CN115896074A - 一种人凝血因子ix纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法 - Google Patents

一种人凝血因子ix纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种特定组成的亲和层析缓冲液体系，包括亲和层析洗涤液和亲和层析洗脱液；所述亲和层析洗涤液是含有如下组分的pH为6.5～7.4的水溶液：0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠；所述亲和层析洗脱液是含有如下组分的pH为7.0～8.0的水溶液：0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸；使用本发明亲和层析缓冲液体系纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。

Description

一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法
技术领域
本发明属于生物制品加工领域，具体涉及一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法。
背景技术
人凝血因子IX(coagulation factorIX,FIX)是一种维生素K依赖的由肝细胞合成并分泌到血液中的单链糖蛋白，由415个氨基酸残基组成，分子量约55KDa，含多糖17％左右。血浆中的含量约为5mg/L，半衰期12～24h。血液内循环的FIX为一种丝氨酸蛋白水解酶形式存在,经其他因子激活后参与活化的内源途径凝血级联反应，对于生理性凝血和止血有重要作用。由于FIX是从健康人血浆中分离的血浆制品，合适的纯化条件和凝胶的使用对FIX比活性有显著性影响，但是目前制备FIX的方法存在FIX比活性低和制备工艺复杂的问题。
例如，蔡骏等人在《柱层析法制备高纯人血FIX研究初探》中报告了一种用DEAE-Sephadex A50凝胶，DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度凝血因子IX的方法，最终FIX比活为35±2.0IU/mg，回收率为30±4％。赵彦鼎等人在《自制填充介质对人血浆凝血因子IX的层析分离》中采用自制的DEAE Bio-Sep FF和肝素Bio-Sep介质，经过两步阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FIX。FIX比活达到99.40IU/mg，纯化倍数为3823倍，回收率约为30％；得到的产品比活性都偏低。
又如，公开号CN110257358A的专利申请《一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法》公开了一种采用DEAE Sephadex A50凝胶+非Ca2+依赖性IX因子免疫亲和层析制备高纯度人凝血因子的生产方法，该方法通过非Ca2+依赖性IX因子免疫亲和层析提高比活性，所制备的人凝血因子IX的比活性达到196.5IU/mg以上。但该方法采用免疫亲和层析制备人凝血因子IX，生产过程中存在配基脱落的风险，后续工艺中未采用有效的去除工艺；亲和层析步骤中洗脱缓冲液含0～2mol/L氯化镁，该物质对人体有一定毒性，但后续却未见有效的去除工艺。
再如，公开号为CN101291951A的专利申请《一种高纯度的人第Ⅸ凝血因子的制备方法》公开了一种利用2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、阳离子交换层析从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式，该方法通过增加层析工艺步骤的方式提高比活性，所制备的人凝血因子IX比活性较高，可达到150IU/mg。公开号CN111378029A的专利申请《一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法》公开了一种2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析纯化从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式，该方式通过四步层析纯化制备FIX比活性可达到150IU/mg以上的制品。但上述两项专利申请由于其生产工艺繁琐，需经过4次层析步骤，本领域专业人士公知，每经过一次层析纯化步骤，均不可避免地会造成目标蛋白损失，因此该制备工艺产品得率较低；此外，4次层析步骤需消耗大量凝胶填料，生产成本极高，不便于大范围推广。
因此，目前亟需提供一种纯化方式简单，成本低廉的，可快速制备高纯度和高回收率高的FIX的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系，以及使用该体系对人凝血因子IX进行纯化的方法。
本发明提供了一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系，包括亲和层析洗涤液和亲和层析洗脱液；
所述亲和层析洗涤液是含有如下组分的水溶液：0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠；
所述亲和层析洗脱液是含有如下组分的水溶液：0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸；
所述亲和层析洗涤液的pH为6.5～7.4；所述亲和层析洗脱液的pH为7.0～8.0。
进一步地，上述亲和层析洗涤液是以如下组分为添加剂的缓冲液：0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠；
所述亲和层析洗脱液是以如下组分为添加剂的缓冲液：0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸；
所述亲和层析洗涤液的pH为7.4；所述亲和层析洗脱液的pH为7.0。
进一步地，上述的亲和层析缓冲液体系还包括亲和层析平衡液，所述亲和层析平衡液为含有0.01～0.03mol/L枸橼酸钠，pH为7.0～8.0的水溶液，优选为以0.03mol/L枸橼酸钠为添加剂，pH为7.4的缓冲液。
本发明还提供了上述的亲和层析缓冲液体系在人凝血因子IX纯化过程中的应用。
本发明还还提供了一种人凝血因子IX纯化方法，包括亲和层析步骤，所述亲和层析步骤使用上述的亲和层析缓冲液体系进行。
进一步地，上述亲和层析步骤包括：
(a)装填肝素亲和凝胶于层析柱，使用亲和层析平衡液平衡4～5倍柱体积；
(b)上样待亲和层析的人凝血因子IX样品，使用亲和层析平衡液洗涤，并用亲和层析洗涤液洗涤；
(c)用亲和层析洗脱液洗脱，从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1～1.5倍柱体积的洗脱液。
进一步地，步骤(a)所述的肝素亲和凝胶是Heparin Bestarose FF、CaptoHeparin、Heparin sepharose FF、UW90 Agarose Heparin或Heparin Agarose FF；
步骤(b)所述待亲和层析的人凝血因子IX样品温度调节为6.0～10.0℃；上样流速为25～150cm/h；所述亲和层析平衡液洗涤和亲和层析洗涤液洗涤的流速为25～150cm/h；
步骤(c)所述亲和层析洗脱液洗脱的流速为25～150cm/h。
更进一步地，步骤(a)所述的肝素亲和凝胶是Heparin Bestarose FF；使用所述亲和层析平衡液平衡5倍柱体积；
步骤(b)所述待亲和层析的人凝血因子IX样品温度调节为10.0℃；上样流速为150cm/h；所述亲和层析平衡液洗涤和亲和层析洗涤液洗涤的流速为150cm/h；
步骤(c)所述亲和层析洗脱液洗脱的流速为150cm/h。
进一步地，上述方法包括如下步骤：
(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)二次离子交换层析；(4)二次超滤透析；(5)亲和层析；(6)纳米过滤；
其中，步骤(1)包括取去冷沉淀的上清血浆经DEAE Sephadex A50凝胶进行柱层析和超滤透析的步骤；
步骤(3)包括经阴离子交换凝胶进行柱层析的步骤，所述阴离子交换凝胶是Diamond DEAE、Capto DEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M或HPDEAE 60。
更进一步地，步骤(1)所述柱层析依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.06～0.12mol/L氯化钠和0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗涤液含0.17～0.23mol/L氯化钠和0.005～0.02mol/枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗脱液含0.5～2.0mol/L氯化钠和0.005～0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；
步骤(3)所述二次离子交换层析所用阴离子交换凝胶是Diamond DEAE，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.10～0.20mol/L氯化钠、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗涤液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20～0.30mol/L氯化钠、0.005～0.020mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗脱液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.33～0.40mol/L氯化钠、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；
步骤(4)所述二次超滤透析所用透析液含0.005～0.020mol/L枸橼酸钠，0.07～0.17mol/L氯化钠，0.015～0.02mol/L盐酸精氨酸，pH值为7.4；
步骤(6)所述纳米过滤所用纳米滤膜规格为≤20nm。
本发明的有益效果：本发明使用了一种特定组成的亲和层析缓冲液体系用于纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1本发明凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法一、制备方法
(1)首次离子交换层析
取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10℃和7.0，按照每1L上清血浆使用1.4g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡液(含0.06mol/L氯化钠和0.005mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0)、洗涤液(含0.17mol/L氯化钠和0.005mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0)和洗脱缓冲液(含0.5mol/L氯化钠和0.005mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0)处理凝胶，收集洗脱液，一次超滤透析；(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯)，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次；
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.10mol/L氯化钠、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至6.0和10mS/cm流入层析柱，上样流速为25cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤(即先后用平衡液和缓冲液分别洗涤，下同)，平衡液为含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.10mol/L氯化钠、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0的缓冲液；洗涤液为含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L氯化钠、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0的缓冲液；平衡和洗涤液流速均为25cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.33mol/L氯化钠、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0的缓冲液)进行洗脱，(平衡液、洗涤液、洗脱液的溶剂均为纯水，下同)洗脱液流速为25cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是：CaptoDEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的5倍透析液用量对制品进行透析，透析液为0.005mol/L枸橼酸钠，0.07mol/L氯化钠，0.015mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4透析缓冲液。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.01mol/L枸橼酸钠，pH 7.4)平衡4倍柱体积。将制品温度调节至6.0℃流入层析柱，上样流速为50cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤，平衡液为含0.01mol/L枸橼酸钠，pH 7.4的洗涤液；洗涤液为含0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠，pH 7.4的洗涤液；平衡和洗涤液流速为50cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.33mol/L氯化钠、0.01mol/L枸橼酸钠，0.015mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4)进行洗脱，洗脱液流速为50cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是：Capto Heparin、Heparin sepharoseFF、UW90 Agarose Heparin和HeparinAgarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒，纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体，用制品量的5倍透析液用量对制品进行透析，透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法，具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
亲和层析上样前后活性回收率为86％，FIX比活性为168IU/mg。
实施例2本发明人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为12℃和7.2，按照每1L上清血浆使用1.5g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡液(含0.10mol/L氯化钠和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为12℃，pH值为7.2)、洗涤液(含0.20mol/L氯化钠和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为12℃，pH值为7.2)和洗脱缓冲液(含1.0mol/L氯化钠和0.020mol/L枸橼酸钠，温度值为12℃，pH值为7.2)处理凝胶，收集洗脱液，一次超滤透析；
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯)，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次；
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.12mol/L氯化钠、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至6.8和15mS/cm流入层析柱，上样流速为100cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤，平衡液为含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.12mol/L氯化钠、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8的缓冲液；洗涤液为含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.28mol/L氯化钠、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8的缓冲液；平衡和洗涤液流速均为100cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.36mol/L氯化钠、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8的缓冲液)进行洗脱，洗脱液流速为100cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是：CaptoDEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析，透析液为0.010mol/L枸橼酸钠，0.14mol/L氯化钠，0.02mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4透析缓冲液。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.4)平衡5倍柱体积。将制品温度调节至7.0℃流入层析柱，上样流速为100cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤，平衡液为含0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.4的洗涤液；洗涤液为含0.13mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠，pH7.4的洗涤液；平衡和洗涤液流速为100cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸，pH7.0)进行洗脱，洗脱液流速为100cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是：Capto Heparin、Heparin sepharose6FF、UW90 Agarose Heparin和HeparinAgarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒，纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体，用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析，透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法，具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
亲和层析上样前后活性回收率为91％，FIX比活性为173IU/mg。
实施例3本发明人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为15℃和7.4，按照每1L上清血浆使用1.6g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡液(含0.12mol/L氯化钠和0.02mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4)、洗涤液(含0.23mol/L氯化钠和0.02mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4)和洗脱缓冲液(含2.0mol/L氯化钠和0.03mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4)处理凝胶，收集洗脱液，一次超滤透析；
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯)，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次；
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠，pH7.5)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至7.5和20mS/cm流入层析柱，上样流速为200cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤，平衡液为含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L氯化钠、0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.5的缓冲液；洗涤液为含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.30mol/L氯化钠、0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.5的缓冲液；平衡和洗涤液流速均为200cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.40mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠，pH7.5的缓冲液)进行洗脱，洗脱液流速为200cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是：CaptoDEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的7倍透析液用量对制品进行透析，透析液为0.020mol/L枸橼酸钠，0.17mol/L氯化钠，0.02mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4透析缓冲液。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.030mol/L枸橼酸钠，pH 7.4)平衡5倍柱体积。将制品温度调节至10℃流入层析柱，上样流速为150cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤，平衡液为含0.03mol/L枸橼酸钠，pH7.4的洗涤液；洗涤液为含0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠，pH7.4的洗涤液；平衡和洗涤液流速为150cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸，pH7.0)进行洗脱，洗脱液流速为150cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是：Capto Heparin、Heparin sepharose 6FF、UW90 Agarose Heparin和Heparin Agarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒，纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体，用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析，透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.2IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法，具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
亲和层析上样前后活性回收率为88％，FIX比活性为175IU/mg。
实验例1、本发明亲和层析所用的洗涤液和洗脱液的筛选
1、洗涤液的筛选
参照实施例1的制备方法，将亲和层析步骤中所用的洗涤液的部分组成按照表1进行调整，其他组成和条件均不变，进行FIX纯化。不同的洗涤液组成得到的亲和层析上样前后的活性回收率、FIX比活性结果如表1所示：
表1
Figure BDA0004006851890000091
Figure BDA0004006851890000101
可见，实验号2～5的洗涤液组成用于FIX纯化过程的亲和层析步骤，能够获得较高收率(不低于80％)且较高比活力(高于150IU/mg)的FIX。其中，实验号4的添加剂组成为氯化钠0.15mol/L、枸橼酸钠0.02mol/L且pH为7.4的洗涤液进行亲和层析处理后的FIX收率高，且FIX比活力高，为最优选的方案。
2、洗脱液的筛选
参照实施例2的制备方法，将亲和层析步骤中所用的洗脱液的部分组成按照表1进行调整，其他组成和条件均不变，进行FIX纯化。不同的洗脱液组成得到的亲和层析上样前后的活性回收率、FIX比活性结果如表1所示：
表2
Figure BDA0004006851890000102
可见，实验号2、5、8、9、10的洗脱液组成用于FIX纯化过程的亲和层析步骤，能够获得较高收率(不低于80％)且较高比活力(高于130IU/mg)的FIX。其中，实验号8的添加剂组成为：氯化钠0.35mol/L、枸橼酸钠0.02mol/L、盐酸精氨酸0.025mol/L且pH为7.0的洗脱液进行亲和层析处理后的FIX收率和FIX比活力最高，为最优选的方案。
综上，本发明提供了一种特定组成的亲和层析缓冲液体系，用于纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。

Claims (10)

1.一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系，其特征在于，包括亲和层析洗涤液和亲和层析洗脱液；
所述亲和层析洗涤液是含有如下组分的水溶液：0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠；
所述亲和层析洗脱液是含有如下组分的水溶液：0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸；
所述亲和层析洗涤液的pH为6.5～7.4；所述亲和层析洗脱液的pH为7.0～8.0。
2.如权利要求1所述的亲和层析缓冲液体系，其特征在于，
所述亲和层析洗涤液是以如下组分为添加剂的缓冲液：0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠；
所述亲和层析洗脱液是以如下组分为添加剂的缓冲液：0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸；
所述亲和层析洗涤液的pH为7.4；所述亲和层析洗脱液的pH为7.0。
3.如权利要求1或2所述的亲和层析缓冲液体系，其特征在于，还包括亲和层析平衡液，所述亲和层析平衡液为含有0.01～0.03mol/L枸橼酸钠，pH为7.0～8.0的水溶液，优选为以0.03mol/L枸橼酸钠为添加剂，pH为7.4的缓冲液。
4.权利要求1～3任一项所述的亲和层析缓冲液体系在人凝血因子IX纯化过程中的应用。
5.一种人凝血因子IX纯化方法，其特征在于，包括亲和层析步骤，所述亲和层析步骤使用权利要求1～3任一项所述的亲和层析缓冲液体系进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤包括：
(a)装填肝素亲和凝胶于层析柱，使用亲和层析平衡液平衡4～5倍柱体积；
(b)上样待亲和层析的人凝血因子IX样品，使用亲和层析平衡液洗涤，并用亲和层析洗涤液洗涤；
(c)用亲和层析洗脱液洗脱，从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1～1.5倍柱体积的洗脱液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的肝素亲和凝胶是HeparinBestarose FF、Capto Heparin、Heparin sepharose FF、UW90Agarose Heparin或HeparinAgarose FF；
步骤(b)所述待亲和层析的人凝血因子IX样品温度调节为6.0～10.0℃；上样流速为25～150cm/h；所述亲和层析平衡液洗涤和亲和层析洗涤液洗涤的流速为25～150cm/h；
步骤(c)所述亲和层析洗脱液洗脱的流速为25～150cm/h。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的肝素亲和凝胶是HeparinBestarose FF；使用所述亲和层析平衡液平衡5倍柱体积；
步骤(b)所述待亲和层析的人凝血因子IX样品温度调节为10.0℃；上样流速为150cm/h；所述亲和层析平衡液洗涤和亲和层析洗涤液洗涤的流速为150cm/h；
步骤(c)所述亲和层析洗脱液洗脱的流速为150cm/h。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)二次离子交换层析；(4)二次超滤透析；(5)亲和层析；(6)纳米过滤；
其中，步骤(1)包括取去冷沉淀的上清血浆经DEAE Sephadex A50凝胶进行柱层析和超滤透析的步骤；
步骤(3)包括经阴离子交换凝胶进行柱层析的步骤，所述阴离子交换凝胶是DiamondDEAE、Capto DEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M或HPDEAE60。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述柱层析依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.06～0.12mol/L氯化钠和0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗涤液含0.17～0.23mol/L氯化钠和0.005～0.02mol/枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗脱液含0.5～2.0mol/L氯化钠和0.005～0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；
步骤(3)所述二次离子交换层析所用阴离子交换凝胶是Diamond DEAE，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.10～0.20mol/L氯化钠、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗涤液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20～0.30mol/L氯化钠、0.005～0.020mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗脱液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.33～0.40mol/L氯化钠、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；
步骤(4)所述二次超滤透析所用透析液含0.005～0.020mol/L枸橼酸钠，0.07～0.17mol/L氯化钠，0.015～0.02mol/L盐酸精氨酸，pH值为7.4；
步骤(6)所述纳米过滤所用纳米滤膜规格为≤20nm。
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