CN111956866B - 一种用于纤维环修复的复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于纤维环修复的复合水凝胶及其制备方法和应用。本申请用于纤维环修复的复合水凝胶,包括采用由末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇、氧化透明质酸和末端为氨基的四臂聚乙二醇复合而成。本申请用于纤维环修复的复合水凝胶,由基团改性的四臂聚乙二醇和透明质酸通过活性酯交换和席夫碱反应构筑而成,对纤维环具有高效粘结和修补作用。本申请复合水凝胶具有较高的机械强度和良好的生物相容性,可促进干细胞在表面的粘附、增殖和分化,具有可控的生物降解性;为纤维环修复提供了一种新的高效、安全、机械强度高且生物相容性好的水凝胶材料。
Description
技术领域
本申请涉及纤维环修复领域,特别是涉及一种用于纤维环修复的复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
椎间盘是一种由髓核、纤维环及上下软骨终版组成的骨组织。当纤维环出现部分缺损使髓核脱位并挤压相邻的脊神经时,会引起身体颈肩和腰腿疼痛,从而诱发椎间盘退变性疾病的产生,不仅给患者带来巨大的精神困扰,且加重其经济负担。目前,针对这类疾病的治疗方法主要分为保守治疗和手术治疗。手术治疗如椎间盘部分切除术虽能在一定程度上改善由神经压迫带来的疼痛症状,但术后愈合缓慢,且复发率较高,导致远期治疗效果欠佳。近年来,临床上尝试在椎间盘切除术后采用缝线缝合纤维环,但该方法仅能满足对纤维环缺损的物理缝合,无法实现对纤维环力学性能和生物学功能的恢复,因此亟需探索一种纤维环的生物学再生修复方法。
随着组织工程学的飞速发展,基于纤维环的组织工程技术日益受到关注,且基于纤维环修复的生物水凝胶材料也不断得以报道。水凝胶由于具有高含水量和类细胞质基质的结构与特性,成为支持细胞生长的三维组织工程水凝胶的理想材料之一。然而,传统水凝胶往往存在力学强度差,难以满足相应骨组织的机械性能要求,这导致其应用受限。因此,如何提高水凝胶力学性能的同时增强其生物相容性,最终实现对纤维环的生物学再生修复,是纤维环修复领域亟待解决的重要课题。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于纤维环修复的复合水凝胶及其制备方法和应用。
本申请采用了以下技术方案:
本申请的第一方面公开了一种用于纤维环修复的复合水凝胶,其包括采用末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇、氧化透明质酸和末端为氨基的四臂聚乙二醇(缩写Tetra-PEG-NH2)复合而成。可以理解,本申请的复合水凝胶其关键在于末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇、氧化透明质酸和末端为氨基的四臂聚乙二醇三者复合形成水凝胶;但是,不排除还可以在水凝胶中添加其它利于纤维环修复或者干细胞生长、粘附、增殖和分化的试剂;在此不作具体限定。
需要说明的是,本申请的复合水凝胶创造性的采用具有良好生物相容性的四臂聚乙二醇和透明质酸作为原料,通过对两者进行基团改性并借助活性酯交换和席夫碱反应来构筑氧化透明质酸(缩写OHA)和四臂聚乙二醇的复合水凝胶(缩写OHA/PEG复合水凝胶)。本申请的OHA/PEG复合水凝胶能够实现对纤维环的高效粘结和修补;并且具有较高的机械强度和良好的生物相容性,可促进干细胞在表面的粘附、增殖和分化,具有可控的生物降解性;为纤维环修复提供了一种新的高效、安全、机械强度高且生物相容性好的水凝胶材料。
本申请的一种实现方式中,复合水凝胶由含有末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的第一溶液,和含有末端为氨基的四臂聚乙二醇的第二溶液复合而成。可以理解,第一溶液和第二溶液所采用的溶剂均为能够有效溶解以上各组分的溶剂,并且具有生物安全性;本申请的一种实现方式中具体采用的是PBS缓冲液作为第一溶液和第二溶液的溶剂,更具体的采用的是浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液。
本申请的一种实现方式中,第一溶液中末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的浓度分别为5~25%(w/v);第二溶液中末端为氨基的四臂聚乙二醇的浓度为5~30%(w/v);第一溶液和第二溶液的体积比为1:1~1:5。
本申请的一种实现方式中,氧化透明质酸的分子量为10~1000KDa,氧化开环程度为10%~50%。
本申请的第二方面公开了本申请的复合水凝胶在制备修复纤维环的药物中的应用。
可以理解,本申请的复合水凝胶能够高效粘结和修补纤维环,因此,可以作为修复纤维环的药物使用。
本申请的第三方面公开了一种用于修复纤维环的试剂盒,该试剂盒中含有第一溶液和第二溶液,第一溶液中含有末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸,第二溶液中含有末端为氨基的四臂聚乙二醇,第一溶液和第二溶液的溶剂均为PBS缓冲液;本申请的试剂盒使用时,按照第一溶液和第二溶液的体积比为1:1~1:5,将第一溶液和第二溶液注射到需要进行纤维环修复的部位形成复合水凝胶。
需要说明的是,本申请创造性的将末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸作为第一溶液,将末端为氨基的四臂聚乙二醇作为第二溶液,组装成用于本申请的用于修复纤维环的试剂盒;按照本申请的试剂盒使用方法,能够很好的起到纤维环修复作用,为纤维环修复提供了一种新的方案和途径。
本申请的一种实现方式中,试剂盒的第一溶液中末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的浓度分别为5~25%(w/v);第二溶液中末端为氨基的四臂聚乙二醇的浓度为5~30%(w/v)。
本申请的一种实现方式中,试剂盒的第一溶液中氧化透明质酸的分子量为10~1000KDa,氧化开环程度为10%~50%。
本申请的第四方面公开了本申请的复合水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
1)末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇(缩写Tetra-PEG-SS)的制备步骤,将四臂聚乙二醇、琥珀酸酐和二甲基氨基吡啶溶解在无水二氯甲烷中,于37℃搅拌反应18~30h,然后将反应液用饱和食盐水洗涤至少3次,收集有机相,并用硫酸镁干燥除水,真空浓缩后用过量的乙醚沉淀两次,得到末端为羧基的四臂聚乙二醇,标记为Tetra-PEG-COOH;向制备的Tetra-PEG-COOH中加入新鲜蒸馏的二氯甲烷(缩写DCM)使之溶解,再分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(缩写EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(缩写NHS),在氮气下室温搅拌18~30h,然后用饱和氯化钠洗涤至少三次,收集有机相并用硫酸镁干燥除水,真空干燥,即获得末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇,标记为Tetra-PEG-SS;
2)氧化透明质酸(缩写OHA)的制备步骤,称取透明质酸加入到水中配成1~5%(w/v)的溶液,搅拌至透明质酸完全溶解;将浓度为0.2~1mol/L高碘酸钠溶液逐滴加到透明质酸溶液中,同时不停搅拌;室温下避光反应1~5h后加入二乙二醇搅拌10~30min终止反应;将产物装入透析袋中透析至少3天,每天换水至少四次;将透析产物冷冻干燥,即获得本申请的氧化透明质酸;其中,透析袋的cutoffMw为3500;
3)复合水凝胶制备步骤,将制备的氧化透明质酸与制备的Tetra-PEG-SS加到PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第一溶液;将末端为氨基的四臂聚乙二醇加到PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第二溶液;将第一溶液和第二溶液混合,即获得本申请的复合水凝胶。其中,PBS缓冲液即磷酸缓冲液,浓度为10mM,pH=7.4。
本申请的一种实现方式中,步骤1)中,四臂聚乙二醇、琥珀酸酐、二甲基氨基吡啶三者的摩尔比依序为1:5:5~1:10:5。
本申请的一种实现方式中,Tetra-PEG-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺三者的摩尔比依序为1:5:5~1:20:20。
本申请的一种实现方式中,步骤2)中,氧化透明质酸的分子量为10~1000KDa,氧化开环程度为10%~50%。
需要说明的是,氧化透明质酸的氧化开环程度可通过调节透明质酸与高碘酸钠的反应配比进行调整。
本申请的一种实现方式中,步骤3)中,第一溶液中末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的浓度分别为5~25%(w/v),第二溶液中末端为氨基的四臂聚乙二醇的浓度为5~30%(w/v)。
本申请的一种实现方式中,第一溶液和第二溶液的体积比为1:1~1:5。
本申请的第五方面公开了一种制备末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇的方法,包括将四臂聚乙二醇、琥珀酸酐和二甲基氨基吡啶溶解在无水二氯甲烷中,37℃搅拌反应18~30h,将反应液用饱和食盐水洗涤至少3次,收集有机相,用硫酸镁干燥除水,真空浓缩后用过量的乙醚沉淀两次,得到末端为羧基的四臂聚乙二醇,标记为Tetra-PEG-COOH;向制备的Tetra-PEG-COOH中加入新鲜蒸馏的二氯甲烷使之溶解,再分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺,在氮气下室温搅拌18~30h,然后用饱和氯化钠洗涤至少三次,收集有机相并用硫酸镁干燥除水,真空干燥,即获得本申请的末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇。
本申请的第六方面公开了一种制备氧化透明质酸的方法,包括称取透明质酸加入到水中配成1~5%(w/v)的溶液,搅拌至透明质酸完全溶解;将浓度为0.2~1mol/L高碘酸钠溶液逐滴加到透明质酸溶液中,同时不停搅拌;室温下避光反应1~5h后加入二乙二醇搅拌10~30min终止反应;将产物装入透析袋中透析至少3天,每天换水至少四次;将透析产物冷冻干燥,即获得本申请的氧化透明质酸。
需要说明的是,本申请的复合水凝胶的制备方法中,实际上包含了末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇的制备步骤和氧化透明质酸的制备步骤两个关键步骤。因此,本申请的第五方面和第六方面分别提供了制备末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇的方法和制备氧化透明质酸的方法;可以理解,本申请第五方面和第六方面提供的制备方法中,一些细节参数都可以参考本申请的复合水凝胶的制备方法,在此不累述。
本申请的有益效果在于:
本申请用于纤维环修复的复合水凝胶,由基团改性的四臂聚乙二醇和透明质酸通过活性酯交换和席夫碱反应构筑而成,对纤维环具有高效粘结和修补作用。本申请复合水凝胶具有较高的机械强度和良好的生物相容性,可促进干细胞在表面的粘附、增殖和分化,具有可控的生物降解性;为纤维环修复提供了一种新的高效、安全、机械强度高且生物相容性好的水凝胶材料。
具体实施方式
现有用于纤维环修复的水凝胶普遍存在力学性能差,难以满足相应骨组织的机械性能要求等问题。
本申请创造性的首次选用具有良好生物相容性的四臂聚乙二醇和透明质酸作为原料,通过对两者进行基团改性并借助活性酯交换和席夫碱反应来构筑氧化透明质酸和四臂聚乙二醇的复合水凝胶,制备方法简便、凝胶成胶迅速,本申请的一种实现方式中只需要小于10s的速度即可迅速成胶。
具体的,本申请研发并提供了一种用于纤维环修复的复合水凝胶,其由末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇、氧化透明质酸和末端为氨基的四臂聚乙二醇复合而成。
本申请的复合水凝胶具有以下优点:
1)本申请OHA/PEG复合水凝胶能够实现对纤维环的高效粘结和修补。
2)本申请OHA/PEG复合水凝胶具有较高的机械强度。
3)本申请OHA/PEG复合水凝胶具有良好的生物相容性,且可促进干细胞在表面的粘附、增殖和分化。
4)本申请OHA/PEG复合水凝胶具有可控的生物降解性。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明,不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例的复合水凝胶由末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇、氧化透明质酸和末端为氨基的四臂聚乙二醇复合而成。其中,末端为氨基的四臂聚乙二醇可以直接购买获得;琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇通过基团改性制备获得,氧化透明质酸通过透明质酸氧化制备获得。
本例的复合水凝胶具体制备方法如下:
合成Tetra-PEG-COOH:将四臂聚乙二醇(1g,1eq)、琥珀酸酐(100mg,10eq)和二甲基氨基吡啶(56mg,5eq)溶解在50mL无水二氯甲烷中,37℃搅拌反应24h。然后将反应液用40mL饱和食盐水洗涤3次,收集有机相,并用MgSO4干燥除水,真空浓缩后用过量的乙醚沉淀两次,得到Tetra-PEG-COOH。
合成Tetra-PEG-SS:即将上述制备的Tetra-PEG-COOH(1g,1eq)置于500mL圆底烧瓶中,加入200mL新鲜蒸馏的DCM使之溶解,再分别加入EDCI(184mg,10eq)和NHS(110mg,10eq),于氮气下室温搅拌反应24h,然后用100mL饱和氯化钠洗涤三次,收集有机相并用MgSO4干燥除水,再真空干燥,即得Tetra-PEG-SS。
合成OHA:称取2g透明质酸加入到100mL水中以配成2%(w/v)的溶液,用磁力搅拌器搅拌至透明质酸完全溶解。将5mL浓度为0.5mol/L高碘酸钠溶液逐滴加到透明质酸溶液中,同时不停搅拌。室温下避光反应5h后加入4mL二乙二醇用于终止反应,搅拌25min。将产物装入透析袋中(cut off Mw=3500)透析3天,每天换水四次。将产物置于塑料培养皿中,经冷冻干燥,即得OHA。
制备OHA/PEG复合水凝胶:将1g OHA与1gTetra-PEG-SS加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第一溶液。将2.0g Tetra-PEG-NH2加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第二溶液。再将3mL第一溶液与3mL第二溶液混合,即制备得到本例的OHA/PEG复合水凝胶。
为了考察本例制备得到的OHA/PEG复合水凝胶的力学强度,将水凝胶切成直径为10mm,高度为4mm的水凝胶小块,置于去离子水中37℃恒温箱放置24h使其完全溶胀。取出水凝胶小块,用千分尺测量水凝胶块的直径和高度。室温下采用万能材料实验机对水凝胶进行压缩实验,压缩速度为0.5mm/min。每个实验组重复三次。结果显示OHA/PEG复合水凝胶的弹性模量为1.6MPa、断裂应力为890KPa、断裂伸长为62.32%;可见本例制备的OHA/PEG复合水凝胶具有较高的机械强度。
为了考察制备得到的OHA/PEG复合水凝胶对纤维环的粘附和修补性能,本例选取了一块猪的椎间盘进行试验,通过处理得到人造缺损的纤维环。然后使纤维环缺损的两截面尽可能靠近,并用注射器向缺口处同时注入2.5mL的第一溶液和2.5mL的第二溶液,形成OHA/PEG复合水凝胶。观察OHA/PEG复合水凝胶对纤维环的修复作用。结果显示,本例的OHA/PEG复合水凝胶在第一溶液和第二溶液混合后约8s即可快速凝胶成胶,并且,OHA/PEG复合水凝胶能够很好地粘结并修补纤维环,对纤维环具有高效粘结和修补作用。
实施例二
本例制备OHA/PEG复合水凝胶的原材料和基本步骤与实施例一相同,所不同的仅仅是一些细节的参数,详细如下:
合成Tetra-PEG-COOH:即将四臂聚乙二醇(1g,1eq)、琥珀酸酐(100mg,10eq)和二甲基氨基吡啶(56mg,5eq)溶解在50mL无水二氯甲烷中,37℃搅拌反应20h。然后将反应液用60mL饱和食盐水洗涤3次,收集有机相,并用MgSO4干燥除水,真空浓缩后用过量的乙醚沉淀两次,得到Tetra-PEG-COOH。
合成Tetra-PEG-SS:即将上述制备的Tetra-PEG-COOH(1g,1eq)置于250mL圆底烧瓶中,加入100mL新鲜蒸馏的DCM使之溶解,再分别加入EDCI(92mg,5eq)和NHS(55mg,5eq),于氮气下室温搅拌反应24h,然后用50mL饱和氯化钠洗涤三次,收集有机相并用MgSO4干燥除水,再真空干燥,即得Tetra-PEG-SS。
合成OHA:称取1g透明质酸加入到100mL水中以配成1%(w/v)的溶液,用磁力搅拌器搅拌至透明质酸完全溶解。将5mL浓度为0.5mol/L高碘酸钠溶液逐滴加到透明质酸溶液中,同时不停搅拌。室温下避光反应2h后加入2mL二乙二醇用于终止反应,搅拌15min。将产物装入透析袋中(cut off Mw=3500)透析3天,每天换水四次。将产物置于塑料培养皿中,经冷冻干燥,即得OHA。
制备OHA/PEG复合水凝胶:将0.5g OHA与1gTetra-PEG-SS加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第一溶液。将1.0g Tetra-PEG-NH2加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第二溶液。再将3mL第一溶液与3mL第二溶液混合,即制备得到本例的OHA/PEG复合水凝胶。
采用实施例一相同的方法考察本例制备得到的OHA/PEG复合水凝胶的力学性能。结果显示,本例的OHA/PEG复合水凝胶其弹性模量为1.4MPa、断裂应力为830KPa、断裂伸长为60.51%,具有较高的机械强度。
采用实施例一相同的方法考察本例制备得到的OHA/PEG复合水凝胶对纤维环的粘附和修补性能。结果显示,本例的OHA/PEG复合水凝胶也能够很好地粘结并修补纤维环,对纤维环具有高效粘结和修补作用。
为考察本例制备的OHA/PEG复合水凝胶的生物活性,实验首先进行原代人脐带间充质干细胞的提取,然后将原代间充质干细胞培养传代扩增至P3代,再将P3代细胞分别接种到本例制备的OHA/PEG复合水凝胶和单纯的四臂聚乙二醇水凝胶(PEG)上,通过CCK-8、Live/Dead检测细胞在这两种水凝胶上的粘附、增殖情况,通过异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽-488荧光试剂观察细胞在表面的形态,通过Western-blot检测OHA/PEG复合水凝胶和PEG水凝胶上培养的细胞的I、II型胶原蛋白及Aggrecan蛋白表达情况。具体实验流程如下:
(1)原代人脐带间充质干细胞的提取:取新鲜脐带放进无菌瓶当中,向无菌瓶中加入生理盐水,轻微晃动,反复清洗,将清洗干净的脐带取出放入无菌培养皿内,剪成小段。用剪刀从横断面沿纵向剖开,同时避开脐带动静脉,找到脐带动静脉用刀片和剪刀一点点分离血管。分离后将脐带铺平,用剪刀分离脐带外膜,留下脐带中的沃顿胶并将其剪成1-2mm3的小块。然后将沃顿胶分成两组放入2个20mL小瓶中,分别加入2%I或II型胶原酶1mL和10mL的Hanks液,将小瓶盖封口后放入4℃冰箱过夜。取出装有沃顿胶的小瓶并将其置于37℃摇床200rmp2小时充分消化。分别将消化后的胶状液过200目钢网至2个小烧杯内进行标记。向每个烧杯加入70mL的Hanks液,反复吹匀后将每只烧杯内的液体放入2支50mL离心管,1300rmp离心7分钟。离心后弃上清,每只离心管内留约15mL液体,再向每只离心管内加30mL的Hanks液,吹匀后再次1300rmp离心7分钟。弃上清后每只离心管内留约1mL液体,向每只离心管内加入4mL高糖DMEM培养液,高糖DMEM培养液中含20%FBS和1%青霉素和1%链霉素,吹匀后将标记相同的两支离心管合并入一支10mL离心管内,再次1300rmp离心7分钟。弃上清留约5mL液体,吹匀后分别接种在2个小培养瓶内,将小培养瓶置于5%CO2,37℃恒温培养箱培养,这两个小培养瓶内即为所得的P0代HWJ-MSCs。P0代提取第三天时观察细胞,弃掉培养液,并加入高糖DMEM培养液5mL继续培养,待细胞生长到90%时进行传代。
(2)原代人脐带间充质干细胞的传代:将4℃冰箱内的Hanks液、0.2%EDTA、0.1%胰蛋白酶、高糖DMEM培养液(含10%FBS和1%青霉素和1%链霉素)置于37℃恒温箱预热;从37℃恒温培养箱中取出培养瓶,弃掉培养瓶内培养液,向培养瓶中加入Hanks液冲洗细胞2-3次,弃掉Hanks液并向培养瓶内加入已配好的0.2%的EDTA 2mL,消化1分钟后翻转培养瓶将液体倒出。再往培养瓶内添加0.1%的胰蛋白酶2mL,30s后在显微镜下观测瓶内细胞消化形态,待到细胞相互分离变亮呈圆形时,向培养瓶内加入2mL高糖DMEM培养液终止消化。运用弯头吸管将培养瓶内部的液体吸取出,反复吹打瓶底使消化的细胞与培养瓶相互分离。将吹打之后的细胞悬液加入10mL离心管1200rmp离心5分钟。弃上清后加入高糖DMEM培养液重悬细胞,待细胞均匀后用细胞计数板在光学显微镜下计数后按照5×105/mL密度将细胞种植在新的大培养瓶中获得P1代HWJ-MSCs。用上述方法在细胞生长到90%时再次传代,直到获得实验所需的P3代HWJ-MSCs。
(3)水凝胶复合HWJ-MSCs体外构建复合体:将OHA/PEG复合水凝胶和PEG水凝胶分别切成2mm厚的圆环薄片,用75%医用酒精消毒,随后用Hanks液反复清洗水凝胶,然后将水凝胶置于96孔板中,用高糖DMEM培养液(含10%FBS和1%青霉素和1%链霉素)浸泡水凝胶,并放置于5%CO2,37℃恒温培养箱中过夜。将P3代HWJ-MSCs从5%CO2,37℃恒温培养箱中取出,倒掉培养瓶中的培养液,再用Hanks液清洗两遍。向培养瓶内加入0.2%EDTA,消化1分钟后翻转培养瓶倒出液体。再向培养瓶内加入0.1%的胰蛋白酶,待细胞相互分离变亮呈圆形时,加入高糖DMEM培养液终止消化,使用弯头吸管将细胞吹打脱离培养瓶。将瓶中液体移入离心管内,1200rmp离心5分钟,弃上清,加入高糖DMEM培养液垂悬,待细胞混匀后,通过光学显微镜计数细胞,再次1200rmp离心5分钟,弃上清,加入高糖DMEM培养液垂悬,使垂悬后的细胞悬液浓度达到1×107/mL。取出处理过的水凝胶,用加样枪头吸干96孔板内的液体。再使用加样枪吸取20μL的细胞悬液,在水凝胶的上、下、左、右4个位置依次接种细胞。接种细胞后将96孔板再次放入5%CO2,37℃恒温培养箱中2小时。取出96孔板,向每个孔加入150μL的高糖DMEM培养液培养细胞。观察细胞在水凝胶上的生长情况,每天更换孔内的培养液。
(4)Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞增殖速率:将三组已经接种上细胞的水凝胶分别于培养后的第1、3、5、7天各选取5个水凝胶准备进行检测。将CCK-8反应液放置于37℃恒温箱复温15分钟后,向所有选取的孔内加入15μL的CCK-8反应液,随后将水凝胶置于恒温培养箱内避光反应2小时。取出反应后的96孔板,吸取加过反应液的孔内培养液150μL,并放入一个新的96孔板中。将新的孔板置于酶标仪上检测反应液在波长为450nm时的OD值。
(5)Live/Dead染色观察:将三组已经接种上细胞的水凝胶,分别在培养第1、7天后行Live/Dead染色观察HWJ-MSCs的存活情况。具体染色步骤如下:取出已培养1或7天的水凝胶细胞复合体,用37℃无菌PBS液清洗样品3次,每次5分钟;向清洗后的水凝胶细胞复合体内加入4%多聚甲醛固定30分钟,固定结束后弃掉固定液,再使用37℃的无菌PBS液清洗样品3次,每次5分钟;向样品内加入已配制好的0.2%triton X-100液,破膜10分钟;用枪头吸出孔板内的液体,再加入37℃的PBS液清洗样品3次,每次5分钟;在避光的环境中,向每个样品加入150μL已配制好的死活细胞染液溶液,置于37℃恒温培养箱内染色30分钟;用枪头吸除死活细胞染色液,加入37℃的PBS液清洗样品3次,每次5分钟;完成上述操作后,将水凝胶取出置于共聚焦小皿内,使用共聚焦荧光显微镜观察标记的细胞。
(6)异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽细胞水凝胶染色:将已经接种上细胞的OHA/PEG水凝胶和PEG水凝胶,分别进行异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽染色,具体步骤如下:PBS清洗样品三次,每次5分钟;4%多聚甲醛固定30min,去掉固定液,再用PBS清洗3次,每次5min;加入10μL配好的染色液,于37℃恒温培养箱染色30min;去除染色液,加入PBS清洗3次,每次5min;加入DAPI工作液150μL,加入37℃恒温箱避光染色10min;去除多余的DAPI染色液,加入37℃无菌PBS清洗样品3次,每次5min;将水凝胶取出放置于共聚焦小皿内,使用共聚焦荧光显微镜观察标记的细胞。
(7)Western-blot检测I型、II型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达量:将水凝胶处理后的细胞取出,细胞裂解,对细胞中的总蛋白进行定量;SDS-PAGE电泳,切胶,筛选出目的蛋白条带,进行转膜操作,使目的蛋白转移至PVDF膜上;封闭,将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2h,然后用缓冲液清洗2~3遍;孵育一抗,以1:1000的比例稀释一抗,加入到封闭好的PVDF膜,4℃过夜,用缓冲液清洗3遍;孵育二抗,以1:3000的比例稀释二抗,加入到PVDF膜中,室温摇床孵育1h,缓冲液清洗3次,每次10min;显色,配置ECL发光液,设置成像仪曝光参数,利用Bio-rad全自动成像仪进行曝光,最终获得成像条带。
统计分析:胶片扫描后,利用ImageJ分析软件分析各条带灰度值,进行数据分析。
结果显示,自培养第三天起,相比PEG水凝胶的组织液OD值仅为0.5,本例的OHA/PEG复合水凝胶的组织液OD值明显升高,达到0.8,表明细胞增殖更明显,各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。在培养第七天时,OHA/PEG复合水凝胶组活细胞粘附密度约为463个/mm2,远高于PEG水凝胶组,PEG水凝胶组活细胞粘附密度仅约为160个/mm2,两者比较有统计学差异。通过异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽-488荧光试剂观察细胞在表面的形态时,发现两种水凝胶表面细胞均呈现为长梭形,细胞形态没有发生改变。Western-blot检测结果表明细胞在诱导培养1周后,OHA/PEG复合水凝胶上的细胞的I型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达量分别是20μg/mL和36μg/mL,均高于PEG水凝胶组,PEG水凝胶上的细胞的I型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达量分别为11μg/mL和14μg/mL,两组水凝胶的II型胶原蛋白表达量均较低,都小于10μg/mL。此外,不同于PEG水凝胶,OHA/PEG复合水凝胶上的细胞在培养第3周的I型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达量分别为85μg/mL和110μg/mL,明显高于培养第1周,而II型胶原蛋白表达量与第1周无明显统计学差异,表明在培养的过程中原代间充质干细胞已向类纤维环细胞方向诱导。
实施例三
本例制备OHA/PEG复合水凝胶的原材料和基本步骤与实施例一相同,所不同的仅仅是一些细节的参数,详细如下:
合成Tetra-PEG-COOH:即将四臂聚乙二醇(1g,1eq)、琥珀酸酐(100mg,10eq)和二甲基氨基吡啶(56mg,5eq)溶解在50mL无水二氯甲烷中,37℃搅拌反应20h。然后将反应液用60mL饱和食盐水洗涤3次,收集有机相,并用MgSO4干燥除水,真空浓缩后用过量的乙醚沉淀两次,得到Tetra-PEG-COOH。
合成Tetra-PEG-SS:即将上述制备的Tetra PEG-COOH(1g,1eq)置于250mL圆底烧瓶中,加入100mL新鲜蒸馏的DCM使之溶解,再分别加入EDCI(92mg,5eq)和NHS(55mg,5eq),于氮气下室温搅拌反应24h,然后用50mL饱和氯化钠洗涤三次,收集有机相并用MgSO4干燥除水,再真空干燥,即得Tetra-PEG-SS。
合成OHA:称取1g透明质酸加入到100mL水中以配成1%(w/v)的溶液,用磁力损拌器搅拌至透明质酸完全溶解。将2mL浓度为0.2mol/L高碘酸钠溶液逐滴加到透明质酸溶液中,同时不停搅拌。室温下避光反应2h后加入1mL二乙二醇用于终止反应,搅拌15min。将产物装入透析袋中(cut off Mw=3500)透析3天,每天换水四次。将产物置于塑料培养皿中,经冷冻干燥,即得OHA。
制备OHA/PEG复合水凝胶:将1g OHA与2g Tetra-PEG-SS加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第一溶液。将3.0g Tetra-PEG-NH2加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第二溶液。再将4mL第一溶液与4mL第二溶液混合,即制备得到本例的OHA/PEG复合水凝胶。
采用实施例一相同的方法考察本例制备得到的OHA/PEG复合水凝胶的力学性能。结果显示,本例的OHA/PEG复合水凝胶其弹性模量为1.2MPa、断裂应力为850KPa、断裂伸长为59.84%,机械强度较高。
采用实施例一相同的方法考察本例制备得到的OHA/PEG复合水凝胶对纤维环的粘附和修补性能。结果显示,本例的OHA/PEG复合水凝胶能很好地粘结并修补纤维环,对纤维环具有高效粘结和修补作用。
采用实施例二相同的方法考察本例制备的OHA/PEG复合水凝胶的生物活性。结果表明自培养第三天起,相比PEG水凝胶的组织液OD值仅为0.4,本例OHA/PEG复合水凝胶的组织液OD值明显升高,达到0.8,表明细胞增殖更明显,各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。在第七天时,OHA/PEG复合水凝胶组活细胞粘附密度约为481个/mm2,数量远高于PEG水凝胶组,PEG水凝胶组活细胞粘附密度仅仅为174个/mm2,两者比较有统计学差异。
采用实施例二相同的方法观察细胞在表面的形态。结果显示,两种水凝胶表面细胞均呈现为长梭形,细胞形态没有发生改变。
采用实施例二相同的方法检测OHA/PEG复合水凝胶和PEG水凝胶上培养的细胞的I、II型胶原蛋白及Aggrecan蛋白表达情况。
结果显示,细胞在培养1周后,OHA/PEG复合水凝胶的Collagen I(I型胶原蛋白)、Aggrecan蛋白表达量分别为25μg/mL和38μg/mL,高于PEG水凝胶组,PEG水凝胶上的细胞的I型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达量分别为9μg/mL和16μg/mL,两组水凝胶的Collagen II(II型胶原蛋白)蛋白表达量较低,都小于10μg/mL;此外,不同于PEG水凝胶,OHA/PEG复合水凝胶在第3周的Collagen I、Aggrecan蛋白表达量分别为81μg/mL和124μg/mL,明显高于第1周,而Collagen II蛋白表达量与第1周无明显统计学差异,表明在培养的过程中原代间充质干细胞已向类纤维环细胞方向诱导。
实施例四
本例制备OHA/PEG复合水凝胶的原材料和基本步骤与实施例一相同,所不同的仅仅是一些细节的参数,详细如下:
合成Tetra-PEG-COOH:即将四臂聚乙二醇(4g,4eq)、琥珀酸酐(200mg,20eq)和二甲基氨基吡啶(224mg,20eq)溶解在60mL无水二氯甲烷中,37℃搅拌反应20h。然后将反应液用80mL饱和食盐水洗涤3次,收集有机相,并用MgSO4干燥除水,真空浓缩后用过量的乙醚沉淀两次,得到Tetra-PEG-COOH。
合成Tetra-PEG-SS:即将上述制备的Tetra-PEG-COOH(1g,1eq)置于250mL圆底烧瓶中,加入100mL新鲜蒸馏的DCM使之溶解,再分别加入EDCI(184mg,10eq)和NHS(110mg,10eq),于氮气下室温搅拌反应24h,然后用60mL饱和氯化钠洗涤三次,收集有机相并用MgSO4干燥除水,再真空干燥,即得Tetra-PEG-SS。
合成OHA:称取1g透明质酸加入到100mL水中以配成1%(w/v)的溶液,用磁力损拌器搅拌至透明质酸完全溶解。将4mL浓度为0.4mol/L高碘酸钠溶液逐滴加到透明质酸溶液中,同时不停搅拌。室温下避光反应4h后加入3mL二乙二醇用于终止反应,搅拌20min。将产物装入透析袋中(cut off Mw=3500)透析3天,每天换水四次。将产物置于塑料培养皿中,经冷冻干燥,即得OHA。
制备OHA/PEG复合水凝胶:将2g OHA与2g Tetra-PEG-SS加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第一溶液。将3.0g Tetra-PEG-NH2加到10mL浓度10mM、pH=7.4的PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第二溶液。再将5mL第一溶液与5mL第二溶液混合,即制备得到本例的OHA/PEG复合水凝胶。
采用实施例一相同的方法考察本例制备得到的OHA/PEG复合水凝胶的力学性能。结果显示,本例的OHA/PEG复合水凝胶其弹性模量为1.5MPa、断裂应力为910KPa、断裂伸长为60.78%,具有较高的机械强度。
采用实施例一相同的方法考察本例制备得到的OHA/PEG复合水凝胶对纤维环的粘附和修补性能。结果显示,本例的OHA/PEG复合水凝胶能很好地粘结并修补纤维环,对纤维环具有高效粘结和修补作用。
采用实施例二相同的方法考察本例制备的OHA/PEG复合水凝胶的生物活性。结果表明自培养第三天起,相比PEG水凝胶的组织液OD值仅为0.4,本例OHA/PEG复合水凝胶的组织液OD值明显升高,达到0.8,表明细胞增殖更明显,各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。在第七天时,OHA/PEG复合水凝胶组活细胞粘附密度约为490个/mm2,数量远高于PEG水凝胶组,PEG水凝胶组活细胞粘附密度仅为187个/mm2,两者比较有统计学差异。
采用实施例二相同的方法观察细胞在表面的形态。结果显示,两种水凝胶表面细胞均呈现为长梭形,细胞形态没有发生改变。
采用实施例二相同的方法检测OHA/PEG复合水凝胶和PEG水凝胶上培养的细胞的I、II型胶原蛋白及Aggrecan蛋白表达情况。
结果显示,细胞在培养1周后,OHA/PEG复合水凝胶的Collagen I(I型胶原蛋白)、Aggrecan蛋白表达量分别为22μg/mL和35μg/mL,高于PEG水凝胶组,PEG水凝胶上的细胞的I型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达量分别为11μg/mL和17μg/mL,两组水凝胶的Collagen II(II型胶原蛋白)蛋白表达量较低,都小于10μg/mL;此外,不同于PEG水凝胶,OHA/PEG复合水凝胶在第3周的Collagen I、Aggrecan蛋白表达量分别为86μg/mL和121μg/mL,明显高于第1周,而Collagen II蛋白表达量与第1周无明显统计学差异,表明在培养的过程中原代间充质干细胞已向类纤维环细胞方向诱导。
以上实施例的测试结果显示,实施例一至实施例四制备的OHA/PEG复合水凝胶,对纤维环都具有高效粘结和修补作用。并且,复合水凝胶具有较高的机械强度和良好的生物相容性,可促进干细胞在表面的粘附、增殖和分化;复合水凝胶的原材料具有可控的生物降解性。
在以上试验的基础上,以实施例一为基础,进一步对复合水凝胶的组分用量进行优化,结果显示,第一溶液中末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的浓度分别为5~25%(w/v),第二溶液中末端为氨基的四臂聚乙二醇的浓度为5~30%(w/v),且第一溶液和第二溶液按体积比1:1~1:5混合,制备的OHA/PEG复合水凝胶,都能够满足纤维环修复的使用需求。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (9)
1.一种用于纤维环修复的复合水凝胶,其特征在于:包括采用末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇、氧化透明质酸和末端为氨基的四臂聚乙二醇复合而成;
所述复合水凝胶由含有末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的第一溶液,和含有末端为氨基的四臂聚乙二醇的第二溶液复合而成;
所述第一溶液中末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的浓度分别为5~25%(w/v);所述第二溶液中末端为氨基的四臂聚乙二醇的浓度为5~30%(w/v);所述第一溶液和第二溶液的体积比为1:1~1:5;
所述氧化透明质酸的分子量为10~1000KDa,氧化开环程度为10%~50%。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶在制备修复纤维环的药物中的应用。
3.一种用于修复纤维环的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有第一溶液和第二溶液,所述第一溶液中含有末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸,所述第二溶液中含有末端为氨基的四臂聚乙二醇,所述第一溶液和第二溶液的溶剂均为PBS缓冲液;
所述试剂盒使用时,按照第一溶液和第二溶液的体积比为1:1~1:5,将第一溶液和第二溶液注射到需要进行纤维环修复的部位形成复合水凝胶;
所述第一溶液中末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的浓度分别为5~25%(w/v);所述第二溶液中末端为氨基的四臂聚乙二醇的浓度为5~30%(w/v);
所述氧化透明质酸的分子量为10~1000KDa,氧化开环程度为10%~50%。
4.根据权利要求1所述的复合水凝胶的制备方法,其特征在于:包括以下步骤,
1)末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇的制备步骤,将四臂聚乙二醇、琥珀酸酐和二甲基氨基吡啶溶解在无水二氯甲烷中,于37℃搅拌反应18~30h,然后将反应液用饱和食盐水洗涤至少3次,收集有机相,并用硫酸镁干燥除水,真空浓缩后用过量的乙醚沉淀两次,得到末端为羧基的四臂聚乙二醇,标记为Tetra-PEG-COOH;向制备的Tetra-PEG-COOH中加入新鲜蒸馏的二氯甲烷使之溶解,再分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺,在氮气下室温搅拌18~30h,然后用饱和氯化钠洗涤至少三次,收集有机相并用硫酸镁干燥除水,真空干燥,即获得末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇,标记为Tetra-PEG-SS;
2)氧化透明质酸的制备步骤,称取透明质酸加入到水中配成1~5%(w/v)的溶液,搅拌至透明质酸完全溶解;将浓度为0.2~1mol/L高碘酸钠溶液逐滴加到透明质酸溶液中,同时不停搅拌;室温下避光反应1~5h后加入二乙二醇搅拌10~30min终止反应;将产物装入透析袋中透析至少3天,每天换水至少四次;将透析产物冷冻干燥,即获得所述氧化透明质酸;
3)复合水凝胶制备步骤,将制备的氧化透明质酸与制备的Tetra-PEG-SS加到PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第一溶液;将末端为氨基的四臂聚乙二醇加到PBS缓冲液中,搅拌均匀,配制成第二溶液;将所述第一溶液和第二溶液混合,即获得所述复合水凝胶。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:步骤1)中,四臂聚乙二醇、琥珀酸酐、二甲基氨基吡啶三者的摩尔比依序为1:5:5~1:10:5。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:Tetra-PEG-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺三者的摩尔比依序为1:5:5~1:20:20。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:步骤2)中,所述氧化透明质酸的分子量为10~1000KDa,氧化开环程度为10%~50%。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:步骤3)中,所述第一溶液中末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇和氧化透明质酸的浓度分别为5~25%(w/v),所述第二溶液中末端为氨基的四臂聚乙二醇的浓度为5~30%(w/v)。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述第一溶液和第二溶液的体积比为1:1~1:5。
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