CN111518289A - 一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶及其制备方法与应用。本发明的水凝胶包括原料氧化透明质酸和琥珀酰壳聚糖，还包括钙离子、聚乙二醇衍生物、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐、N‑羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种。本发明通过在氧化透明质酸和琥珀酰壳聚糖的基础上，引入钙离子、聚乙二醇衍生物、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的一种或几种，通过调节水凝胶的组分和组分含量，制备得到可自愈合和可注射水凝胶，使其具备力学性能可调控的特性，提高其生物相容性、止血、促伤口愈合、促血管生成等性能。

Description

一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
组织出血和创伤在日常生活中和临床上十分常见，因此在止血的同时应该注意促进伤口修复和减少疤痕产生。水凝胶被广泛应用于生物医用材料，因为其与细胞外基质结构相似，具备柔软和高含水率的3D结构，有利于细胞生长、粘附和分泌生长因子等。水凝胶能够吸收血液中的水分，富集血小板和血细胞，并且可以保持伤口湿润，从而起到止血和伤口愈合的作用。但是目前研究的水凝胶多为预制水凝胶，难以填补和覆盖不规则的伤口，缺乏可注射和可自愈的特性，当受到外力压迫时，水凝胶容易出现破损而暴露出伤口，从而削弱止血效果。
透明质酸是细胞外基质的主要成分之一，有促进伤口愈合的作用，但是透明质酸缺乏在生理条件下可以形成水凝胶和动态化学键的活性基团，限制其在水凝胶方面的应用。壳聚糖是常用的止血材料之一，因为其带有正电荷的氨基可与红细胞表面的负电荷发生静电作用，有利于加速凝血进而止血。但是壳聚糖在生理条件下难以溶解，阻碍其在生物医学领域更广泛的应用。未经化学修饰的透明质酸和壳聚糖难以形成水凝胶，所以需要对其修饰，使二者能在生理条件下快速形成水凝胶，从而综合二者优势，发掘其在止血和促伤口愈合方面的应用潜能。中国专利文献CN105833344A(申请号201610266469.9)公开了一种可注射水凝胶在眼内填充物中的应用，其特征是在玻璃体切除手术中作为眼内填充物应用，以及作为眼内用药载体应用；所述的可注射水凝胶由两剂组成，第一剂是含氧化多糖的胶液，第二剂是含甲壳素衍生物和/或胶原蛋白的胶液，两剂分别装入双联注射器的两个注射管中，两剂胶液经双联注射器同时推注，在推注过程中发生混合、交联，即氧化多糖的双醛基与甲壳素衍生物和/或胶原蛋白的氨基发生交联反应，形成具有粘弹性的水凝胶。该发明所制备的可注射水凝胶是原位成型可注射水凝胶，需要将两种水凝胶前体溶液装入双联注射器，注射之后方可形成水凝胶，此过程对器械和操作要求高，操作繁琐。并且凝胶化时间需要严格控制，若凝胶化过慢，注射到体内还未形成水凝胶则会被体液稀释，释放原料的毒性并且延长凝胶时间；若凝胶化过快，则会堵塞针头，无法顺利注射。而且该专利所制备的水凝胶仅通过氧化多糖的醛基与甲壳素衍生物和/或胶原蛋白的伯胺基形成单一的可逆亚胺键，不仅会导致较低的力学强度，还会因为残留较多的游离醛基导致较大的细胞毒性。另外，该专利制备的水凝胶仅应用于制备眼内填充物，对于止血和促进伤口愈合方面没有进一步研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶，包括原料：氧化透明质酸和琥珀酰壳聚糖，还包括钙离子、聚乙二醇衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种。
根据本发明优选的，所述可注射自愈合水凝胶包括原料：氧化透明质酸和琥珀酰壳聚糖，以及钙离子和/或聚乙二醇衍生物。
根据本发明优选的，所述可注射自愈合水凝胶包括原料：氧化透明质酸和琥珀酰壳聚糖，以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺和/或聚乙二醇衍生物。
根据本发明优选的，所述钙离子来自氯化钙或碳酸钙。
根据本发明优选的，所述聚乙二醇衍生物为四臂聚乙二醇氨基或端氨基端羧基聚乙二醇，所述聚乙二醇衍生物的重均分子量为5000-10000Da。
上述力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括步骤如下：
(1)配制氧化透明质酸溶液，向氧化透明质酸溶液中加入钙离子溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液的一种或几种，配制得氧化透明质酸复合溶液；
(2)配制琥珀酰壳聚糖溶液，向琥珀酰壳聚糖溶液中加入聚乙二醇衍生物溶液，配制得琥珀酰壳聚糖复合溶液；
(3)将步骤(1)和步骤(2)中的氧化透明质酸溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液，或者氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖溶液，或者氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液混合，进行交联反应，得到力学性能可调的可注射自愈合水凝胶。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述氧化透明质酸按照以下步骤制备：向透明质酸水溶液中逐滴加入高碘酸钠水溶液，黑暗中搅拌反应2h；然后加入过量乙二醇，继续搅拌1h；将所得溶液在去离子水中透析3天后冻干，获得氧化透明质酸。
进一步优选的，所述透明质酸的重均分子量为870-1430KDa，所述透明质酸水溶液的浓度为10mg/mL；所述高碘酸钠水溶液的浓度为0.5mol/L；其中，透明质酸重复二糖单元：高碘酸钠摩尔比为1：(0.6-1)；透析的截留分子量为8-14KDa。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述氧化透明质酸溶液的浓度为40-80mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；进一步优选为60mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述钙离子溶液的浓度为60-120mg/mL；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度均为60-120mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；在氧化透明质酸复合溶液中，氧化透明质酸：钙离子化合物质量比为1：(0.05-0.2)；氧化透明质酸：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺质量比为1：(0.1-0.2)：(0.04-0.2)。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述钙离子溶液的浓度为120mg/mL；在氧化透明质酸复合溶液中，氧化透明质酸：钙离子化合物质量比为1：0.1；氧化透明质酸：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺质量比为1：0.2：0.05或1：0.1：0.04。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述琥珀酰壳聚糖按照以下步骤制备：将壳聚糖分散于含有丁二酸酐的二甲基亚砜中，60℃搅拌反应1.5-4h后离心；将沉淀分散于水中，用氢氧化钠溶液调pH值至10-12，形成黄色溶液；加入丙酮以产生沉淀；离心收集沉淀用丙酮洗涤，干燥后得到琥珀酰壳聚糖。
进一步优选的，所述的壳聚糖的脱乙酰度为80-90％，重均分子量为10-50KDa；所述壳聚糖在反应体系中的浓度为40-60mg/mL；所述壳聚糖的氨基与丁二酸酐的摩尔比为1：(1-2)。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述琥珀酰壳聚糖溶液的浓度为40-80mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；进一步优选为60mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述聚乙二醇衍生物溶液的浓度为60-120mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；在琥珀酰壳聚糖复合溶液中，琥珀酰壳聚糖：聚乙二醇衍生物质量比为1：(0.1-0.5)。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述聚乙二醇衍生物溶液的浓度为120mg/mL；在琥珀酰壳聚糖复合溶液中，琥珀酰壳聚糖：聚乙二醇衍生物质量比为1：0.2。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述氧化透明质酸溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液混合时二者的质量比为1：(1-2.3)；所述氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖溶液混合时二者的质量比为1：(1-2.3)；所述氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液混合时二者的质量比为1：(1-2.3)。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述交联反应的温度为25-37℃，时间为30-60秒。
上述力学性能可调的可注射自愈合水凝胶可以在促进止血和伤口愈合方面应用。
本发明的技术特点：
本发明以琥珀酰壳聚糖和氧化透明质酸为主要原料，加入钙离子、聚乙二醇衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种，通过调节水凝胶的组分和组分含量，制备得到一系列基于琥珀酰壳聚糖-氧化透明质酸的力学性能可调控的可注射自愈合水凝胶，并且进一步研究不同水凝胶组分和含量对水凝胶的生物相容性、止血性能、促进伤口愈合性能和促进血管、毛囊、皮脂腺等再生的影响。
琥珀酰壳聚糖-氧化透明质酸水凝胶是通过琥珀酰壳聚糖上的伯胺基与氧化透明质酸上的醛基通过席夫碱反应形成，该反应简单迅速，但是因为席夫碱反应是可逆反应，所以产生水凝胶的同时还存在较多未交联的游离琥珀酰壳聚糖和氧化透明质酸，这将会导致较大的细胞毒性，不利于其在生物医学领域的广泛应用。因此尽可能减少具有较大毒性的游离氧化透明质酸的含量是提高水凝胶生物相容性的有效策略。
向琥珀酰壳聚糖-氧化透明质酸水凝胶中引入带有伯胺基的聚乙二醇衍生物，使氧化透明质酸上的醛基与琥珀酰壳聚糖、聚乙二醇衍生物上的伯胺基形成可逆的亚胺键，减少了水凝胶体系中醛基含量，并且四臂聚乙二醇氨基和端氨基端羧基聚乙二醇均具有优异的生物相容性，因此可显著提高水凝胶的生物相容性。
向琥珀酰壳聚糖-氧化透明质酸水凝胶中引入钙离子，使氧化透明质酸上的醛基与琥珀酰壳聚糖上的伯胺基形成可逆亚胺键，同时氧化透明质酸的羧基与钙离子形成离子键，也可以减少游离氧化透明质酸的含量，提高水凝胶的生物相容性。并且因为钙离子是凝血因子IV和细胞内第二信使，通过提高细胞内钙离子浓度，可以激活细胞骨架钙调蛋白，从而提高水凝胶的止血、促进伤口愈合和血管、毛囊、皮脂腺再生等性能。
向琥珀酰壳聚糖-氧化透明质酸水凝胶中引入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，使氧化透明质酸上的醛基与琥珀酰壳聚糖上的伯胺基形成可逆亚胺键，同时氧化透明质酸的羧基与伯胺基形成不可逆的酰胺键，可以减少游离氧化透明质酸的含量，并且提高水凝胶聚合物网络的紧密程度，使其力学强度增大。
本发明的有益效果为：
1、本发明通过对壳聚糖改性制备获得琥珀酰壳聚糖，不仅保留了壳聚糖本身生物相容性好、生物可降解、止血抗菌等优点，还赋予其在水中可溶解的特性，扩大其在生物医药领域的应用范围；将透明质酸氧化获得氧化透明质酸，不仅保留了透明质酸本身吸水性强、促进伤口愈合等优点，还使其在室温下可以快速与琥珀酰壳聚糖上伯胺基交联形成动态亚胺键。
2、本发明通过在氧化透明质酸和琥珀酰壳聚糖的基础上，引入钙离子、聚乙二醇衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的一种或几种，通过调节水凝胶的组分和组分含量，制备得到可自愈和可注射水凝胶，使其具备力学性能可调控的特性；其中，引入钙离子和/或聚乙二醇衍生物可以提高水凝胶生物相容性；引入钙离子还可以提高水凝胶的止血、促进伤口愈合和血管、毛囊、皮脂腺再生等性能。
3、本发明制备的可注射水凝胶是剪切稀化水凝胶，可以通过先凝胶化再注射的方式，避免了原位凝胶化中凝胶前体溶液在未凝胶化前就注射到体内而被体液稀释，延长其凝胶化时间和削弱其治疗效果。而剪切稀化自愈合水凝胶不受上述因素影响，可以随时注射，操作简便，能够快速发挥水凝胶的治疗效果，并且可以减少未凝胶化的原料及交联剂的毒性。本发明制备的可注射自愈合水凝胶经过普通医用注射器针头注射到达患处后，利用水凝胶内部动态的席夫碱反应快速愈合成完整的水凝胶，并且覆盖出血点。该水凝胶综合了透明质酸、壳聚糖、钙离子、聚乙二醇衍生物等的优势，兼具止血和促进伤口愈合的效果。
附图说明
图1为实施例1制备的氧化透明质酸的核磁氢谱图；
图2为实施例2制备的琥珀酰壳聚糖的核磁氢谱图；
图3为水凝胶的形态示意图；
图4为水凝胶的自愈合示意图；图中，a为切开的水凝胶，b为自愈合的水凝胶；
图5为对比例1制备的NSC-OHA水凝胶流变特性图；图中，A为溶胶-凝胶转变测试图，B为自愈合特性测试图；
图6为实例10制备的NSC-OHA-EDC2-NHS水凝胶流变特性图；图中，A为溶胶-凝胶转变测试图，B为自愈合特性测试图；
图7为L929细胞在水凝胶浸出液中的细胞存活率统计图；图中纵坐标为细胞存活率(％)；
图8为水凝胶的止血性能测试图；图中纵坐标为出血量(g)；
图9为小鼠背部皮肤全层缺损后第0、3、5、10天的图像；
图10为小鼠背部皮肤伤口愈合率柱状图；图中纵坐标为伤口愈合率(％)；
图11为小鼠背部皮肤伤口敷用水凝胶后第10天的血管内皮生长因子染色图像；图中比例尺为100μm；
图12为小鼠背部皮肤伤口敷用水凝胶后第10天的马松三色染色图像；图中放大倍数为200×。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明未详尽说明的，均按本领域常规技术。
实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。
透明质酸的重均分子量为1430KDa，可购自华熙福瑞达生物医药有限公司；壳聚糖的重均分子量为50KDa，脱乙酰度为90％，可购自济南海得贝海洋生物有限公司；止血粉末Arista可购自巴德医疗器械有限公司。
实施例1
氧化透明质酸(OHA)的制备：
向200mL的10mg/mL透明质酸水溶液中，逐滴加入5mL的0.5mol/L高碘酸钠水溶液，黑暗中搅拌反应2h；然后加入1mL乙二醇，继续搅拌1h；将所得溶液在去离子水透析3天后冻干，透析袋的截留分子量为8-14KDa，获得氧化透明质酸(OHA)。
上述氧化透明质酸的核磁氢谱如图1所示，与透明质酸(HA)对比，OHA核磁氢谱图在4.9-5.0ppm出现新的醛基特征峰，表明成功合成OHA。
实施例2
琥珀酰壳聚糖(NSC)的制备：
将壳聚糖分散于含有丁二酸酐的二甲基亚砜中，使壳聚糖在反应体系浓度为50mg/mL；壳聚糖的氨基：丁二酸酐的摩尔比为1：(1-2)，60℃搅拌反应1.5-4h后离心；将沉淀分散于水中，用氢氧化钠溶液调pH值至10-12，形成黄色溶液；加入丙酮以产生沉淀；离心收集沉淀用丙酮洗涤，干燥后得到琥珀酰壳聚糖(NSC)。
上述琥珀酰壳聚糖的核磁氢谱如图2所示，与壳聚糖(CS)对比，NSC核磁氢谱图在2.40-2.49ppm处出现新亚甲基氢的特征峰，表明成功合成NSC。
实施例3
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括步骤如下：
(1)将实施例1制备的OHA溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的OHA溶液；将氯化钙(CaCl2)溶于水中，得120mg/mL的氯化钙水溶液；将OHA溶液和氯化钙水溶液混合，其中OHA和氯化钙的质量比为1:0.1，得到OHA复合溶液1；
(2)将实施例2制备的NSC溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的NSC溶液；
(3)将步骤(1)中的OHA复合溶液1与步骤(2)中的NSC溶液混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，得到NSC-OHA-Ca2水凝胶。
实施例4
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括步骤如下：
(1)将实施例1制备的OHA溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的OHA溶液；将氯化钙溶于水中，得120mg/mL的氯化钙水溶液；将OHA溶液和氯化钙水溶液混合，其中OHA和氯化钙的质量比为1:0.05，得到OHA复合溶液2；
(2)将实施例2制备的NSC溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的NSC溶液；
(3)将步骤(1)中的OHA复合溶液2与步骤(2)中的NSC溶液混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，得到NSC-OHA-Ca1水凝胶。
实施例5
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括步骤如下：
(1)将实施例1制备的OHA溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的OHA溶液；
(2)将实施例2制备的NSC溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的NSC溶液；将四臂聚乙二醇氨基(4-arm-PEG-NH2)溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，得120mg/mL的四臂聚乙二醇氨基溶液；将四臂聚乙二醇氨基溶液与NSC溶液混合，其中NSC与四臂聚乙二醇氨基的质量比为1：0.2，得到NSC复合溶液1；
(3)将步骤(1)中的OHA溶液与步骤(2)中的NSC复合溶液1混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，得到NSC-OHA-PEG1水凝胶。
实施例6
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备：将按照实施例3步骤(1)制备的OHA复合溶液1与按照实施例5步骤(2)制备的NSC复合溶液1混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，得到NSC-OHA-PEG1-Ca2水凝胶。
实施例7
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备：与实施例5的制备方法相同，不同之处在于聚乙二醇衍生物改为端氨基端羧基聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)，得到NSC-OHA-PEG2水凝胶。
实施例8
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括步骤如下：
(1)将实施例1制备的OHA溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的OHA溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，获得浓度均为120mg/mL的EDC溶液和NHS溶液；将OHA溶液与EDC溶液和NHS溶液混合，其中OHA、EDC和NHS的质量比为1：0.2：0.05，得到OHA复合溶液3；
(2)将实施例2制备的NSC溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的NSC溶液；将端氨基端羧基聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，得120mg/mL的端氨基端羧基聚乙二醇溶液；将端氨基端羧基聚乙二醇溶液与NSC溶液混合，其中NSC与端氨基端羧基聚乙二醇的质量比为1：0.2，得到NSC复合溶液2；
(3)将步骤(1)中的OHA复合溶液3与步骤(2)中的NSC复合溶液2混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，得到NSC-OHA-PEG2-EDC2-NHS水凝胶。
实施例9
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括步骤如下：
(1)将实施例1制备的OHA溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的OHA溶液；将EDC和NHS分别溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，获得浓度均为120mg/mL的EDC溶液和NHS溶液；将OHA溶液与EDC溶液和NHS溶液混合，其中OHA、EDC和NHS的质量比为1：0.1：0.04，得到OHA复合溶液4；
(2)将实施例2制备的NSC溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的NSC溶液；
(3)将步骤(1)中的OHA复合溶液4与步骤(2)中的NSC溶液混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，得到NSC-OHA-EDC1-NHS水凝胶。
实施例10
一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，包括步骤如下：
(1)将实施例1制备的OHA溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的OHA溶液；将EDC和NHS分别溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，获得浓度均为120mg/mL的EDC溶液和NHS溶液；将OHA溶液与EDC溶液和NHS溶液混合，其中OHA、EDC和NHS的质量比为1：0.2：0.05，得到OHA复合溶液3；
(2)将实施例2制备的NSC溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，得60mg/mL的NSC溶液；
(3)将步骤(1)中的OHA复合溶液3与步骤(2)中的NSC溶液混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，得到NSC-OHA-EDC2-NHS水凝胶。
对比例1
琥珀酰壳聚糖-氧化透明质酸(NSC-OHA)水凝胶的制备：
将实施例1制备的OHA和实施例2制备的NSC分别溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，获得60mg/mL的OHA溶液和NSC溶液；将OHA溶液和NSC溶液混合，二者的质量比为1:1，25-37℃交联反应30-60秒，获得NSC-OHA水凝胶。
实施例3-10和对比例1制备得到的水凝胶形态示意图如图3所示，将琥珀酰壳聚糖溶液/琥珀酰壳聚糖复合溶液和氧化透明质酸溶液/氧化透明质酸复合溶液在25-37℃混合30-60秒后即可从可流动的溶液状态转变为不可流动的有一定延展和柔韧性的水凝胶状态。将水凝胶装入普通医用注射器后，水凝胶可以通过外径为0.6毫米的针头顺利注射，说明所制备的水凝胶均具备剪切稀化的可注射特性。将实施例3-10和对比例1制备的水凝胶分别采用甲基橙和溴酚蓝着色，制成两个圆柱形，分别沿直径切开，将甲基橙着色的一半水凝胶和溴酚蓝着色的一半水凝胶在室温下相互接触20min，示意图如图4所示，两半经甲基橙和溴酚蓝分别着色的水凝胶在室温下相互接触20min后可自发愈合成一整块水凝胶，并且用镊子夹起其中一半后，水凝胶依旧保持完整，说明水凝胶具有可自愈特性。这是因为水凝胶是由大量动态亚胺键形成的聚合物网络结构，当水凝胶网络被破坏，亚胺键可在室温下自发重新形成。
实验例1
将制备的水凝胶进行流变恢复测试，检测其力学性能和自愈合特性：将直径为1cm、高为0.3cm的圆柱形水凝胶放置于流变仪上，固定频率1Hz，应变从1％到1000％检测凝胶-溶胶转变点。随后，固定频率1Hz，应变从1％到500％，切换间隔为100秒并循环3次，进行连续交替应变扫描，检测水凝胶可自愈性能。
对比例1的水凝胶流变恢复测试结果如图5所示，其中由图5A可知，对比例1制备的NSC-OHA水凝胶在应变为228％时，储能模量＜损耗模量，说明此时水凝胶网络被破坏从而发生凝胶-溶胶转变。实施例10制备的水凝胶流变恢复测试结果如图6所示，其中由图6A可知，实施例10制备的NSC-OHA-EDC2-NHS水凝胶在应变为299％时，发生凝胶-溶胶转变。实施例10制备的水凝胶发生凝胶-溶胶转变所需的应变大于对比例1，说明同时含有酰胺键和亚胺键的NSC-OHA-EDC2-NHS的力学强度大于仅含有亚胺键的NSC-OHA水凝胶。
由图5B和图6B可知，水凝胶在连续交替应变(1％到500％)循环3次后，依然能够迅速从溶胶状恢复为正常水凝胶状态。即当应变为500％时，储能模量＜损耗模量，水凝胶内部网络结构被外力破坏从而转变为可流动的溶胶状态，而当应变下降为1％时，储能模量迅速恢复并大于损耗模量，恢复为水凝胶状态，表明所制备的水凝胶具有可自愈特性。
实验例2
将实施例3～10和对比例1制备的水凝胶进行细胞相容性测试：将水凝胶浸泡在MEM培养基中24h，得到浓度为10mg/mL的水凝胶浸提液。将小鼠成纤维(L929)细胞以5000个/孔种植在96孔板上24h，随后将培养基更换为水凝胶浸出液，继续培养24h，通过CCK-8检测方法，检测细胞存活率。以止血粉末Arista为阳性对照组。
检测结果如图7所示，实施例3～10所制备的水凝胶细胞存活率均大于70％，并且均大于对比例1。对比例1的NSC-OHA水凝胶的细胞存活率最低是因为其仅通过NSC伯胺基与OHA醛基形成动态亚胺键，造成水凝胶内部暴露出大量毒性大的游离OHA醛基。
而加入聚乙二醇衍生物的水凝胶能够显著提高水凝胶的细胞相容性(P值＜0.05)，表现出细胞存活率＞100％，因为在该类水凝胶中的OHA可以同时与NSC和聚乙二醇衍生物形成亚胺键，显著减少游离OHA醛基。
加入钙离子或EDC/NHS的水凝胶组也能降低水凝胶的细胞毒性，因为这些水凝胶中不仅存在亚胺键，还存在钙离子与OHA形成的离子键，或者NSC上的伯胺基与OHA羧基形成的酰胺键，提高了水凝胶的交联程度，减少了细胞毒性。
实验例3
将实施例3～6和对比例1制备的水凝胶进行止血性能测试：出血模型为小鼠肝脏出血。小鼠麻醉后，解剖以暴露出肝脏。在腹腔与肝脏之间垫1层保鲜膜，避免肝脏出血点以外的出血干扰实验结果；然后在肝脏下面垫2层滤纸，以吸收肝脏损伤后流出的血液；然后用手术剪在肝脏左叶的肝尖剪一个0.6cm长的出血点。随后分别注射0.4mL的水凝胶或加入24mg粉末到伤口处覆盖出血点，并按压30s，统一在4min后称量吸血滤纸，计算出血量。阳性对照为临床上广泛应用的止血粉末Arista，阴性对照为自由出血不做其他处理。
测试结果如图8所示，与空白对照组相比，实例3-6和对比例1制备的水凝胶和Arista止血粉末均能显著降低出血量(P＜0.0001)，证明所制备的水凝胶均具备止血性能。与对比例1的NSC-OHA水凝胶相比，加入钙离子的水凝胶(即实施例实施例3制备的NSC-OHA-Ca2水凝胶、实施例4制备的NSC-OHA-Ca1水凝胶、实施例6制备的NSC-OHA-PEG1-Ca2水凝胶)和临床上广泛应用的Arista止血粉末的止血效果更好(P＜0.01)。
实验例4
将实施例3～6和对比例1制备的水凝胶进行伤口愈合测试：伤口模型为小鼠背部皮肤全层缺损。小鼠麻醉后，脱毛后创建直径为0.7cm的背部全层皮肤缺损，拍照并记录伤口初始面积为A0。然后用PBS润洗伤口，分别注射0.2mL的水凝胶或加入12mg粉末到伤口处覆盖伤口，随后用纱布包扎，在第3、5、10天拍摄伤口图片并记录伤口面积(At)。阳性对照为临床上广泛应用的止血粉末Arista，阴性对照为仅用PBS润洗伤口后包扎。按照以下公式计算伤口愈合率：
Figure BDA0002502557980000091
小鼠伤口愈合情况如图9所示，在皮肤缺损后第3、5、10天，小鼠背部伤口逐渐收缩。
小鼠伤口愈合率如图10所示，在皮肤受损后第3天，各组伤口没有显著性差异；但是在第5天，与空白组相比，实施例3～6和对比例1制备的水凝胶促进伤口愈合效果更显著(P＜0.05)，其中，加入适量钙离子的水凝胶(即实施例3制备的NSC-OHA-Ca2水凝胶、实施例6制备的NSC-OHA-PEG1-Ca2水凝胶)能更明显的促进伤口愈合(P＜0.01)，并且实施例3制备的NSC-OHA-Ca2水凝胶的伤口愈合率大于Arista止血粉末(P＜0.05)。
在皮肤受损后第10天，与空白组相比，加入钙离子的水凝胶(即实施例实施例3制备的NSC-OHA-Ca2水凝胶、实施例4制备的NSC-OHA-Ca1水凝胶、实施例6制备的NSC-OHA-PEG1-Ca2水凝胶)仍然能够表现出显著提高伤口愈合的效果(P＜0.05)，而且实施例6制备的NSC-OHA-PEG1-Ca2水凝胶的促伤口愈合效果最好。
实验例5
伤口组织免疫荧光染色：取实验例4中敷用实施例3～6和对比例1制备的水凝胶后第10天的小鼠，剪取伤口处皮肤，通过冷冻切片获得厚度为8μm的组织切片，4％多聚甲醛固定20min，用TBS(三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液，pH 7.4，下述亦同)漂洗5min×3次。滴加5％山羊血清封闭剂，37℃封闭30min。吸去封闭液，滴加血管内皮生长因子一抗并放入避光湿盒中4℃孵育过夜，随后TBST(三(羟甲基)氨基甲烷吐温缓冲液，pH 7.4，下述亦同)洗涤5min，TBS洗涤3次。然后滴加FITC羊抗兔二抗，37℃避光孵育1h，随后分别用TBST和TBS洗涤。最后滴加适量4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，室温孵育10min，TBS洗涤3次后封片。倒置荧光显微镜下采集图像，结果如图11所示，血管内皮生长因子被标记为绿色，细胞核被标记为蓝色。
由图11可知，各组伤口均有血管内皮生长因子的表达，其中加入适量钙离子的水凝胶组(实施例3制备的NSC-OHA-Ca2水凝胶和实施例6制备的NSC-OHA-PEG1-Ca2水凝胶)的血管内皮生长因子表达量最多，有利于血管生成。
实验例6
伤口组织马松三色染色：取实验例4中敷用实施例3～6和对比例1制备的水凝胶后第10天的小鼠，剪取伤口处皮肤，用4％多聚甲醛固定，石蜡切片后进行马松三色染色，并在显微镜下采集图像，结果如图12所示。
敷用水凝胶后第10天，各组小鼠出现了表皮、真皮和胶原纤维结构。其中，空白组伤口有大量炎症细胞和成纤维细胞浸润，此时伤口可能刚刚进入新组织形成的初级阶段，愈合速度慢。而敷用Arista、实施例3-6制备的水凝胶的伤口均出现少量血管、毛囊和皮脂腺等结构，并且炎症细胞和成纤维细胞适量增殖，胶原沉积更规则，愈合速度快。其中，加入适量钙离子的水凝胶组(实施例3制备的NSC-OHA-Ca2、实施例6制备的NSC-OHA-PEG1-Ca2水凝胶)伤口处血管和皮肤附属器等数量更多、结构更成熟，代表伤口刚刚进入重塑阶段，伤口愈合速度更快。

Claims (10)

1.一种力学性能可调的可注射自愈合水凝胶，其特征在于，包括原料：氧化透明质酸和琥珀酰壳聚糖，还包括钙离子、聚乙二醇衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的可注射自愈合水凝胶，其特征在于，所述钙离子来自氯化钙或碳酸钙；
优选的，所述聚乙二醇衍生物为四臂聚乙二醇氨基或端氨基端羧基聚乙二醇，所述聚乙二醇衍生物的重均分子量为5000-10000Da。
3.权利要求1所述的力学性能可调的可注射自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)配制氧化透明质酸溶液，向氧化透明质酸溶液中加入钙离子溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液的一种或几种，配制得氧化透明质酸复合溶液；
(2)配制琥珀酰壳聚糖溶液，向琥珀酰壳聚糖溶液中加入聚乙二醇衍生物溶液，配制得琥珀酰壳聚糖复合溶液；
(3)将步骤(1)和步骤(2)中的氧化透明质酸溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液，或者氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖溶液，或者氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液混合，进行交联反应，得到力学性能可调的可注射自愈合水凝胶。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述氧化透明质酸按照以下步骤制备：向透明质酸水溶液中逐滴加入高碘酸钠水溶液，黑暗中搅拌反应2h；然后加入过量乙二醇，继续搅拌1h；将所得溶液在去离子水中透析3天后冻干，获得氧化透明质酸；
优选的，所述透明质酸的重均分子量为870-1430KDa，所述透明质酸水溶液的浓度为10mg/mL；所述高碘酸钠水溶液的浓度为0.5mol/L；其中，透明质酸重复二糖单元：高碘酸钠摩尔比为1：(0.6-1)；透析的截留分子量为8-14KDa。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述氧化透明质酸溶液的浓度为40-80mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述钙离子溶液的浓度为60-120mg/mL；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度均为60-120mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；在氧化透明质酸复合溶液中，氧化透明质酸：钙离子化合物质量比为1：(0.05-0.2)；氧化透明质酸：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺质量比为1：(0.1-0.2)：(0.04-0.2)。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述琥珀酰壳聚糖按照以下步骤制备：将壳聚糖分散于含有丁二酸酐的二甲基亚砜中，60℃搅拌反应1.5-4h后离心；将沉淀分散于水中，用氢氧化钠溶液调pH值至10-12，形成黄色溶液；加入丙酮以产生沉淀；离心收集沉淀用丙酮洗涤，干燥后得到琥珀酰壳聚糖；
优选的，所述的壳聚糖的脱乙酰度为80-90％，重均分子量为10-50KDa；所述壳聚糖在反应体系中的浓度为40-60mg/mL；所述壳聚糖的氨基与丁二酸酐的摩尔比为1：(1-2)。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述琥珀酰壳聚糖溶液的浓度为40-80mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；
优选的，步骤(2)中所述聚乙二醇衍生物溶液的浓度为60-120mg/mL，溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；在琥珀酰壳聚糖复合溶液中，琥珀酰壳聚糖：聚乙二醇衍生物质量比为1：(0.1-0.5)。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述氧化透明质酸溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液混合时二者的质量比为1：(1-2.3)；所述氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖溶液混合时二者的质量比为1：(1-2.3)；所述氧化透明质酸复合溶液和琥珀酰壳聚糖复合溶液混合时二者的质量比为1：(1-2.3)；
优选的，步骤(3)中所述交联反应的温度为25-37℃，时间为30-60秒。
10.权利要求1所述的力学性能可调的可注射自愈合水凝胶可以在促进止血和伤口愈合方面应用。
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