开的涉及脑蛋白水解物制剂及工艺的专利申请29件。
例如中国发明专利文献CN01130523.1公开了一种脑蛋白水解物注射液生产工艺：新鲜猪脑去除表面的粘膜及血渍等，匀浆，双层纱布过滤，胃蛋白酶水解，加胰酶水解，加盐酸调pH值2.5～3.0，-20～10℃下静置10～30小时；室温，双层纱布过滤，加水，调pH值到中性，微孔滤膜过滤澄清，超滤膜超滤，超滤膜进行浓缩，浓缩液加热沸腾15分钟，然后迅速冷却，再微孔滤膜和超滤膜，得到的超滤液，再经121℃蒸汽灭菌；根据所需药液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算需要添加的氨基酸用量，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配装针成成品药液，灭菌成无菌制剂。又如CN1857711A公开了一种脑蛋白水解物及其冻干制剂的生产方法：将猪脑匀浆，胃蛋白酶、胰酶水解，上羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化，调配肽图，收集目标物，采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，进行定氮、氨基酸分析，添加相应氨基酸配制成浓配液，滤膜过滤，即得。现有的制备工艺在生产制剂时需要额外添加相应氨基酸才能制得符合标准的脑蛋白水解物，而根据国家食品药品监督管理局2008年734号关文件要求，脑蛋白水解物不得添加外源性氨基酸。因而我们需要进行不添加外源性氨基酸的脑蛋白水解物的制备方法的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有脑蛋白水解物制备技术中需要额外添加相应氨基酸的缺陷，提供一种脑蛋白水解物冻干粉针剂及其制备方法，采用该制备方法制备的脑蛋白水解物冻干粉针剂中小分子肽反相肽图色谱鉴别与对照品相似度≥0.90，无需补充添加外源性氨基酸，完全依靠猪脑水解制得。
本发明的第一个方面是提供一种脑蛋白水解物冻干粉针剂，所述脑蛋白水解物冻干粉针剂中小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697～200602中的小分子多肽的相似度≥90％；所述脑蛋白水解物冻干粉针剂含有16种游离氨基酸：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；所述脑蛋白水解物冻干粉针剂中总的氨基酸的氮含量占所述脑蛋白水解物冻干粉针剂的总氮量的85％以上。
优选地，所述脑蛋白水解物冻干粉针剂采用下述步骤制备而成：
1)取检验合格猪脑，去杂(去除血管、脂肪等杂质)，加纯化水匀浆；
2)将步骤1)得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
3)将步骤2)得到的清液调节pH至1.7～3，加热至100～110℃，保温15～45min(优选为20～40min，更优选为25～35min)，然后调节pH至8.0～9.0；
4)冷处理，取清液，8～10kd膜超滤，收集滤液；
5)将步骤4)得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，阴离子交换膜浓缩，0.2μm膜过滤得原液；
6)将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入赋形剂，控制赋形剂的含量为4～8wt％，调节pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤；
步骤7)灌装，设置冻干曲线，冻干，压塞，轧盖，既得。
其中，步骤4)中所述冷处理，是指将液体冷却到10℃以下。
优选地，步骤7)中所述冻干曲线为：将温度降至-38℃以下，维持3～5小时；开启冷凝器，当冷凝器温度降至-50℃以下开启抽真空，当真空度低于10Pa，升温，但控制温度低于0℃，维持4～10小时；再次升温至10℃～45℃，维持4小时以上。
优选地，在步骤1)之后，进行步骤2)之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。
进一步优选地，使蛋白质变性具体可采用下述步骤：将匀浆液与75～85℃下保温15～30min。
优选地，步骤6)中所述的赋形剂为甘露醇、聚乙二醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖或葡萄糖。
优选地，步骤5)中上柱层析所使用的层析填料为Amberlite IRA-200。
优选地，步骤5)中所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子膜(孔径0.001μm)。
优选地，步骤2)具体为：调节pH至1.7～3.0，加入胃蛋白酶水解，胃蛋白酶水解于35～45℃下进行，保温3～5h，然后调节pH至7.2～7.8，加入胰酶水解，胰酶水解于35～45℃下进行，保温2～4h，灭活酶，终止水解，收集清液。
其中，步骤2)中收集清液可以通过过滤、离心等本领域已知的方式实现。
本发明的第二个方面是提供一种脑蛋白水解物冻干粉针剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，取检验合格猪脑，去杂(去除血管、脂肪等杂质)，加纯化水匀浆；
步骤2，将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
步骤3，将步骤2得到的清液调节pH至1.7～3，加热至100～110℃，保温15～45min(优选为20～40min，更优选为25～35min)，然后调节pH至8.0～9.0；
步骤4，冷处理，取清液，8～10kd膜超滤，收集滤液；
步骤5，将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，阴离子交换膜浓缩，0.2μm膜过滤得原液；
步骤6，将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入赋形剂，控制赋形剂的含量为4～8wt％，调节pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤；
步骤7灌装，设置冻干曲线，冻干，压塞，轧盖，既得。
其中，步骤4中所述冷处理，是指将液体冷却到10℃以下。
优选地，步骤7中所述冻干曲线为：将温度降至-38℃以下，维持3～5小时；开启冷凝器，当冷凝器温度降至-50℃以下开启抽真空，当真空度低于10Pa，升温，但控制温度低于0℃，维持4～10小时；再次升温至10℃～45℃，维持4小时以上。
优选地，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。
进一步优选地，使蛋白质变性具体可采用下述步骤：将匀浆液于75～85℃下保温15～30min。
优选地，所述制备方法还包括步骤7：灌装，100～120℃灭菌，检漏。
优选地，步骤6中所述的赋形剂为甘露醇、聚乙二醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖或葡萄糖。
优选地，步骤5中上柱层析所使用的层析填料为Amberlite IRA-200。
优选地，步骤5中所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子膜。
优选地，步骤2具体为：调节pH至1.7～3.0，加入胃蛋白酶水解，胃蛋白酶水解于35～45℃下进行，保温3～5h，然后调节pH至7.2～7.8，加入胰酶水解，胰酶水解于35～45℃下进行，保温2～4h，灭活酶，终止水解，收集清液。
其中，步骤2中收集清液可以通过过滤、离心等本领域已知的方式实现。与现有技术相比，本发明制备工艺具有如下优点：
1、本发明在胃蛋白酶、胰酶水解成多肽与游离氨基酸的清液后，调pH至1.7～3.0，100～110℃加热30分钟，可防止水解液中游离氨基酸再次结合成肽键，形成短肽，同时可以灭活人畜共患病毒，比现有专利更合理，防止多肽与游离氨基酸可逆结合和灭活人畜共患病毒在双酶水解后进行，属于末端控制，无其它生物材料加入，更安全；
2、采用Amberlite IRA-200交换填料可大大改善现有阴离子交换不能吸附全部氨基酸的问题；
3、采用阴离子交换膜，在pH8.0～9.0溶液中，氨基酸带负电荷，与膜表面电荷相互排斥，游离氨基酸和多肽被截留；阳离子交换膜优选美国进口膜DUS-8040C离子膜，孔径为0.001um，孔径50d分子量，游离氨基酸可进一步被截留；
4、本发明工艺中采用了2次超滤，2次过滤，最大限度降低大分子致敏物质、保证了最终不可灭菌SAL无菌保证值；
5、本发明工艺中采用超滤后冻结，超滤去除大分子后冻结可减少氨基酸析出，冻结后解冻可以进一步去除少量杂质；
6、本发明提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂中小分子肽反相肽图色谱鉴别与脑蛋白水解物140697～200602的相似度≥0.90；含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量比例≥85％，含有门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸等16种氨基酸。
本发明工艺简单，制得的脑蛋白水解物冻干粉针剂中小分子多肽与16种游离氨基酸含量恒定，所得脑蛋白水解物冻干粉针剂中多肽与对照品相似≥0.90，含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量比例≥85％，无需额外补充添加氨基酸，完全依靠猪脑水解制得，药效稳定，更安全；冻干粉针剂中水分含量小于3％，制剂稳定，物质不易改变，保存期质量更稳定，降低不良反应发生率，提高用药安全。
附图说明
图1为本发明实施例1制备工艺中的冻干曲线图；
图2为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂与中检所脑蛋白水解物140697～200602的对比指纹图谱；
图3为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂的指纹图谱；
图4为中检所脑蛋白水解物140697～200602的指纹图谱；
图5为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂与中检所脑蛋白水解物140697～200602的重叠指纹图谱；
图6为中检所脑蛋白水解物140697～200602的16种氨基酸的高效液相图谱；
图7为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂的游离氨基酸的高效液相图谱；
图8为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂的总氨基酸的高效液相图谱；
图9为本发明实施例2制备工艺中的冻干曲线图；
图10为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂与中检所脑蛋白水解物140697～200602的对比指纹图谱；
图11为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂的指纹图谱；
图12为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂与中检所脑蛋白水解物140697～200602的重叠指纹图谱；
图13为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂的游离氨基酸的高效液相图谱；
图14为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物冻干粉针剂的总氨基酸的高效液相图谱。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明做进一步的描述，以更好地理解本发明。
实施例1
脑组织(检疫合格)去除血管、脂肪等等杂质后取100kg，加1.5倍体积纯化水匀浆，于80℃保温25分钟，冷却，盐酸调pH1.7，胃蛋白酶水解，42℃保温3小时，氢氧化钠调pH7.6，胰酶水解，42℃保温2小时，离心收集清液；盐酸调pH2，105℃下保温30分钟，氢氧化钠调pH8.5；冷处理，抽取上清，10kd膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，用DUS-8040C离子膜浓缩50L，0.2μm膜除菌过滤，得原液，-15℃以下冻结保存；原液解冻，加入赋形剂5％，调节pH6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜除菌过滤，灌装；设置冻干曲线(参照图1：灌装制品温度达到-40℃以下时，继续降温3小时，且冷凝器的温度达到-50℃以下时，抽真空，当真空系统的真空度低于10Pa时，一次干燥温度设定为0℃以下干燥，维持5小时；二次干燥温度设定为10℃～45℃，到达温度恒温干燥4小时以上)，冻干，真空压塞，轧盖，每支为含总氮30mg的规格。
相似度测定：
对照品为中检所脑蛋白水解物140697～200602。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4mm，粒径5μm)；以0.1％三氟醋酸溶液为流动相A；以0.085％三氟醋酸乙腈溶液--0.1％三氟醋酸溶液(80:20)为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml；检测波长为276nm。柱温40℃；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，结果如图2～5和表2所示。
表1 相似度测定中的梯度洗脱表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 0 | 100 |
| 53 | 0 | 100 |
| 55 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
表2 实施例1指纹图谱相似度评价结果
| S1 | S2 | 对照指纹图谱 | |
| S1 | 1 | 0.944 | 0.969 |
| S2 | 0.944 | 1 | 0.996 |
| 对照指纹图谱 | 0.969 | 0.996 | 1 |
由图2-5和表2可知，本实施例提供的总氮30mg规格的冻干粉针剂中的小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697～200602的相似度为0.944，符合质量控制要求(≥0.90)。
氨基酸测定：
对照品为中检所脑蛋白水解物140697～200602。AccQ Tag方法，4μmNora～PakTMC18(3.9×150mm)柱，流动相A为pH5.0、0.1mol/L，醋酸-磷酸盐缓冲液；流动相B为60％HPLC级乙腈，按表3进行梯度洗脱；使用AccQFluor衍生剂柱前衍生，UV检测波长为248nm，流速为每分钟1ml，柱温为37℃。检测结果如图6、7和8所示。
表3 氨基酸测定中的梯度洗脱表
| 时间(min) | 流速(ml/min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | 曲线 |
| 起始 | 1.0 | 100 | 0 | * |
| 0.5 | 1.0 | 98 | 2 | 6 |
| 15.0 | 1.0 | 93 | 7 | 6 |
| 19.0 | 1.0 | 90 | 10 | 6 |
| 32.0 | 1.0 | 67 | 33 | 6 |
| 33.0 | 1.0 | 67 | 33 | 6 |
| 34.0 | 1.0 | 0 | 100 | 6 |
| 37.0 | 1.0 | 0 | 100 | 6 |
| 38.0 | 1.0 | 100 | 0 | 6 |
| 42.0 | 1.0 | 100 | 0 | 6 |
由图6和图7可知，本实施例提供的总氮30mg规格的冻干粉针剂中氨基酸的保留时间和中检所脑蛋白水解物140697～200602的一致，含有16种氨基酸(门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸)。
由图8可知，本实施例提供的总氮30mg规格的冻干粉针剂中总氨基酸的氮含量占总氮的87.4％。
实施例2
脑组织(检疫合格)去除血管、脂肪等杂质后取100kg，加2倍体积纯化水匀浆，于85℃保温30分钟，冷却，盐酸调pH2.0，胃蛋白酶水解，42℃保温4小时，氢氧化钠调pH7.8，胰酶水解，42℃保温2小时，离心收集清液；盐酸调pH2，110℃水解30分钟，氢氧化钠调pH9.0；冷处理，抽取上清，10kd膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，用DUS-040C离子膜浓缩50L，0.2μm膜除菌过滤，得原液，-5℃以下冻结保存；原液解冻，加入赋形剂6％，调节pH6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜除菌过滤，灌装；设置冻干曲线(参照图9：灌装制品温度达到-38℃以下时，继续降温4小时，且冷凝器的温度达到-50℃以下时，抽真空，当真空系统的真空度低于10Pa时，一次干燥温度设定为0℃以下干燥，维持8小时；二次干燥温度设定为10℃～45℃，到达温度恒温干燥12小时以上)，冻干，真空压塞，轧盖，每支为含总氮60mg的规格。
相似度测定的方法参照实施例1，结果如图4、图10～12和表4所示。
表4 实施例2指纹图谱相似度评价结果
| S1 | S2 | 对照指纹图谱 | |
| S1 | 1 | 0.955 | 0.973 |
| S2 | 0.955 | 1 | 0.998 |
| 对照指纹图谱 | 0.973 | 0.998 | 1 |
由图4、图10-12和表4可知，本实施例提供的总氮60mg规格的冻干粉针剂中的小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697～200602的相似度为0.955，符合质量控制要求(≥0.90)。
氨基酸测定的方法参照实施例1，结果如图6、图13和图14所示。由图6和图13可知，本实施例提供的总氮60mg规格的冻干粉针剂中氨基酸的保留时间和中检所脑蛋白水解物140697～200602的一致，含有16种氨基酸(门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸)。由图14可知，本实施例提供的总氮60mg规格的冻干粉针剂中总氨基酸的氮含量占总氮的86.8％。
实施例3
脑组织(检验、检疫合格)去除血管等杂质后取100kg，加2倍体积纯化水匀浆，于85℃保温30分钟，冷却，盐酸调pH3.0，胃蛋白酶水解，35℃保温5小时，氢氧化钠调pH7.2，胰酶水解，45℃保温3小时，离心收集清液；盐酸调pH3.0，110℃保温30分钟，氢氧化钠调pH8.0；冷处理，抽取上清液，10kd膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，用DUS-040C离子膜浓缩50L，0.2μm膜过滤，得原液，-15℃以下冻结保存；原液解冻，加入赋形剂8％，调节pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤，灌装；设置冻干曲线(灌装制品温度达到-38℃以下时，继续降温4小时，且冷凝器的温度达到-50℃以下时，抽真空，当真空系统的真空度低于10Pa时，一次干燥温度设定为0℃以下干燥，维持6小时；二次干燥温度设定为10℃～45℃，到达温度恒温干燥8小时以上)，冻干，真空压塞，轧盖，每支为含总氮30mg的规格。
实施例4
脑组织(检验、检疫合格)去除血管等杂质后取100kg，加2倍体积纯化水匀浆，于75℃保温20分钟，冷却，盐酸调pH1.7，胃蛋白酶水解，40℃保温5小时，氢氧化钠调pH7.2，胰酶水解，45℃保温3小时，离心收集清液；盐酸调pH2.8，110℃保温45分钟，氢氧化钠调pH8.0；冷处理，抽取上清液，10kd膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，用DUS-040C离子膜浓缩50L，0.2μm膜过滤，得原液，-15℃以下冻结保存；原液解冻，加入赋形剂7％，调节pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤，灌装；设置冻干曲线(灌装制品温度达到-38℃以下时，继续降温3小时，且冷凝器的温度达到-50℃以下时，抽真空，当真空系统的真空度低于10Pa时，一次干燥温度设定为0℃以下干燥，维持6小时；二次干燥温度设定为10℃～45℃，到达温度恒温干燥10小时以上)，冻干，真空压塞，轧盖，每支为含总氮30mg的规格。
实施例5
脑组织(检验、检疫合格)去除血管等杂质后取150kg，加1倍体积纯化水匀浆，于80℃保温15分钟，冷却，盐酸调pH1.7，胃蛋白酶水解，40℃保温5小时，氢氧化钠调pH7.2，胰酶水解，45℃保温3小时，离心收集清液；盐酸调pH1.7.，110℃保温15分钟，氢氧化钠调pH8.0；冷处理，抽取上清液，10kd膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，用DUS-040C离子膜浓缩50L，0.2μm膜过滤，得原液，-15℃以下冻结保存；原液解冻，加入赋形剂8％，调节pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤，灌装；设置冻干曲线(灌装制品温度达到-38℃以下时，继续降温4小时，且冷凝器的温度达到-50℃以下时，抽真空，当真空系统的真空度低于10Pa时，一次干燥温度设定为0℃以下干燥，维持6小时；二次干燥温度设定为10℃～45℃，到达温度恒温干燥8小时以上)，冻干，真空压塞，轧盖，每支为含总氮60mg的规格。
对实施例3～5提供的注射液进行相似度测定，测定方法参照实施例1。实施例3～5提供的注射液中小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697～200602的相似度分别为0.957、0.952、0.954，均符合质量控制要求(≥0.90)。
对实施例3～5提供的注射液进行氨基酸测定，测定方法参照实施例1。实施例3～5提供的注射液中游离氨基酸与对照品保留时间一致，含有16种氨基酸，实施例3～5提供的注射液中总氨基酸的氮含量占总氮的比例分别为87.5％、86.9％、88.2％。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种脑蛋白水解物冻干粉针剂，其特征在于，所述脑蛋白水解物冻干粉针剂中小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697～200602中的小分子多肽的相似度≥90％；所述脑蛋白水解物冻干粉针剂含有16种游离氨基酸：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；所述脑蛋白水解物冻干粉针剂中总的氨基酸的氮含量占所述脑蛋白水解物冻干粉针剂的总氮量的85％以上。
2.所述脑蛋白水解物冻干粉针剂采用下述步骤制备而成：
1)取检验合格猪脑，去杂，加纯化水匀浆；
2)将步骤1)得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
3)将步骤2)得到的清液调节pH至1.7～3，加热至100～110℃，保温15～45min，然后调节pH至8.0～9.0；
4)冷处理，取上清液，8～10kd膜超滤，收集滤液；
5)将步骤4)得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，阴离子交换膜浓缩，0.2μm膜过滤得原液；
6)将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入赋形剂，控制赋形剂的含量为4～8wt％，调节pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤；
步骤7)灌装，设置冻干曲线，冻干，压塞，轧盖，既得。
3.根据权利要求2所述的脑蛋白水解物冻干粉针剂，步骤7)中所述冻干曲线为：将温度降至-38℃以下，维持3～5小时；开启冷凝器，当冷凝器温度降至-50℃以下开启抽真空，当真空度低于10Pa，升温，但控制温度低于0℃，维持4～10小时；再次升温至10℃～45℃，维持4小时以上。
4.根据权利要求2所述的脑蛋白水解物冻干粉针剂，其特征在于，在步骤1)之后，进行步骤2)之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。
5.根据权利要求2所述的脑蛋白水解物冻干粉针剂，其特征在于，步骤6)中所述的赋形剂为甘露醇、聚乙二醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖或葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物冻干粉针剂，其特征在于，步骤5)中上柱层析所使用的层析填料为Amberlite IRA-200，所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子膜。
7.一种脑蛋白水解物冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取检验合格猪脑，去杂，加纯化水匀浆；
步骤2，将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
步骤3，将步骤2得到的清液调节pH至1.7～3，加热至100～110℃，保温15～45min，然后调节pH至8.0～9.0；
步骤4，冷处理，取上清液，8～10kd膜超滤，收集滤液；
步骤5，将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8.0～9.0，阴离子交换膜浓缩，0.2μm膜过滤得原液；
步骤6，将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入赋形剂，控制赋形剂的含量为4～8wt％，调节pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤；
步骤7灌装，设置冻干曲线，冻干，压塞，轧盖，既得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤7中所述冻干曲线为：将温度降至-38℃以下，维持3～5小时；开启冷凝器，当冷凝器温度降至-50℃以下开启抽真空，当真空度低于10Pa，升温，但控制温度低于0℃，维持4～10小时；再次升温至10℃～45℃，维持4小时以上。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤6中所述的赋形剂为甘露醇、聚乙二醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖或葡萄糖；步骤5中上柱层析所使用的层析填料为Amberlite IRA-200，阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子膜。
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