CN115197315A - 以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法 - Google Patents

以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115197315A
CN115197315A CN202211072552.4A CN202211072552A CN115197315A CN 115197315 A CN115197315 A CN 115197315A CN 202211072552 A CN202211072552 A CN 202211072552A CN 115197315 A CN115197315 A CN 115197315A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cryoprecipitate
solution
human fibrinogen
raw material
chromatography
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211072552.4A
Other languages
English (en)
Inventor
邓坤
刘健
徐河
陈昱宏
洪福星
刘畅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tonrol Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Tonrol Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tonrol Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Tonrol Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202211072552.4A priority Critical patent/CN115197315A/zh
Publication of CN115197315A publication Critical patent/CN115197315A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：(一)粗纯沉淀制备；(二)溶解过滤；(三)S/D病毒灭活；(四)capto q xp凝胶色谱层析；(五)超滤透析；(六)冻干及干热灭活。本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，制备过程中工艺简单，减少工艺中离心步骤，单步凝胶吸附，有效提高产品纯度；包含两步病毒灭活步骤，可灭活已知的脂包膜/非脂包膜病毒，临床病毒安全性得到极大的保障。

Description

以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法。
背景技术
人纤维蛋白原是一个含有2964个氨基酸残基、相对分子质量为340KD、具有对称的二聚体结构的血浆可溶性糖蛋白，血浆中含量高达2～4g/L。在人凝血系统中发挥着关键作用，凝血的最后阶段是人纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变为人纤维蛋白，人纤维蛋白和其他血细胞成分聚集成不溶性团状物达到止血的目的。除直接参与凝血过程外，还在血小板聚集，血液粘度方面起着重要作用，是心、脑血管病发病的重要原因。
人纤维蛋白原的生产工艺的研究主要有：国内部分企业采用低温乙醇沉淀的生产方法，工艺路线：血浆经8％乙醇沉淀，溶解后S/D病毒灭活，15％乙醇沉淀，溶解后超滤除醇，过滤除菌，分装冻干而成。国内也有部分企业，以冷沉淀为原料，用离子交换层析收集流穿液，经甘氨酸多次沉淀，超滤浓缩，分装冻干而成。德国CSL Behring公司产品工艺路线是：采用冷沉淀为起始原料，经过多次Al(OH)3吸附和甘氨酸沉淀工艺，以及巴氏灭活法(60℃/10h)进行病毒灭活，最终获得纯度高、安全性好的制品。
低温乙醇工艺是利用等电点、蛋白质浓度、温度、离子强度等因素来实现蛋白分离，在蛋白质沉淀时会有共沉现象，易引起纤维蛋白原变性，产品纯度在75％左右。离子交换层析收集流穿液，过程涉及到多次离心分离，增加能耗，周期较长。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种能提高产品纯度，缩短周期，降低能耗的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：
(一)粗纯沉淀制备
(1)以冷沉淀为原料，将冷沉淀切碎，加入到6.5倍24-26℃含肝素钠3IU/g的注射用水中溶解，搅拌溶解1-2h，离心后过滤；
(2)收集步骤(1)中过滤后液体，用0.5mol/L的乙酸调节pH至6.0-7.0，温度降至8-12℃，离心获得粗纯沉淀；
(二)溶解过滤
将步骤(2)中所述粗纯沉淀用溶解液溶解，20-30℃搅拌1h，粗纯沉淀溶解液用0.45μm滤板过滤；
(三)S/D病毒灭活
步骤(二)中过滤后液体在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，在24-26℃保温6h；灭活后液体加入等倍体积的注射用水终止灭活；
(四)capto q xp凝胶色谱层析
(a)用capto q xp凝胶装填柱子，用平衡液进行平衡；
(b)上样，将步骤(三)中灭活后液体进行上样，上样量为凝胶体积的3-5倍，上样速度为6-8mL/min；
(c)洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；
(d)洗脱，用洗脱液进行洗脱；
(五)超滤透析
收集步骤(d)中洗脱后溶液，用透析液透析5-6遍，获得透析浓缩液，即为人纤维蛋白原原液；
(六)冻干及干热
将步骤(五)得到的浓缩液按2-3％蛋白含量进行配制，冻干；冻干结束后进行100℃干热灭活30min，获得人纤维蛋白原产品。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，步骤(二)中所述溶解液配方为：0.02mol/L枸橼酸钠、0.03mol/L氯化钠、0.02mol/Lg盐酸精氨酸，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，步骤(三)中具体步骤为：步骤(二)中过滤后液体按重量10:1比例在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％，在24-26℃保温6h；灭活后液体加入等倍体积的注射用水终止灭活。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，所述S/D溶液为Tween-80和磷酸三丁酯，使用前进行预配，预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，步骤(a)中所述平衡液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，步骤(c)中所述洗涤液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5；步骤(d)中所述洗脱液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.5-1mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，步骤(五)中所述透析液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠，盐酸精氨酸0.15-0.25mol/L，pH 6.8-7.2。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，步骤(五)中将洗脱液超滤透析至电导率10-30Ms/cm，pH 6.5-7.5。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其中，步骤(一)中粗纯沉淀中人纤维蛋白原纯度为40％。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法制备得到的人纤维蛋白原。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，提供了一种一步凝胶吸附制备人纤维蛋白原的方法，技术效果如下：
1、工艺简单，减少工艺中离心步骤，单步层析吸附，能有效提高产品纯度。
2、包含两步病毒灭活步骤，可灭活已知的脂包膜/非脂包膜病毒，临床病毒安全性得到极大的保障。
3、采用capto q xp凝胶能够有效吸附目标蛋白。
4、粗纯沉淀制备方法能够充分溶解冷沉淀，有效保护目标蛋白。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，所述溶解液配方为：0.02mol/L枸橼酸钠、0.03mol/L氯化钠、0.02mol/L g盐酸精氨酸，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5，能够有效保护目标蛋白。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，所述平衡液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5，能够有效平衡凝胶，去除杂蛋白，吸附目标蛋白。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，步骤(c)中所述洗涤液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH6.5-7.5和；步骤(d)中所述洗脱液为0.02-0.1Mmol/L枸橼酸钠和0.5-1Mmol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5，能够有效洗涤去杂蛋白，有效收取目标蛋白。
本发明所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，所述透析液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠，盐酸精氨酸0.15-0.25mol/L，pH 6.8-7.2，能够有效保护目标蛋白活性。
附图说明
图1为本发明实施例1中凝胶色谱层析谱图。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：
(一)粗纯沉淀制备
(1)以冷沉淀为原料，将100g冷沉淀切碎，加入到650g 24-26℃含肝素钠3IU/g的注射用水中溶解，搅拌溶解1.5h，离心后过滤；
(2)收集步骤(1)中过滤后液体600g，用5mL 0.5mol/L的乙酸调节pH至6.2，温度降至10℃，离心获得粗纯沉淀40g；
(二)溶解过滤
将步骤(2)中所述粗纯沉淀用400g溶解液溶解，26℃搅拌1h，粗纯沉淀溶解液用0.45μm滤板过滤；所述溶解液配方为：0.02mol/L枸橼酸钠、0.03mol/L氯化钠、0.02mol/Lg盐酸精氨酸，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；
(三)S/D病毒灭活
步骤(二)中过滤后液体330g，在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液33g，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％，在25℃保温6h。S/D溶液使用前进行预配，吐温-80和磷酸三丁酯预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。
灭活后液体363g，加入等倍体积的注射用水终止灭活。
(四)capto q xp凝胶色谱层析
(a)capto q xp凝胶200mL装填柱子，用平衡液进行平衡；所述平衡液为0.05mol/L枸橼酸钠和0.3mol/L氯化钠溶液，溶液pH 7.1。所述capto q xp凝胶购自美国通用电气公司(GE)。
(b)上样，将步骤(三)中灭活后液体720g以6.6mL/min上样速度进行上样。
(c)洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；所述洗涤液为0.05mol/L枸橼酸钠和0.3mol/L氯化钠溶液，溶液pH 7.1。
(d)洗脱，用洗脱液进行洗脱；所述洗脱液为0.05mol/L枸橼酸钠和0.8mol/L氯化钠溶液，溶液pH 7.1。
(五)超滤透析
收集步骤(d)中洗脱后溶液600g，用透析液透析5遍，至电导率20Ms/cm，pH 7.0，获得透析浓缩液200g，即为人纤维蛋白原原液。所述透析液为枸橼酸钠0.05mol/L，盐酸精氨酸0.2mol/L，pH为7.1。
(六)冻干及干热
将步骤(五)得到的浓缩液按2.5％蛋白含量进行配制，冻干；冻干结束后进行100℃干热灭活30min，获得人纤维蛋白原产品。
步骤(一)中粗纯沉淀中人纤维蛋白原纯度为40％。
图1是凝胶色谱层析谱图，可以看出，采用上述洗涤液洗涤能够有效去除杂蛋白，洗脱液洗脱能够有效洗下目标蛋白，达到纯化目标蛋白的目的。
步骤(五)获得人纤维蛋白原原液纯度为91％，凝固活力20S；冻干后人纤维蛋白原成品纯度91％，凝固活力25S。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(一)粗纯沉淀制备
(1)以冷沉淀为原料，将冷沉淀切碎，加入到6.5倍24-26℃含肝素钠3IU/g的注射用水中溶解，搅拌溶解1-2h，离心后过滤；
(2)收集步骤(1)中过滤后液体，用0.5mol/L的乙酸调节pH至6.0-7.0，温度降至8-12℃，离心获得粗纯沉淀；
(二)溶解过滤
将步骤(2)中所述粗纯沉淀用溶解液溶解，20-30℃搅拌1h，粗纯沉淀溶解液用0.45μm滤板过滤；
(三)S/D病毒灭活
步骤(二)中过滤后液体在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，在24-26℃保温6h；灭活后液体加入等倍体积的注射用水终止灭活；
(四)capto q xp凝胶色谱层析
(a)用capto q xp凝胶装填柱子，用平衡液进行平衡；
(b)上样，将步骤(三)中灭活后液体进行上样，上样量为凝胶体积的3-5倍，上样速度6-8mL/min；
(c)洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；
(d)洗脱，用洗脱液进行洗脱；
(五)超滤透析
收集步骤(d)中洗脱后溶液，用透析液透析5-6遍，获得透析浓缩液，即为人纤维蛋白原原液；
(六)冻干及干热灭活
将步骤(五)得到的浓缩液按2-3％蛋白含量进行配制，冻干；冻干结束后进行100℃干热灭活30min，获得人纤维蛋白原产品。
2.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(二)中所述溶解液配方为：0.02mol/L枸橼酸钠、0.03mol/L氯化钠、0.02mol/L g盐酸精氨酸，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(三)中具体步骤为：步骤(二)中过滤后液体按重量10:1比例在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％，在24-26℃保温6h；灭活后液体加入等倍体积的注射用水终止灭活。
4.根据权利要求3所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：所述S/D溶液为Tween-80和磷酸三丁酯，使用前进行预配，预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。
5.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(a)中所述平衡液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(c)中所述洗涤液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.1-0.5mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5；步骤(d)中所述洗脱液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠和0.5-1mol/L氯化钠溶液，pH 6.5-7.5。
7.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(五)中所述透析液为0.02-0.1mol/L枸橼酸钠，盐酸精氨酸0.15-0.25mol/L，pH 6.8-7.2。
8.根据权利要求1所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(五)中将洗脱液超滤透析至电导率10-30Ms/cm，pH 6.5-7.5。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤(一)中粗纯沉淀中人纤维蛋白原纯度为40％。
10.权利要求1-9任意一项所述的以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法制备得到的人纤维蛋白原。
CN202211072552.4A 2022-09-02 2022-09-02 以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法 Pending CN115197315A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211072552.4A CN115197315A (zh) 2022-09-02 2022-09-02 以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211072552.4A CN115197315A (zh) 2022-09-02 2022-09-02 以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115197315A true CN115197315A (zh) 2022-10-18

Family

ID=83573213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211072552.4A Pending CN115197315A (zh) 2022-09-02 2022-09-02 以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115197315A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3920625A (en) Isolation of coagulation factors from biological material using cross linked sulfated, sulfonated carbohydrates
CA1213214A (en) Preparation of highly purified human antihemophilic factor
CA1243950A (en) Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate
CN113563457B (zh) 一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子ⅷ和纤溶酶原的方法
CN106349387B (zh) 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法
CN108048433B (zh) 一种人凝血酶原复合物的制备方法
CN107163138B (zh) 一种人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法
CN108017710B (zh) 一种人纤维蛋白原的制备方法
US3904751A (en) Process for isolating a fibrin stabilizing factor from human placenta
US4510084A (en) Method of producing an antithrombin III-heparin concentrate or antithrombin III-heparinoid concentrate
CN112028988A (zh) 一种冻干型人凝血因子viii的制备方法
CN107880112B (zh) 一种人凝血因子viii的制备方法以及人凝血因子viii制品
CN109207461B (zh) 一种凝血因子x激活剂及其制备方法
CN111378029B (zh) 一种人凝血因子ix的制备方法
CN105294858A (zh) 一种冻干人凝血因子viii的制备方法
CN113652414B (zh) 一种高纯人凝血酶的制备方法
CN105481976B (zh) 一种制备人凝血因子viii的离子交换层析用洗涤缓冲液及其用途
CN116497009A (zh) 一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法
CN115197315A (zh) 以冷沉淀为原料用色谱层析法制备人纤维蛋白原的方法
CN115947825A (zh) 一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺
CN114957447B (zh) 一种超滤稀释液及提高人凝血因子ⅷ质量的制备方法
CN113789319B (zh) 从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及应用
CN115975997B (zh) 一种人凝血因子ix纯化的二次超滤透析液及纯化方法
CN110563833A (zh) 一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法及其产品和应用
US3627642A (en) Lysozyme salts

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination