CN108912352A - 一种抗菌粘附可注射水凝胶敷料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种抗菌粘附可注射水凝胶敷料及其制备方法和应用，属于可降解生物医用材料技术领域。通过在壳聚糖上接枝2,3‑环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)，得到季铵化壳聚糖聚合物(QCS)作为水凝胶的主要原料，通过在三嵌段共聚物F127上接枝对羧基苯甲醛，得到醛基封端的F127聚合物(PF127‑CHO)作为凝胶的交联剂，和季铵化壳聚糖聚合物(QCS)在生理环境下进行交联反应，得到拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料(QCS/PF)。该方法工艺简单、原料来源广泛、制备成本低廉；经该方法制得的水凝胶敷料具有良好的粘合性、pH值响应性、机械性能、自愈合性能、止血性能及抗菌性能，因此能够应用于皮肤损伤治疗药物领域。

Description

一种抗菌粘附可注射水凝胶敷料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于可降解生物医用材料技术领域，具体涉及一种能够快速自愈合、易延展、易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤损伤是人体最为常见的损伤之一，例如擦伤，烧伤，手术外伤等，不合理的治疗方案常会危害人体健康，例如引发细菌感染，组织脱水，甚至更为严重的二次创伤。(X.Zhao,H.Wu,B.Guo,R.Dong,Y.Qiu,P.X.Ma,Biomaterials 2017,122,34.)因此，设计新型的伤口敷料在现代医学中具有重要的临床意义。
相比于传统的医用敷料，水凝胶医用敷料是近年来发展起来的一种新型的创伤敷料。与其它类型的敷料相比，其优点包括：水凝胶基质可以提供湿润的组织接触环境，具有良好的细胞相容性，能够吸收伤口渗出液，不与组织粘连从而避免更换敷料时带来的二次损伤等。
近些年，一些新型水凝胶敷料在伤口愈合应用中得到了一定的关注和研究。然而，目前常见的水凝胶敷料通常存在着以下的不足：第一，这类水凝胶通过负载特定的抗生素或特定药物从而获得抗菌的效果，而一些新型耐药细菌的出现，在一定程度上限制了这类缺乏固有抗菌性能的水凝胶在临床上应用；(X.Zhao,P.Li,B.Guo,P.X.Ma,ActaBiomaterial 2015,26,236.)第二，在人体关节处，皮肤受损的部位需要一定活动空间，传统水凝胶敷料由于机械性能较弱，并不能解决病患被敷料捆绑所带来的不适感，甚至由于活动产生的机械外力会引发凝胶敷料的断裂或破损，而这类水凝胶敷料的使用时间也大大降低；第三，由于人体皮肤是弱酸性的环境，传统的水凝胶敷料并不能在酸性环境下智能控释负载药物，更快促进伤口愈合过程；(Z.Fan,B.Liu,J.Wang,S.Zhang,Q.Lin,P.Gong,L.Ma,S.Yang,Advanced Functional Materials 2014,24,3933；N.Annabi,D.Rana,E.Shirzaei Sani,R.Portillo-Lara,J.L.Gifford,M.M.Fares,S.M.Mithieux,A.S.Weiss,Biomaterials 2017,139,229.)第四，这类水凝胶的制备过程往往较为复杂，原料昂贵，操作步骤较多，一定程度上也限制了其在临床上的应用。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种抗菌粘附可注射水凝胶敷料及其制备方法和应用；该方法工艺简单、原料来源广泛、制备成本低廉；经该方法制得的水凝胶敷料具有良好的粘合性、pH值响应性、机械性能、自愈合性能、止血性能及抗菌性能，因此能够应用于皮肤损伤治疗药物领域。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开的一种抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过在壳聚糖上接枝2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，得到季铵化壳聚糖聚合物；
(2)通过在三嵌段共聚物F127上接枝对羧基苯甲醛，得到醛基封端的F127聚合物，即PF127-CHO；
(3)将季铵化壳聚糖聚合物和醛基封端的F127聚合物分别配制成溶液后，在20～45℃交联反应5～400s，制得抗菌粘附可注射水凝胶敷料；其中，季铵化壳聚糖聚合物和醛基封端的F127聚合物的质量比为(1～20)：(50～200)。
优选地，步骤(1)中季铵化壳聚糖聚合物的具体制备步骤包括：
1)先将壳聚糖溶解到去离子水中，随后一边搅拌一边滴加冰乙酸，在55℃下反应10～300min，然后加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，在40～60℃反应12～36h，得到反应液；
2)将反应溶液在转速2000～6000r/min离心10-30分钟，得到上清液，加入5～8倍体积的丙酮，沉淀完全，最后抽滤干燥，得到季铵化壳聚糖聚合物；
其中，壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为(1～6)：(0.5～6)。
更进一步优选地，冰乙酸水溶液的浓度为0.03mol/L～0.12mol/L；壳聚糖和冰乙酸水溶液的用量比为5g：(100～260)mL。
优选地，步骤(2)中，醛基封端的F127聚合物(PF127-CHO)的制备步骤具体包括：
a)将F127聚合物密封在三口瓶中60-90℃下真空干燥5-24小时，随后加入干燥的二氯甲烷，在0℃冰浴下加入干燥的三乙胺，充分搅拌10～60min，之后将干燥的甲磺酰氯溶于干燥的二氯甲烷中，将甲磺酰氯溶液滴加入F127溶液，在氮气环境下搅拌10～60min，随后在15～40℃下搅拌12～36h，之后在反应溶液中加入去离子水，并用二氯甲烷进行提纯，重复2～5次，有机相用0.5mol/L～2mol/L盐酸溶液进行洗涤，重复2～4次，再用饱和食盐水洗涤2～4次，之后将有机相用干燥的硫酸钠固体干燥并旋转蒸发，将浓缩的有机相用5～8倍体积的冰乙醚进行沉淀，直至沉淀完全析出，并将该沉淀过程重复1～3次，15～40℃下真空干燥，得到白色中间产物G1；
b)将白色中间产物G1溶解至干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，并加入碳酸钾、4-羧基苯甲醛，在氮气保护下，60～90℃搅拌15～60h，待反应液凉至15～30℃，加入去离子水，并用二氯甲烷进行提纯，重复2～4次，有机相用饱和食盐水洗涤2～4次，之后将有机相用干燥的硫酸钠固体干燥并旋转蒸发，将浓缩的有机相用5～8倍体积的冰乙醚进行沉淀，直至沉淀完全析出，并将该沉淀过程重复1～3次，15～40℃下真空干燥，得到醛基封端的F127聚合物(PF127-CHO)。
更进一步优选地，步骤a)中，F127聚合物：三乙胺：甲磺酰氯的质量体积比为：(15～30)g：(1.2～4.5)mL：(0.5～2.5)mL；F127聚合物：二氯甲烷的质量体积比为(15～30)g：(100～300)mL；甲磺酰氯：二氯甲烷溶解液的体积比为(0.5～2.5)：(15～50)。
步骤a)中，去离子水：盐酸溶液：饱和食盐水：总二氯甲烷的体积比为(40～220)：(25～180)：(25～180)：(115～350)。
步骤a)中，硫酸钠固体：F127聚合物质量比为(5～25)g：(15～30)g。旋转蒸发得到浓缩的有机相(二氯甲烷)：总二氯甲烷溶液的体积比为(10～100)：(115～350)。
更进一步优选地，步骤b)中，白色中间产物G1：N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为(15～30)g：(100～300)mL。
步骤b)中，去离子水：饱和食盐水：二氯甲烷的体积比为(40～220)：(25～180)：(115～350)。
步骤b)中，硫酸钠固体：白色中间产物G1的质量比为(5～25)：(15～30)。
步骤b)中，旋转蒸发得到浓缩的有机相(二氯甲烷)：总二氯甲烷溶液的体积比为(10～100)：(115～350)。
优选地，步骤(3)中，季铵化壳聚糖溶液是用磷酸缓冲盐溶液配制，质量浓度为20～70mg/mL；醛基封端的F127聚合物溶液是用磷酸缓冲盐溶液配制，质量浓度为150～500mg/mL，季铵化壳聚糖溶液：醛基封端的F127聚合物溶液的体积比为(50～400)：(150～450)。
本发明还公开了采用上述方法制得的抗菌粘附可注射水凝胶敷料，并且公开了其可以负载生物活性分子，在皮肤伤口愈合方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的制备方法，以海洋无毒天然生物材料壳聚糖为基础，通过在壳聚糖上接枝2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)，得到季铵化壳聚糖聚合物(QCS)作为水凝胶的主要原料，壳聚糖因为具有良好的生物相容性，生物可降解性和良好的抗菌性能，是一类重要的用于形成生物医用材料的原料，而壳聚糖的衍生物季铵化壳聚糖聚合物(QCS)不仅极大提高壳聚糖在生理环境下的溶解性，同时也提高其自身的抗菌能力。同时，三嵌段共聚物F127已被证明拥有良好的生物相容性，应用于生物医用材料领域，本发明通过在三嵌段共聚物F127上接枝对羧基苯甲醛，得到醛基封端的F127聚合物(PF127-CHO)作为凝胶的交联剂，和季铵化壳聚糖聚合物(QCS)在生理环境下进行交联反应，得到拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料(QCS/PF)。
经本发明方法制得的水凝胶敷料具有以下优点：
1、本发明中QCS/PF水凝胶拥有优良的抗菌性能是由于季铵化壳聚糖中的季铵基团和壳聚糖上带正电的氨基基团都可以通过静电吸附的方法从而分解细菌的细胞壁，导致释放细胞内液，从而起到良好杀菌效果。另外，水凝胶中活性的席夫碱基团也有一定的抗菌效果，因而该水凝胶QCS/PF的抗菌活性是材料的固有性能，且效果显著；
2、本发明中季铵化壳聚糖(QCS)中的氨基和醛基封端的F127聚合物(PF127-CHO)中的醛基在生理环境下会发生动态结合，形成动态席夫碱键，另外由于三嵌段共聚物F127是在水中可以进行自组装，形成微型胶术，在水凝胶网络中这种微型胶术也充当动态的交联剂，因此该水凝胶网络中同时存在动态化学键(席夫碱)和动态物理作用(胶束交联)，赋予该水凝胶的优异的自愈合性能，同时这种自愈合性能是“自主性的”,不需外界的环境刺激；
3、本发明中的氨基在弱酸性环境下会逐渐质子化，分子间静电作用增强，席夫碱键会逐渐破损甚至断裂，造成凝胶部分孔径变大，从而在酸性环境下药物释放迅速，表现出明显的pH响应性能；
4、本发明中PF127胶束在水凝胶网络中承担动态微型交联剂的作用，当水凝胶收到外部挤压或者拉伸作用时，PF127胶束可以在负载时耗散一部分能量，并且在卸载时重新恢复其原始结构，因此该水凝胶被赋予易于拉伸和压缩的良好机械性能；
5、本发明中由于醛基封端的F127聚合物(PF127-CHO)中醛基可以与皮肤组织的氨基之间发生化学反应，相互结合，同时壳聚糖可以通过静电作用和疏水作用于细胞膜上的磷脂分子相互结合，因此这两种作用共同赋予该水凝胶良好的粘合性能；
6、本发明中由于壳聚糖本身良好的止血性能，同时该系列水凝胶结构稳定，粘合性能优异，成凝胶时间较短，因此该水凝胶拥有良好的止血性能。
实验结果证明：本发明方法制得的拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料(QCS/PF)在全切口皮肤损伤模型中，通过评估伤口愈合率，肉芽组织厚度和胶原蛋白含量，该凝胶QCS/PF展示出优于商用敷料(TegadermTM)的治疗效果，同时当该凝胶敷料负载生物活性分子时，展示出更为优异的皮肤创面愈合的治疗效果。此外，这些水凝胶具有稳定的流变学特性，与人体软组织媲美的模量，可以调控的成凝胶时间，优异的粘附性能，自愈合性能，良好的pH响应性能，生物相容性，固有的抗菌性能以及良好的止血性能等。因此，该系列多功能水凝胶敷料QCS/PF在促进关节处皮肤伤口愈合领域有着良好的应用前景。
基于上述优势，使得本发明制造的可注射水凝胶敷料(QCS/PF)可以负载用于伤口愈合的生物活性药物，如姜黄素(Curcumin)等。负载药物之后的水凝胶可以有效释放其包埋的药物，从而可以发挥姜黄素在促进伤口愈合方面强大的调节作用(增强成纤维细胞的迁移，胶原沉积和再上皮化等)。
附图说明
图1是本发明中聚合物QCS，PF127-CHO和QCS/PF水凝胶的FT-IR图。
图2为本发明制得的QCS/PF水凝胶在37℃下(PBS，pH＝7.4)平衡溶胀比。
图3为本发明制得的QCS/PF水凝胶在37℃下(PBS，pH＝7.4和pH＝6.8)体外降解曲线。
图4(a)是QCS聚合物和PF127-CHO聚合物质量比为10：72的水凝胶(QCS/PF0.8)原始孔径的扫描电子显微镜图片，图4(b)是QCS聚合物和PF127-CHO聚合物质量比为10：90的水凝胶(QCS/PF1.0)原始孔径的扫描电子显微镜图片，图4(c)是QCS聚合物和PF127-CHO聚合物质量比为10：108的水凝胶(QCS/PF1.2)原始孔径的扫描电子显微镜图片，图4(d)是QCS聚合物和PF127-CHO聚合物质量比为10：120的水凝胶(QCS/PF1.3)原始孔径的扫描电子显微镜图片，比例尺是50μm；图4(e)是QCS聚合物和PF127-CHO聚合物在不同质量比下形成水凝胶的孔径统计图。
图5(a)是本发明制得的水凝胶QCS/PF1.0在流变仪测定的存储模量，耗损模量-应力曲线图；图5(b)是本发明制得的水凝胶QCS/PF01.0在流变仪测定的存储模量，耗损模量-时间曲线图。
图6(a)是本发明制得的水凝胶QCS/PF的应力-应变曲线；图6(b)是本发明制得的水凝胶QCS/PF1.0在50％的应变下循环拉伸试验。
图7(a)是本发明制得的水凝胶QCS/PF1.0在10％-90％应变下的压缩应力-应变曲线；图7(b)是本发明制得的水凝胶QCS/PF1.0在90％的应变下循环压缩试验；图7(c)是本发明制得的水凝胶QCS/PF1.0在60％的应变下循环压缩试验。
图8为本发明制得的QCS/PF可注射水凝胶流变学性能(存储模量-时间曲线)。
图9(a)为本发明制得的QCS/PF1.0水凝胶敷料应用在人体关节处的图片，手肘弯曲夹角0°；图9(b)为本发明制得的QCS/PF1.0水凝胶敷料应用在人体关节处的图片，手肘弯曲夹角60°；图9(c)为本发明制得的QCS/PF1.0水凝胶敷料应用在人体关节处的图片，手肘弯曲夹角90°；图9(d)为本发明制得的QCS/PF1.0水凝胶敷料应用在人体关节处的图片，手肘弯曲夹角120°，比例尺为5cm。
图10(a)为本发明制得的QCS/PF水凝胶对大肠杆菌(E.coli)杀伤率的统计图；图10(b)为本发明制得的QCS/PF水凝胶对金黄色葡萄球菌(S.aureus)杀伤率的统计图。
图11是水凝胶和成纤维细胞L929共同培养1，3，5天细胞存活数目统计图。
图12是负载生物活性分子姜黄素的QCS/PF1.0水凝胶清楚1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)的百分比统计。
图13为本发明制得的水凝胶在不同pH值的生理溶液磷酸盐缓冲液(PBS)中释放姜黄素(Curcumin)的释放曲线。
图14为本发明制得的水凝胶QCS/PF的粘粘强度。
图15为本发明制得的水凝胶QCS/PF1.0的止血能力测试。
图16为本发明制得的QCS/PF1.0水凝胶和Cur-QCS/PF1.0水凝胶和商业薄膜敷料(TegadermTM)(对照组)，在第0，5，10和15天的伤口收缩面积统计。
图17(a)为小鼠皮肤创口经过商业薄膜敷料(TegadermTM)处理后，第5天的组织形态学切片；图17(b)为小鼠皮肤创口经过本实验制得的QCS/PF1.0水凝胶敷料处理后，第5天的组织形态学切片；图17(c)为小鼠皮肤创口经过本实验制得的Cur-QCS/PF1.0水凝胶敷料处理后，第5天的组织形态学切片；图17(d)为小鼠皮肤创口经过商业薄膜敷料(TegadermTM)处理后，第10天的组织形态学切片；图17(e)为小鼠皮肤创口经过本实验制得的QCS/PF1.0水凝胶敷料处理后，第10天的组织形态学切片；图17(f)为小鼠皮肤创口经过本实验制得的Cur-QCS/PF1.0水凝胶敷料处理后，第10天的组织形态学切片；图17(g)为小鼠皮肤创口经过商业薄膜敷料(TegadermTM)处理后，第15天的组织形态学切片；图17(h)为小鼠皮肤创口经过本实验制得的QCS/PF1.0水凝胶敷料处理后，第15天的组织形态学切片；图17(i)为小鼠皮肤创口经过本实验制得的Cur-QCS/PF1.0水凝胶敷料处理后，第15天的组织形态学切片；比例尺是200μm；
图18为小鼠皮肤创口经过本实验制得的Cur-QCS/PF1.0，QCS/PF1.0水凝胶和商业薄膜敷料(TegadermTM)处理后，第15天新生组织处肉芽组织厚度统计图。
图19为小鼠皮肤创口经过本实验制得的Cur-QCS/PF1.0，QCS/PF1.0水凝胶和商业薄膜敷料(TegadermTM)处理后，新生组织处羟脯氨酸含量。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开的一种拥有快速自愈合、易延展、易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)QCS(Quaternized chitosan，季铵化壳聚糖)聚合物的制备：
先将壳聚糖溶解到去离子水中，随后一边搅拌一边滴加冰乙酸，在55℃下反应10-300分钟，然后加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，在40-60℃反应12-36h，将反应溶液在转速2000-6000r/min离心10-30分钟，得到上清液，加入5～8倍体积的丙酮，沉淀完全，最后抽滤干燥，得到季铵化壳聚糖聚合物；其中，壳聚糖、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为(1～6)：(0.5～6)。
(2)PF127-CHO(Benzaldehyde-terminated PF127，醛基封端的F127)聚合物的制备，包括以下步骤
1)将F127聚合物密封在三口瓶中60-90℃下真空干燥5-24小时，随后加入干燥的二氯甲烷，在0℃冰浴下加入干燥的三乙胺，充分搅拌10-60分钟，之后将干燥的甲磺酰氯溶于干燥的二氯甲烷中，将甲磺酰氯溶液滴加入F127溶液，在氮气环境下搅拌10-60分钟，随后在15-40℃下搅拌12-36小时，之后在反应溶液中加入去离子水，并用二氯甲烷进行提纯，重复2-5次，有机相用0.5mol/L-2mol/L盐酸溶液进行洗涤，重复2-4次，再用饱和食盐水洗涤2-4次，之后将有机相用干燥的硫酸钠固体干燥并旋转蒸发，将浓缩的有机相用5～8倍体积的冰乙醚进行沉淀，直至沉淀完全析出，并将该沉淀过程重复1-3次，15-40℃下真空干燥，得到白色中间产物G1；
2)将得到的白色中间产物G1溶解至干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，并加入碳酸钾、4-羧基苯甲醛，在氮气保护下，60-90℃搅拌15-60小时，待反应液凉至15-30℃，加入去离子水，并用二氯甲烷进行提纯，重复2-4次，有机相用饱和食盐水洗涤2-4次，之后将有机相用干燥的硫酸钠固体干燥并旋转蒸发，将浓缩的有机相用5～8倍体积的冰乙醚进行沉淀，直至沉淀完全析出，并将该沉淀过程重复1-3次，15-40℃下真空干燥，得到醛基封端的F127聚合物(PF127-CHO)。
(3)拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备：将季铵化壳聚糖聚合物配制成溶液，并且与醛基封端的F127聚合物溶液混合，在20-45℃相互交联5～400秒，得到拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料；其中季铵化壳聚糖和PF127-CHO的质量比为(1～20)：(50～200)。
本发明制得的QCS/PF水凝胶拥有具有优良的抗菌性能，具体是指水凝胶可以有效杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
本发明中QCS/PF水凝胶拥有具有优异的自愈合性能是由于该水凝胶网络中同时存在动态化学键(席夫碱)和动态物理作用(胶束交联)，因此水凝胶在受到损伤时候可以自主愈合，无需外接环境刺激。
本发明制备的水凝胶QCS/PF在弱酸性环境下，分子间静电作用增强，交联的结构部分断裂，水凝胶部分孔径变大，使得包埋的药物释放，因而表现出明显的pH响应性能。
本发明中PF127胶束在水凝胶网络中承担动态微型交联剂的作用，当水凝胶收到外部挤压或者拉伸作用时，PF127胶束可以在负载时耗散一部分能量，并且在卸载时重新恢复其原始结构，因此该水凝胶表现出易于拉伸和压缩的良好机械性能。
本发明中由于PF127-CHO中醛基可以与皮肤组织的氨基之间发生化学反应，同时壳聚糖可以与细胞膜上的磷脂分子相互结合，因此该水凝胶表现出良好的粘合性能。
本发明中由于壳聚糖良好的止血性能，同时该水凝胶结构稳定，粘合性能优异，成凝胶时间较短，因此该水凝胶表现出良好的止血性能。
本发明中该可注射水凝胶敷料(QCS/PF)可以负载用于伤口愈合的生物活性分子，如姜黄素、黄芪多糖、阿莫西林、阿司匹林、相关生物蛋白等，实施例效果验证试验中主要展示疏水药物姜黄素(Curcumin)的释放过程。
本发明合成的聚合物和该水凝胶的结构式(QCS/PF)及合成路线如下所示：本发明制得的QCS的结构式如下式A所示：
本发明制得的PF-CHOB如下式B所示：
本发明制得的QCS/PF水凝胶的结构式如下式C所示：
本发明制得的QCS的合成路线如下所示：
本发明制得的PF-CHO的合成路线如下所示：
本发明制得的QCS/PF水凝胶的合成路线如下所示：
实施例1
1)QCS(Quaternized chitosan，季铵化壳聚糖)聚合物的制备：先将0.5g壳聚糖溶解到去离子水中，随后一边搅拌一边滴加冰乙酸，在55℃下反应180分钟，然后加入0.873g2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，在55℃反应18h，将反应溶液在转速4000r/min离心10分钟，得到上清液，加入5倍体积的丙酮，沉淀完全，最后抽滤干燥，得到季铵化壳聚糖聚合物；
2)PF127-CHO(Benzaldehyde-terminated PF127，醛基封端的F127)聚合物的制备：
(1)将25gF127聚合物密封在三口瓶中90℃下真空干燥12小时，随后加入干燥的二氯甲烷200mL，在0℃冰浴下加入2.7mL干燥的三乙胺，充分搅拌10分钟，之后将16.68g干燥的甲磺酰氯溶于35mL干燥的二氯甲烷中，将甲磺酰氯溶液滴加入F127溶液，在氮气环境下搅拌30分钟，随后在30℃下搅拌24小时，之后在反应溶液中加入150mL去离子水，并用150mL二氯甲烷进行提纯，重复4次，有机相用150mL,1mol/L盐酸溶液进行洗涤，重复4次，再用150mL饱和食盐水洗涤4次，之后将有机相用15g干燥的硫酸钠固体干燥并旋转蒸发至50mL，将浓缩的有机相用5倍体积的冰乙醚进行沉淀，直至沉淀完全析出，并将该沉淀过程重复3次，30℃下真空干燥，得到白色中间产物G1；
(2)将得到的白色中间产物G1溶解至干燥的200mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入2.74g碳酸钾、1.95g 4-羧基苯甲醛，在氮气保护下，80℃搅拌48小时，待反应液凉至30℃，加入150mL去离子水，并用150mL二氯甲烷进行提纯，重复4次，有机相用150mL饱和食盐水洗涤4次，之后将有机相用15g干燥的硫酸钠固体干燥并旋转蒸发至50mL，将浓缩的有机相用5倍体积的冰乙醚进行沉淀，直至沉淀完全析出，并将该沉淀过程重复3次，30℃下真空干燥，得到醛基封端的F127聚合物(PF127-CHO)。
3)拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备：将200μL季铵化壳聚糖聚合物用磷酸盐缓冲液配制成50mg/mL溶液，并且与300μL的240mg/mL用磷酸盐缓冲液配制的醛基封端的F127聚合物溶液混合，在37℃相互交联90秒，得到拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料QCS/PF0.8。
实施例2
与实施例1不同的是，将步骤3)中醛基封端的F127聚合物溶液分别替换成500mg/mL、400mg/mL、360mg/mL、300mg/mL和150mg/mL，交联时间对应为15秒、20秒，30秒，55秒，120秒，分别命名为QCS/PF1.7,QCS/PF1.3,QCS/PF1.2,QCS/PF1.0,QCS/PF0.5。
经过测试，如图8所示，在PF-CHO聚合物溶液分别为400mg/mL、360mg/mL、300mg/mL、240mg/mL时，水凝胶展示适中的存储模量，表明拥有良好的稳定性；
因此本发明中醛基封端的F127聚合物溶液的浓度在为150～500mg/mL。
步骤(3)中季铵化壳聚糖溶液是用磷酸缓冲盐溶液配制，质量浓度为20～70mg/mL，醛基封端的F127聚合物溶液是用磷酸缓冲盐溶液配制，质量浓度为150～500mg/mL，季铵化壳聚糖溶液：醛基封端的F127聚合物溶液的体积比为(50～400)μL：(150～450)μL。
实施例3
与实施例1不同的是，将步骤3)中的QCS聚合物溶液分别替换成20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、70mg/mL，交联时间对应为300秒、200秒、100秒、70秒、50秒，分别命名为QCS2/PF0.8，QCS3/PF0.8，QCS4/PF0.8，QCS6/PF0.8，QCS7/PF0.8。
本发明的拥有快速自愈合，易延展，易压缩的抗菌粘附可注射水凝胶敷料，性能稳定，其抗菌性能在体外抗菌测试中均表现良好，机械性能和自愈合性能在测试中均表现优异，空白凝胶和负载姜黄素的凝胶均对小鼠皮肤创口有优于商用敷料(TegadermTM)的促进愈合作用，而且该方法制备的水凝胶能够显著促进成纤维细胞(L929)的粘附、增殖，显示出良好较强的生物相容性，下面结合附图及实验数据详细分析。
参见图1，为实施例1～3制得的QCS和PF-CHO聚合物以及QCS/PF水凝胶在傅里叶转换红外光谱图(FT-IR)，分析图谱可得：QCS聚合物上1475cm-1峰分别属于GTMAC的特征峰，表明2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)成功接枝在壳聚糖链上，QCS聚合物被成功合成；PF-CHO聚合物上1734cm-1处的峰是由C＝O的伸缩振动引起，说明醛基已经被成功接枝在F127聚合物链端；在水凝胶QCS/PF的红外图谱上新出现的位于1644cm-1的峰则是聚合物QCS贡献的氨基和聚合物PF-CHO贡献的醛基相互反应形成希夫碱键的特征振动。以上的FT-IR结果证明水凝胶QCS/PF的形成，以及聚合物QCS和聚合物PF-CHO的成功合成。
参见图2，为实施例1、2制得的QCS/PF水凝胶在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中达到溶胀平衡的溶胀率，从图中可以看出，所有水凝胶均溶胀率均超过8(ESR>8)，表明该系列水凝胶良好的吸水能力以及多孔的结构。
图3为实施例1，2制得的QCS/PF水凝胶在pH值为7.4和pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中体外降解曲线。从图3中可以看出，该系列水凝胶均表现出良好的可降解性，同时QCS/PF在酸性环境中的降解速率明显快于碱性环境下的降解速率，且随着交联剂PF-CHO含量的增多，水凝胶降解速率逐渐变弱。
图4(a-e)的扫描电子显微镜图片(SEM)和孔径统计图，可以观察到按照实施例1，2中的制得的水凝胶QCS/PF0.8，QCS/PF1.0，QCS/PF1.2，QCS/PF1.3的原始孔径分别为43.28±8.37μm、33.43±4.71μm、28.66±5.43μm和21.70±8.31μm，如图4(a)、图4(b)、图4(c)和图4(d)所示。因此，该系列水凝胶拥有良好的多孔结构，有利于负载的药物小分子从孔中扩散。
图5(a)和图5(b)是用流变恢复测试对水凝胶进行的自愈合性能的测试，包括存储模量，耗损模量-应力曲线和存储模量，耗损模量-时间曲线。选择实施例2制备的水凝胶样品QCS/PF1.0加以说明。发现该水凝胶样品在施加外力113.7％时达到该凝胶的胶状和溶液状的临界位点，如图5(a)。当给其施加200％的应变力，水凝胶的存储模量低于其耗损模量，水凝胶结构坍塌，而当应变力减少至1％时，水凝胶的存储模量又迅速回升，水凝胶结构又恢复正常，如此反复改变外力5次，水凝胶依旧可以表现出良好的自愈合性能，说明该水凝胶的自愈合性能稳定且优良，如图5(b)。
图6为本发明制得的QCS/PF水凝胶拉伸性能的测试。如图6(a)所示，实施例1，2制得的水凝胶拉伸应变在58.2％-76.1％之间，与人体皮肤的拉伸应变(60％～75％)相似。图6(b)为实施例2制得的QCS/PF1.0水凝胶样品通过五十个连续加载-卸载循环评估水凝胶的机械稳定性。如图所示，在后面的拉伸循环中存在较小的恢复耗损。在经过五十次连续的加卸-载循环后，QCS/PF1.0的拉伸应力下降约20％，这些数据表明水凝胶良好的拉伸性能和抗疲劳性能。
图7为本发明制得的QCS/PF水凝胶压缩和恢复特性的测试。如图7(a)所示，实施例2制得的水凝胶QCS/PF1.0水凝胶在承受10％～90％应变的外部压缩时，水凝胶发生形变，而当取消外部负载时，水凝胶可以快速恢复到初始形状。如图7(b)所示，当水凝胶进行50次循环压缩试验时，其承受的最大压缩应变为90％，水凝胶发生滞后作用和较小的变形，表明水凝胶网络中存在能量耗散。如图7(c)所示，在较低的应变(60％)下，QCS/PF1.0水凝胶没有出现严重的塑性变形，也没有出现强度下降，表明它们具有更好的弹性，且恢复耗损较小，因此水凝胶良好的压缩性能和抗疲劳性能。
图8为本发明制得的QCS/PF水凝胶流变学性能。通过存储模量(G’)和耗损模量(G”)对时间(t)的模式进行测量。图中分别展示的实施例1和实施例2制得的水凝胶样品的存储模量和时间的关系曲线。可以看出，随着交联剂PF-CHO的浓度增高，水凝胶样品的存储模量不断增高，实施例1和实施例2中的样品QCS/PF0.8，QCS/PF1.0，QCS/PF1.2，QCS/PF1.3，其水凝胶样品的存储模量分别为52630Pa，48120Pa，32820Pa和22320Pa。这些结果说明，依照本发明方法制得的可注射水凝胶敷料的可以达到一个较高的强度，从而拥有一个相对稳定的结构以及稳定的机械性能。
图9为本发明制得的QCS/PF1.0水凝胶应用于人体肘部的照片，实验者可以自由弯曲肘关节(交叉角从0°到180°)且不存在任何阻力，这证实了该水凝胶作为关节皮肤伤口敷料的实际用途。
图10为本发明制得的QCS/PF水凝胶对大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)的杀伤率的统计。图中展示的实施例1和实施例2中的QCS/PF1.3，QCS/PF1.2，QCS/PF1.0，QCS/PF0.8的细菌杀伤率的数据统计。结果显示，所有的凝胶组都可以有效地杀死其表面的细菌(>90％)，包括革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，说明该水凝胶QCS/PF具有优良的抗菌能力。
图11为成纤维细胞(L929)在QCS/PF水凝胶表面的细胞粘附和增殖的数目统计。图中展示的实施例1和实施例2中的QCS/PF1.3，QCS/PF1.2，QCS/PF1.0，QCS/PF0.8的细胞数据统计。从图11中可以看出，成纤维细胞在与水凝胶CP/OD共同培养细胞的1,3,5天之内，QCS/PF1.0，QCS/PF0.8组的细胞增殖良好，与对照组没有显著性差异，显示出良好较强的生物相容性，可以作为良好的生物医疗材料。
图12为本发明制得的QCS/PF水凝胶负载药物姜黄素的抗氧化性能测试。姜黄素具有优异的抗氧化性能，可以清除自由基，显著改善伤口愈合效果并保护组织免受氧化。从图中可以看出，Cur-QCS/PF1.0水凝胶的抗氧化活性通过测试DPPH·的清除效率来评估。相比于未负载药物的组，以Cur-QCS/PF1.0水凝胶为例，DPPH·的吸收峰强度明显下降，这意味着该水凝胶具有良好的抗氧化能力。随着水凝胶含量的提高，DPPH·的清除能力也相应增加。因此，可以通过改变水凝胶的含量，改变该水凝胶的抗氧化能力，以满足不同的实际需要。
图13为本发明制得的水凝胶在不同pH值的生理溶液磷酸盐缓冲液(PBS)中释放姜黄素的释放曲线。从图13中可以看出，弱酸性环境下(pH＝6.0和pH＝6.8)姜黄素的累积释放率远高于pH＝7.4的弱碱性环境，该结果表明该水凝胶拥有良好的pH响应性能，在弱酸性皮肤环境下，该水凝胶不仅可以达到药物缓释的效果同时又可以达到一个有效的药物释放率，从而达到良好的治疗效果。
图14为本发明制得的水凝胶敷料的粘合强度的测试。以实施例1和实施例2中制得的水凝胶样品QCS/PF1.3，QCS/PF1.2，QCS/PF1.0，QCS/PF0.8表现的粘合强度从6.1kPa至4.4kPa。通过增加PF127-CHO的含量，水凝胶的粘合强度逐渐增强。这些水凝胶表现出理想的粘合强度，与商用纤维蛋白胶粘合剂(约5kPa)保持相当的强度。因此，该系列水凝胶表现出良好的粘合性能。
图15为本发明制得的水凝胶敷料的止血性能测试。通过小鼠肝脏出血模型进行评估，以实施例2中制备的QCS/PF1.0为例发现，对照组小鼠肝脏释放的血液量接近616.7±157.0mg，而QCS/PF1.0水凝胶组小鼠的出血量为80.1±7.13mg，且存在极显著差异(P<0.01)。这表明水凝胶具有良好的体内止血性能。
图16为本发明制得的水凝胶敷料QCS/PF1.0，Cur-QCS/PF1.0和商用敷料(TegadermTM)分别在第5天，第10天和第15天的伤口收缩面积统计。第5天时，各组的伤口面积均有所减少，而Cur-QCS/PF1.0水凝胶创面收缩面积最大,为72％，说明其对伤口愈合的促进作用较快。第10天，两种水凝胶组均显示出比对照组更好的治疗效果。QCS/PF1.0组创面收缩面积比对照组高出近9％(P<0.05)，Cur-QCS/PF1.0组高于对照组13％(P<0.05)。在第15天，虽然所有组都表现出极小的伤口剩余面积，但Cur-QCS/PF1.0水凝胶组的创面收缩面积仍比对照组高出5％。因此，QCS/PF1.0水凝胶和Cur-QCS/PF1.0水凝胶组显示出比对照组更好的伤口愈合效果，同时当该水凝胶负载生物活性药物(姜黄素)时，Cur-QCS/PF1.0在整个伤口愈合阶段显示出更为优异的治疗效果。
图17(a-c)为本发明制得的水凝胶敷料QCS/PF1.0，Cur-QCS/PF1.0和商用敷料(TegadermTM)分别在第5天，第10天和第15天的伤口处组织的H&E染色结果，以评估不同阶段的伤口愈合进展。如图17(a-c)所示，所有组在第五天时均显示轻度急性炎症反应，并且有炎性细胞和成纤维细胞迁移到伤口部位。而与对照组和QCS/PF1.0水凝胶组相比，Cur-QCS/PF1.0水凝胶的伤口部位出现相对较多的成纤维细胞和较少的炎性细胞，这是由于姜黄素的良好的抗氧化作用。第十天时(图17(d-f))，所有水凝胶组形成一层完整的上皮结构。此外，水凝胶组(Cur-QCS/PF1.0，QCS/PF1.0)组比对照组表现出更多的成纤维细胞，更为规整的上皮和结缔组织，以及更多的血管和毛囊。第15天(图17(g-i))，对照组除了形成上皮和真皮的基本结构外，还在QCS/PF1.0水凝胶组中形成少量血管和毛囊。Cur-QCS/PF1.0表现出最多的成熟血管，毛囊，同时其表皮增厚和成纤维细胞增殖良好，因此水凝胶组QCS/PF1.0表现出由于对照组的治疗效果，Cur-QCS/PF1.0在三组中显示最佳伤口愈合效果。
图18为本发明制得的水凝胶敷料QCS/PF1.0，Cur-QCS/PF1.0和商用敷料(TegadermTM)的肉芽组织厚度统计。如图18所示，经过15天的治疗，对照组的肉芽组织比Cur-QCS/PF1.0水凝胶组薄约550μm(P<0.01)，比QCS/PF1.0组薄约220μm(P<0.05)。因此，QCS/PF1.0水凝胶表现出比对照更好的伤口愈合作用，并且姜黄素加载组(Cur-QCS/PF1.0水凝胶)在这三组中显示出最优的治疗效果。
图19为本发明制得的水凝胶敷料QCS/PF1.0，Cur-QCS/PF1.0和商用敷料(TegadermTM)肉芽组织中的总胶原蛋白水平测定，以进一步评估三种治疗方案的治疗效果。如图19所示，所有组中胶原蛋白的含量在前10天内保持上升，并且在第15天保持稳定水平。与对照组相比，QCS/PF1.0和Cur-QCS/PF1.0水凝胶组在15天内表现出更高的胶原蛋白水平。此外，当QCS/PF1.0水凝胶负载姜黄素时，Cur-QCS/PF1.0显示出比其他组更高的胶原水平(P<0.05)。因此，所有水凝胶组均显示出比商用敷料更好的治疗效果，并且载药水凝胶组(Cur-QCS/PF1.0)在实验组中表现出最好的治疗效果。

Claims (10)

1.一种抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过在壳聚糖上接枝2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，得到季铵化壳聚糖聚合物；
(2)通过在三嵌段共聚物F127上接枝对羧基苯甲醛，得到醛基封端的F127聚合物；
(3)将季铵化壳聚糖聚合物和醛基封端的F127聚合物分别配制成溶液后，在20～45℃交联反应5～400s，制得抗菌粘附可注射水凝胶敷料；其中，季铵化壳聚糖聚合物和醛基封端的F127聚合物的质量比为(1～20)：(50～200)。
2.根据权利要求1所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，季铵化壳聚糖聚合物的具体制备步骤包括：
1)先将壳聚糖溶解于去离子水中，边搅拌边滴加冰乙酸水溶液，然后在55℃下反应10～300min，之后加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，在40～60℃反应12～36h，得到反应液；
2)将反应液离心处理后收集上清液，加入上清液5～8倍体积的丙酮，沉淀完全后抽滤干燥，得到季铵化壳聚糖聚合物；
其中，壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为(1～6)：(0.5～6)；壳聚糖与冰乙酸水溶液的用量比为5g：(100～260)mL；冰乙酸水溶液的浓度为0.03mol/L～0.12mol/L。
3.根据权利要求1所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，醛基封端的F127聚合物的具体制备步骤包括：
a)将F127聚合物密封于反应容器中进行干燥处理，然后加入干燥的二氯甲烷，再在0℃冰浴下加入干燥的三乙胺，充分搅拌10～60min，制得F127溶液；将干燥的甲磺酰氯溶于干燥的二氯甲烷中，得到甲磺酰氯溶液，将该甲磺酰氯溶液滴加至F127溶液中，在氮气环境下搅拌10～60min，随后在15～40℃下搅拌12～36h，之后在反应体系中加入去离子水，并用二氯甲烷进行萃取，有机相用酸溶液和饱和食盐水洗涤处理，然后干燥、浓缩，将浓缩后的有机相用冰乙醚重结晶处理，将析出的沉淀干燥，制得白色中间产物G1；
b)将白色中间产物G1溶解至干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，并加入碳酸钾和4-羧基苯甲醛，在氮气保护下，于60～90℃搅拌反应15～60h，待反应液冷却至15～30℃，加入去离子水，并用二氯甲烷进行萃取，有机相经洗涤、干燥、浓缩处理后用冰乙醚进行重结晶处理，直至沉淀完全析出，将析出的沉淀干燥，制得醛基封端的F127聚合物。
4.根据权利要求3所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤a)中，F127聚合物、三乙胺与甲磺酰氯的用量比为：(15～30)g：(1.2～4.5)mL：(0.5～2.5)mL。
5.根据权利要求3所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，F127聚合物与二氯甲烷的用量比为(15～30)g：(100～300)mL；甲磺酰氯与二氯甲烷的体积比为(0.5～2.5)：(15～50)。
6.根据权利要求3所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤b)中，白色中间产物G1：碳酸钾：4-羧基苯甲醛的质量比为(15～30)：(1.8～3.5)：(0.8～4.0)。
7.根据权利要求3所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤b)中，白色中间产物G1与N,N-二甲基甲酰胺的用量比为(15～30)g：(100～300)mL。
8.根据权利要求1所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将季铵化壳聚糖聚合物用磷酸盐缓冲液配制成质量浓度为20～70mg/mL的季铵化壳聚糖溶液；将醛基封端的F127聚合物用磷酸盐缓冲液配制成质量浓度为150～500mg/mL的醛基封端的F127聚合物溶液；季铵化壳聚糖溶液与醛基封端的F127聚合物溶液的体积比为(50～400)：(150～450)。
9.采用权利要求1～8中任意一项所述的方法制得的抗菌粘附可注射水凝胶敷料。
10.权利要求9所述的抗菌粘附可注射水凝胶敷料在制备针对皮肤伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述水凝胶敷料能够负载生物活性分子。
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